一、蛋白激酶C激动剂和抑制剂对溶血磷脂酰胆碱引起脑微血管平滑肌细胞增殖的影响（论文文献综述）
杨绍忠[1]（2021）在《七氟烷和异氟烷通过PI3K-C2α/Rho激酶调节血管平滑肌收缩》文中研究指明血管张力由机体的内在机制和外在机制共同调节。吸入性麻醉药可直接作用于各种血管床的血管平滑肌和内皮细胞,影响血管阻力,从而导致器官血流改变。在维持血管张力方面,血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cell,VSMC）中的钾离子（K+）通道起着重要作用。氯化钾（Potassium chloride,KCl）刺激血管平滑肌（Vascular smooth muscle,VSM）收缩的机制可能涉及Ca2+依赖和Ca2+敏化途径。KCl膜去极化通过电压依赖性Ca2+通道受体增加VSM细胞Ca2+内流,导致胞浆游离Ca2+（[Ca2+]i）增加。[Ca2+]i的增加激活Ca2+-钙调蛋白（Ca2+-calmodulin,CaM）依赖的肌球蛋白轻链激酶（Myosin light chain kinase,MLCK）,导致肌球蛋白轻链（Myosin light chain,MLC）磷酸化和血管收缩。除Ca2+依赖途径外,Ca2+诱导的Ca2+敏化途径还可通过调节Ⅱ类磷酸酰肌醇3-激酶α 亚基（Class Ⅱphosphoinositide 3-kinase α-isoform,PI3K-C2α）和 Rho 激酶活性来抑制MLC磷酸酶（MLC phosphatase,MLCP）,从而导致血管收缩。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide3-kinase,PI3K）是一个广泛表达的酶家族,可以磷酸化膜肌醇脂类并发挥多种生物活性。根据其结构、分布、活化机制和功能不同,PI3K可分为Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ三类。Ⅰ类PI3K根据不同类型的偶联受体和调节激活剂可进一步分为IA类和IB类,介导细胞增殖、存活和迁移。Ⅱ类PI3K分为 PI3K-C2α,PI3K-C2β,和 PI3K-C2γ 三种。研究表明 PI3K-C2α 和 PI3K-C2β均参与Rho的激活和Rho激酶依赖性MLCP抑制。Ⅲ类存在于酵母中,是由Vps34蛋白（磷酸酰肌醇3-激酶囊泡分选蛋白34）组成的。已知VSM表达多种PI3Ks,包括Ⅰ类酶p110α和 p110β,Ⅱ类酶 PI3K-C2α 和 C2β。PI3Ks已被证明与糖尿病（diabetes mellitus,DM）及其并发症密切相关,是葡萄糖稳态的关键分子。PI3Ks对DM患者的重要性不仅限于对糖代谢的调节,还与DM引起的靶器官损害密切相关,如血管、心脏和大脑。研究证实,DM可导致中枢神经系统中PI3K活性的降低。大脑中PI3K信号的上调,可以逆转DM的病理后果,而使用PI3K抑制剂则可减轻甚至恢复DM相关的损伤。蛋白激酶B（protein kinase B,PKB）又称Akt,是PI3K途径的关键下游底物,在细胞凋亡、增殖、迁移和转录及葡萄糖代谢等多种细胞过程中发挥关键作用。PI3K/Akt信号通路广泛存在于细胞中,可以激活并调控众多激酶靶点,是生理和病理条件下调节血管张力的关键因子。PI3K/Akt信号通路参与内皮细胞的典型功能,如调节血管平滑肌张力和血管生成等。Rho激酶在VSMC收缩机制中起重要作用。体内Rho-Rho激酶的激活可改变Ca2+的敏感性,磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶向亚基1（Myosin phosphatase target subunit 1,MYPT1）,抑制MLCP引起血管收缩。体内血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ,Ang Ⅱ）、凝血酶和内皮细胞或平滑肌细胞中高血糖等因素,均可触发Rho激酶的激活。最新研究表明,DM患者外周循环白细胞的Rho激酶活性显着增加,抑制Rho激酶活性可以改善DM的疗效及预后。目前,临床常用的吸入性麻醉药为七氟醚（sevoflurane,SEVO）和异氟醚（isoflurane,ISO）,通常表现为浓度依赖性的心肌抑制和血管舒张,引起低血压。既往研究表明,SEVO和ISO可以通过PI3K/Akt途径对心肌和脑缺血再灌注损伤提供保护作用。PI3K/Akt通路通过L型Ca2+通道的调控以及Rho激酶、磷酸二酯酶5（phosphodiesterase 5,PDE5）的激活,导致血管收缩。研究表明,抑制PI3K信号通路是一种潜在的抗高血压和血管保护疗法。可能机制与细胞内信号转导直接作用于VSM有关,但确切机制尚未完全清楚。我们前期研究发现SEVO通过抑制蛋白激酶C（Protein kinase C,PKC）磷酸化降低Ang Ⅱ诱导的血管收缩,而不影响VSM中[Ca2+]i。最近研究表明,SEVO抑制 MLC、蛋白激酶 C 增强抑制蛋白（PKC-Potentiated inhibitory protein,CPI-17）和肌球蛋白磷酸酶靶向亚基 1/Thr853（Myosin phosphatase target subunit/Thr853,MYPT1/Thr853）对AngⅡ的磷酸化反应。ISO也抑制MLC对Ang Ⅱ的磷酸化反应,与MYPT1/Thr853的降低有关,但与CPI-17的磷酸化无关。SEVO和ISO均不影响Ang Ⅱ诱导的肌球蛋白磷酸酶靶向亚基1/Thr696（Myosin phosphatase target subunit/Thr696,MYPT1/Thr696）磷酸化。上述研究表明两种吸入性麻醉药对Ang Ⅱ诱导的血管收缩和MLC磷酸化有相似的抑制作用,但其抑制MLCP活性的机制却不同。PI3K参与Rho的激活和由此产生的Rho激酶依赖性MLCP抑制,可诱导血管平滑肌收缩,但与其细胞内Ca2+浓度升高无关,表明该激酶参与了细胞内Ca2+敏化途径。研究表明,临床浓度的SEVO可显着抑制非DM大鼠对去甲肾上腺素（Norepinephrine,NE）的反应,但对DM大鼠无此作用。临床研究证实,用ISO或SEVO麻醉诱导,非DM患者的足部皮肤温度比DM患者更高,提示由交感神经系统控制的体温调节在DM患者中受损。这些发现表明DM血管对吸入性麻醉药的反应性发生了改变。但DM血管对吸入性麻醉药反应性的差异及其机制尚未确定,尤其是对血管病变较严重的老年DM研究较少。目前,关于SEVO和ISO对Ca2+诱导的Ca2+敏化途径在调节VSM收缩中的作用所知甚少。本研究分为三部分,第一部分研究对象为正常大鼠主动脉血管,旨在探讨吸入性麻醉药通过调节PI3K亚基和Rho激酶活性,对正常大鼠主动脉血管平滑肌收缩的影响。第二部分研究对象为老龄DM血管,通过与幼龄和老龄正常大鼠血管对比,旨在探讨吸入性麻醉药对DM大鼠主动脉血管平滑肌收缩的影响,并探讨年龄和DM对吸入性麻醉药血管舒张反应的特异性影响。主动脉为弹性储器血管,而决定外周血管阻力的主要是阻力血管,因此第三部分研究对象选择胃癌患者手术切除的大网膜动脉,旨在探讨吸入性麻醉药通过调节PI3K亚基和Rho激酶活性,对阻力血管平滑肌收缩的影响。本研究将为临床合理应用吸入性麻醉药提供更多理论依据,有助于改善患者预后。第一部分:七氟烷和异氟烷通过PI3K-C2 α/Rho激酶调节大鼠主动脉血管平滑肌收缩目的探讨SEVO和ISO通过调节正常大鼠离体主动脉血管平滑肌中PI3K亚基和Rho激酶活性对KCl所致血管平滑肌收缩的影响。方法1.血管平滑肌组织制备。雄性Wistar大鼠（250-350g）用氟烷麻醉,通过颈总动脉放血实施安乐死。仔细解剖降主动脉,去除附着的脂肪和连接组织,切成3-4mm的动脉环。用不锈钢针轻轻摩擦内表面,去除内皮细胞。动脉环垂直安装在两个挂钩之间,上挂钩连接到等张力传感器的杠杆上。2.等张肌力收缩测量。用KCl（60mM）培养主动脉环,观察平滑肌细胞完整性其整体收缩反应性,并确认动脉环内皮细胞已去除。在加入KCl前先将每只大鼠（n=7）的6个主动脉环随机暴露于SEVO和ISO的0、1、2和3最小肺泡浓度（MAC）或 1mM LY294002（PI3K 抑制剂）或1μM Y27632（Rho 激酶抑制剂）环境中培养15min。使用等张肌力传感器测量KCl诱发的血管收缩张力。SEVO、ISO、LY294002和Y27632对KCl诱导的大鼠主动脉平滑肌收缩的等张力变化以相对于KCl（60mM）诱导的最大等张力的百分比表示。3.MYPT1、CPI-17和MLC磷酸化测定。从每只大鼠的降主动脉取一条去除内皮细胞的动脉条带（约3.5cm）,在实验开始前将其浸泡在含氧的KBS溶液中平衡60min。主动脉条分别在0（对照）、60 mM KCl、1 MAC-SEVO（1.7%）、2 MAC-SEVO（3.5%）、1 mM LY294002 和 1μM Y27632 或 0（对照）、60mM KCl、1MAC-ISO、2MAC-ISO、1mM LY294002 和 1μM Y27632 中培养。在有 KCl 的情况下培养15min,无KCl的情况下培养5min,用液氮快速冷冻,匀浆离心后使用Western blot分析测定MYPT1、CPI-17和MLC磷酸化程度。实验中用化学发光法检测免疫反应带的密度,用图像分析软件评估。磷酸化与总CPI-17、MLC和MYPT1的比值用作每种酶的活化指标,并表示为相对于基线对照水平的百分比。4.PI3K和Rho激酶（Rock Ⅱ）转膜活化测定。为测定SEVO、ISO和激酶抑制剂对KCl刺激的PI3K和Rock Ⅱ转膜活化的剂量效应,主动脉条分别先用1.7%SEVO、3.5%SEVO、1.2%ISO、2.3%ISO、1 mM LY294002 和 1μM Y27632处理15min后,用KCl培养5min。使用Western blot分析测定PI3K和Rho激酶（RockII）转膜活化水平。实验中用化学发光法检测免疫反应带的密度,用图像分析软件评估。PI3K-p85α、PI3K-C2 α和Rock Ⅱ的含量以总值的百分比表示（膜中含量/膜和胞质中总量）。结果1.等张肌力收缩测量。KCl诱导大鼠主动脉平滑肌快速而持续收缩,在约5min后达到最大水平,并在大鼠主动脉环中持续超过30min。SEVO和ISO均以浓度依赖的方式减弱KCl诱导的动脉平滑肌收缩,并且LY294002（1mM）和Y27632（1μM）对平滑肌收缩也起抑制作用。SEVO对KCl诱导的血管平滑肌收缩抑制作用与等效浓度的ISO 比较,无显着性差异。2.MYPT1、CPI-17和MLC磷酸化测定。KCl诱导MLC磷酸化迅速增加,且在暴露于KCl约5min后达到峰值水平。SEVO和ISO也以浓度依赖的方式抑制 KCl 诱导的 MLC 磷酸化,LY294002（1mM）和 Y27632（1μM）对 MLC磷酸化也起到抑制作用。SEVO和ISO均以浓度依赖的方式抑制KCl引起的MYPT1/Thr853磷酸化,但均不影响MYPT1/Thr696和CPI-17/Thr38的磷酸化。3.PI3K 和 Rho 激酶（Rock Ⅱ）转膜活化测定。LY294002（1mM）抑制 KCl诱导的PI3K-p85和PI3K-C2α转膜活化（分别为P<0.05和P<0.01）。Y27632（1uM）和LY294002（1mM）均能抑制KCl诱导的Rock Ⅱ转膜活化（P<0.01）。SEVO和ISO均抑制大鼠主动脉血管平滑肌中PI3K-C2α和Rock Ⅱ转膜活化,但对PI3K-p85转膜活化无影响。结论1.SEVO和ISO均能通过抑制正常大鼠主动脉血管平滑肌中PI3K-C2α和Rho激酶活性及MLC磷酸化,抑制血管收缩。2.LY294002可通过抑制MLC磷酸化和PI3K活性抑制血管收缩。3.吸入性麻醉药发挥抑制作用的细胞机制是通过PI3K-C2α/Rho激酶/MYPT1/MLC途径介导。意义SEVO和ISO可通过调节大鼠主动脉血管平滑肌中PI3K-C2α和Rho激酶活性抑制血管平滑肌收缩。临床浓度的吸入性麻醉药与PI3K抑制剂合用可增强血管舒张作用。研究为使用PI3K抑制剂进行抗癌治疗的患者使用吸入性麻醉药时的循环管理提供一定临床指导。第二部分:七氟烷和异氟烷通过PI3K/Rho激酶调节糖尿病血管平滑肌收缩目的探讨SEVO和ISO对PI3K和Rho激酶参与的老年2型糖尿病大鼠血管平滑肌收缩的影响。方法1.实验动物。选择老年雄性OLETF大鼠（65～70周龄）和年龄匹配的非糖尿病LETO大鼠及幼年Wistar大鼠（6～8周龄）作为研究对象。OLETF大鼠是一种自发性的2型糖尿病（type 2 diabetesmellitus,T2DM）动物模型,具有先天性多食、轻度肥胖、迟发性高血糖、高胰岛素血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症的特点,与人类T2DM的病理生理过程相似。2.口服糖耐量试验。实验前对各组大鼠进行口服糖耐量试验（Oral glucose tolerance test,OGTT）。大鼠禁食8～14h,取尾静脉血测定空腹血糖。然后葡萄糖（2g/kg）灌胃,30、60、90、120min时分别测定负荷后血糖。各组大鼠符合入组标准后用于后续实验。3.血管平滑肌制备。三组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠（40mg/kg）麻醉后,颈总动脉放血实施安乐死。仔细解剖降主动脉,切成3～4mm长的动脉环。用不锈钢针轻轻摩擦内表面,去除内皮细胞。动脉环垂直安装在两个挂钩之间,上挂钩连接到等张力传感器的杠杆上。4.等张肌力测量。等张力传感器测量KCl诱导的三组大鼠主动脉血管收缩张力。用KCl诱导动脉环后,将各组动脉环随机分别暴露于SEVO或ISO（MAC值为 0、1、2、3）、10μM LY294002 和 1μMY27632 的环境中培养 15min。SEVO和ISO通过校准的汽化器以2L/min的新鲜气流流量通入到气体混合物中,使用气相色谱仪监测和调整KBS溶液中的SEVO浓度。SEVO、ISO、LY294002和Y27632对KCl（60mM）诱导的三组大鼠动脉平滑肌收缩的等张力变化以相对于KCl（60mM）诱导的最大等张力的百分比表示。结果1.葡萄糖耐量曲线变化。大鼠OGTT曲线变化表明,老年OLETF大鼠餐后血糖明显高于对照组同龄LETO大鼠及幼年Wistar大鼠,有显着差异（P<0.01）且在30min达到最高值。LETO大鼠及Wistar大鼠血糖峰值在10mmol/L以下,但峰值出现时间不同,老年LETO大鼠峰值在进食后30min,幼年Wistar大鼠峰值在餐后60min。2.KCl（60mM）对大鼠主动脉血管平滑肌收缩的影响。KCl诱导三组大鼠主动脉平滑肌快速而持续收缩,与LETO组及Wistar组相比,OLETF组大鼠主动脉收缩更明显,有显着性差异（P<0.05）,LETO组与Wistar组无显着性差异。3.SEVO和ISO对KCl诱导的大鼠主动脉平滑肌收缩的影响。SEVO和ISO对幼年和老年大鼠血管反应存在显着性差异,SEVO对幼年大鼠血管抑制作用较等效浓度ISO更强,其中2MAC和3MAC SEVO较等效浓度ISO有显着性差异（P<0.05）。