一、HCV RNA含量与肝脏组织病理学损伤之间的关系（论文文献综述）
施国明,黄晓勇,任正刚,陈漪,程蕾蕾,杜世锁,方艺,葛宁灵,李爱民,李苏,李晓牧,卢倩,陆品相,孙建方,王汉萍,魏来,徐立,杨国欢,曾昭冲,张岚,张力,赵海涛,赵灵,赵明,周爱萍,刘荣乐,刘新会,伍家鸣,张莹,樊嘉,周俭,中华医学会肿瘤学分会肝癌学组[1]（2021）在《肝癌免疫检查点抑制剂相关不良反应管理中国专家共识（2021版）》文中认为免疫检查点抑制剂（ICIs）的临床应用显着改善肝细胞癌（简称肝癌）病人预后。随着ICIs在肝癌中的广泛应用, 免疫相关不良反应（irAE）越来越受到重视。肝癌复杂的疾病特征和多手段结合的治疗模式对irAE管理提出挑战。因此, 《肝癌免疫检查点抑制剂相关不良反应管理中国专家共识（2021版）》编审委员会组织多学科专家共同讨论并制订该共识。该共识聚焦肝癌irAE管理相关问题, 提出建议, 旨在提高临床医师规范、安全用药的能力, 从而使病人从免疫治疗中得到最大获益。
张世龙[2]（2021）在《杜仲桃叶珊瑚苷对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究》文中提出目的:明确杜仲桃叶珊瑚苷（AU）对大鼠肝脏缺血再灌注损伤（HIRI）的保护效应;并通过体内、体外实验对其保护机制进行深入探讨。方法:1.明确杜仲AU是否通过抗炎、抗氧化发挥对HIRI的保护效应。40只雄性SD大鼠（SPF级）随机分为5组,每组8只。分别设假手术组（Sham）,杜仲AU低剂量组（AU-L）、中剂量组（AU-M）、高剂量组（AU-H）及缺血再灌注损伤组（IRI）。其中AU-L、AU-M和AU-H组分别予AU 1、5、10mg/kg·d腹腔注射,Sham、IRI组予相同体积生理盐水腹腔注射。连续预处理10d后,除Sham组外,其余各组均建立HIRI模型（70%肝脏缺血1h,再灌注6h）。收集大鼠血清及再灌注肝组织进行相关指标检测。肝脏HE染色观察再灌注肝组织病理损伤情况;全自动生化分析仪检测血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）水平,以了解肝功能损伤情况;ELISA法检测血清中高迁移率族蛋白B1（HMGB1）、肿瘤坏死因子-a（TNF-a）及白细胞介素-1b（IL-1b）的含量,了解促炎细胞因子释放情况;硫代巴比妥酸法、黄嘌呤氧化酶法及荧光探针技术分别检测再灌注肝组织中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）及活性氧（ROS）生成情况,了解氧化应激水平。2.探讨杜仲AU对HIRI的保护机制。（1）杜仲AU对HIRI无菌炎症反应的影响。（1）体内实验,在整体水平上明确杜仲AU是否通过下调HMGB1的表达和/或主动分泌,影响TLR-4/NF-k B信号通路,抑制HIRI无菌炎症反应。取HIRI保护效应最优的AU组及Sham、IRI组的再灌注肝组织进行以下指标检测:实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹（WB）法分别检测HMGB1、Toll样受体4（TLR-4）及高度糖基化终产物受体（RAGE）的m RNA及蛋白水平,了解HMGB1、TLR-4及RAGE的表达情况;WB检测干扰素调节因子1（IRF-1）、免疫沉淀（IP）联合WB检测乙酰化HMGB1（Ac-HMGB1）,了解HMGB1主动分泌情况;WB检测髓样分化因子88（My D88）、核因子k B-p65（p65）、磷酸化p65（P-p65）、核因子k B抑制蛋白a（Ik B-a）、磷酸化Ik B-a（P-Ik B-a）、肝组织细胞核内p65蛋白、IL-1b及TNFa等的蛋白水平,了解杜仲AU对NF-k B炎症反应通路的影响。（2）体外实验,在细胞水平进一步明确杜仲AU对TLR-4/NF-k B通路的影响。选取人正常肝细胞株HL-7702（LO2）,构建TLR-4过表达LO2稳转细胞株。分为正常LO2组（NC）、空质粒转染组（EPT）、TLR-4过表达组（OE）、TLR-4过表达+杜仲AU组（AU）和TLR-4过表达+TLR-4受体抑制剂TAK-242组（TAK）。将各组细胞接种于6孔板,AU组和TAK组用含不同浓度AU或TAK-242的完全培养基培养48h,余下三组用普通完全培养基培养48h,收集细胞悬液。CCK-8检测杜仲AU和TAK-242对LO2细胞活力的影响;WB检测各组TLR-4、My D88、P-p65和P-Ik B-a蛋白水平,探讨杜仲AU对TLR-4/NF-k B信号通路相关蛋白的影响。（2）体内实验初步探讨杜仲AU对HIRI所致细胞凋亡的影响。取HIRI保护效应最优AU组及Sham、IRI组的再灌注肝组织进行以下指标检测:TUNEL法观察细胞凋亡现象;WB检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α（PGC-1α）、解偶联蛋白2（UCP2）、caspase3和cleaved caspase3的蛋白水平,以初步了解杜仲AU对线粒体损伤介导细胞凋亡途径的影响。结果:1.不同剂量杜仲AU对大鼠HIRI的保护效应:AU-M组病理学评分较IRI组明显降低（P<0.05）,AU-L和AU-H组病理学评分较IRI组无明显差异（P>0.05）;与IRI组相比,三种剂量杜仲AU均能下调血清中ALT、AST、TNF-a、IL-1b和HMGB1水平,减少肝组织中ROS、MDA生成,增加肝组织SOD的表达,差异均具统计学意义（P<0.05）;其中AU-M组ALT、AST、HMGB1、TNF-a、IL-1b、MDA、ROS降低及SOD升高最为显着（P<0.05）。2.杜仲AU减轻HIRI分子机制:（1）杜仲AU对无菌炎症反应的影响:（1）体内实验,相较于IRI组,AU-M组肝组织中HMGB1、TLR-4和RAGE的m RNA及蛋白水平显着降低（P<0.05）;IRF-1和Ac-HMGB1,My D88、p65、P-p65、P-Ik B-a和入核p65,以及IL-1b、TNF-a的蛋白水平均明显降低（P<0.05）;Ik B-a蛋白水平明显升高（P<0.05）。（2）体外实验,与EPT组相比,NC组的TLR-4水平无明显变化（P>0.05）,而OE组的TLR-4水平明显升高（P<0.05）;杜仲AU（8μM）和TAK-242（4μM）预处理均能够明显减少肝细胞内TLR-4、My D88、P-p65和P-IκB-α的蛋白水平（P<0.05）,且两组之间除TLR-4水平存在差异（P<0.05）,其余指标均无显着差异（P>0.05）。（2）杜仲AU对HIRI所致细胞凋亡的影响:TUNEL染色结果显示:与Sham组相比,IRI组标记凋亡细胞的荧光明显增强,荧光区域明显增大;而AUM组的荧光较IRI组明显减弱,荧光区域也明显减小。AU-M组肝组织细胞中caspase3和cleaved caspase3蛋白水平较IRI组明显降低,而PGC-1α和UCP2蛋白水平明显升高（P<0.05）。结论:1.杜仲AU（1、5、10mg/kg·d）均可通过抗炎、抗氧化作用发挥对大鼠HIRI的保护效应,以5mg/kg·d AU保护效应最佳。2.杜仲AU可通过下调HMGB1表达及减少HMGB1主动分泌,进而抑制TLR-4/NF-k B信号通路,减轻HIRI无菌炎症反应,发挥对HIRI的保护效应。3.杜仲AU还可能通过抑制线粒体损伤介导的细胞凋亡途径,发挥对HIRI的保护效应。
侯丽爽[3]（2021）在《芝麻活性成分调控FXR/SHP/LXR信号改善肝纤维化进程的机制研究》文中研究指明目的:肝纤维化一种结缔组织异常增生的病理过程,伴随胶原蛋白大量合成及细胞外基质（extracellular matrix,ECM）过度沉积。诱因主要包括酒精、药物、代谢紊乱、病毒感染、免疫性肝炎和胆汁淤积等。在世界范围内,肝纤维化引起的肝硬化和肝癌,是肝病发病率和死亡率的主要原因。肝病的发病率逐年增加,使我国成为肝病大国,严重损害人民健康,加重社会负担。目前的疗法,包含药物及纤维源性标记物等技术。但需要结合大量临床评估,才能确保其有效性。化学合成药物在改善病毒性肝炎方面已有临床报道,但对纤维结缔组织的增生,仍缺乏针对性。中药组分或有效成分,在抗肝纤维化方面展现明显优势。课题组发现天然植物芝麻,具有抗炎抗氧化药理活性,推测可能对肝病有改善作用。为此,选择其主要活性成分芝麻素和芝麻酚,验证对肝纤维化的改善作用。由于芝麻素和芝麻酚在抗肝纤维化中的作用机制仍然不明确,制约了新药的开发与应用。因此,本研究开展了芝麻素和芝麻酚在体内外抗肝纤维化的研究,解析抗肝纤维化的机制,为肝纤维化的临床治疗提供药理学参考,并为新药的研发提供理论基础。芝麻素（sesamin,SES）和芝麻酚（sesamol,DER）是一种天然的木酚素类化合物,具有抗炎、抗氧化等多种药理活性。但对肝纤维化的干预效果还不明确。因此,本课题主要研究SES和DER改善肝纤维化的相关机制。