老年大鼠组中,ISO 比等效浓度SEVO抑制作用更显着,且OLETF组比LETO组更明显,但两者没有显着性差异。三组间比较,1MAC SEVO对KCl诱导的幼年Wistar大鼠主动脉血管收缩抑制作用最强,且与OLETF组和LETO组相比,有显着差异（P<0.05）。2MAC SEVO对三组大鼠无显着性差异。3MAC SEVO对KCl诱导的OLETF组血管收缩抑制作用最强,与LETO组和Wistar组相比,有显着差异（P<0.05）。与SEVO不同,相比较OLETF组和LETO组,各浓度ISO对幼年Wistar大鼠主动脉血管收缩抑制作用最弱,有显着性差异（P<0.05）。4.LY294002（10μM）和Y27632（1μM）对KCl诱导的大鼠主动脉血管收缩的影响。LY294002和Y27632对三组大鼠主动脉血管收缩均有抑制作用。三组间LY294002和Y27632抑制程度比较,Wistar组与LETO组没有统计学差异（P>0.05）,OLETF大鼠组主动脉舒张程度明显高于LETO组和Wistar组,有显着性差异（P<0.01）。结论1.与正常血管相比,KCl诱导糖尿病血管平滑肌收缩显着增强。2.SEVO和ISO对幼年和老年大鼠主动脉血管平滑肌收缩抑制有显着差异,SEVO对幼龄血管抑制作用更明显,尤其是高浓度时。ISO对老年血管抑制作用更强。3.吸入性麻醉药对正常血管和糖尿病血管反应明显不同,提示糖尿病血管PI3K和Rho激酶活性异常。4.PI3K抑制剂LY294002和Rho激酶抑制剂Y27632对糖尿病血管收缩抑制作用更强,进一步提示糖尿病血管PI3K和Rho激酶活性异常。意义探明吸入性麻醉药调控糖尿病血管舒张的特异性反应,为糖尿病患者围术期合理选择麻醉药物,实现麻醉学向围术期医学转变,预防围术期急性心脑血管事件的发生提供理论依据。第三部分:七氟烷通过PI3K-C2 α/Rho激酶调节大网膜动脉血管平滑肌收缩目的研究SEVO通过调控PI3K-C2α和Rho激酶活性对KCl诱导的大网膜动脉血管平滑肌收缩的影响。方法1.组织制备。取患者腹腔镜胃切除后的大网膜动脉为研究样本。仔细解剖大网膜动脉,去除附着的脂肪和连接组织,并将备好的动脉切成3～4mm的动脉环。动脉环用棉签或针头轻轻摩擦,以机械方式去除内皮细胞,避免内皮衍生的血管舒张物质介导的影响。动脉环用苯肾上腺素（10-5mol/L）预收缩,对缓激肽（10-6mol/L）无舒张反应时,表明内皮细胞已完全去除。去除内皮细胞的动脉环垂直安装在两个挂钩之间,上挂钩连接到等张力传感器的杠杆上。2.等张肌力测量。等张力传感器测量KCl诱导的动脉血管收缩张力。在37℃的Krebs碳酸氢盐溶液（KBS）中通入95%（v/v）O2和5%（v/v）CO2的混合气（新鲜气体流量为2L/min）。动脉环在3g的静息张力下平衡60min,每隔20min更换一次培养液。随后用KCl（60mM）培养动脉环,观察平滑肌细胞的完整性及其整体收缩反应性。在加入KCl之前先将动脉环随机暴露于SEVO（MAC值为 0、1、2）或 10μM LY294002（PI3K 抑制剂）或 1μMY27632（Rho 激酶抑制剂）的环境中培养15min。SEVO通过校准的汽化器以2L/min的新鲜气流流量通入到气体混合物中,使用气相色谱仪监测和调整KBS溶液中的SEVO浓度。SEVO、LY294002和Y27632对KCl诱导的大网膜动脉平滑肌收缩的等张力变化以相对于KCl（60mM）诱导的最大等张力收缩的百分比表示。4.MYPT1、CPI-17和MLC磷酸化测定。在大网膜动脉样本中取一条内皮剥脱的血管条带（约3.5cm）,将其浸泡在含氧的KBS溶液中,平衡60min。将不同大网膜动脉条随机于 0（对照）、60mM KCl、1MAC-SEVO（1.7%）、2 MAC-SEVO（3.4%）、LY294002（10μM）或 Y27632（1μM）中培养。在无 KCl 的情况下培养15min,在KCl存在的情况下培养5min,随后用液氮进行快速冷冻。匀浆离心后使用Western blot分析MYPT1、CPI-17和MLC磷酸化程度。实验用化学发光法检测免疫反应带的密度,用图像分析软件评估。磷酸化与总CPI-17、MLC和MYPT1的比值用作每种酶的活化指标,并表示为相对于基线对照水平的百分比。5.PI3K和Rho激酶（Rock Ⅱ）转膜活化测定。选取样本中己去除内皮细胞的大网膜动脉条,将其浸泡在含有20ml KBS溶液的器官浴槽中平衡60min,每20min更换一次KBS溶液。将平衡后的动脉条分别置于1MAC-SEVO（1.7%）、2MAC-SEVO（3.4%）、LY294002（10μM）和 Y27632（1μM）的环境中培养 15min。用KCl处理5min后,用液氮快速冷冻样品。使用Western blot方法测定PI3K和Rho激酶（RockⅡ）的转膜活化。实验用化学发光法检测免疫反应带的密度,用图像分析软件评估。PI3K-p85α、PI3K-C2α和Rock Ⅱ的含量以总值的百分比表示（即膜中含量/膜加胞质中总含量）。结果1.等张肌力测量。等张力传感器测量KCl诱导的动脉VSM收缩张力。SEVO、LY294002和Y27632对KCl诱导的大网膜动脉VSM收缩的等张力变化以相对于KCl（60mM）诱导的最大等张力的百分比表示。测量结果显示SEVO以浓度依赖的方式减弱KCl诱导的人离体大网膜动脉VSM收缩,LY294002（10μM）和Y27632（1μM）也可以对其起到抑制作用。2.MYPT1、CPI-17和MLC磷酸化测定。结果显示KCl诱导MLC磷酸化迅速增加,且在暴露于KCl约5min后达到峰值水平。SEVO以浓度依赖的方式抑制KCl引起的MLC和MYPT1/Thr853磷酸化。与第一部分结果一致,SEVO不影响KCl引起的大网膜动脉MYPT1/Thr696和CPI-17/Thr38磷酸化的增加;此外,LY294002（10μM）和Y27632（1μM）也可以抑制KCl诱导的MLC磷酸化。3.PI3K和Rho激酶（Rock Ⅱ）转膜活化测定。与第一部分结果一致,SEVO以浓度依赖的方式抑制人离体大网膜动脉血管平滑肌PI3K-C2α和Rock Ⅱ的转膜活化,但SEVO不会以浓度依赖的方式抑制PI3K-p85对KCl的反应。LY294002（10μM）可抑制 KCl 诱导的 PI3K-p85 和 PI3K-C2α 转膜活化。Y27632（1uM）和LY294002（10μM）均能抑制KCl诱导的Rock Ⅱ转膜活化。结论1.SEVO可通过调控大网膜动脉血管中PI3K-C2α和Rho激酶活性抑制血管收缩。2.低浓度PI3K抑制剂LY294002（10μM）可有效抑制PI3K活性和MLC磷酸化,舒张血管。3.SEVO对KCl诱导的血管收缩的抑制作用与调节MLCP的上游活化因子PI3K-C2α/Rho激酶活性有关。意义临床常用剂量的SEVO可通过调控大网膜动脉血管平滑肌中PI3K-C2α和Rho激酶活性抑制血管收缩。吸入性麻醉药对弹性储器血管和阻力血管均有浓度依赖性抑制作用。该研究为围术期使用PI3K抑制剂进行抗癌治疗的患者使用吸入性麻醉药时的循环管理提供重要理论依据。
龙向淑[2]（2021）在《HOXC6对大鼠血管平滑肌细胞增殖、迁移和血管内皮细胞凋亡的影响》文中指出研究背景冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）、冠状动脉腔内成形术/支架植入术后再狭窄及脑卒中等动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）发病率和病死率在多数发展中国家仍呈逐年升高的趋势,是中国乃至全球范围内非感染性疾病死亡的首要原因。动脉粥样硬化（AS）是ASCVD的主要病理基础。在多种导致AS的不良因素作用下,位于中膜层的血管平滑肌细胞（VSMCs）迁移至内膜及内膜下层并异常增殖,而内膜层的血管内皮细胞（VECs）凋亡增多,是AS发生发展的主要细胞病理学基础。然而,血管壁细胞异质性生物学行为异常及其介导AS发生的分子机制尚未完全明了。同源框（HOX）是一类进化上高度保守并影响脊索动物形态发生的同源域转录因子。HOX基因家族包含39个同源基因。近期研究表明,HOXA4、HOXA5、HOXA6、HOXB1及HOXB9等多个HOX基因在猪主动脉壁的表达受剪切应力影响,但这些基因对血管生物学功能和AS的影响未知。同源框C6（HOXC6）属HOX基因家族C簇成员。研究显示,HOXC6在多器官系统恶性肿瘤组织中表达增高并影响肿瘤细胞增殖、迁移及凋亡等生物学行为。此外,HOXC6可调节血管壁多能干细胞分化为VSMCs、以及皮肤成纤维细胞分化为血管壁间充质细胞。但是,HOXC6对VSMCs和VECs的增殖、迁移及凋亡等生物学行为是否有影响迄今未见文献报道。研究目的了解Hoxc6等39个Hox基因在AS大鼠主动脉壁和正常主动脉壁的差异表达,然后进一步探讨HOXC6对VSMCs增殖及迁移和VECs凋亡的影响及其部分机制,为明确HOXC6能否成为ASCVD分子治疗新靶点奠定理论基础。研究方法采用苏木素和伊红（H&E）染色法对大鼠主动脉染色验证AS大鼠建模是否成功。应用免疫组织化学法检测Hoxc6、Bcl-2和Bax蛋白在大鼠主动脉的原位表达。采用免疫荧光染色法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在VSMCs和CD31在VECs中的表达。采用反转录实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测39个Hox基因、p53、增殖细胞核抗原（PCNA）、磷脂酶C beta（PLCβ）和血小板活化因子受体（PTAFR）mRNAs表达。用蛋白质免疫印迹（Western blot）检测大鼠主动脉或心脏组织中和大鼠VSMCs（RVSMCs）中Hoxc6、p53及PCNA蛋白表达,检测VECs中HOXC6、BCL-2、BAX、Caspase-3、Cleaved caspase-3、Caspase-9、PTAFR、PLCβ及IL-18蛋白表达,以及检测VECs中蛋白激酶C zeta（PKCζ）、NF-κBp65磷酸化和PKCζ膜转位水平变化。应用Cell counting kit-8（CCK-8）和5-乙炔基-2’-脱氧尿苷（Ed U）实验检测VSMCs增殖。用细胞划痕法和Transwell实验检测VSMCs迁移。用原位末端转移酶标记技术（TUNEL）和流式细胞技术检测VECs凋亡。采用生物信息学分析方法挖掘并分析GEO数据库中冠心病相关基因表达及其可能参与的信号通路。应用双荧光素酶报告基因实验检测HOXC6与PTAFR启动子DNA序列结合。采用染色质免疫共沉淀（Ch IP）结合qPCR（Ch IP-qPCR）验证HOXC6与PTAFR启动子DNA结合的特定靶序列。结果1.在AS大鼠主动脉壁异常表达的Hox基因H&E染色结果显示,AS大鼠主动脉内膜/中膜比值较正常主动脉明显增加（P<0.01）。采用qRT-PCR对39个Hox基因mRNA检测结果显示,AS大鼠主动脉壁较正常大鼠主动脉壁表达上调或下调（表达增加或减少倍数的均数绝对值≥2）的Hox基因为17个,其中Hoxa1、Hoxa3、Hoxa9、Hoxb7、Hoxc5、Hoxc6、Hoxc8、Hoxc9及Hoxc10共9个基因表达上调（均P<0.01）,而Hoxa2、Hoxa4、Hoxa5、Hoxa6、Hoxb2、Hoxb3、Hoxb4及Hoxb6共8个基因下调（均P<0.01）。在上调的9个Hox基因中,其中Hoxc6表达升高了10余倍,较之升高倍数更大的Hoxc9或Hoxc10,Hoxc6在大鼠主动脉壁的基础表达丰度最高,而且重复性最好,因此首选Hoxc6作进一步验证。2.Hoxc6和增殖、凋亡相关分子在AS大鼠主动脉壁异常表达qRT-PCR和Western blot结果显示,Hoxc6 mRNA和蛋白在AS大鼠主动脉壁的表达明显升高（P<0.01）,伴随p53 mRNA和蛋白在AS大鼠主动脉壁的表达显着减少,而PCNA表达显着增多（均P<0.01）。免疫组化染色结果显示,在AS大鼠主动脉壁的粥样斑块病变和迁移至内膜的VSMCs中,Hoxc6蛋白的表达较正常主动脉显着增多（P<0.01）,伴随抑凋亡分子Bcl-2蛋白在AS大鼠主动脉壁增厚的内膜组织和粥样斑块病变中的表达较正常主动脉明显减少,而促凋亡蛋白Bax表达显着增多（均P<0.01）。3.敲低Hoxc6表达抑制RVSMCs增殖与迁移免疫荧光染色实验结果显示,氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）处理的RVSMCs用α-SMA抗体染色后,阳性细胞/细胞总数的比率较正常RVSMCs下降（P<0.05）。Ed U、CCK-8、细胞划痕及Transwell实验结果显示,ox-LDL作用于细胞后,RVSMCs增殖明显增多,细胞迁移能力显着增强（均P<0.01）,伴随p53蛋白表达减少,PCNA表达增多（均P<0.01）。然而,下调ox-LDL处理或正常培养的RVSMCs中Hoxc6表达后,RVSMCs增殖显着减少,细胞迁移能力明显减弱（均P<0.01）,伴p53蛋白表达显着增多,而PCNA表达明显减少（均P<0.01）。此外,先后敲低RVSMCs中Hoxc6和p53表达后,RVSMCs的增殖和迁移能力较单独敲低Hoxc6组增强（均P<0.05）,但比正常对照组减弱（均P<0.05）。4.下调HOXC6表达抑制VECs凋亡TUNEL、流式细胞技术、qRT-PCR及Western blot结果显示,ox-LDL作用于大鼠主动脉内皮细胞（RAECs）或人脐静脉内皮细胞（HUVECs）后,细胞凋亡率较正常对照组均显着升高（均P<0.05）,伴随抑凋亡蛋白BCL-2表达显着减少（均P<0.01）,而促凋亡蛋白BAX、Caspase-3及其活化片段Cleaved caspase-3和Caspase-9表达增多（均P<0.05）。然而,下调ox-LDL处理或正常培养的RAECs或HUVECs中HOXC6表达后,细胞凋亡率较正常对照组或单独ox-LDL处理组下降（均P<0.05）,伴随抑凋亡蛋白BCL-2表达显着增多（均P<0.01）,而促凋亡蛋白BAX、Caspase-3及其活化片段Cleaved caspase-3和Caspase-9表达减少（均P<0.05）。此外,在HUVECs中过表达HOXC6之后,HUVECs凋亡率和凋亡相关蛋白变化的趋势与抑制HOXC6表达时相反（均P<0.05）。5.HOXC6靶向PTAFR经PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18途径影响HUVECs凋亡GEO数据库中冠心病有关的三个数据集gse20681、gse40231和gse46560取交集结果显示,血小板活化因子受体（PTAFR）等68个基因存在交集。KEGG pathway分析显示,PTAFR可通过PLC/PKC途径影响细胞凋亡,进一步在JASPAR数据库预测结果显示,HOXC6与PTAFR启动子存在特异结合位点。鉴于HOXC6影响RAECs和HUVECs凋亡的一致性,选择HUVECs为靶细胞,探讨HOXC6影响VECs凋亡的机制。qRT-PCR、Western blot结果显示,ox-LDL处理HUVECs或促进HOXC6表达后,PTAFR表达增多（均P<0.05）,伴随下游信号分子PLCβ表达增多（均P<0.05）,PKCζ磷酸化和膜转位水平升高（均P<0.05）,NF-κBp65磷酸化和IL-18表达水平升高（均P<0.05）。然而,在ox-LDL处理或正常培养的HUVECs中敲低HOXC6表达之后,上述观察指标的变化趋势与促进HOXC6表达时相反（均P<0.05）。此外,分别用PTAFR激动剂血小板活化因子和PKCζ激动剂溶血磷脂酰胆碱作用于HUVECs,均可逆转下调HOXC6表达所致的抑制HUVECs凋亡及PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18信号通路活性的效应（均P<0.05）。而且,双荧光素酶报告基因实验结果显示,HUVECs中过表达HOXC6之后,HOXC6与PTAFR启动子结合的活性显着增高（P<0.01）。Ch IP-qPCR实验结果显示,HOXC6可与PTAFR启动子特定位点AGAGGAATAGATTAAA和（或）GAAGCAATCAACCAAG序列结合（P<0.01）。结论1.39个Hox基因中的17个在AS大鼠主动脉壁与正常大鼠主动脉壁之间差异表达,其中Hoxc6表达显着升高,伴随p53和Bcl-2与Hoxc6呈负向性、而PCNA和Bax与Hoxc6呈正向性表达异常。2.HOXC6一方面可负调控p53表达而促进VSMCs增殖与迁移,另一方面靶向PTAFR经PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18途径促进VECs凋亡。由此提示HOXC6影响VSMCs增殖、迁移和VECs凋亡的异质性。
杜佳欣[3]（2021）在《LPA通过PKCδ介导ERK和JNK途径诱导血管平滑肌细胞基质蛋白CTGF的表达》文中研究表明心血管疾病是威胁人类健康、常见的重要疾病。冠心病是心血管系统疾病最常见的一种,其主要病理表现为形成动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）。AS发病过程中,低密度脂蛋白（Low density lipoprotein,LDL）在动脉内膜逐渐积累,被氧化修饰成氧化低密度脂蛋白（Oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL）。ox-LDL促进血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cell,VSMC）增殖、迁移,ox-LDL主要活性成分之一是溶血磷脂酸（Lysophosphatidic acids,LPA）。结缔组织生长因子（Connective tissue factor,CTGF）是一种重要的生长因子,激活一系列AS及随后血栓形成发病机制有关的基因,促进VSMC的增殖、迁移。因此,了解血管平滑肌细胞中CTGF表达的调控机制,是了解动脉粥样硬化的一个重要途径。LPA是否参与调控以及如何调控CTGF基因的转录机制尚不清楚,本研究对此进行了探讨。为探讨LPA对血管平滑肌细胞中CTGF表达的影响,本研究用LPA刺激细胞,Trizol试剂提取总RNA用于Northern blot检测,收集细胞裂解液用于Western blot检测。结果显示,LPA显着地诱导血管平滑肌细胞中CTGF mRNA和蛋白的表达,诱导CTGF蛋白表达具有时间和浓度依赖性（P<0.05）,LPA刺激3 h时达到峰值,LPA浓度高于1μM时即可诱导CTGF表达。进一步探讨蛋白激酶C（Protein kinase C,PKC）、有丝分裂原激活蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases,MAPK）通路在LPA诱导血管平滑肌细胞中的作用。采用药物诱导及抑制的方法,结果显示,LPA显着并有时间依赖性地诱导细胞外信号调节激酶（Extracellular-signal-regulated kinase,ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）、PKC和p38的磷酸化。PKC、ERK、JNK磷酸化时间高峰大多在2 min,p38激活时间在2 min至1 h。PKC、ERK、JNK特异性抑制剂剂量依赖性地阻断LPA诱导的CTGF蛋白表达（P<0.01）,p38特异性抑制剂对LPA诱导的CTGF蛋白表达水平没有显着的影响（P>0.05）。ERK特异性抑制剂剂量依赖性的阻断JNK磷酸化水平（P<0.01）。以上结果表明,LPA诱导血管平滑肌细胞基质蛋白CTGF表达需激活PKC、ERK和JNK,而不需激活p38 MAPK。ERK激活介导JNK激活,是LPA诱导CTGF表达所必需的。为探讨PKCδ和PKCθ哪种激酶参与诱导CTGF表达,应用PKC siRNA（小分子干扰）实验,结果显示,抑制PKCδ的表达,而非抑制PKCθ的表达,减弱了ERK和JNK的激活,从而阻断了LPA诱导的CTGF表达。进一步探讨LPA诱导CTGF表达的主要受体,选用野生型C57BL/6J小鼠、LPA1和LPA2基因基因敲除型小鼠,用LPA刺激,结果显示,在LPA1和LPA2基因敲除的小鼠平滑肌细胞中,缺失LPA1不能诱导CTGF的表达,而缺失LPA2不影响CTGF的表达。由此表明LPA1介导LPA诱导CTGF表达。研究最终结果显示LPA诱导血管平滑肌细胞基质蛋白CTGF表达细胞内信号通路的调控机制为:LPA通过LPA1激活PKCδ,PKCδ可以同时激活ERK和JNK,ERK激活介导JNK激活。本研究提出了LPA诱导血管平滑肌细胞基质蛋白CTGF的表达及其信号通路调控机制,发现了PKC亚型PKCδ在其中的重要调控作用,该研究可为心血管炎性疾病治疗研究提供新的思路。
黄万杰[4]（2021）在《西地那非激活PPARγ下调TRPC治疗新生鼠肺动脉高压的作用和机制研究》文中研究表明目的:新生儿持续性肺动脉高压（Persistent Pulmonary Hypertension of Newborn,PPHN）是新生儿期最常见的一种严重肺血管疾病,病死率高,临床预后差。目前有关PPHN的治疗是以一氧化氮吸入（i NO）,高频通气以及肺血管扩张剂等综合治疗为主,近年来,西地那非逐渐应用于PPHN治疗并取得一定的效果,但详尽的作用机制尚需进一步研究。本研究旨在建立新生鼠肺动脉高压动物模型和细胞模型的基础上,应用HE染色、免疫荧光、Western blot、PCR、细胞转染等实验手段,探索西地那非除经典作用途径外的可能作用机制。研究方法:第一部分:用10%低氧处理生后48小时新生大鼠建立PPHN模型,利用灌胃给药的方法给予西地那非（25mg/kg.d,日1次）进行干预,14天后检测新生大鼠右室压力（间接反映肺动脉压力）,计算右室肥厚指数（RV/LV+S）,应用HE染色观察肺组织远端肺小动脉重塑情况,利用a-SMA和Ki67免疫荧光染色观察肺组织远端肺小动脉平滑肌细胞的增殖情况。分别应用PKG、PPARγ、TRPC1、TRPC6和a-SMA的免疫荧光双染观察PKG、PPARγ、TRPC1、TRPC6在肺组织的表达情况;应用Western-blot和Real-time PCR检测以上指标在肺组织中的表达。第二部分:1、以HPASMCs为研究对象,建立肺动脉高压体外细胞模型,从细胞水平研究西地那非对PKG、PPARγ、TRPC1、TRPC6等指标的影响,深入研究其分子调控机制。同时利用Ki67和casepase3检测HPASMCs的增殖和凋亡情况;2、同时应用西地那非和PPARγ的药物学抑制剂GW9662干预HPASMCs,检测PKG、PPARγ、TRPC1、TRPC6、Ki67、casepase3的基因和蛋白表达;第三部分:采用小RNA干扰技术沉默PPARγ基因并转染HPASMCs,应用西地那非干预细胞,检测PKG、PPARγ、TRPC1、TRPC6、Ki67、casepase3的基因和蛋白表达。结果:第一部分:1、PPHN组的右心室平均压力明显升高,应用西地那非后右室压力减低,介于PPHN组和对照组之间。2、PPHN组右室肥厚指数（RVHI,RV/LV+S）显着增高,应用西地那非后RVHI明显下降,介于PPHN组和对照组之间。3、HE染色显示PPHN组远端肺小动脉管壁明显增厚,管腔狭窄,应用西地那非后远端肺小动脉管壁增厚及管腔狭窄改善,介于PPHN组和对照组之间。4、a-SMA和Ki67免疫荧光双染显示PPHN组远端肺小动脉平滑肌细胞数量明显增多,14天后细胞仍处于增殖情况;应用西地那非后远端PASMCs数量减少,细胞增殖情况受到抑制。5、PPARγ和a-SMA免疫荧光双染、Western-blot和Real-time PCR显示PPHN组远端肺小动脉平滑肌细胞和肺组织中PPARγ的表达显着下降,应用西地那非后PPARγ的表达出现上调,介于PPHN组和对照组之间。6、TRPC1、TRPC6和a-SMA免疫荧光双染、Western-blot和Real-time PCR显示PPHN组远端肺小动脉平滑肌细胞和肺组织中TRPC1、TRPC6的表达显着升高,应用西地那非后TRPC1、TRPC6的表达出现下降,介于PPHN组和对照组之间。第二部分:1、建立肺动脉高压细胞模型,检测西地那非的最佳药物浓度,发现最佳药物浓度为10m M;利用10m M西地那非处理细胞,Western-blot和Real-time PCR的结果显示PPHN模型组PKG和PPARγ的表达下降,TRPC1和TRPC6的表达上升,西地那非组PKG和PPARγ的表达上调,TRPC1和TRPC6的表达下调,介于PPHN组和对照组之间。2、Western-blot和Real-time PCR的结果显示PPHN模型组Ki67的表达上升,casepese3的表达下降,西地那非组Ki67表达下调,casepase3的表达上调,介于PPHN组和对照组之间。3、引入PPARγ的药物学抑制剂GW9662,检测其最佳药物浓度;同时应用西地那非和GW9662干预细胞,发现应用GW9662后PPARγ的表达下降,同时上调了TRPC1和TRPC6的表达。第三部分:1、小干扰RNA沉默PPARγ基因并转染HPASMCs细胞,PPARγ的蛋白和基因表达均明显下降;2、构建HPASMCs的PPARγ敲减细胞模型后,我们应用低氧条件和西地那非处理细胞。si R-PP组较对照组PPARγ表达下降（P<0.05）,同时加用西地那非的西地那非+Sir-PP组较si R-PP组也并未能将PPARγ的表达上调;此外,si R-PP组TRPC1和TRPC6的表达出现明显升高,西地那非+si R-PP组较si R-PP组未能下调TRPC1和TRPC6的表达。结论:1、口服西地那非可以显着下降低氧所致新生鼠肺动脉高压,并显着改善右心室肥厚,上调PKG、PPARγ表达的同时,下调TRPC1和TRPC6的表达,抑制了远端肺小动脉平滑肌细胞的增殖。2、通过多维度细胞实验（药理学抑制剂和小干扰RNA）表明,西地那非除了经典的NO/c GMP/PKG途径,还能通过PPARγ/TRPC途径,抑制HPASMCs的增殖,为临床PPHN的防治提供实验基础与新的思路。
吴双[5]（2020）在《非小细胞肺癌中LPA受体亚型的靶向作用及其机制研究》文中提出溶血磷脂酸（LPA）作为一种生物活性脂质小分子,通过其6种受体亚型（LPAR1-6）偶联G蛋白介导多种信号通路,参与多种生理病理过程。研究报道LPA在人卵巢癌腹水和人肺癌胸腔积液中大量积累,其中LPA被认为是卵巢癌的生物标记,而我们在研究中发现LPA促进肺肿瘤的发展。因此,本研究将探究参与LPA在非小细胞肺癌中靶向作用的受体亚型,在细胞、组织及个体三个层面上阐明其信号机制,同时对LPA介导的受体亚型能否成为肺癌治疗的小分子靶点做机制性探讨。研究中以非小细胞肺癌A549细胞株作为细胞模型,分别用CCK法、transwell小室、克隆形成实验检测LPA对A549细胞的作用,分别采用药理学和分子生物学方法检测LPA受体亚型在LPA诱导细胞增殖迁移过程中的作用;克隆人LPAR1和LPAR3基因,构建LPAR1/3基因的过表达载体,构建LPAR1基因干扰载体。在此基础上构建LPAR1/3过表达细胞系和LPAR1干扰细胞系,通过荧光定量PCR法检测基因表达水平,用western blot方法检测目的蛋白表达,通过ELISA法测定细胞内c AMP的含量。免疫组化检测分析癌旁组织和肺癌组织中溶血磷脂酸受体的表达并做H-score评分。利用人源肺癌细胞A549的裸鼠异种移植肿瘤模型,评估体内溶血磷脂酸受体的体内致瘤性。在LPA受体转基因细胞模型中阐明LPA诱导作用的信号转导机制。研究发现LPA促进肺癌细胞的增殖、迁移及克隆形成。溶血磷脂酸受体1和3亚型在A549细胞中优先表达;LPAR1/3受体拮抗剂Ki16425和LPAR1受体拮抗剂Ono7300243均能抑制LPA诱导的细胞增殖迁移活性。LPAR1过表达可以促进A549细胞增殖和迁移,而LPAR3在细胞中过表达没有此作用;LPAR1敲低会降低LPA诱导的细胞增殖和迁移活性。在免疫组化实验中观察到肺癌组织的LPAR1表达明显高于癌旁组织。裸鼠异种移植肿瘤模型中LPAR1稳定过表达的A549细胞来源肿瘤块质量和体积均显着高于对照组,同时,LPAR1敲低A549细胞源的异种移植裸鼠肿瘤块质量和体积均显着降低。在裸鼠肿瘤块中,LPAR1和Ki-67在LPAR1过表达细胞源固体肿瘤中显着高表达并且两者之间呈现正相关性。研究结果显示,Gi蛋白抑制剂PTX能显着抑制LPA诱导的A549细胞增殖迁移作用。STS作为PKC的抑制剂也能抑制LPA诱导的A549细胞迁移作用,而H89（PKA的抑制剂）没有明显作用。LPA在LPAR1过表达A549肺癌细胞中激活ERK1/2、JNK和p38的磷酸化。PD98059（ERK1/2的抑制剂）显着抑制LPA诱导的A549细胞增殖作用,SB203580（p38的抑制剂）显着抑制LPA诱导的A549细胞迁移作用,但是,SP600125（JNK的抑制剂）对LPA诱导的A549细胞增殖和迁移过程中几乎没有作用。NF-?B抑制剂BAY11-7082能够同时抑制LPA/LPAR1介导的A549细胞增殖和迁移作用综上所述我们得出以下结论:1.在人肺癌A549细胞中LPAR1和LPAR3优先表达,LPAR1促进LPA诱导的肺癌细胞增殖迁移和克隆形成作用,但LPAR3不参与此过程。LPAR1在肺癌组织中高表达,可作为一种潜在的分子标记物。2.LPAR1在体内具有致瘤性。3.LPAR1促进肺癌A549细胞增殖的信号通路为LPA/LPAR1/Gi/ERK1/2/NF-?B,而其促进迁移的通路为LPA/LPAR1/Gi/PKC/JNK-p38/NF-?B。我们的研究结果表明,LPAR1可能是肺癌的一个潜在治疗靶点,而LPAR1拮抗剂则有望成为肺癌治疗的候选药物。