具体为:SES如何调节法尼醇X受体（farnesoid X receptor,FXR）和小异二聚体伴侣（short heterodimer partner,SHP）,在体内外干预炎症及肝纤维化;DER介导FXR/肝X受体（liver X receptor,LXR）信号调控硫代乙酰胺（thioacetamide,TAA）或雷帕霉素（rapamycin,RA）诱导的肝损伤、炎症、自噬及肝纤维化的机制研究;DER抑制大鼠肝星状细胞（hepatic stellate cells-T6,HSC-T6）的活化,调控FXR/LXR信号串扰,参与THP-1巨噬细胞及人肝星状细胞（LX-2）的交互,抑制肝星状细胞活化。方法:（1）在SES改善TAA诱导的肝纤维化模型中,采用C57BL/6小鼠,分为6组:正常组、TAA组、TAA和SES（20 mg/kg）组、TAA和SES（40mg/kg）组、TAA和Curcumin（Cur）（20 mg/kg）组以及单独的SES组。除正常组和单独SES组,其他组小鼠腹膜内注射TAA连续5周,第1周每周3次100 mg/kg,第2至5周每周两次200 mg/kg。此外,在给药组中,从第二周开始连续28天,以口服灌胃法对小鼠进行SES或Cur治疗。同时,正常组和TAA组施用等量生理盐水4周。在实验结束后,首先检测血清生化指标谷草转氨酶（AST）及谷丙转氨酶（ALT）水平。使用天狼星红染色（Sirius Red）,三色胶原染色（Masson）及苏木精-伊红染色法（H&E）,检查肝脏组织病理学变化。通过免疫组织化学染色、免疫荧光染色,检测相应抗体的表达。最后,采用蛋白印记与实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（Quantitative Reverse Transcription PCR,q RTPCR）结合的方式,检测纤维化及炎症的水平。在体外,先用TGF-β激活HSCs2h,然后给予SES（3.125,6.25,12.5μM）,FXR的激动剂GW4064（2μM）或FXR的抑制剂Gugglusterone（50μM）处理2h。通过免疫荧光,蛋白印记,q RT-PCR等方法,检测FXR,SHP,α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）,核苷酸结合域-（NOD-）样受体蛋白3（nucleotide-binding domain-（NOD-）like receptor protein 3,NLRP3）,白介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）,白介素-1α（interleukin-1α,IL-1α）等蛋白的表达情况。采用特异性基因阻断FXR（si FXR）和SHP（si SHP）转染HSCs,通过蛋白印记和q RT-PCR检测相关蛋白的表达。（2）在DER改善TAA诱发肝纤维化模型中,采用C57BL/6小鼠,随机分为6组:正常组、TAA组、TAA和DER（10 mg/kg）组、TAA和DER（20 mg/kg）组、TAA和Cur（20 mg/kg）组,及单独的DER（20 mg/kg）组。TAA给药方式同SES。在给药组中,从第二周开始连续28天,以口服灌胃法对小鼠进行DER（10、20 mg/kg）治疗。同时,正常组、TAA组小鼠,给予等量生理盐水4周。在自噬诱导肝纤维化的模型中,将鼠随机分为5组:正常组、TAA组、TAA和DER（20 mg/kg）组、TAA和RA（2 mg/kg）组、TAA和3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）（10 mg/kg）组。TAA组的给药方式同SES。从第2至5周,除正常组和TAA组,另外二组每周3次腹腔注射RA或3-MA。实验结束后,检测血清生化指标及组织病理学变化。采用蛋白印记与荧光定量逆转录聚合酶链反应（Reverse Transcription PCR,RT-PCR）、q RT-PCR的方法,测定纤维化指标和炎症因子的表达。体外模型,先用TGF-β激活HSCs,然后给予DER（3.125,6.25,12.5μM）进行处理,检测FXR,LXRα/β,微管相关蛋白轻链3α/β（Microtubule-associated protein light chain 3α/β,MAPLC3α/β）和泛素结合蛋白自噬受体（Sequestosome 1,SQSTM1/P62）等相关蛋白的表达。利用转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）激活HSCs后,联合RA和3-MA,给予DER作用后,检测了相关蛋白的表达。另外,用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）（0-100 ng/ml）刺激THP-1细胞,收集上清液LPS条件培养基,联合RA激活LX-2细胞。给予DER或3-MA孵育后,检测自噬蛋白及炎症蛋白的表达。用FXR激动剂GW4064,LXR激动剂GW3965及DER处理LX-2细胞,通过RT-PCR及细胞荧光,检测自噬蛋白,α-SMA及炎症相关的蛋白表达。结果:（1）SES显着降低了的ALT、AST水平,改善了TAA导致的组织病理学变化。明显抑制了α-SMA、I型胶原（type I collagen,collagen-I）、金属蛋白酶-1的组织抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1）/基质金属蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13,MMP13）等纤维化相关标志蛋白及炎症细胞因子的浸润,并上调了FXR、SHP的表达。体外结果显示,SES能明显抑制由TGF-β刺激引起的纤维化标志蛋白的表达。通过蛋白印记,q RT-PCR,细胞免疫荧光方法,证实了SES对NLRP3、caspase-1和IL-1β等炎症因子的调控作用。SES和FXR的激动剂GW4064都能明显提高FXR、SHP的表达,下调α-SMA、IL-1α和IL-6的表达。（2）DER显着降低了TAA引起的血清生化指标ALT、AST水平,改善了组织病理学变化,明显抑制了纤维化标志蛋白及自噬蛋白的表达。DER还下调了炎症细胞因子含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase-1,caspase-1）和IL-6等的表达并抑制NLRP3炎性小体的激活。DER与自噬抑制剂3-MA具有相同的功效,显着下调了ALT、AST水平,改善了TAA或RA导致的组织病理学变化。体外结果显示,DER明显抑制了由TGF-β刺激引起的HSCs中纤维化标志蛋白及炎症细胞因子的表达。DER处理后,逆转了TGF-β激活HSCs引起的FXR和LXRα/β蛋白表达的下调。使用TGF-β和RA联合刺激HSCs,DER和3-MA功能相似,抑制了自噬蛋白和炎症细胞因子的释放。收集LPS刺激THP-1细胞的上清液孵育LX-2细胞,DER和3-MA抑制了自噬蛋白、α-SMA和炎症细胞因子的表达。DER通过基因阻断自噬相关蛋白（autophagy Related Protein 7,ATG7）（si ATG7）同样抑制了LPS条件培养基引起LX-2细胞的活化。此外,DER同GW4064或GW3965功能相似,上调了LX-2细胞中FXR和LXR的表达,抑制了自噬蛋白及NLRP3炎症小体的活化。基因沉默FXR（si FXR）和LXR（si LXR）后,DER或3-MA同样抑制了LX-2细胞的活化。结论:（1）SES通过介导FXR/SHP信号通路,抑制了NLRP3炎症小体的活化及炎症细胞因子的表达,减少ECM的沉积及HSCs的活化。通过基因沉默FXR及SHP,验证了FXR和SHP的相互调控作用,并且,SES充当FXR的激动剂,激活FXR及SHP的表达。此外,SES保护肝脏免受TAA毒性的影响,防止胶原蛋白的累积,减少炎症因子对肝脏的损害及组织病理学的变化,改善了肝纤维化。（2）DER通过靶向FXR/LXR信号,参与LX-2细胞和THP-1细胞的交互,抑制LX-2细胞的自噬反应、减少NLRP3炎症小体的活化、caspase-1的裂解及炎症细胞因子IL-1β的产生。DER的作用同3-MA,抑制了HSCs的激活及自噬,降低了TAA引起的纤维化标志蛋白的表达,改善组织病理学的变化,减少NLRP3及炎症因子的浸润,抑制了肝纤维化的发展。此外,DER同3-MA都能抑制肝脏自噬反应,缓解RA引起的自噬对肝脏的损害,减少肝脏炎症及组织病理的改变,发挥肝保护的作用。总之,本研究证实了天然的木酚素类化合物SES和DER,参与FXR/SHP/LXR信号交互,具有改善肝纤维化和抑制炎症的良好功效,防止TAA及自噬对肝脏造成的损伤。DER通过调控巨噬细胞与HSCs细胞间的串扰,发挥改善肝纤维化的作用。SES和DER可作为改善肝纤维化的理想调节剂,并具备天然药物独特的生物活性优势。未来,我们在SES和DER的药代动力学,生物利用度及安全性评价等方面,将会做更多的应用及研究,为临床开发安全、有效、创新的抗肝纤维化药物,奠定良好的理论基础。