罗景华[6]（2020）在《分泌型磷脂酶A2阻断剂通过减少肺表面活性剂降解对脂多糖致新生大鼠ARDS肺损伤的保护作用》文中指出背景:急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）是指由心源性以外的各种肺内外致病因素导致的急性、进行性呼吸衰竭。2017年国际上首次制定新生儿ARDS标准（蒙特勒标准）。由于新生儿生物学、病理生理学等特殊性,其发病机制仍不明。我们前期收集2014年1月1日～2017年7月30日925例呼吸窘迫早产儿临床资料,基于新生儿ARDS标准进行分组,发现与新生儿呼吸窘迫综合征（NRDS）相比,ARDS新生儿气管内滴入肺表面活性剂后氧合改善、临床症状好转,但很快病情反复,需要多次肺表面活性剂的使用。我们推测ARDS患儿体内存在使肺表面活性剂快速灭活的成份,阻断此活性成份,可有效改善ARDS患儿临床症状。研究表明分泌型磷脂酶A2（sPLA2）能够改变肺表面活性剂磷脂的组成、降低肺泡稳定性,且为多种炎性介质的限速酶。另外研究显示ARDS时炎症反应的失控与P38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号传导通路及核因子-κB（NF-κB）的激活密切相关。故本研究将通过体内外实验观察分泌型磷脂酶A2阻断剂（Varespladib）对ARDS新生大鼠肺表面活性剂中二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、肺表面活性蛋白A（SP-A）、p38MAPK/NF-κB信号通路关键因子等表达的影响,探讨Varespladib对新生大鼠ARDS肺的保护作用及可能机制。方法:采用腹腔注射LPS构建新生儿ARDS模型,随机分成3组:对照组（38 只）、LPS 组（41 只）、LPS+sPLA2 阻断剂组（Varespladib）（40 只）。HPLC检测肺组织中DPPC含量;电子天平称量肺组织湿重,称重后干燥48h,称量干重,计算肺组织湿/干重比例;HE染色观察病理变化及计算肺组织损伤评分:ELISA检测各组血清中SP-A、IL-1、IL-4、TNF-a、sPLA2及肺泡灌洗液中SP-A表达。RT-PCR、WB检测肺组织中sPLA2、p38 MAPK及NF-κB信号通路关键因子（p38 MAPK、p-p38 MAPK,NF-κB p65、p-NF-κB p65）表达;体外LPS干预肺Ⅱ上皮细胞（A549）,随机分为5组:对照组、LPS组、LPS+Varespladib 组、LPS+Varespladib 组+p38 MAPK 激动剂（Anisomycin）组、LPS+Varespladib 组+NF-κB p65 激动剂（Betulinic acid）。通过 CCK8 检测各组细胞增殖情况,RT-PCR检测p38 MAPK、NF-κB p65mRNA的表达,WB检测p38 MAPK、p-p38MAPK（Thr180+Tyr182）,NF-κB p65,p-NF-κB p65（Ser536）蛋白表达。结果:LPS可减少新生大鼠肺组织中DPPC、SP-A表达及促进IL-1、IL-4、TNF-a、sPLA2等炎性因子的表达导致肺损伤;Varespladib可上调DPPC、SP-A的表达,抑制IL-1、IL-4、TNF-a、sPLA2炎性因子的表达,减轻肺损伤、降低死亡率（P<0.05）;LPS可显着上调新生大鼠肺组织中P38 MAPKmRNA、NF-κB P65mRNA表达和磷酸化蛋白/总蛋白比值（p-p38MAPK/p38MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65）（P<0.05）,促进其磷酸化（P<0.05）。Varespladib 可下调新生大鼠肺组织中P38 MAPK、NF-κB P65mRNA表达和磷酸化蛋白/总蛋白比值（P<0.05）,抑制 P38 MAPK 及 NF-κB P65 磷酸化（P<0.05）。LPS 促进肺 Ⅱ型上皮细胞系（A549）的贴壁生长、促进细胞异常增殖;LPS促进A549细胞中P38 MAPKmRNA、NF-κB P65mRNA和磷酸化蛋白/总蛋白比值增加（P<0.05）,促进其磷酸化（P<0.05）;Varespladib抑制肺Ⅱ型上皮细胞（A549）异常增殖、下调A549细胞中P38 MAPKmRNA、NF-κB P65mRNA和磷酸化蛋白/总蛋白比值（P<0.05）,抑制 P38 MAPK 及 NF-κB P65 磷酸化（P<0.05）。结论:sPLA2阻断剂通过减少肺表面活性物的降解,减少炎性因子的释放对ARDS新生大鼠肺起保护作用;sPLA2阻断剂可能通过阻断P38MAPK/NF-κB p65信号通路减少ARDS新生大鼠肺损伤。
耿嘉男[7]（2020）在《基于人参皂苷Rg3与瑞舒伐他汀不同内皮保护机制的二者联用抗动脉粥样硬化作用研究》文中研究表明动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是导致不稳定冠状动脉综合征和心源性猝死的重要原因之一,流行病学统计结果显示,自2015年以来亚洲众多国家中因脂代谢异常引发AS导致的心血管疾病发病率急剧上升,已成为除传染性疾病外有较高死亡率的疾病。内皮细胞是血管内膜的主要组成细胞,是保护血管的第一道重要屏障,内膜异常是AS典型病理改变,表现为内皮细胞愈合能力降低、抗炎症细胞浸润能力下降以及细胞凋亡等,进而累及血管进一步损伤。人参皂苷Rg3（ginsenoside Rg3,Rg3）是人参的主要活性成分之一,其抗肿瘤和免疫调节等药理作用已经被熟知。随着研究的不断深入,Rg3对心血管系统的保护作用亦被证实,但有关Rg3抗AS作用及相关机制尚未明确。瑞舒伐他汀属他汀类药物,为HMG-Co A还原酶抑制剂,因具有比其他同类药物调节血脂作用更强、半衰期更短以及生物利用度更高等优点而备受青睐,但其抗AS机制及是否与内皮保护作用有关尚需深入研究。本论文基于吉林省科技厅自然科学基金项目:“瑞舒伐他汀对ox-LDL导致内皮细胞内质网应激的干预作用及分子机制研究”（编号:20150101200JC）,探讨瑞舒伐他汀在脂代谢异常引发AS中除降脂外的内皮保护作用及机制,同时对比研究Rg3的内皮保护和抗AS作用及机制。并通过体内实验比较瑞舒伐他汀、Rg3或二者联用对ApoE-/-小鼠AS的保护作用,以期为临床不能耐受全剂量他汀类药物或高肝酶活性患者,联合应用瑞舒伐他汀和Rg3治疗,确保更有效的冠状动脉护理提供理论依据。主要研究如下:1.Rg3对ox-LDL诱导内皮细胞功能异常的作用及机制研究为确定Rg3是否对ox-LDL导致内皮细胞异常有改善作用,建立ox-LDL（200μg/mL）诱导的内皮细胞（HUVECs）损伤模型,Rg3（15、30μmol/L）对HUVECs进行预处理,应用划痕实验、单核细胞黏附实验和Western blotting等方法,研究Rg3对ox-LDL诱导HUVECs功能异常的影响。实验结果显示,Rg3可显着对抗ox-LDL导致的HUVECs愈合能力及抗单核细胞黏附功能下降,减少FAK的磷酸化,抑制黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表达,抑制基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达,表明Rg3可抑制ox-LDL诱导HUVECs功能异常,且与抑制FAK介导的黏附因子表达有关。为阐明Rg3对ox-LDL诱导HUVECs功能异常的作用机制,采用了迁移实验、单核细胞黏附实验、Western blotting、免疫荧光和qPCR等方法和技术,对相关指标进行了检测。实验结果显示,Rg3可显着增强ox-LDL抑制HUVECs的PPARγ表达,抑制损伤的内皮细胞内NF-κB活化后核易位,降低炎症因子MCP-1和IL-6 mRNA水平;给予GW9662（PPARγ特异性抑制剂）对HUVECs进行预处理,可显着抑制Rg3增强HUVECs迁移及抗单核细胞黏附能力的作用,并抑制Rg3下调FAK的磷酸化、黏附因子和基质金属蛋白酶表达、NF-κB活化后核易位以及炎症因子的作用,表明Rg3可能通过上调内皮细胞PPARγ表达发挥抑制ox-LDL诱导HUVECs异常的作用。2.瑞舒伐他汀对ox-LDL诱导内皮细胞凋亡的保护作用及机制研究建立ox-LDL诱导的内皮细胞损伤模型,瑞舒伐他汀（0.01、0.1及1μmol/L）对HUVECs进行预处理,应用试剂盒、MTT、流式细胞术、DAPI染色和Western blotting等技术和方法,探究瑞舒伐他汀的抗AS作用是否与内皮保护及抗内皮凋亡有关。实验结果显示,瑞舒伐他汀可显着增强ox-LDL刺激下HUVECs分泌NO水平降低,降低细胞氧化应激水平,增强HUVECs的PI3K/Akt/eNOS通路活化及Bcl-2/Bax的比率;MTT结果显示,瑞舒伐他汀可抑制ox-LDL诱导的HUVECs生存率下降;流式细胞术检测结果显示,瑞舒伐他汀可显着降低ox-LDL诱导的HUVECs凋亡率升高;DAPI染色结果显示,瑞舒伐他汀可显着抑制ox-LDL诱导的HUVECs细胞核损伤,以上均表明瑞舒伐他汀可以抑制ox-LDL诱导的HUVECs损伤及凋亡。此外,内皮细胞因其含有丰富的内质网,提示其可能对内质网应激异常导致细胞凋亡更为敏感,为阐明瑞舒伐他汀抑制ox-LDL诱导HUVECs凋亡的作用机制,对内质网应激相关通路进行检测,结果显示瑞舒伐他汀显着降低CHOP、sXBP1和Caspase-12mRNA水平,抑制GRP78表达,降低PERK、IRE1α及eIF2α的磷酸化,表明瑞舒伐他汀可能通过抑制内质网应激相关通路来抑制ox-LDL诱导的HUVECs凋亡。3.Rg3与瑞舒伐他汀联合应用对高脂饮食诱导ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化作用研究为比较Rg3与瑞舒伐他汀的抗AS作用,探究Rg3与瑞舒伐他汀联用是否可更有效抑制AS发生及发展,本研究采用高脂饲料（含40%脂肪,1.25%胆固醇）饲养ApoE-/-小鼠成功复制动脉粥样硬化模型后,随机分为4组:模型组、Rg3组（Rg3）、瑞舒伐他汀组（RSV）和Rg3与瑞舒伐他汀联用组（Rg3+RSV）,以C57BL/6J小鼠保持喂养普通饲料作为正常对照。给药4 w后,检测小鼠血清T-CHO、TG、LDL-C、HDL-C及CRP水平,HE染色和油红O染色观察小鼠主动脉AS斑块情况,MASSON染色检测小鼠主动脉胶原含量,免疫荧光染色检测小鼠主动脉内皮细胞凋亡情况,免疫组织化学染色检测主动脉和斑块巨噬细胞及平滑肌细胞含量,进而统计各组小鼠AS斑块核帽比及易损指数。本研究结果表明,与正常对照组比较,模型组小鼠T-CHO、TG、LDL-C以及CRP水平均显着升高,HDL-C水平显着降低;主动脉内膜及内膜下细胞排列紊乱,大量胞质呈空泡状,且主动脉内膜隆起纤维斑块层,动脉壁炎细胞浸润、泡沫化严重;主动脉内皮细胞凋亡显着增多,动脉壁胶原纤维含量显着减少;主动脉及斑块部位巨噬细胞表达显着增多,平滑肌细胞显着减少,小鼠AS斑块核帽比及易损指数显着升高。首先,与模型组比较,Rg3+RSV组及RSV组均显着降低小鼠血清LDL-C水平,显着抑制小鼠主动脉内皮细胞凋亡,且两组水平无显着差异,同时Rg3+RSV组显着降低小鼠血清T-CHO水平,但较正常仍呈较高水平,RSV组小鼠血清TG水平显着下降,提示瑞舒伐他汀可能发挥主要降低小鼠血清脂蛋白及抗内皮细胞凋亡作用;其次,Rg3+RSV组和Rg3组均显着降低AS小鼠血清中CRP水平,两组无显着差异,提示Rg3可能发挥主要降低小鼠炎症水平作用;另外,Rg3+RSV组和RSV组小鼠主动脉的胶原纤维含量较模型均显着增加,Rg3+RSV组和Rg3组巨噬细胞表达较模型组减少更为显着,而Rg3+RSV组α-SMA阳性表达增多显着,使得Rg3+RSV组AS斑块核帽比及易损指数降低更为显着。综上所述,Rg3可增强血管内皮细胞愈合能力及抵御炎症细胞黏附的能力,降低炎症因子和促AS细胞因子水平,可能与调节PPARγ/FAK信号通路有关,且Rg3可降低AS小鼠炎症水平,降低主动脉内膜及AS斑块巨噬细胞浸润,表明其可能通过抑制炎症对内皮损伤发挥抗AS作用;瑞舒伐他汀除改善AS小鼠血脂水平外,具有抑制AS小鼠血管内皮细胞凋亡作用,可能与增强血管内皮细胞PI3K/Akt/eNOS通路活化以及抑制内质网应激相关通路有关;另外,Rg3显示出显着抑制ApoE-/-小鼠的AS发生发展的作用,且Rg3与瑞舒伐他汀联用抗AS效果更为显着,提示当临床应用他汀类药物治疗AS效果不理想或对他汀类药物不耐受时,联合应用Rg3可能更有效发挥治疗AS作用。
段晨阳[8]（2020）在《Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中的作用及机制研究》文中提出线粒体作为细胞有氧呼吸的主要场所,是缺血缺氧后较早发生损害的细胞器之一。以往针对线粒体的治疗措施主要以抗氧化应激、抗凋亡等线粒体功能障碍发生后的效应为靶点,缺乏针对线粒体质量调控过程中关键环节的防治措施,治疗效果有限。近年研究表明,线粒体质量失衡如线粒体过度分裂、融合受损、自噬和代谢紊乱等关键环节异常与缺血缺氧损伤后多器官功能障碍和机体物质能量代谢紊乱的发生密切相关。Drp1作为经典线粒体动力蛋白,主要影响了线粒体质量调节中的线粒体分裂过程。以往研究认为Drp1只有在内质网和线粒体接触（ER-Mito接触）引起线粒体预收缩后才会被招募到线粒体上参与线粒体分裂过程,但招募机制还有待深入研究。并且正常情况下转位到线粒体上参与线粒体分裂的Drp1仅占总Drp1含量的6%,还有大量Drp1存在于胞浆中。那么大量存在的细胞质Drp1具有哪些功能?在被招募到线粒体之前是否已经开始参与线粒体分裂过程?对于ER-Mito接触形成及线粒体预收缩是否有调控作用?对除了线粒体分裂的其他线粒体质量调控环节比如线粒体自噬、线粒体代谢等是否也有影响呢?此外,目前研究认为Drp1被招募到线粒体上后主要是通过其GTPase活性切割线粒体膜介导分裂的,但是Drp1介导线粒体分裂结束后下一步如何发展一直是困扰大家的问题。近年来在多种疾病模型中发现Drp1参与了线粒体和细胞功能调节,但具体调控机制尚不清楚。有研究表明,线粒体mPTP通道过度开放是线粒体膜电位改变、细胞坏死等发生的先决条件,而ROS大量堆积可能是引起上述线粒体和细胞功能障碍的重要诱因。那么缺血缺氧后线粒体Drp1除了介导线粒体分裂外,是否对线粒体外膜mPTP通道开放和ROS的产生及清除也有影响?为此,本研究利用整体失血性休克和细胞糖氧剥夺方法复制急性缺血缺氧损伤模型。首先我们了解了缺血缺氧损伤后多组织器官线粒体质量失衡的特征规律。其次我们探究了Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中的作用及调控机制,重点研究了细胞质Drp1介导ER-Mito接触对线粒体预收缩的启动机制以及线粒体Drp 1对mPTP和ROS等线粒体功能的调控机制。最后,我们观察了使用Drp 1抑制剂Mdivi-1或者Drp 1敲除干预等措施对缺血缺氧损伤后多器官功能的保护作用,为从维持线粒体质量平衡角度调整急性缺血缺氧损伤临床救治方案提供了新思路和新靶点。[研究内容]第一部分:急性缺血缺氧损伤后多组织器官线粒体质量失衡的特征规律研究利用失血性休克SD大鼠模型和糖氧剥夺细胞模型,观察缺血缺氧不同时相点（0.5h、1h、2h、3h、4h）血管组织、肠组织、心肌组织及其对应细胞线粒体形态和数量变化以及ATP产生、ROS含量、线粒体膜电位等线粒体功能变化,以了解急性缺血缺氧损伤多组织器官线粒体质量失衡的特征规律。第二部分:Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中作用及调控机制研究1.