宋远[4]（2021）在《穿心莲内酯对酒精性肝损伤保护作用的研究》文中认为背景酒精性肝损伤是由于酒精所致肝细胞功能受损的动态病理过程,随着其病理变化过程的加重,酒精性肝损伤可逐渐形成酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝硬化,甚至肝细胞癌等酒精性肝病,进而导致较为严重的临床结局。目前,酒精性肝损伤发生发展过程的分子机制尚不完全清楚,也无明确的治疗靶点。从流行病学角度看,由过量饮酒所致酒精性肝病的患病率存在明显的地域差异,目前尚无全国性统计数据,如有研究报道辽宁省部分城市酒精性肝病的患病率为6.10%,高于浙江省的4.34%。目前临床上治疗酒精性肝损伤的药物主要包括:糖皮质激素、抗氧化剂、营养补充剂、中药以及天然活性成分、抗体类药物等,药物治疗费用不一,且疗效报道也存在争议。目前明确酒精性肝损伤的病理进程和分子机制以及探索有效的治疗药物仍是需要解决的问题。穿心莲内酯是临床常用的具有抗炎、抗病毒、免疫调节等功效的中药成分,近年来的研究报道,穿心莲内酯还可能具有保肝利胆、保护心脑血管等作用,提示药物作用可能存在某些新功效值得开发,可以产生“老药新用”的生物学效应。作者通过前期课题研究基础以及临床观察发现,穿心莲内酯可能对肝脏酶学指标的改善具有较好的效果,但其具体的作用靶点尚未被明确阐述。因此,本研究首先利用文献计量学描述穿心莲内酯与肝损伤的研究现状,同时收集并分析了某三甲医院应用穿心莲内酯的病例现状,研究探讨穿心莲内酯在临床中的应用情况;其次,本研究构建了酒精性肝损伤细胞模型和动物模型,从体外和体内两个层面对酒精性肝损伤发生发展的过程和具体的发病机制进行了实验研究,利用穿心莲内酯进行干预,探讨其对酒精性肝损伤的保护作用,从而为阐明酒精性肝损伤的发病机制和探寻新的临床治疗药物提供理论依据和实验数据。目的:（1）通过文献计量学以及分析某三甲医院应用穿心莲内酯成品药物开展临床治疗的病例情况,明确穿心莲内酯的研究热点和临床适应症以及可能的药理作用机制,为深入探寻穿心莲内酯药物在酒精性肝损伤中的应用提供研究路径。（2）分别构建酒精性肝损伤细胞模型和动物模型,应用穿心莲内酯进行干预,探讨穿心莲内酯对酒精性肝损伤保护作用的可能机制。方法:（1）以CNKI、GNBR,Drugbank,Hetionet数据库为数据来源,检索主题词为“穿心莲内酯”和“肝损伤”或“Andrographolide”和“Liver Injury”,检索时间范围为2000年1月1日-2020年12月31日,文献类型为期刊文献,提取其中的发表年份、引证关系及关键词等信息,通过自行编制的计算机代码进行可视化分析。（2）回顾性分析吉林省某三甲医院2015年1月至2019年12月期间住院治疗,且在院期间应用穿心莲内酯注射液的患者,通过方差分析、卡方检验、秩和检验等方法比较分析患者入院和出院时的血常规、肝功、肾功、血糖、血脂和血离子水平的变化情况。（3）选择健康成年雄性C57BL/6J小鼠,麻醉后,用75%酒精全身消毒放入超净工作台中,解剖小鼠,取出肝脏,制备小鼠原代肝细胞悬液并进行培养。经酒精染毒,同时应用低、中、高剂量（0.05、0.1、0.2mmol/L）穿心莲内酯进行干预,采用ELISA法检测细胞培养液中炎症相关因子的含量,q RT-PCR和Western Blot方法检测细胞内炎症相关信号通路基因和蛋白的表达变化情况。（4）选择8周龄雄性C57BL/6J小鼠,体重16-20g,随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组、穿心莲内酯低、中、高剂量组,共六组,每组15只。空白对照组小鼠给予生理盐水灌胃,模型组小鼠给予市售高度白酒灌胃12w,阳性对照组小鼠给予高度白酒灌胃,同时给予水飞蓟宾灌胃,剂量为0.1g/kg·BW·d-1,穿心莲内酯低、中、高剂量组除给予高度白酒灌胃,同时分别给予穿心莲内酯0.05、0.1、0.2g/kg·BW·d-1灌胃。成模后,检测各组小鼠血清转氨酶、肝脏组织脂质代谢、抗氧化等各项生化指标的变化情况,同时利用q RT-PCR、Western Blot等方法检测小鼠肝组织中炎症相关信号通路基因和蛋白的表达情况。结果:（1）本研究利用文献计量学方法,以“穿心莲内酯”和“肝损伤”或“Andrographolide”和“Liver Injury”为主题词,搜集2000年以来,发表在CNKI、GNBR、Drugbank和Hetionet数据库的全部期刊文献,结果表明,在CNKI数据库中穿心莲内酯与肝损伤相关的研究共34篇,年度发文数量逐渐上升,结合外文数据库研究结果发现,穿心莲内酯与肝损伤研究的作用机制与抗炎信号通路有关。（2）本研究纳入了2015年1月至2019年12月在某三甲医院住院治疗期间应用过穿心莲内酯注射液患者的病历资料,共207例,通过比较用药前后患者血常规、肝功能、肾功能、血糖、血脂及离子水平的变化情况发现,穿心莲内酯对患者血常规指标中白细胞、单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞以及肝功能指标中谷草转氨酶、前白蛋白等的改善具有明显效果,而用药前后患者的肾功能、血脂及离子水平无明显变化,提示穿心莲内酯具有一定的抗炎和保护肝脏的作用。（3）酒精对体外培养的小鼠原代肝细胞具有一定的毒性作用,且呈现明显的剂量依赖性。酒精对体外培养的小鼠原代肝细胞24h毒性作用的IC50值约为400 mmol/L,且酒精可导致小鼠原代肝细胞内的炎症反应相关因子IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、NF-κB、TNF-α和CYP2E1的表达水平显着升高,而经不同浓度的穿心莲内酯干预表现对肝脏细胞的保护作用,尤以高剂量（0.2mmol/L）组作用效果最为显着。（4）本研究成功建立了小鼠酒精性肝损伤动物模型,给予8周龄雄性C57BL/6J小鼠4mg/d·kg·BW高度白酒一周后过渡至6mg/d·kg·BW灌胃共12w后,可诱导小鼠出现肝脏重量和肝脏指数增加,血清转氨酶相关指标AST、ALT和γ-GT的水平显着升高（P<0.05）;肝脏组织氧化应激指标MDA显着升高、SOD和GSH显着下降（P<0.05）;肝组织内总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）以及ROS蓄积,表明经高度白酒灌胃12w后,小鼠出现明显的肝组织损伤。（5）穿心莲内酯对小鼠酒精性肝损伤具有明显的保护作用。分别给予酒精模型组小鼠不同浓度（0.05、0.1、0.2g/kg·BW）的穿心莲内酯,结果发现,高剂量穿心莲内酯（0.2g/kg·BW）组可显着降低小鼠的肝脏重量和肝脏指数,差异具有统计学意义（P<0.05）;且高剂量穿心莲内酯组小鼠血清转氨酶AST、ALT和γ-GT水平显着低于酒精模型组,而与空白对照组和阳性对照组无明显统计学差异;穿心莲内酯中、高剂量组小鼠肝组织中脂质过氧化指标MDA水平显着低于酒精模型组,差异具有统计学意义（P<0.05）,抗氧化指标SOD和GSH水平在高剂量穿心莲内酯组显着高于模型组,与阳性对照组无明显差异;穿心莲内酯可在一定程度上有效降低酒精诱导的肝组织脂质紊乱,且以高剂量组,即0.2g/kg·BW穿心莲内酯的保护效果最为明显,高剂量组穿心莲内酯组小鼠肝组织中TC和TG水平与阳性对照组相比,无统计学差异（P>0.05）;与模型组相比,穿心莲内酯各剂量组小鼠肝脏ROS均明显下降,特别是中、高剂量组下降更加明显,差异具有统计学意义（P<0.05）,以高剂量组效果最为明显。且高剂量穿心莲内酯组小鼠肝组织ROS水平与阳性对照组无明显差异（P>0.05）。（6）从各组小鼠肝组织病理学（HE染色）结果可以看出,空白对照组和阳性对照组小鼠肝细胞大小一致,肝细胞索以小叶中央动脉为中心呈辐射状排列;胞核大呈圆形,胞浆均匀红染;胆小管细胞结构完整,未见病变。与空白对照组小鼠相比,模型组小鼠肝组织结构紊乱,肝小叶和肝索结构消失,其中有大量脂肪空泡和炎细胞浸润,肝细胞胞浆稀疏,呈纤维化状态。与模型组相比,穿心莲内酯各剂量组小鼠肝组织形态有所改善,尤以高剂量（0.2g/kg·BW）组小鼠表现最为明显,肝组织接近阳性对照组结构,其脂肪空泡、炎细胞浸润和纤维化状态均有明显改善。（7）穿心莲内酯对各组小鼠肝组织NF-κB、TNF-α和CYP2E1蛋白水平的表达均有明显影响,从免疫组化结果看,模型组小鼠肝组织中有大量NF-κB和TNF-α的原位表达。与模型组相比,随着干预剂量的增高,穿心莲内酯各剂量组NF-κB和TNF-α的蓄积逐渐减少,且呈现明显的剂量依赖性,穿心莲内酯高剂量组小鼠肝组织NF-κB和TNF-α的表达量已接近空白对照组和阳性对照组水平。从Western Blot结果看,模型组小鼠肝组织中NF-κB、TNF-α和CYP2E1表达水平均显着升高（P<0.05）,而经穿心莲内酯干预后,NF-κB、TNF-α和CYP2E1的表达水平均有所下降,差异具有统计学意义（P<0.05）。穿心莲内酯各剂量组NF-κB、TNF-α和CYP2E1的表达水平与阳性对照组无明显差异（P>0.05）。结论:（1）通过文献计量学分析得出,穿心莲内酯与肝损伤相关研究可能的信号通路主要是炎症信号分子,如NF-κB p100、NF-κB p105、TNF-α等。（2）通过对穿心莲内酯的临床应用现状分析得出,穿心莲内酯是目前临床上常用的抗炎药物,对改善肝脏功能具有一定的作用。（3）酒精对体外培养的小鼠原代肝细胞具有一定的毒性作用,呈现明显的剂量依赖性,穿心莲内酯高剂量组（0.2 mmol/L）对酒精所致原代肝细胞损伤具有明显的保护作用。（4）本研究成功建立了小鼠酒精性肝损伤动物模型,即给予4mg/d·kg·BW高度白酒一周后过渡至6mg/d·kg·BW灌胃共12w,可诱导小鼠出现血清转氨酶升高、肝脏脂质过氧化、ROS生成等肝脏功能受损及组织病理改变。（5）穿心莲内酯高剂量组（0.2g/kg·BW）可有效降低小鼠酒精性肝损伤时的血清转氨酶水平、氧化应激水平、肝脏脂质水平以及ROS生成。（6）穿心莲内酯对酒精性肝损伤的保护作用机制可能是通过抑制CYP2E1/ROS/NF-κB信号通路相关蛋白的表达实现的。