急性缺血缺氧损伤后线粒体动力蛋白Drp1表达、分布及修饰变化利用失血性休克SD大鼠模型和糖氧剥夺血管平滑肌细胞（VSMC）模型,观察缺血缺氧不同时相点线粒体动力蛋白表达、分布情况;观察缺血损伤后血管和肠组织Drp1修饰变化。2.Drp1在缺血缺氧损伤后线粒体形态和数量变化中作用及对ER-Mito接触的调控机制（1）Drp1介导线粒体分裂对线粒体形态和数量变化的调控作用利用Drp1干扰/过表达腺病毒转染的VSMC细胞,观察干预线粒体Drp1对正常情况下和缺氧后线粒体形态和数量变化的影响,以明确Drp1介导线粒体分裂对线粒体形态和数量变化的调控作用。（2）细胞质Drp1介导ER-Mito接触对线粒体预收缩的启动机制利用失血性休克SD大鼠和Drp1敲除小鼠（Drp1+/-）模型、糖氧剥夺VSMC细胞模型,观察缺血缺氧不同时相点ER-Mito接触情况;观察干预细胞质Drp1对ER-Mito接触和线粒体预收缩的影响;观察干预Drp1-Shroom4复合体对肌动蛋白束化、ER-Mito接触以及线粒体预收缩的影响,以阐明细胞质Drp1通过Shroom4束化肌动蛋白启动ER-Mito接触形成的机制。（3）细胞质Drp1加速线粒体转位的发生机制利用失血性休克SD大鼠模型和糖氧剥夺VSMC细胞模型,观察缺血不同时相点Calnexin、Fundc1表达及分布情况;观察干预内质网蛋白Calnexin对缺氧早期Drp1和Fundc1的线粒体转位、线粒体预收缩和线粒体分裂的影响,以了解细胞质Drp1在ER-Mito接触位点Calnexin-Fundc1环的招募作用下加速线粒体转位的发生机制。（4）Drp1介导线粒体自噬对破损线粒体的清除机制利用失血性休克Drp1敲除小鼠（Drp1+/-）模型和糖氧剥夺Drp1干扰腺病毒转染的VSMC细胞模型,基因组学分析生理和缺血损伤情况下Drp1可能参与的调控通路;观察干预Drp1对缺血缺氧后线粒体自噬小体和自噬溶酶体形成的影响;观察干预Drp1对自噬相关蛋白表达及分布的影响,以阐明Drp1通过Clec16a-Parkin途径介导线粒体自噬的机制。3.Drp1在缺血缺氧损伤mPTP开放和ROS堆积等线粒体功能变化中作用及调控机制（1）Drp1在缺血缺氧损伤后线粒体mPTP通道开放中的作用及调控机制利用失血性休克SD大鼠、Drp1敲除小鼠（Drp1+/-）模型和糖氧剥夺VSMC细胞模型,观察缺氧不同时相点mPTP开放情况;观察缺血缺氧不同时相点mPTP结构蛋白表达和分布情况;观察干预mPTP结构蛋白HK2表达活性对缺氧后mPTP开放的影响;观察干预线粒体Drp1-LRRK2结合对HK2活性、分布和mPTP开放的影响,以阐明线粒体Drp1对缺血缺氧损伤mPTP过度开放的调控机制。（2）Drp1在缺血缺氧损伤后线粒体ROS堆积中的作用及调控机制利用失血性休克Drp1敲除小鼠（Drp1+/-）模型和糖氧剥夺VSMC细胞模型,观察机体能量代谢变化;代谢组学检测干预Drp1对缺血损伤后线粒体代谢的影响;观察干预Drp1介导谷胱甘肽代谢对线粒体功能的影响,以阐明Drp1通过影响线粒体代谢参与ROS生成和清除的潜在调控通路。第三部分:干预Drp1对急性缺血缺氧损伤重要器官功能保护作用及临床意义研究使用Drp1抑制剂Mdivi-1以及Drp1敲除干预观察缺血缺氧损伤后（1）血管反应性、血管管径变化、血管平滑肌细胞收缩张力以及动态血压维持情况;（2）肝肾血流灌注、肝功、肾功、心输出量、心损和心肌细胞收缩力;（3）肠上皮紧密连接情况、肠道菌群组成及肠屏障功能;（4）血流动力学指标（LVSP、±dp/dt max）、血气指标（Lac、HCO3-、BE、pH等）以及72h存活情况,以阐明干预Drp1对急性缺血缺氧损伤后重要器官功能的保护作用及其临床意义。[研究结果]第一部分:急性缺血缺氧损伤后多组织器官线粒体质量失衡的特征规律研究1.缺血缺氧损伤后血管、肠和心脏组织线粒体形态和数量均发生明显变化,但变化时间、变化程度和变化形式存在差异。血管组织变化起始于缺血缺氧后1h并逐渐加剧。肠组织在缺血缺氧后0.5h即发生明显变化,但后续并没有进一步加重。心脏组织变化不如血管和肠组织明显,缺血缺氧后2h才有稍许增加,并且不同于血管和肠组织线粒体缺血缺氧后表现为线粒体过度分裂和碎片化线粒体数量增多,缺血缺氧损伤对心肌线粒体的影响主要体现在心肌线粒体排布紊乱和内部嵴结构的破坏。2.缺血缺氧损伤后血管、肠和心脏组织线粒体功能均发生明显变化,且缺血缺氧损伤后相同组织线粒体功能变化均晚于线粒体形态和数量的变化。第二部分:Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中作用及调控机制研究1.急性缺血缺氧损伤后线粒体动力蛋白Drp1表达、分布及修饰变化（1）缺血缺氧损伤1h后Drp1发生从细胞质到线粒体转位,且其时相变化规律与线粒体碎片化程度呈正相关,提示Drp1线粒体转位在缺血缺氧早期线粒体过度分裂中发挥了重要作用。进一步发现转位到线粒体上的Drp1主要富集在线粒体预收缩位点,对于线粒体分裂的发生具有重要意义。（2）缺血损伤后Drp1的磷酸化、苏木化、亚硝基化修饰明显增高,泛素化修饰轻度减低。缺血缺氧损伤后活跃的Drp1修饰变化对于线粒体质量调控具有重要意义。2.Drp1在缺血缺氧损伤后线粒体形态和数量变化中作用及对ER-Mito接触的调控机制（1）缺血缺氧后线粒体碎片化的发生是由于Drp1线粒体转位后介导线粒体过度分裂导致的。干扰Drp1后线粒体Drp1减少的同时伴随线粒体碎片数量减少。正常情况下过表达Drp1会导致线粒体过度分裂和线粒体数量的增加。上述结果明确了 Drp1线粒体转位介导线粒体分裂对线粒体形态和数量变化的决定作用。（2）缺血缺氧损伤初期Drp1发生大量线粒体转位之前,过度磷酸化和亚硝基化的细胞质Drp1通过激活细胞骨架调节蛋白Shroom4并与之结合形成Drp1-Shroom4复合体。Drp1-Shroom4复合体如“卡扣”一样将内质网周围散乱分布的F-肌动蛋白束化,增强了内质网与线粒体之间的牵引力和有效接触面积。随后内质网在束化F-肌动蛋白锚定端INF2的牵引下,缠绕在线粒体周围,形成ER-Mito接触并进一步引起线粒体预收缩。（3）缺血缺氧损伤ER-Mito接触引起大量线粒体预收缩后,内质网Calnexin会迁移到ER-Mito接触位点并与细胞质中Fundcl结合形成功能环,加速细胞质Drp1沿内质网轨迹向ER-Mito接触位点的线粒体转位过程。（4）缺血缺氧损伤后活化Drp1可上调线粒体Clec16a表达,一方面抑制了 Parkin的线粒体募集,导致线粒体碎片形成自噬小体受阻;另一方面也加速了自噬小体向自噬溶酶体的转变,促进了缺血缺氧损伤后的自噬流过程。3.Drp1在缺血缺氧损伤mPTP开放和ROS堆积等线粒体功能变化中作用及调控机制（1）缺血缺氧晚期,线粒体收缩位点大量富集的Drp1除了介导线粒体分裂外,还会通过结合mPTP结构蛋白BAX,识别线粒体收缩位点附近的mPTP通道。然后通过招募线粒体LRRK2到线粒体收缩或分裂位点形成Drp1-LRRK2复合体引起mPTP通道结构蛋白HK2失活及其线粒体分离,破坏mPTP通道结构,导致mPTP通道过度开放,线粒体CytC释放增多,影响线粒体功能和细胞功能。（2）缺血缺氧后活化Drp1会造成ROS的过度堆积,进而破坏线粒体功能,引起细胞能量代谢异常。其潜在发生机制包括:（a）活化Drp1通过抑制辅酶Q的生物合成破坏线粒体呼吸链,导致线粒体ROS生成增加;（b）活化Drp1抑制线粒体谷氨酸-谷胱甘肽代谢,导致ROS清除减少;（c）活化Drp1通过阻断神经递质途径（包括酪氨酸-多巴胺代谢和维生素E相关通路）进一步降低ROS清除率。第三部分:干预Drp1对急性缺血缺氧损伤重要器官功能保护作用及临床意义研究1.急性缺血缺氧损伤后合并使用Drp1抑制剂Mdivi-1液体复苏可以明显提高血管反应性及其收缩张力。干预Drp1可以很好地维持缺血缺氧损伤后的动态血压。2.干预Drp1可以改善缺血损伤后肝肾血流灌注和肝肾功能,对于缺血损伤后心肌细胞收缩力也有一定的影响。3.Drp1敲除干预可以通过影响肠道菌群中拟杆菌门的组成、恢复短链脂肪酸（SCFA）的产生,从而保护缺血损伤后的肠屏障功能。4.干预Drp1介导的线粒体质量失衡可以很好地改善缺血缺氧损伤后血流动力学、血气和存活情况。[结论]1.Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中发挥了重要作用。其中“Drp1的过度激活（磷酸化、苏木化、亚硝基化）”和“大量细胞质Drp1的线粒体转位”是急性缺血缺氧后线粒体形态数量和功能发生变化的重要原因。2.缺血缺氧后大量存在的细胞质Drp1在被招募到线粒体之前已经开始参与线粒体分裂过程。具体表现为过度磷酸化和亚硝基化的细胞质Drp1通过Shroom4束化肌动蛋白,增强内质网和线粒体之间牵引力,启动大量ER-Mito接触并引起大量线粒体预收缩,为后续细胞质Drp1转位到线粒体收缩位点介导线粒体过度分裂奠定了结构基础。3.缺血缺氧后细胞质Drp1加速线粒体转位是由于ER-Mito接触位点Calnexin-Fundcl功能环大量形成,促进了细胞质Drp1沿内质网向ER-Mito接触位点的大量迁移。4.缺血缺氧晚期Drp1介导线粒体分裂结束后下一步会进一步影响线粒体功能。线粒体Drp1一方面在线粒体收缩或分裂位点通过识别并破坏线粒体mPTP通道结构引起mPTP过度开放,CytC释放增加;另一方面还可通过多种线粒体代谢途径影响ROS的清除和生成,导致ROS过度堆积,最终加重了缺血缺氧后线粒体和细胞功能损伤。5.急性缺血缺氧损伤后使用Drp1抑制剂Mdivi-1液体复苏或者Drp1敲除干预可以保护血管收缩张力、改善肝肾血流灌注以及肠屏障功能,弥补了常规林格液体复苏“虽然可以快速扩容但难以长时间维持血压”的缺陷,对于延长急性缺血缺氧损伤患者的临床救治时间、提高患者救治率和存活率具有重要临床意义。
单锴[9]（2020）在《二十二碳六烯酸及其氧化产物抑制前列腺癌的机制研究》文中研究表明ω3多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids,PUFA）是一种必需脂肪酸,其与ω6 PUFA的均衡摄入是健康的保证。然而西方化的饮食导致国民ω3 PUFA的膳食摄入相对于ω6 PUFA显着不足。这种失衡与多种疾病的发生高度相关其中包括肿瘤。由于前列腺癌“慢性癌症的特点”,营养支持和膳食干预不论是对于其预防、转归还是预后都有着尤为重要的意义。流行病学和本实验室前期研究均提示:ω3 PUFA能显着抑制前列腺炎症,抑制前列腺肿瘤的生长,减缓前列腺癌发展并提高小鼠成活率,而ω6 PUFA却是相反的效果。并且在ω3 PUFA中,二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid,DHA）对于人前列腺癌的抑制效应较强。这提示,以DHA为代表的ω3 PUFA在前列腺癌的预防和治疗领域有重要应用价值。尽管已经有一些研究报道了DHA抗炎和抗肿瘤的作用,但是相关机制研究的还很不足,本课题通过体内外研究发现,DHA对于前列腺癌的抑制作用依赖于其氧化代谢过程,并至少通过两个机制:1)DHA经脂氧化酶（Lipoxygenase,LOX）氧化产生的D型消退素（Resolvin D,RvD）1和2可以调控组织微环境中巨噬细胞极化继而抑制炎症和肿瘤细胞的生长;2)DHA通过脂氧化酶依赖及非依赖途径产生的过氧化产物在胞内积累可直接导致肿瘤细胞发生铁死亡。论文的主要研究结果如下:（1）发现DHA和RvD通过调控PKA通路调节巨噬细胞极化并抑制炎症和肿瘤:首先在Pten-/-前列腺癌小鼠中发现膳食DHA在抑制小鼠前列腺癌的同时,抑制了前列腺局部M2样巨噬细胞的浸润。之后通过体外实验发现无论是生理浓度的DHA（1-10μM）还是其氧化物RvD（1-100 nM）都不能直接抑制前列腺癌细胞的体外增殖而在癌细胞-巨噬细胞共培养系统中,DHA和RvD却能显着抑制癌细胞增殖。通过培养基转移实验证实,RvD1和RvD2的抗肿瘤作用是通过抑制TAM极化,抑制TAM表达血管内皮生长因子和表皮生长因子等促肿瘤因子介导的。同时,在人THP-1细胞和小鼠骨髓来源巨噬细胞中,RvD1和RvD2还通过抑制脂多糖-干扰素γ引起的M1极化,抑制肿瘤坏死因子-α等M1型细胞因子表达;促进白细胞介素-4介导的M2a极化,促进IL-10等M2a型细胞因子表达而发挥抗炎作用。最后通过筛选RvD受体下游G蛋白偶联受体Gα信号通路,我们发现蛋白激酶A（Protein Kinase A,PKA）的活化在TAM,M1和M2a巨噬细胞中是显着不同的,而PKA抑制剂能有效阻断RvD对各种巨噬细胞极化的调控的作用。（2）发现游离DHA能够显着提高细胞内氧化应激水平,其脂质过氧化产物介导铁死亡:在多种肿瘤细胞中,我们发现生理浓度的PUFA（10μM）本身没有细胞毒性而通过Erastin、RSL3或谷氨酸诱导其过氧化产物积累则可以明显介导细胞死亡,并且这一作用与添加的PUFA的不饱和度呈正相关。DHA作为体内常见的不饱和度最高的PUFA具有最强的促铁死亡效应。在PC3细胞移植瘤小鼠中,ω3 PUFA饮食更可以显着加强基于铁死亡的肿瘤杀伤,延长动物生命。在体外通过脂质组学和基因沉默GPR120、酰基CoA合成酶长链家族成员（Acyl-CoA Synthetase Long Chain Family Member,ACSL）和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶（Lysophosphatidylcholine Acyltransferase,LPCAT）发现外源性DHA可以以胞内游离脂肪酸形式发生过氧化。使用抑制剂,基因沉默和基因过表达的方式从正反两个方面可以证实DHA的过氧化弄够同时由LOX依赖的（ALOX5和ALOX15）和LOX非依赖的途径介导。（3）发现DHA参与的铁死亡过程中,RIPK1-SQSTM1/p62-GSDMD是一重要致死信号通路:通过抑制剂筛选发现靶向受体相互作用丝氨酸/苏氨酸激酶1（Receptor interacting serine/threonine kinase 1,RIPK1）的多种小分子抑制剂均可以在肿瘤细胞中抑制DHA参与的铁死亡。Western blot显示RIPK1的S166磷酸化水平在DHA参与的铁死亡过程中也是上调的。使用Co-IP方法鉴定到RIPK1与Sequestosome-1（SQSTM1/p62）蛋白在DHA参与的铁死亡中存在显着的物理结合,而在此过程中SQSTM1/p62的269位苏氨酸和272位丝氨酸显着磷酸化。使用多种RIPK1抑制剂,或对RIPK1的激酶活性通过突变方式失活则能显着抑制SQSTM1/p62的磷酸化与细胞死亡。通过蛋白质谱我们发现RIPK1与SQSTM1/p62与Gasdermin D（GSDMD）在DHA参与的铁死亡中存在结合。通过抑制剂和基因沉默实验我们进一步发现RIPK1与SQSTM1/p62调控了Caspase-4和-5依赖的GSDMD活化,促使GSDMD N片段的产生,最终导致细胞死亡。综上所述,本研究从肿瘤微环境中两个关键成分——肿瘤细胞和TAM角度探讨了DHA及其氧化产物拮抗前列腺癌的机制,为理解ω3 PUFA调控肿瘤及慢性炎症做了一定的理论补充,也对将来其关键代谢产物的临床应用提供一定的指导意义。ω3 PUFA是一种必需脂肪酸,本研究也为炎症和肿瘤相关疾病的预防和治疗给出了膳食指导。