吕艳杭[5]（2021）在《基于PKCα/Nrf2/ROS通路探讨柔肝化纤颗粒抗肝纤维化大鼠的作用》文中提出目的:观察柔肝化纤颗粒对四氯化碳（CCl4）复合因素诱导的肝纤维化大鼠模型的干预作用,从PKCα/Nrf2/ROS信号通路方面探讨柔肝化纤颗粒抗肝纤维化的作用机制。方法:将48只Wistar雄性大鼠随机分为正常组、病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗组,每组12只。除正常组外,其余每组大鼠采用皮下注射40%CCl4（第一次使用5ml/kg体重,以后每隔3天以每3ml/kg体重,每周2次,共8周）皮下注射,联合高脂低蛋白食物（以玉米面为饲料,实验第一、二周加用0.5%胆固醇、20%猪油）,为了防止肝纤维化自然修复对实验结果造成的影响,除正常组外,其余各组仍每周腹腔注射一次40%CCl4油剂3ml/kg体重/每次;正常组正常饲养,同时采用同体积花生油皮下注射8周后灌胃给予同体积的生理盐水,肝纤维化模型组造模成功病理模型组于4mg/kg生理盐水灌胃,秋水仙碱组于每日0.11mg/kg体重给予秋水仙碱进行灌胃;柔肝化纤颗粒剂量组予柔肝化纤颗粒溶液4mg/kg灌胃,每周3次,共8周,连续8周取材。各组分别于用药8周后,禁食12h,经1%戊巴比妥麻醉,股静脉采血后处死,开腹剖取肝脏,通过HE染色、Masson染色观察肝脏情况,采用ELLSA检测活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）、超氧化歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase,GSH-Px）、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量;采用PCR、Western Blot检测平滑肌肌动蛋白（α-Smooth Muscle Actin,α-SMA）、E-钙黏蛋白（E-Cadherin,E-Cad）、I型胶原蛋白酶（Collagen I,Col I）、III型胶原蛋白酶（Collagen III,Col III）、血红素氧合酶1（Heme Oxygenase-1,HO-1）、醌氧化还原酶1（NAD（P）H:Quinone dehydrogenase1,NQO1）、蛋白激酶C（Protein Kinase C,PKCα）、核因子E2相关因子（NF-E2-related factor 2,Nrf2）m RNA及蛋白表达。结果:1.柔肝化纤颗粒对肝组织的影响正常组大鼠肝组织的肝小叶结构完整,轮廓清晰,肝组织致密,无假小叶结节形成,汇管区及其周围未见小胆管及纤维组织增生,胞核位于中央。病理模型组肝小叶结构被破坏,甚至消失,结节形成,肝索排列紊乱,汇管区大量增生的纤维,呈条索状,肝细胞脂肪变性,胞浆出现许多大小不等的空泡。秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组均存在肝小叶结构不清晰,汇管区及其周围小胆管可见纤维组织增生,肝细胞脂肪变性,胞浆出现许多大小不等的空泡,但程度均较病理模型组有明显减轻。2.柔肝化纤颗粒对SOD、GSH-Px、MDA含量的影响1与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的MDA含2量显着升高（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组MDA含量均有不同程度降低（P<0.05）。3与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的SOD、GSH-Px显着降低（P<0.05）;与模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组明显升高（P<0.05）。3.柔肝化纤颗粒对血清ROS的影响与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的ROS含量明显升高（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的ROS含量均降低（P<0.05）。4.柔肝化纤颗粒对α-SMA m RNA、E-Cadherin m RNA、PKCαm RNA、Nrf2mRNA、HO-1 m RNA、NQO1 m RNA、Collagen I m RNA、Collagen III m RNA表达的影响1与正常组相比,病理模型组的PKCαm RNA相对表达量下降（P<0.05）,柔肝化纤颗粒组的PKCαm RNA相对表达量升高（P<0.05）,秋水仙碱组无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的PKCαm RNA相对表达量明显升高（P<0.05）。2与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的Nrf2m RNA相对表达量下降（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的Nrf2 m RNA相对表达量明显升高（P<0.05）。3与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的HO-1m RNA相对表达量下降（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的HO-1 m RNA相对表达量明显升高（P<0.05）。4与正常组相比,病理模型组的NQO1 m RNA相对表达量下降（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的NQO1 m RNA相对表达量明显升高（P<0.05）。5与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的α-SMA m RNA相对表达量升高（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的α-SMA m RNA相对表达量明显下降（P<0.05）。6与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的E-Cadherin m RNA相对表达量升高（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的E-Cadherin m RNA相对表达量明显下降（P<0.05）。?与正常组相比,病理模型组的Collagen I m RNA相对表达量升高（P<0.05）,柔肝化颗粒组Collagen I m RNA相对表达量显着下降（P<0.05）,秋水仙碱组无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的Collagen I m RNA相对表达量明显下降（P<0.05）。7与正常组相比,病理模型组Collagen III m RNA相对表达量显着升高（P<0.05）,柔肝化颗粒组Collagen III m RNA相对表达量显着下降（P<0.05）,秋水仙碱组无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的Collagen III m RNA相对表达量明显下降（P<0.05）。5.柔肝化纤颗粒对α-SMA、E-Cadherin、HO-1、NQO1、PKCα、Nrf2、Collagen I、Collagen III蛋白表达的影响1与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的PKCα蛋白表达下降（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的PKCα蛋白表达明显升高（P<0.05）。