曹铮[10]（2020）在《G蛋白偶联受体介导的蛋白激酶C激活及其下游信号通路机制研究》文中研究表明20世纪80年代,蛋白激酶C（PKC）因其作为一种二酰甘油敏感的酶,同时也是强效促肿瘤因子佛波酯的“受体”而引起人们的广泛关注。PKC的发现解决了科学界长达25年的疑问,即促进脂质水解的激动剂是怎样去改变细胞生理活动的。PKC属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,其活性的控制是通过自抑制假底物的可逆释放来实现的。G蛋白偶联受体（GPCRs）在激动剂的作用下,可以将胞外信号传递至胞内,引发一系列生理活动,其中尤为重要的一个方面就是可以通过PKC激活胞外信号调节激酶（ERK1/2）,从而调节细胞分化、有丝分裂、增殖等,甚至是一些异常的生理过程,如肿瘤的发生等。因此,进行GPCRs介导的蛋白激酶C激活机制及其下游信号通路机制的探究尤为重要。首先,本文的研究用生物信息学的方法在刺参（Apostichopus japonicus）基因组数据信息中挖掘得到Kisspeptin及其受体的相关基因,并进行功能性鉴定和研究分析。编码AjKiss前体的基因可以翻译得到一条长为180个氨基酸的前体肽,可以进一步水解产生两条成熟的C末端酰胺化多肽,即AjKiss1a（32个氨基酸）和AjKiss1b（18个氨基酸）。另外,两个AjKiss受体（AjKissR1和AjKissR2）的cDNA序列信息在A.japonicus的基因组中被找到并在卵巢组织中被克隆得到。功能性实验分析结果表明,AjKissR1和AjKissR2均能很好地表达和定位在HEK293T细胞的细胞膜上,并在AjKiss1a和AjKiss1b的作用下可以快速动员胞内钙离子,但呈现一定的配体选择性（AjKiss1a倾向作用于AjKissR2,AjKiss1b倾向作用于AjKissR1）。此外,AjKissR1/2在AjKiss1a/b的作用下,都能发生明显内吞,以及介导Gαq-PLC依赖的信号通路途径。进一步的研究发现,AjKiss1b的C末端核心10肽片段,即AjKiss1b-10,均能激活AjKissR1/2,引起受体内吞发生,以及Gαq-PLC依赖的Ca2+信号通路和ERK1/2信号通路的激活。在AjKiss1b-10的作用下,AjKissR1和AjKissR2均能通过Gαq-PLC-Ca2+/PKC信号通路激活ERK1/2,另外,AjKissR1还能够偶联Gαi/o并通过Gβγ依赖的方式激活PKCε,进而对ERK1/2的激活做出贡献。其次,本文的研究在先前工作（家蚕CAPAPVK受体相关研究）的基础上首次发现了可变剪接产生的天然剪接变体BomCAPAPVK-R1△341是CAPA-PK的特异性受体。BomCAPAPVK-R1基因由七个外显子组成,其中第七个外显子的丢失致使C末端截短的剪接变体△341的产生。C末端的截短不仅影响了△341的膜定位,同时也影响了GRKs依赖的受体内吞发生。之前我们关于R1的研究表明,和常见的GPCRs剪接变体类似,△341可以作为负调节蛋白对野生型受体R1的膜定位和功能等方面产生影响,但其本身并不能被CAPA-PVKs激活。而在本研究中,我们惊喜地发现△341能被另一相近家族神经肽CAPA-PK特异性激活。进一步的功能性实验分析结果表明,不同于Gαq偶联的野生型受体R1,△341是通过偶联Gαi/o来介导腺苷酸环化酶的抑制和胞内cAMP的下调,以及通过Gβγ-PI3K-PKCζ信号通路来介导ERK1/2的磷酸化。综上所述,本文的研究发现首次揭示了Kisspeptin神经肽信号系统在非脊索动物物种中的存在和功能,并探究了其可能介导信号通路机制,为下丘脑神经分泌系统的古老起源提供了有力证据,也为无脊椎动物神经肽相关的研究提供了重要的参考。而对天然剪接变体△341的研究则为在家蚕中区分CAPA-PK和CAPA-PVK神经肽信号系统的作用提供了有力的证据,进一步说明了单个GPCR基因能够产生多种结构和功能上更为独特的蛋白亚型,明确了之前未被承认的GPCRs剪接变体的重要地位,为更好地理解GPCRs剪接变体在生理和病理研究中的重要意义提供了有力证据。
二、蛋白激酶C激动剂和抑制剂对溶血磷脂酰胆碱引起脑微血管平滑肌细胞增殖的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、蛋白激酶C激动剂和抑制剂对溶血磷脂酰胆碱引起脑微血管平滑肌细胞增殖的影响（论文提纲范文）
（1）七氟烷和异氟烷通过PI3K-C2α/Rho激酶调节血管平滑肌收缩（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 七氟烷和异氟烷通过PI3K-C2α/Rho激酶调节大鼠主动脉血管平滑肌收缩 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 七氟烷和异氟烷通过PI3K/Rho激酶调节糖尿病大鼠主动脉血管平滑肌收缩 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第三部分 七氟烷通过PI3K-C2α/Rho激酶调节大网膜动脉血管平滑肌收缩 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 综述 吸入性麻醉药调控血管平滑肌张力的细胞机制 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
（2）HOXC6对大鼠血管平滑肌细胞增殖、迁移和血管内皮细胞凋亡的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 同源框C6影响细胞增殖、迁移与凋亡的机制及其在心血管疾病的研究进展 |
| 引言 |
| 1.HOXC6与细胞生长相关分子和(或)信号通路 |
| 2.HOXC6与细胞凋亡相关分子和(或)信号通路 |
| 3.HOXC6与非编码RNA |
| 4.HOXC6影响细胞增殖、迁移及凋亡的其它机制 |
| 5.HOXC6在心血管疾病研究进展 |
| 6.总结及展望 |
| 7.本论文立题依据和研究目的意义 |
| 8.本研究技术路线 |
| 第二章 粥样硬化主动脉异常表达的同源框基因及Hoxc6促进大鼠血管平滑肌细胞增殖和迁移 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 组织、细胞和主要实验试剂 |
| 2.1.3 siRNA和引物序列信息 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 建AS大鼠模型和采集组织标本 |
| 2.2.2 大鼠主动脉组织苏木素和伊红(hematoxylin and eosin, H&E)染色 |
| 2.2.3 大鼠主动脉组织免疫化学染色 |
| 2.2.4 细胞实验分组与细胞培养及鉴定 |
| 2.2.5 siRNA转染细胞 |
| 2.2.6 反转录实时定量聚合酶链式反应(real time quantitative reverse transcription olymerase chain reaction, qRT-PCR) |
| 2.2.7 蛋白质免疫印迹(Western blot) |
| 2.2.8 Cell counting kit-8(CCK-8)实验 |
| 2.2.9 5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine, EdU)细胞增殖检测方法 |
| 2.2.10 细胞划痕实验 |
| 2.2.11 Transwell实验 |
| 2.2.12 统计学方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 大鼠主动脉组织H&E染色结果 |
| 3.2 AS大鼠主动脉壁异常表达的Hox基因 |
| 3.3 Hoxc6 mRNA和蛋白在正常大鼠主动脉和心脏的差异表达 |
| 3.4 Hoxc6、p53及PCNA在 AS大鼠主动脉壁的异常表达 |
| 3.4.1 Hoxc6、p53及PCNA mRNAs在AS大鼠主动脉壁的异常表达 |
| 3.4.2 Hoxc6、p53及PCNA蛋白在AS大鼠主动脉壁的异常表达 |
| 3.5 大鼠血管平滑肌细胞免疫荧光鉴定结果 |
| 3.6 Hoxc6 siRNAs抑制RVSMCs中 Hoxc6表达的效率 |
| 3.7 下调Hoxc6表达抑制RVSMCs增殖 |
| 3.8 下调Hoxc6表达抑制RVSMCs迁移 |
| 3.9 下调Hoxc6表达对RVSMCs中p53和PCNA蛋白表达的影响 |
| 3.10 p53 siRNA抑制RVSMCs中p53的表达 |
| 3.11 下调p53 表达部分逆转Hoxc6 siRNA抑制RVSMCs增殖的作用 |
| 3.12 下调p53 表达部分逆转Hoxc6 siRNA抑制RVSMCs迁移的作用 |
| 3.13 Hoxc6与p53 siRNAs对 Hoxc6、p53和PCNA蛋白表达的影响 |
| 4.讨论 |
| 4.1 39个Hox基因中的17个在AS大鼠主动脉壁异常表达 |
| 4.2 Hoxc6在AS大鼠主动脉壁高表达可能与VSMCs增殖活性增高有关 |
| 4.3 Hoxc6可能与ox-LDL协同促进RVSMCs增殖及迁移 |
| 4.4 Hoxc6促进RVSMCs增殖、迁移的效应可能与Hoxc6负调控p53表达有关 |
| 5.小结 |
| 第三章 HOXC6促进血管内皮细胞凋亡 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 细胞及主要实验试剂 |
| 2.1.3 siRNA和引物序列信息 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 H&E染色 |
| 2.2.2 免疫组织化学染色 |
| 2.2.3 总RNA提取和qRT-PCR |
| 2.2.4 Western blot |
| 2.2.5 细胞实验分组和细胞培养、鉴定及细胞转染 |
| 2.2.6 原位末端转移酶标记技术(Td T-mediated dUTP Nick-End Labeling, TUNEL)检测细胞凋亡 |
| 2.2.7 流式细胞技术检测细胞凋亡 |
| 2.2.8 统计学方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 H&E染色验证AS大鼠建模成功 |
| 3.2 Hoxc6、Bcl-2和Bax蛋白在大鼠主动脉壁的原位表达 |
| 3.3 大鼠主动脉内皮细胞的鉴定 |
| 3.4 鼠Hoxc6 siRNAs对 RAECs中 Hoxc6表达的抑制作用 |
| 3.5 下调Hoxc6 表达抑制RAECs凋亡 |
| 3.6 下调RAECs中 Hoxc6表达影响凋亡相关蛋白的表达 |
| 3.7 人脐静脉内皮细胞的鉴定 |
| 3.8 人HOXC6 siRNAs对HUVECs中HOXC6表达的抑制作用 |
| 3.9 下调HOXC6表达抑制HUVECs凋亡 |
| 3.10 下调HOXC6表达影响HUVECs中凋亡相关蛋白的表达 |
| 3.11 过表达HOXC6促进HUVECs凋亡 |
| 3.12 过表达 HOXC6影响HUVECs中凋亡相关蛋白的表达 |
| 4.讨论 |
| 4.1 Hoxc6在AS大鼠主动脉壁表达升高可能与VECs异常凋亡有关 |
| 4.2 HOXC6可促进体外培养的VECs凋亡 |
| 5.小结 |
| 第四章 HOXC6 经 PLCβ/PKCζ/NFκ-Bp65/IL-18途径促进人脐静脉内皮细胞凋亡 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 qPCR引物序列信息 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验分组和细胞培养及细胞转染 |
| 2.2.2 总RNA提取和qRT-PCR |
| 2.2.3 总蛋白提取和细胞膜蛋白及胞浆蛋白提取 |
| 2.2.4 Western blot |
| 2.2.5 TUNEL检测细胞凋亡 |
| 2.2.6 流式细胞技术检测细胞凋亡 |
| 2.2.7 统计学方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 下调HOXC6表达抑制PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18通路活性 |
| 3.1.1 下调HOXC6表达抑制PLCβmRNA表达 |
| 3.1.2 下调HOXC6表达抑制PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18通路活性 |
| 3.2 过表达HOXC6促进PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18通路活性 |
| 3.2.1 过表达 HOXC6促进PLCβmRNA表达 |
| 3.2.2 过表达HOXC6激活PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18通路 |
| 3.3 溶血磷脂酰胆碱逆转下调HOXC6表达而抑制 PKCζ/NF-κBp65/IL-18通路活性的效应 |
| 3.4 LPC逆转下调HOXC6表达而抑制HUVECs凋亡的效应 |
| 3.5 LPC逆转下调HOXC6表达所致凋亡相关蛋白的表达变化 |
| 4.讨论 |
| 4.1 VECs异常凋亡是AS发生的始动环节 |
| 4.2 HOXC6经PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18途径促进HUVECs凋亡 |
| 5.小结 |
| 第五章 HOXC6靶向血小板活化因子受体经PLCβ/PKCζ/NFκ-Bp65/IL-18途径促进人脐静脉内皮细胞凋亡 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 qPCR引物序列信息 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验分组和细胞培养及细胞转染 |
| 2.2.2 总RNA提取和qRT-PCR |
| 2.2.3 总蛋白提取和BCA测蛋白浓度 |
| 2.2.4 Western blot |
| 2.2.5 TUNEL检测细胞凋亡 |
| 2.2.6 流式细胞技术检测细胞凋亡 |
| 2.2.7 生物信息学分析 |
| 2.2.8 双荧光素酶报告基因实验 |
| 2.2.9 染色质免疫共沉淀(ChIP)实验 |
| 2.2.10 统计学方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 对3个CHD相关数据集进行生物信息学分析的结果 |
| 3.2 敲低HOXC6基因抑制PTAFR表达 |
| 3.3 过表达HOXC6促进PTAFR表达 |