2与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组Nrf2蛋白表达下降（P<0.05）,柔肝化纤颗粒组Nrf2蛋白表达无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的Nrf2蛋白表达明显升高（P<0.05）。3与正常组相比,病理模型组、柔肝化纤颗粒组的HO-1蛋白相对表达量下降（P<0.05）,秋水仙碱组HO-1蛋白相对表达量无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组的HO-1蛋白相对表达量明显升高（P<0.05）,柔肝化纤颗粒升高不明显（P>0.05）。3与正常组相比,病理模型组、秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的NQO1蛋白相对表达量下降（P<0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的NQO1蛋白相对表达量明显升高（P<0.05）。4与正常组相比,病理模型组的α-SMA蛋白相对表达量升高（P<0.05）,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的α-SMA蛋白相对表达量无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的α-SMA蛋白相对表达量明显下降（P<0.05）。5与正常组相比,病理模型组的E-Cadherin蛋白相对表达量升高（P<0.05）,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的E-Cadherin蛋白相对表达量无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,柔肝化纤颗粒组的E-Cadherin蛋白相对表达量明显下降（P<0.05）。6与正常组相比,病理模型组的Collagen I蛋白相对表达量升高（P<0.05）,柔肝化纤颗粒组的Collagen I蛋白相对表达量下降（P<0.05）,秋水仙碱组的Collagen I蛋白相对表达量无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的Collagen I蛋白相对表达量明显下降（P<0.05）。7与正常组相比,病理模型组的Collagen III蛋白相对表达量升高（P<0.05）,柔肝化纤颗粒组的Collagen I蛋白相对表达量下降（P<0.05）,秋水仙碱组的Collagen I蛋白相对表达量无明显差异（P>0.05）;与病理模型组相比,秋水仙碱组、柔肝化纤颗粒组的Collagen III蛋白相对表达量明显下降（P<0.05）。结论:柔肝化纤颗粒可改善CCl4诱导的大鼠的肝纤维化程度,显着降低血清中ROS、MDA含量,升高血清中SOD、GSH-Px的含量,提示柔肝化纤颗粒对肝纤维化大鼠具有一定的抗氧化应激作用。柔肝化纤颗粒通过对PKCα的激活,促进Nrf2发生核转移,抑制ROS信号通路的表达以抗氧化应激反应,下调α-SMA、E-cadherin的表达以抑制HSCs活化,减少Collagen I、Collagen III分泌,减少ECM在肝脏中的沉积,从而实现逆转肝纤维化进程。
杨晶晶[6]（2021）在《DNMT3A介导LncRNA ANRIL甲基化促进肝纤维化的分子机制》文中指出研究背景肝纤维化（Liver fibrosis）是各种损伤因素引发的持续性损伤修复反应,导致肝组织内细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）的异常沉积,进一步引发肝脏结构和肝功能异常改变的一种病理过程。目前临床上肝纤维化的治疗效果不佳,严重危害人类的生命健康。因此,阐明肝纤维化的发病机制,具有重要临床意义。研究证实,活化的肝星状细胞（Hepatic stellate cells,HSCs）是肝脏合成ECM的主要细胞,肝星状细胞活化增殖是肝纤维化形成的中心环节。在各种损伤刺激下,HSCs由静止的、储存维生素A的细胞向增生的、成纤维的肌成纤维细胞的转分化,并分泌α-平滑肌肌动蛋白（Alpha-smooth muscle actin,α-SMA）、I型胶原（Collagen I,Col1a1）等,产生促纤维化的细胞因子如转化生长因子（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）、血小板源性生长因子（Platelet derived growth factor-BB,PDGF-BB）等现已被公认为肝纤维化的主要驱动因素。然而,到目前为止,关于调控HSCs增殖和肝纤维化发病的分子机制不详,因此,探究肝纤维化发病过程中HSCs增殖的分子作用机制对预防和治疗肝纤维化意义重大。各种因素参与调控HSCs增殖,表观遗传修饰DNA甲基化是重要的表观遗传标记,在肝纤维化形成过程中起关键作用。本课题组研究发现DNA甲基化参与调控HSCs增殖,但是作为DNA甲基化转移酶之一的DNMT3A在肝纤维化的发病过程中起着怎样的调控作用,仍不明确。此外,研究表明,表观遗传学修饰长链非编码RNA（Long non-coding RNA,Lnc RNA）具有调控HSCs增殖的作用,INK4基因座中反义非编码RNA（Antisense Non-Coding RNA in the INK4 Locus,ANRIL）是已知的具有调控细胞活化增殖功能的关键分子之一。文献报道Lnc RNA ANRIL可通过介导细胞增殖通路相关蛋白的表达调控细胞增殖活性。但是,关于Lnc RNA ANRIL如何调控HSCs增殖的具体分子机制不清,有待阐明。基于DNMT3A与Lnc RNA ANRIL两种表观遗传修饰方式如何调控HSCs增殖,两者之间相互作用、作用靶点和调控方式,需要深入阐明。本文将探究DNMT3A介导Lnc RNAANRIL甲基化在肝纤维化中的分子机制,以期为临床肝纤维化的治疗提供科学依据、新的分子诊断指标和干预靶点。本研究收集临床肝纤维化患者血清及组织标本,并采用经典的四氯化碳（CCl4）皮下注射建立小鼠肝纤维化模型为体内研究对象,以肝星状细胞HSCs为体外研究对象,应用荧光原位杂交、甲基化特异性PCR（MSP）、5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brd U）荧光染色等技术,进行DNMT3A介导Lnc RNA ANRIL甲基化在肝纤维化中的分子机制研究。全文共分三个部分:第一部分临床肝纤维化患者样本中DNMT3A、ANRIL、α-SMA、Collagen I的差异表达目的:阐明DNMT3A、ANRIL、α-SMA、Collagen I在临床患者肝纤维化样本中的差异表达。方法:选取安徽医科大学第二附属医院肝胆外科慢性肝病患者20例。所有患者均签署剩余标本使用知情同意书。分组:根据肝穿刺活检病理学诊断有无合并纤维化症状分为对照组（无纤维化组）和纤维化组各10例,肝穿刺活检病理学诊断参照《肝纤维化诊断及治疗共识（2019）》。并记录患者的相关信息,如年龄、性别等,严格按照安徽医科大学生物医学伦理委员会要求执行,收集血清及肝组织样本待测。（1）检测肝纤维化患者血清中AST、ALT、HA的含量变化;（2）HE染色观察肝纤维化患者肝脏组织病理学改变;（3）Masson染色及天狼猩红染色观察肝纤维化患者肝脏组织胶原沉积改变;（4）Western blotting及免疫组织化学实验检测DNMT3A、肝纤维化标志蛋白α-SMA、Collagen I在肝纤维化患者肝脏组织中的差异表达;（5）RT-qPCR检测DNMT3A、ANRIL、α-SMA、Collagen I m RNA在肝纤维化患者肝脏组织中的差异表达。结果:1.临床患者肝纤维化组织中DNMT3A表达显着升高,ANRIL表达明显降低（1）肝纤维化组血清中AST/ALT比值、HA的含量与对照组相比明显增加;（2）与对照组相比,肝纤维化组肝组织中胶原沉积明显增多、炎性浸润增加,纤维化改变显着;（3）肝纤维化组肝组织中DNMT3A、α-SMA、Collagen I蛋白的表达较对照组显着增高;（4）肝纤维化组肝组织中DNMT3A、α-SMA、Collagen I m RNA的表达较对照组显着增高,而ANRIL m RNA的表达则显着降低。（5）相关性Preason分析结果显示:肝纤维化患者组织中DNMT3A和α-SMA的相对表达呈现明显正相关,ANRIL和α-SMA的相对表达呈现明显负相关。小结:DNMT3A高表达与ANRIL低表达以及肝脏功能受损,可能与肝纤维化患者纤维化形成有关。