| 3.4 血小板活化因子逆转下调HOXC6表达而抑制HUVECs凋亡的效应 |
| 3.5 PAF逆转敲低HOXC6而抑制PTAFR表达及PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18通路活性的效应 |
| 3.6 过表达HOXC6促进HOXC6与PTAFR启动子结合 |
| 3.7 ChIP-qPCR验证HOXC6蛋白与PTAFR启动子特定位点序列结合 |
| 3.7.1 10%total Input染色质DNA样品片段化效果的验证 |
| 3.7.2 ChIP-qPCR标准曲线 |
| 3.7.3 ChIP-qPCR扩增产物的特异性及片段大小的验证 |
| 3.7.4 HOXC6 蛋白与PTAFR启动子特定位点结合 |
| 3.7.5 过表达HOXC6促进HOXC6蛋白与PTAFR-promoter扩增位点结合 |
| 4.讨论 |
| 4.1 HOXC6可能靶向PTAFR经 PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18信号通路促进VECs凋亡 |
| 4.2 HOXC6与PTAFR启动子特定位点序列结合而促进PTAFR/PLCβ/PKCζ/NF-κBp65/IL-18轴活性 |
| 5.小结 |
| 结论、创新点及展望 |
| 1.结论 |
| 2.创新点 |
| 3.展望 |
| 4.研究不足之处 |
| 致谢 |
| 主要参考文献 |
| 附录 |
| 附录 Ⅰ:发表论文 |
| 附录 Ⅱ:参加科研项目 |
（3）LPA通过PKCδ介导ERK和JNK途径诱导血管平滑肌细胞基质蛋白CTGF的表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 动脉粥硬化及其致病机制 |
| 1.2 溶血磷脂酸 |
| 1.3 结缔组织生长因子 |
| 1.4 蛋白激酶C |
| 1.5 丝裂原活化蛋白激酶 |
| 1.6 研究目的与立题依据 |
| 第2章 LPA通过PKC介导MAPK通路诱导血管平滑肌细胞基质蛋白CTGF的表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 血管平滑肌细胞鉴定 |
| 2.3.2 LPA对血管平滑肌细胞中CTGF表达的影响 |
| 2.3.3 PKC和 MAPK通路在LPA诱导血管平滑肌细胞中CTGF表达的作用 |
| 2.3.4 PKC介导MAPK通路调控LPA诱导平滑肌细胞中CTGF表达 |
| 2.3.5 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 LPA通过PKCδ介导ERK和 JNK途径诱导血管平滑肌细胞基质蛋白CTGF的表达 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 LPA通过PKCδ介导诱导血管平滑肌细胞基质蛋白CTGF表达 |
| 3.3.2 LPA_1是LPA诱导CTGF表达的主要受体 |
| 3.3.3 LPA诱导平滑肌细胞基质蛋白CTGF表达的信号通路调控机制 |
| 3.3.4 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论与创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（4）西地那非激活PPARγ下调TRPC治疗新生鼠肺动脉高压的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:PPHN大鼠模型中PKG、PPARγ、TRPC1、TRPC6的基因及蛋白的动态表达变化 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:西地那非通过PPARγ/TRPC途径对人肺动脉平滑肌细胞的影响 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:西地那非通过PPARγ对肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡调控的机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 PPARγ在心肺血管系统中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（5）非小细胞肺癌中LPA受体亚型的靶向作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略说明 |
| 第一章 溶血磷脂酸受体1及其相关疾病的研究进展(文献综述) |
| 1.1 LPAR1的生物学特征 |
| 1.1.1 LPAR1的发现与染色体定位 |
| 1.1.2 LPAR1的基因表达特征与结构 |
| 1.1.3 LPAR1介导的下游信号转导通路 |
| 1.2 LPAR1的生理病理效应 |
| 1.2.1 LPAR1的生理学作用 |
| 1.2.2 LPAR1与肿瘤 |
| 1.2.3 LPAR1与神经系统疾病 |
| 1.2.4 LPAR1与心血管疾病 |
| 1.2.5 LPAR1与纤维化 |
| 1.2.6 LPAR1与代谢紊乱 |
| 1.3 展望 |
| 第二章 LPARs在非小细胞肺癌中的作用及其机理研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要仪器设备 |
| 2.2.2 主要试剂耗材 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞增殖 |
| 2.3.2 细胞迁移 |
| 2.3.3 克隆形成 |
| 2.3.4 Real Time PCR(RT-PCR)检测 |
| 2.3.5 LPAR1和LPAR3 过表达载体构建 |
| 2.3.6 LPAR1干扰载体构建 |
| 2.3.7 LPAR1稳转细胞系构建 |
| 2.3.8 LPAR1受体活性检测 |
| 2.3.9 肿瘤异种移植裸鼠模型 |
| 2.3.10 标本HE染色和免疫组化实验 |
| 2.3.11 Western Blot |
| 2.3.12 基于TCGA数据库LPAR1 转录组数据下载与分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 LPA促进肺癌细胞增殖、迁移、克隆形成 |
| 2.4.2 Ki16425和ono7300243 抑制LPA诱导的A549 细胞增殖、迁移 |
| 2.4.3 构建LPAR1和LPAR3 转基因细胞系 |
| 2.4.4 LPA促进LPAR1 转基因细胞增殖、迁移、克隆形成 |
| 2.4.5 沉默LPAR1抑制细胞增殖和迁移 |
| 2.4.6 LPA激活LPAR1 促进体内肿瘤的发生和发展 |
| 2.4.7 LPAR1在肺癌组织中高表达 |
| 2.4.8 LPA促进丝裂原活化蛋白激酶磷酸化 |
| 2.4.9 LPA通过LPAR1 介导A549 细胞迁移增殖信号通路 |
| 2.4.10 基于TCGA数据库的LPAR1 表达分析 |
| 2.5 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（6）分泌型磷脂酶A2阻断剂通过减少肺表面活性剂降解对脂多糖致新生大鼠ARDS肺损伤的保护作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分: 外源性肺表面活性剂在新生儿ARDS中的疗效观察 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分: 分泌型磷脂酶A2阻断剂对新生大鼠ARDS肺损伤作用的体内实验研究 |
| 1 实验材料及方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分: 分泌型磷脂酶A2阻断剂在新生大鼠ARDS肺损伤中保护作用的体外实验 |
| 1 实验材料及方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 分泌型磷脂酶A2及其在ARDS中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 中英文缩写简要 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（7）基于人参皂苷Rg3与瑞舒伐他汀不同内皮保护机制的二者联用抗动脉粥样硬化作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.氧化型低密度脂蛋白与动脉粥样硬化 |
| 1.1 氧化型低密度脂蛋白与动脉粥样硬化关系 |
| 1.2 氧化型低密度脂蛋白对血管内皮细胞的影响 |
| 1.2.1 氧化型低密度脂蛋白与内皮功能异常 |
| 1.2.2 氧化型低密度脂蛋白促内质网应激与内皮细胞凋亡 |
| 1.3 氧化型低密度脂蛋白对血管炎症细胞的影响 |
| 1.4 氧化型低密度脂蛋白对血管平滑肌细胞的影响 |
| 2.抗动脉粥样硬化药物研究进展 |
| 2.1 他汀类药物在抗动脉粥样硬化治疗中的应用 |
| 2.2 人参皂苷Rg3抗动脉粥样硬化作用研究进展 |
| 2.3 药物联合应用治疗动脉粥样硬化 |
| 第二章 人参皂苷Rg3对ox-LDL诱导内皮功能异常的作用及机制研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 药品及试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要溶液及配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 HUVECs的培养、传代和冻存 |
| 2.2 THP-1的培养、传代和冻存 |
| 2.3 Ox-LDL损伤HUVECs最佳浓度的确定 |
| 2.4 Rg3对HUVECs生存率的影响 |
| 2.5 Rg3对ox-LDL损伤HUVECs生存率的作用 |
| 2.6 划痕实验 |
| 2.7 THP-1细胞黏附实验 |
| 2.8 Transwell实验 |
| 2.9 免疫荧光检测 |
| 2.10 qPCR检测炎症因子表达的影响 |
| 2.11 Western Blot |
| 2.12 统计学处理 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 Ox-LDL损伤HUVECs最佳浓度 |
| 3.2 Rg3对HUVECs生存率的影响 |
| 3.3 Rg3对ox-LDL降低HUVECs细胞生存率的作用 |
| 3.4 Rg3对ox-LDL损伤HUVECs愈合能力的改善作用 |
| 3.5 Rg3对ox-LDL诱导THP-1对HUVECs黏附的抑制作用 |
| 3.6 Rg3对ox-LDL诱导HUVECs黏附分子ICAM-1、VCAM-1表达的影响 |
| 3.7 Rg3对ox-LDL诱导HUVECs FAK磷酸化的影响 |
| 3.8 Rg3对ox-LDL诱导HUVECs内MMP-2及MMP-9表达的影响 |
| 3.9 Rg3对ox-LDL抑制HUVECs PPARγ表达的影响 |
| 3.10 GW9662抑制PPARγ表达的浓度确定 |
| 3.11 GW9662和Rg3对ox-LDL抑制HUVECs PPARγ表达的作用 |
| 3.12 GW9662和Rg3对ox-LDL导致HUVECs迁移抑制、THP-1黏附及相关信号通路的作用 |
| 4.小结 |
| 第三章 瑞舒伐他汀对ox-LDL诱导内皮细胞凋亡的保护作用及机制研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 药品及试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要溶液配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 瑞舒伐他汀对HUVECs生存率的影响 |
| 2.2 瑞舒伐他汀对ox-LDL损伤HUVECs生存率的作用 |
| 2.3 试剂盒检测NO和氧化应激水平 |
| 2.4 Annexin V/PI双染检测细胞凋亡 |
| 2.5 DAPI染色 |
| 2.6 qPCR检测 |
| 2.7 Western Blot |
| 2.8 统计学处理 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 瑞舒伐他汀对HUVECs生存率的影响 |
| 3.2 瑞舒伐他汀对ox-LDL导致HUVECs损伤的改善作用 |
| 3.3 瑞舒伐他汀对ox-LDL抑制HUVECs NO分泌的影响 |
| 3.4 瑞舒伐他汀对ox-LDL诱导HUVECs氧化应激的影响 |
| 3.5 瑞舒伐他汀对ox-LDL抑制HUVECse NOS磷酸化的影响 |
| 3.6 瑞舒伐他汀对ox-LDL抑制HUVECs PI3K/Akt磷酸化的影响 |
| 3.7 瑞舒伐他汀对各组细胞Bcl-2/Bax表达的影响 |
| 3.8 瑞舒伐他汀对ox-LDL诱导HUVECs凋亡的影响 |
| 3.9 瑞舒伐他汀对各组HUVECs内CHOP、sXBP1及Caspase-12 mRNA水平的影响 |
| 3.10 瑞舒伐他汀对ox-LDL诱导的HUVECs内质网应激的影响 |
| 4.小结 |
| 第四章 人参皂苷Rg3与瑞舒伐他汀联合应用对高脂饮食诱导的ApoE~(-/-)小鼠动脉粥样硬化作用研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 药品及试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 主要溶液配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 动物的饲养 |
| 2.3 动脉粥样硬化模型复制及给药 |
| 2.4 血脂四项指标检测 |
| 2.5 Elisa试剂盒检测小鼠血清CRP水平 |
| 2.6 小鼠主动脉分离及主动脉大体油红O染色 |
| 2.7 HE及MASSON染色 |
| 2.8 免疫组织化学及免疫荧光染色 |
| 2.9 统计学处理 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 药物对AS小鼠体重及一般状态的影响 |
| 3.2 药物对AS斑块水平对影响 |
| 3.3 药物对AS小鼠血清脂蛋白水平的影响 |
| 3.4 药物对AS小鼠血清CRP水平的影响 |
| 3.5 药物对AS小鼠主动脉内皮细胞凋亡的影响 |
| 3.6 药物对AS小鼠主动脉纤维斑块层及胶原纤维水平的影响 |
| 3.7 药物对AS小鼠主动脉CD68及α-SMA表达的影响 |
| 4.小结 |
| 第五章 讨论 |
| 1.体外实验研究 |
| 1.1 Rg3对ox-LDL诱导内皮功能异常的作用及机制研究 |
| 1.2 瑞舒伐他汀对ox-LDL诱导内皮细胞凋亡的保护作用及机制研究 |
| 2.体内实验研究 |
| 2.1 Rg3与瑞舒伐他汀联用对AS小鼠血清脂蛋白水平的影响 |
| 2.2 Rg3与瑞舒伐他汀联用对AS小鼠血清CRP水平的影响 |
| 2.3 Rg3与瑞舒伐他汀联用对ApoE~(-/-)小鼠AS病理改变的影响 |
| 结论及创新点 |
| 工作展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得科研成果 |
| 致谢 |
（8）Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 急性缺血缺氧损伤后多组织器官线粒体质量失衡的特征规律研究 |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中的作用及调控机制研究 |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 干预Drp1对急性缺血缺氧损伤重要器官功能保护作用及临床意义研究 |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 Drp1在缺血缺氧损伤中的作用及机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 创伤休克血管低反应性研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（9）二十二碳六烯酸及其氧化产物抑制前列腺癌的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 多不饱和脂肪酸的氧化 |
| 1.1.1 PUFA与类二十/二十二烷酸代谢 |
| 1.1.2 PUFA与脂质过氧化 |
| 1.2 类二十/二十二烷酸与巨噬细胞炎症 |
| 1.3 铁死亡 |
| 1.3.1 脂质过氧化与铁死亡 |
| 1.3.2 铁死亡相关信号通路 |
| 1.4 立题意义与研究内容 |
| 1.4.1 立题意义 |
| 1.4.2 主要研究内容 |
| 第二章 膳食ω3多不饱和脂肪酸对小鼠前列腺癌的作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与设备 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 细胞系与动物 |
| 2.2.3 主要仪器和设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 小鼠组织石蜡切片的制作 |
| 2.3.2 Western Blot |
| 2.3.3 数据统计与分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 膳食ω3PUFA对小鼠前列腺癌的作用 |
| 2.4.2 膳食ω3 PUFA前列腺癌组织中的M2 巨噬细胞浸润的作用 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 D型消退素对巨噬细胞极化的作用 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.2.1 试剂 |
| 3.2.2 细胞系与动物 |
| 3.2.3 细胞培养用液 |
| 3.2.4 主要仪器和设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 液质联用分析 |
| 3.3.2 巨噬细胞极化 |
| 3.3.3 MTT细胞计数实验 |
| 3.3.4 流式细胞术 |
| 3.3.5 RNA提取与q PCR |
| 3.3.6 数据统计与分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 组织中存在Rv D及 Rv D所需的代谢酶类 |
| 3.4.2 DHA和 Rv D借助巨噬细胞抑制前列腺癌细胞增殖 |
| 3.4.3 RvD作用于肿瘤相关巨噬细胞抑制前列腺癌细胞增殖 |
| 3.4.4 Rv D对 TAM极化的作用 |
| 3.4.5 RvD对M2a极化的作用 |
| 3.4.6 RvD对M1极化的作用 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 Rv D对巨噬细胞PKA通路的调节作用 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与设备 |
| 4.2.1 试剂 |
| 4.2.2 主要仪器和设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 RNA提取与q PCR |
| 4.3.2 数据统计与分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 RvD受体在不同极化状态的巨噬细胞的表达 |
| 4.4.2 不同极化状态的巨噬细胞中Rv D对 PKA通路的调控 |
| 4.4.3 PKA通路对巨噬细胞极化的作用 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 二十二碳六烯酸对细胞铁死亡的作用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料与设备 |
| 5.2.1 试剂 |
| 5.2.2 细胞系与动物 |
| 5.2.3 培养基 |
| 5.2.4 主要仪器和设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 液质联用分析 |
| 5.3.2 气质联用分析 |
| 5.3.3 小干扰RNA的转染 |
| 5.3.4 流式细胞术检测胞内ROS与 LPO |
| 5.3.5 流式细胞术检测凋亡指标 |
| 5.3.6 经典生化反应 |
| 5.3.7 裸鼠成瘤实验 |
| 5.3.8 免疫荧光 |
| 5.3.9 数据统计与分析 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 人体组织与培养的细胞中脂肪酸的含量 |
| 5.4.2 不同的脂肪酸对铁死亡诱导剂介导的细胞死亡的作用 |
| 5.4.3 不同饱和度脂肪酸对FIN相关细胞死亡的调控 |
| 5.4.4 DHA对 FIN介导的细胞死亡对非肿瘤细胞的效应 |
| 5.4.5 DHA与 FIN介导的细胞死亡方式 |
| 5.4.6 DHA对铁死亡特异性的ROS积累的作用 |
| 5.4.7 铁死亡过程中胞内多层次的氧化作用 |
| 5.4.8 DHA对体内铁死亡依赖的肿瘤治疗作用 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 DHA在胞内发生脂质过氧化的机制 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验材料与设备 |
| 6.2.1 试剂 |
| 6.2.2 主要仪器和设备 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 薄层层析 |
| 6.3.2 ALOX5代谢产物检测与脂质组学 |
| 6.3.3 RT-PCR方法检测ACSL与 LPCAT的表达 |
| 6.3.4 质粒的转染 |
| 6.3.5 数据统计与分析 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 DHA的添加对细胞脂质组成的影响 |
| 6.4.2 DHA的作用不依赖于其受体GPR120 |
| 6.4.3 游离DHA对铁死亡的作用 |
| 6.4.4 铁死亡的ROS与 LPO的积累 |
| 6.4.5 COX与 LOX途径在DHA参与的铁死亡中的作用 |
| 6.5 本章小结 |
| 第七章 RIPK1对DHA参与的铁死亡的作用 |
| 7.1 前言 |
| 7.2 实验材料与设备 |
| 7.2.1 试剂 |
| 7.3 实验方法 |
| 7.3.1 质粒的转染 |
| 7.3.2 免疫共沉淀 |
| 7.3.3 数据统计与分析 |
| 7.4 结果与讨论 |
| 7.4.1 DHA介导的铁死亡特征 |
| 7.4.2 RIPK1抑制剂对铁死亡的作用 |
| 7.4.3 铁死亡中RIPK1的磷酸化 |
| 7.4.4 RIPK1各个位点的功能 |
| 7.4.5 RIPK1的激酶活性对铁死亡的作用 |
| 7.4.6 RIPK1没有形成经典的坏死复合体 |
| 7.4.7 SQSTM1/p62与RIPK1 的结合 |
| 7.5 本章小结 |
| 第八章 RIPK1-SQSTM1/p62-GSDMD对 DHA参与的铁死亡的作用 |
| 8.1 前言 |
| 8.2 实验材料与设备 |
| 8.2.1 试剂 |
| 8.2.2 主要仪器和设备 |
| 8.3 实验方法 |
| 8.3.1 蛋白质谱鉴定 |
| 8.3.2 数据统计与分析 |
| 8.4 结果与讨论 |
| 8.4.1 DHA参与的铁死亡中SQSTM1/p62 的磷酸化 |
| 8.4.2 DHA参与的铁死亡中SQSTM1/p62 的胞内聚集 |
| 8.4.3 SQSTM1/p62对DHA参与的铁死亡的作用 |
| 8.4.4 RIPK1对SQSTM1/p62 的磷酸化的调控 |
| 8.4.5 自噬在铁死亡中的作用 |
| 8.4.6 GSDMD与 RIPK1和SQSTM1/p62 的相互作用 |
| 8.4.7 GSDMD对铁死亡的作用 |
| 8.4.8 RIPK1与SQSTM1/p62对GSDMD活化的调控 |
| 8.4.9 CASP5在铁死亡中的作用 |
| 8.4.10 RIPK1对CASP5 活化的调控 |
| 8.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
| 附录Ⅱ:Co-IP方法鉴定的与SQSTM1/p62或RIPK1 结合的蛋白质 |
（10）G蛋白偶联受体介导的蛋白激酶C激活及其下游信号通路机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 GPCRs的激活和调节 |
| 1.3 GPCRs介导的Ca~(2+)和PKC信号通路 |
| 1.4 PKC的发现 |
| 1.4.1 蛋白激酶C的结构域组成 |
| 1.4.2 PKC的成熟 |
| 1.4.3 PKC的可逆活化 |
| 1.4.4 PKC的下调 |
| 1.4.5 PKC的下游底物 |
| 1.5 GPCRs诱导的ERK激活:依赖PKC和不依赖PKC的通路 |
| 参考文献 |
| 第二章 PKC-EGFP转位系统的构建与测试 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 PKC-GFP质粒改造 |
| 2.3.2 更多PKC亚型的克隆与载体的构建 |
| 2.3.3 PKC-EGFP活细胞成像检测 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 刺参Kisspeptins受体通过PKC介导的ERK1/2 信号通路活化机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 刺参(A.japonicus)Kisspeptin系统 |
| 3.3.2 Apoja KpRs及其配体的功能性鉴定 |
| 3.3.3 Apoja KpRs配体结合力差异鉴定 |
| 3.3.4 Apoja KpRs偶联Gαq介导下游信号通路 |
| 3.3.5 AjKiss1b-10 激活Apoja KpRs并介导下游信号通路 |
| 3.3.6 AjKiss1b-10 激活Apoja KpRs介导ERK1/2 磷酸化机制不同 |
| 3.3.7 AjKiss1b-10 激活Apoja KpRs并介导PKC活化 |
| 3.3.8 Apoja Kisspeptin系统和脊椎动物Kisspeptin系统的交互作用 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 家蚕神经肽CAPA-PVK受体可变剪接体介导的ERK1/2 磷酸化机制研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 Bom CAPA-PVK-R1 天然剪接突变体△341 的产生 |
| 4.3.2 剪接突变体△341 在细胞中的表达 |
| 4.3.3 △341 能够被CAPA-PK激活 |
| 4.3.4 剪接突变体△341 偶联Gαi/o介导下游信号通路 |
| 4.3.5 剪接突变体△341 通过Gβγ介导下游ERK1/2 信号通路 |
| 4.3.6 剪接突变体△341 通过PKCζ介导下游ERK1/2 信号通路 |
| 4.3.7 剪接突变体△341 通过PI3K介导下游ERK1/2 信号通路 |
| 4.3.8 缺少C末端,剪接突变体△341 激动剂引起的内吞受损 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 全文总结 |
| 5.1 主要研究成果 |
| 5.2 本文创新点 |
| 5.3 本文的后续研究及展望 |
| 作者简介 |
四、蛋白激酶C激动剂和抑制剂对溶血磷脂酰胆碱引起脑微血管平滑肌细胞增殖的影响（论文参考文献）
- [1]七氟烷和异氟烷通过PI3K-C2α/Rho激酶调节血管平滑肌收缩[D]. 杨绍忠. 山东大学, 2021(11)
- [2]HOXC6对大鼠血管平滑肌细胞增殖、迁移和血管内皮细胞凋亡的影响[D]. 龙向淑. 贵州大学, 2021(01)
- [3]LPA通过PKCδ介导ERK和JNK途径诱导血管平滑肌细胞基质蛋白CTGF的表达[D]. 杜佳欣. 吉林大学, 2021(01)
- [4]西地那非激活PPARγ下调TRPC治疗新生鼠肺动脉高压的作用和机制研究[D]. 黄万杰. 中国医科大学, 2021(02)
- [5]非小细胞肺癌中LPA受体亚型的靶向作用及其机制研究[D]. 吴双. 内蒙古大学, 2020(04)
- [6]分泌型磷脂酶A2阻断剂通过减少肺表面活性剂降解对脂多糖致新生大鼠ARDS肺损伤的保护作用[D]. 罗景华. 南方医科大学, 2020(06)
- [7]基于人参皂苷Rg3与瑞舒伐他汀不同内皮保护机制的二者联用抗动脉粥样硬化作用研究[D]. 耿嘉男. 吉林大学, 2020(01)
- [8]Drp1在急性缺血缺氧损伤致线粒体质量失衡中的作用及机制研究[D]. 段晨阳. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [9]二十二碳六烯酸及其氧化产物抑制前列腺癌的机制研究[D]. 单锴. 江南大学, 2020(01)
- [10]G蛋白偶联受体介导的蛋白激酶C激活及其下游信号通路机制研究[D]. 曹铮. 浙江大学, 2020(08)