第二部分小鼠肝纤维化组织和肝星状细胞中DNMT3A、ANRIL、α-SMA、Collagen I的表达及ANRIL启动子区域甲基化水平目的进一步阐明小鼠肝纤维化组织和肝星状细胞中DNMT3A、ANRIL、α-SMA、Collagen I的表达及ANRIL启动子区域甲基化水平。方法1.30只雄性小鼠（18～22g）随机分为2组:正常组15只、CCl4处理组15只。自处理之日开始,除正常组给予橄榄油（1 ml/kg）皮下注射外,其他各组小鼠皮下注射50%CCl4橄榄油溶液（1 ml/kg）每周2次,共12周;直至第12周结束,建模过程中注意观察并记录小鼠体重变化,于造模满12周时,麻醉后留取肝脏组织和血液标本,检测相关指标。（1）检测肝纤维化小鼠血清中AST、ALT、HA、TGF-β1的含量变化;（2）HE染色观察小鼠肝纤维化组织病理学改变;（3）Masson染色及天狼猩红染色观察小鼠肝纤维化组织胶原沉积改变;（4）Western blotting及免疫组织化学实验检测DNMT3A、α-SMA、Collagen I蛋白在小鼠肝纤维化组织中的表达;（5）RT-qPCR检测DNMT3A、ANRIL、α-SMA、Collagen I m RNA在小鼠肝纤维化组织中的表达;（6）FISH检测ANRIL在小鼠肝纤维化组织中的表达;（7）MSP检测小鼠肝纤维化组织中ANRIL启动子区域甲基化水平。2.体外以肝星状细胞HSCs为研究对象,使用细胞因子TGF-β1（5ng/ml）诱导刺激HSCs增殖,建立体外HSCs增殖模型,进行以下实验:（1）检测TGF-β1处理HSCs后上清液中HA和PIIIP的含量变化;（2）Western blotting及免疫荧光实验检测DNMT3A、α-SMA、Collagen I蛋白在TGF-β1处理HSCs中的差异表达;（3）RT-qPCR检测DNMT3A、ANRIL、α-SMA、Collagen I m RNA在TGF-β1处理HSCs中的差异表达;（4）应用MTT、CCK8以及Brd U荧光染色检测观察TGF-β1处理对HSCs增殖的影响;（5）BSP检测TGF-β1处理HSCs后ANRIL启动子区域甲基化位点变化。结果:1.小鼠肝纤维化组织中DNMT3A表达显着增高,ANRIL表达显着降低,ANRIL表达降低可能与ANRIL基因启动子区域甲基化水平升高有关。（1）肝纤维化小鼠血清中AST/ALT比值、HA、TGF-β1含量水平较对照组明显增高;（2）与对照组相比,小鼠肝纤维化组织中胶原沉积增多、炎性浸润增加、纤维化改变明显;（3）与对照组相比,DNMT3A、α-SMA、Collagen I蛋白和m RNA的表达在小鼠肝纤维化组织中显着增高,而ANRIL m RNA在小鼠肝纤维化组织中的表达显着降低;（4）小鼠肝纤维化组织中ANRIL启动子区域甲基化水平与对照组相比显着升高。2.体外HSCs增殖模型中,DNMT3A高表达,ANRIL低表达,ANRIL的低表达可能与ANRIL启动子区域甲基化水平升高有关（1）TGF-β1处理后HSCs细胞上清液中HA和PIIIP的含量较对照组明显增高;（2）与对照组相比,TGF-β1诱导刺激HSCs（24h、48h）后HSCs增殖活性明显增强;（3）与对照组相比,DNMT3A、α-SMA、Collagen I蛋白和m RNA的表达在TGF-β1诱导刺激HSCs中显着增高,而ANRIL m RNA的表达显着降低;（4）同时,TGF-β1诱导刺激HSCs中ANRIL启动子区域甲基化水平较对照组显着升高。小结:DNMT3A高表达与ANRIL高甲基化修饰导致的ANRIL表达下调,可能与小鼠肝纤维化形成和HSCs增殖有关。但是关于DNMT3A与ANRIL如何调控肝纤维化形成和HSCs增殖,两者之间有何调控作用,仍不清楚,值得进一步研究。第三部分DNMT3A介导ANRIL甲基化在肝纤维化与HSCs增殖中的分子作用机制目的:探究DNMT3A介导ANRIL甲基化调控HSCs细胞增殖及肝纤维化的分子机制。方法:1.60只雄性小鼠（18～22g）随机分为4组:正常组,CCl4处理组,CCl4+LV3慢病毒空载体组,CCl4+LV3-DNMT3A慢病毒组,每组各15只。自处理之日开始,除正常组给予（1 ml/kg）剂量橄榄油皮下注射外,其他各组小鼠皮下注射50%CCl4橄榄油溶液（1 ml/kg）每周2次,共12周;于造模满11周后,LV3慢病毒空载体组小鼠,LV3-DNMT3A慢病毒组小鼠,分别给予30μl慢病毒空载体LV3和30μl慢病毒LV3-DNMT3A尾静脉注射处理（慢病毒颗粒的滴度为1×109TU/ml）,一周后处死小鼠,留取肝脏组织和血液标本,检测相关指标。（1）HE染色观察重组慢病毒DNMT3A干预后小鼠肝纤维化组织病理学改变;（2）Masson染色及天狼猩红染色观察重组慢病毒DNMT3A干预后小鼠肝纤维化组织胶原沉积改变;（3）Western blotting及免疫组织化学实验检测重组慢病毒DNMT3A干预后,DNMT3A、α-SMA、Collagen I蛋白在小鼠肝纤维化组织中的表达变化;（4）RT-qPCR检测重组慢病毒DNMT3A干预后,DNMT3A、ANRIL、α-SMA、Collagen I m RNA在小鼠肝纤维化组织中的表达变化;（5）FISH检测重组慢病毒DNMT3A干预后,ANRIL在小鼠肝纤维化组织中的表达变化。2.细胞实验:应用DNMT3A过表达质粒、DNMT3A小干扰RNA以及DNA甲基转移酶抑制剂2’-脱氧-5-氮杂胞嘧啶（5-aza-2’-deoxycytidine,5-Azad C）1μmol/L分别转染处理TGF-β1（5ng/ml）刺激24h后的HSCs,实验分组:对照组,TGF-β1（5ng/ml）处理组,TGF-β1（5ng/ml）+DNMT3A过表达质粒处理组,TGF-β1（5ng/ml）+DNMT3A小干扰RNA处理组,TGF-β1（5ng/ml）+5-Azad C（1μmol/L）处理组,并进行以下实验:（1）Western blotting检测DNMT3A、α-SMA、Collagen I蛋白在DNMT3A过表达质粒、DNMT3A小干扰RNA以及5-Azad C（1μmol/L）干预处理后HSCs中的表达变化;（2）RT-qPCR检测DNMT3A、ANRIL、α-SMA、Collagen I m RNA在DNMT3A过表达质粒、DNMT3A小干扰RNA以及5-Azad C（1μmol/L）干预处理后HSCs中的表达变化;（3）应用MTT、CCK8以及Brd U荧光染色检测观察DNMT3A过表达质粒、DNMT3A小干扰RNA以及5-Azad C（1μmol/L）处理后对HSCs增殖的影响。3.应用ANRIL过表达质粒、ANRIL小干扰RNA转染处理TGF-β1（5ng/ml）刺激24h后的HSCs,实验分组:对照组,TGF-β1（5ng/ml）处理组,TGF-β1（5ng/ml）+ANRIL过表达质粒处理组、TGF-β1（5ng/ml）+ANRIL小干扰RNA处理组;并进行以下实验:（1）Western blotting检测ANRIL过表达质粒、ANRIL小干扰RNA分别处理活化增殖的HSCs中α-SMA、Collagen I、AMPK、Phospho-AMPK（p-AMPK）蛋白的表达变化;（2）RT-qPCR检测ANRIL过表达质粒、ANRIL小干扰RNA分别处理活化增殖的HSCs中ANRIL、α-SMA、Collagen I m RNA的表达变化;（3）应用MTT、CCK8以及Brd U荧光染色观察ANRIL过表达质粒、ANRIL小干扰RNA对HSCs增殖的影响。结果:1.重组慢病毒DNMT3A干预后,ANRIL的表达明显升高,小鼠肝纤维化程度明显改善（1）与对照组相比,小鼠肝纤维化组织中胶原沉积增多、炎性浸润增加、纤维化改变明显,给予重组慢病毒DNMT3A干预后,与慢病毒空载体组相比,肝脏细胞结构改善、胶原纤维减少,肝组织纤维化病理改善更为明显;（2）与对照组相比,小鼠肝纤维化组织中DNMT3A、α-SMA、Collagen I蛋白和m RNA的表达显着增高,给予重组慢病毒DNMT3A干预后,与慢病毒空载体组相比,小鼠肝纤维化组织中DNMT3A、α-SMA、Collagen I蛋白和m RNA的表达明显减少;（3）然而,与对照组相比,ANRIL m RNA在小鼠肝纤维化组织中的表达显着降低,给予重组慢病毒DNMT3A干预后,与慢病毒空载体组相比,小鼠肝纤维化组织中ANRIL m RNA的表达明显升高。2.体外HSCs增殖模型中,过表达DNMT3A可显着抑制ANRIL表达,促进HSCs增殖;而沉默DNMT3A可明显促进ANRIL表达,抑制HSCs增殖;提示DNMT3A通过负调控ANRIL的表达影响HSCs增殖活性（1）与阴性对照组相比,转染DNMT3A小干扰RNA处理后HSCs中DNMT3A m RNA表达显着降低,而ANRIL m RNA表达显着增高。（2）然而,与空质粒组相比,转染DNMT3A过表达质粒后HSCs中DNMT3A m RNA表达明显增高,而ANRIL m RNA表达明显降低。（3）与TGF-β1刺激组相比,使用DNA甲基化抑制剂5-Azad C处理HSCs后ANRIL表达水平明显升高。（4）与空质粒组相比,转染DNMT3A过表达质粒后HSCs增殖活性明显增强;（5）与阴性对照组相比,转染DNMT3A小干扰RNA后可明显抑制HSCs增殖;此外,与TGF-β1刺激组相比,5-Azad C处理后可明显抑制HSCs增殖。3.过表达ANRIL能明显抑制AMPK蛋白磷酸化水平,同时可显着降低HSCs的增殖活性;沉默ANRIL可显着增加AMPK蛋白磷酸化水平,同时可显着促进HSCs的增殖活性;（1）与空质粒组相比,ANRIL过表达质粒转染HSCs后ANRIL表达显着升高,而α-SMA、Collagen I、p-AMPK表达明显降低;（2）另外,与空质粒组相比,ANRIL过表达质粒转染后明显抑制HSCs增殖。（3）然而,与阴性对照组相比,ANRIL小干扰RNA转染HSCs后ANRIL表达显着降低,而α-SMA、Collagen I、p-AMPK表达明显增高;（4）与阴性对照组相比,ANRIL小干扰RNA转染后明显促进HSCs增殖。小结:Lnc RNAANRIL可能因DNMT3A介导的高水平甲基化修饰而表达下调,使得ANRIL对AMPK信号通路核心蛋白AMPK的抑制作用减弱,AMPK蛋白磷酸化水平升高,激活AMPK信号通路,HSCs增殖活性增强,促进肝纤维化的形成。结论:1.DNMT3A高表达与Lnc RNA ANRIL低表达以及肝脏功能受损,可能与肝纤维化形成有关。2.DNMT3A高表达与Lnc RNA ANRL发生高甲基化修饰导致ANRIL表达下调,可能与肝纤维化形成和HSCs增殖有关。3.LncRNA ANRIL可能因DNMT3A介导的高甲基化修饰而表达下调,使得ANRIL对AMPK信号通路核心蛋白AMPK的抑制作用减弱,AMPK蛋白磷酸化水平升高,激活AMPK信号通路,HSCs增殖活性增强,促进肝纤维化的形成。
郑瑞鹏[7]（2020）在《基于微生物组学的慢性肝病临床特点及粪菌移植延缓肝硬化大鼠疾病进程的机制研究》文中研究指明慢性肝病是一种由病毒、酒精或药物等不同致病因素引起肝损伤的进行性疾病。慢性肝病的持续性进展,可导致进行性肝脏损伤、炎症和修复的恶性循环,患者通常会经历肝炎、肝纤维化和肝硬化等过程,如疾病不能被有效控制,最终可发展为肝癌。早期的肝炎主要是以肝脏局部炎症反应导致肝细胞受损为特征,炎症的持续存在则可进一步引发慢性肝炎、肝纤维化甚至肝硬化的发生,患者一旦进入肝硬化阶段将导致肝脏的不可逆性损伤,最终形成肝癌。其中肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）是肝癌的最常见类型。我国是肝病高发国家,据统计,2019年全世界一半以上的肝癌病例发生在中国,且80%的新增病例处于晚期癌症阶段。临床上主要采用手术切除或肝移植等外科手段对肝癌进行治疗,但肝癌患者的五年生存率极低,给社会公共卫生体系和患者身体健康带来了沉重的负担。因此,发现并干预慢性肝病的早期阶段,如肝炎和肝硬化的进程,对于延缓其进展并阻止肝癌的发生发展尤为重要。肠道菌群在机体的免疫调节、代谢平衡以及营养摄入等方面都发挥着重要的作用,被称为是一个被遗忘的代谢“器官”。肝脏通过门静脉、胆道与肠道连接,向肠道输送胆汁酸等生物活性物质维持机体需要,而肠道中的微生物及其代谢产物也会沿着门静脉逆行至肝脏进而对肝脏造成损伤,此通路被称为肠-肝轴。近年来随着高通量测序技术的发展,越来越多的临床研究表明肠道菌群紊乱在酒精性脂肪肝（Alcoholic liver disease,ALD）、非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）、肝硬化以及肝癌等多种慢性肝病的发生发展中发挥着重要作用。目前的研究多聚焦于肠道菌群与某种特定的肝病之间的关联性,但肠道菌群结构分布与慢性肝病的发生发展的关系有待于深入研究。肠道菌群失衡可导致有害菌增多,产生大量的细菌脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）,LPS通过与Toll-like Receptor 4（TLR4）受体结合,激活免疫细胞内MyD88-NF-κB通路,最终促进IL-6、IL-1β和TNF-α等促炎性细胞因子的基因转录与合成分泌,从而加重炎症反应。益生菌可改善肠道菌群失衡并能延缓慢性肝病的发生和发展,从而降低肝病的恶化和死亡率。但益生菌不能在肠道中长期定殖,且不同菌株间功能差异巨大,对肝病的治疗作用仍具有较大争议。粪菌移植（Fecal microbiota transplantation,FMT）是一种将健康人的肠道菌群整体移植到患者胃肠道内,对肠道菌群进行重塑的方法,已广泛应用于难辨梭状芽孢杆菌感染、炎症性肠病、顽固性便秘以及肠道免疫缺陷等疾病。目前应用FMT治疗慢性肝病的研究较少,其原因与慢性肝病的肠道菌群结构特点未被彻底揭示相关。此外,FMT治疗慢性肝病的作用机制也并不明确。为了解多种慢性肝病患者肠道菌群的组成特点,进而探讨FMT对慢性肝病的治疗作用机制。本研究拟使用高通量测序技术（16S rRNA）检测肝炎、肝硬化、HCC患者以及健康人的肠道菌群,解析不同病因和不同阶段慢性肝病的肠道菌群结构和组成,探讨肠道菌群与慢性肝病疾病进展之间的关系。同时通过构建肝硬化大鼠模型,以FMT对肝硬化大鼠进行干预,并联合微生物组学和代谢组学技术探讨FMT对肝硬化大鼠的治疗作用及机制,为临床上慢性肝病的诊治技术开辟新的领域。一、慢性肝病肠道菌群结构多样性研究方法:（1）以肝炎、肝硬化、HCC患者以及健康个体为研究对象,使用16S rRNA高通量测序技术检测肠道菌群的结构和组成,分析慢性肝病不同阶段肠道菌群的变化;（2）根据HCC患者是否存在肝硬化,分为肝硬化肝癌（LC-HCC:52例）和非肝硬化性肝癌（NLC-HCC:23例）两组,通过与单纯肝硬化组对比,分析肝硬化的并发对HCC患者肠道菌群的影响;（3）根据疾病诱因将HCC分为乙肝病毒诱发的HCC组（HBV-HCC:35例）、丙肝病毒诱发的HCC组（HCV-HCC:25例）和酒精性HCC组（ALD-HCC:15例）,探讨不同病因对HCC患者肠道菌群结构和组成的影响。结果:（1）与健康组、肝炎组和HCC组相比,肝硬化组肠道菌群的多样性明显降低,疣微菌门和变形菌门的丰度明显增高（p﹤0.05）,软壁菌门丰度显着降低（p﹤0.001）;在属水平上,叶杆菌属、鞘氨醇单胞菌属、肠球菌属和Erysipelatoclostridium菌属等菌属的丰度显着增高（p﹤0.05）,而青枯菌属、Catenibacterium菌属和Lachnospira菌属等菌属的丰度显着降低（p﹤0.05）。与健康组和肝炎组相比,尽管HCC组肠道菌群的多样性无明显变化（p﹥0.05）,但梭杆菌门的丰度显着增高（p﹤0.05）,同时劳特氏菌属、Clostridiates菌属以及Sarcina菌属等菌属的丰度显着增加（p﹤0.05）。这表明,在四组中,肝硬化组患者肠道菌群失调最为严重,尽管HCC组肠道菌群多样性无显着变化,但菌群种类的比例变化可能与HCC的发生相关。（2）与肝硬化组相比,LC-HCC组肠道菌群多样性无显着变化,而NLC-HCC组肠道菌群多样性显着增加（p﹤0.05）。菌属水平分析结果显示:与肝硬化相比,LC-HCC组中双歧杆菌菌属、阿克曼菌属等有益菌属以及考拉杆菌属等产短链脂肪酸菌属丰度显着降低（p﹤0.05）,拟杆菌属、脱硫弧菌属等产LPS菌属丰度显着增高（p﹤0.05）。结果提示肠道菌群中有益菌的减少以及有害菌的增多可能是肝硬化进展为HCC的原因之一。（3）在HBV-HCC组、HCV-HCC组和ALD-HCC组之间,α多样性和β多样性分析结果表明三组之间没有显着差异（p﹥0.05）。尽管在三组中发现了肠球菌属等18个差异性菌属,但在门水平上没有统计学差异（p﹥0.05）。由此可见,HCC患者肠道菌群的结构组成与其不同病因无显着关联性。二、FMT对肝硬化大鼠的治疗作用及机制研究方法:使用CCL4和CCL4联合酒精的方法分别构建了两种肝硬化大鼠模型,并每天给予健康大鼠的粪便菌液进行干预治疗。（1）连续造模12周后,比较分析各组大鼠的生活状态、体重、腹水形成时间、生存时间和死亡率;并应用全自动生化分析仪和HE染色技术对各组大鼠的肝功能指标以及肝脏的纤维化程度进行检测,探讨FMT对肝硬化大鼠的治疗作用。（2）ELISA检测各组大鼠血清中IL-6、IL-1β、和TNF-α炎症因子以及血浆中内毒素的含量;对各组大鼠血液、肠系膜淋巴结和肝脏组织中细菌含量以及肠道黏膜屏障的完整性进行检测;RT-PCR和Western-blot分别检测肝脏组织中TLR4-MyD88-NF-κB通路中相关信号分子的基因和蛋白的表达水平,初步探讨FMT对肝硬化大鼠的治疗机制。结果:（1）与肝硬化组相比,FMT治疗组大鼠的生活状态得到有效改善,体重增加,腹水形成时间和生存时间明显延长,死亡率显着降低（p﹤0.01）;血清中ALT、AST和GGT等肝功能指标均显着改善（p﹤0.05,p﹤0.01）,而白蛋白指标则明显增高（p﹤0.05）;肝组织表面的结节数量减少,肝组织中假小叶结构减少,结缔组织增生程度减轻。以上结果表明,FMT可有效改善肝硬化大鼠的生活状态,恢复肝功能并延缓肝硬化的发展进程。（2）ELISA结果显示,FMT治疗组大鼠血清中IL-6、TNF-α和IL-1β促炎性细胞因子以及内毒素的含量均显着降低（p﹤0.05）;血液、肠系膜淋巴结和肝组织中的细菌菌落数均显着减少（p﹤0.05）,肠道黏膜的结构和屏障功能得到有效改善;大鼠肝组织中TLR4-MyD88-NF-κB通路的相关分子基因和蛋白的表达水平均显着降低。以上结果表明,FMT可有效改善肝硬化大鼠的肠道黏膜结构和屏障功能,减少细菌移位;FMT可通过下调TLR4-MyD88-NF-κB通路的相关分子基因和蛋白的表达水平,减轻肝硬化大鼠的炎症水平。三、FMT对肝硬化大鼠的肠道菌群组成与代谢的影响方法:（1）应用16S rRNA高通量测序技术对各组大鼠的肠道菌群进行检测,分析比较各组大鼠肠道菌群的结构和组成,探讨FMT能否有效改善肝硬化大鼠肠道菌群的紊乱;（2）使用UPLC-Q/TOF-MS技术对各组大鼠血浆中差异性代谢物进行鉴别和分析,探讨FMT能否通过调节肝硬化大鼠的代谢模式进而发挥保护作用。结果:（1）肝硬化大鼠肠道菌群中乳杆菌科等有益菌属的丰度显着降低,而梭菌科和毛螺旋菌科等有害菌属的丰度显着增高,菌群结构和多样性紊乱;FMT治疗后,乳杆菌科等有益菌属的丰度增高,梭菌科和毛螺旋菌科等有害菌属的丰度降低,说明FMT可在一定程度上改善菌群结构,维持肠道微生态的平衡,进而通过肠-肝轴延缓肝硬化的进程。（2）肝硬化大鼠血浆中鞘氨醇和LysoPC（18:1（9Z））的含量显着降低,而视黄醇、8,9-环氧二十碳三烯酸、9-顺式视黄醛和花生四烯酸等代谢物的含量显着增高;FMT可调节花生四烯酸和视黄醇代谢通路。以上结果表明,FMT的治疗机制可能是通过改善肝硬化大鼠的肠道菌群的紊乱和调节花生四烯酸和视黄醇的代谢通路,进而延缓肝硬化的发展进程。结论:1.慢性肝病的发生与肠道菌群的紊乱密切相关,肝细胞癌（HCC）患者肠道菌群的紊乱与其是否并发肝硬化密切相关,而HCC患者肠道菌群的结构组成与其不同病因（如HBV感染、HCV感染或过度饮酒）无显着关联性。肝硬化进展为HCC可能与双歧杆菌菌属、阿克曼菌属等有益菌属及考拉杆菌属等产短链脂肪酸菌属丰度的降低,且与拟杆菌属、脱硫弧菌属等产LPS的菌属丰度的增高有关。2.粪菌移植（FMT）可有效改善肝硬化大鼠的肠道黏膜结构和屏障功能,减少细菌移位,进而延缓肝硬化发展进程;FMT的作用机制可能与下调TLR4-MyD88-NF-κB通路的相关分子基因和蛋白的表达水平,抑制促炎性细胞因子产生有关;FMT可通过调节花生四烯酸和视黄醇等代谢通路,改变大鼠的代谢模式,进而延缓肝硬化大鼠的疾病进程。创新性:1.本研究表征了我国吉林省肝炎、肝硬化和肝细胞癌（HCC）等慢性肝病患者的肠道菌群结构,发现HCC肠道菌群的紊乱与其是否并发肝硬化密切相关,而HCC患者肠道菌群的结构组成与其不同病因无显着关联性。2.本研究通过构建肝硬化大鼠模型验证了TLR4-MyD88-NF-κB通路相关信号分子在肝硬化发生发展中的作用。发现粪菌移植（FMT）可通过抑制TLR4-MyD88-NF-κB通路的相关分子基因和蛋白的表达水平,改善肝硬化大鼠的相关症状。3.本研究联合微生物组学和代谢组学技术阐释了FMT对肝硬化大鼠的治疗机制,发现FMT可通过调整肝硬化大鼠的肠道菌群结构并通过调节花生四烯酸和视黄醇代谢紊乱,延缓肝硬化的发展进程。
伍莉红[8]（2020）在《MiR-223/中性粒细胞颗粒蛋白信号轴调控NASH相关肝纤维化的功能和机制研究》文中认为一、研究背景非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）包括肝细胞单纯性脂肪变、非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis,NASH）及由其进展的肝纤维化和肝硬化[1]。由于肥胖和代谢综合症发病率快速增加,NAFLD成为全世界范围内最主要的慢性肝病之一。与单纯性脂肪变相比,NASH患者进展为终末期肝病的风险显着增加。目前,NASH发生及发展为肝纤维化的分子机制尚未阐明,尚无特异性治疗NASH及NASH相关肝纤维化的药物。临床及动物研究结果已证实,肝组织中性粒细胞浸润增强是NASH的重要组织病理学特征之一[1]。中性粒细胞颗粒蛋白是中性粒细胞发挥免疫调控作用的重要因子。Micro RNA-223（miR-223）是一种在中性粒细胞中具有高丰度的micro RNA,其在多种炎症状态下调节中性粒细胞的活化及炎性反应。研究miR-223及中性粒细胞颗粒蛋白调控NASH相关肝纤维化的功能和分子机制对于深入揭示NASH进展为肝纤维化的关键病理生理机制以及发现药物研发的新型、潜在靶点具有重要科学意义。二、研究目的本课题的总体研究目标在于揭示miR-223/中性粒细胞颗粒蛋白信号轴调控NASH相关肝纤维化的功能和分子机制,具体包括:1.采用低蛋氨酸和胆碱缺乏及L-氨基酸限定的高脂饮食（CDAHFD）,诱导可模拟NASH相关肝纤维化的关键临床和组织病理学特征的小鼠模型;2.研究miR-223调控NASH肝脏炎症及相关肝纤维化及中性粒细胞炎症反应的病理生理学功能;3.通过转录组测序鉴定出miR-223调控中性粒细胞颗粒蛋白的关键转录因子;4.利用miR-223敲除和野生型小鼠骨髓移植形成miR-223嵌合体小鼠,验证髓系细胞及其分化的中性粒细胞是否是介导miR-223调控NASH及其相关肝纤维化的关键细胞。三、研究策略与方法1.NASH相关肝纤维化小鼠模型的诱导及表型鉴定C57 BL/6J野生型的10周龄雄性小鼠以CDAHFD饮食饲喂10周诱导NASH相关肝纤维化。通过肝组织的H&E染色、Masson染色、天狼星红染色、α-SMA免疫组织化学染色、肝纤维化相关基因m RNA水平检测以及血清ALT和AST生化检测进行NASH组织病理学特征、肝纤维化及肝损伤程度分析。通过体重、瞬时血糖以及代谢耗氧量和体脂率的检测鉴定小鼠肥胖代谢表型。2.Mi R-223表达水平检测以实时定量PCR方法,检测miR-223在标准饲料和CDAHFD饮食饲喂10周的野生型（wild type,WT）雄性小鼠肝脏中的表达水平。3.Mi R-223敲除和野生型对照小鼠NASH相关肝纤维化的评价C57 BL/6J背景的miR-223敲除（miR-223 knockout,miR-223 KO）小鼠和野生型对照小鼠按照与第1部分相同的方法诱导NASH相关肝纤维化。造模结束后,运用上述实验方法检测NASH组织病理学、肝纤维化、肝损伤及代谢表型。通过免疫组织化学方法检测中性粒细胞肝脏浸润及在LPS诱导炎症中的迁移能力、肝脏中性粒细胞颗粒蛋白的表达。同时运用蛋白印迹方法检测肝组织中中性粒细胞颗粒蛋白的表达。检测中药干预后的LPS激活的巨噬细胞中TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-6、MPO、LCN2、PR3、NE的m RNA水平。4.转录组学筛选miR-223下游转录因子进行miR-223的转录组测序,筛选出miR-223调控中性粒细胞颗粒蛋白的潜在转录因子。通过检测野生型和miR-223 KO小鼠中性粒细胞和肝脏非实质细胞中m RNA水平验证并进一步筛选转录因子。双荧光素酶报告基因检测miR-223是否直接与转录因子结合发挥其作用。利用RT-PCR的方法检测野生型和miR-223 KO小鼠骨髓细胞和中性粒细胞中多个中性粒细胞颗粒蛋白（MPO、LCN2、PR3、NE）的m RNA水平。5.骨髓移植形成miR-223髓系细胞嵌合体小鼠通过骨髓移植选择性改变小鼠骨髓中miR-223的表达,并诱导NASH相关肝纤维化。造模结束后,运用上述检测方法检测NASH组织病理学、肝纤维化程度及代谢表型。四、研究结果1.CDAHFD饮食诱导小鼠模型可模拟临床NASH相关肝纤维化的关键组织病理学和代谢异常模型小鼠表现出NASH典型的组织病理学特征,包括脂肪变性、气球样变以及肝组织炎症;并表现出明显的纤维化;该模型除体重及血糖外,其它代谢表型与NASH患者相符,包括体脂率升高和代谢耗氧量降低（n=5/组）。2.Mi R-223在小鼠NASH相关肝纤维模型的肝组织表达丰度显着升高Mi R-223在标准饲料和CDAHFD饮食诱导小鼠肝脏中的表达水平检测结果显示,miR-223在CDAHFD饮食诱导的NASH相关肝纤维化模型小鼠肝脏中的表达显着升高（n=5/组）。3.Mi R-223在NASH相关肝纤维化中的病理生理学功能1)Mi R-223缺失显着加重CDAHFD饮食诱导的实验性NASH在CDAHFD饮食诱导的情况下,miR-223 KO小鼠肝脏NASH组织病理学特征,包括脂肪变性、气球样变以及肝小叶炎症较野生型对照组显着加重（n=5/组）。2)Mi R-223缺失显着加重CDAHFD饮食诱导的肝纤维化在CDAHFD饮食诱导的情况下,miR-223 KO小鼠较野生型小鼠肝脏出现更加明显的胶原沉积及肝纤维化相关基因m RNA水平升高（n=4-5/组）。3)Mi R-223缺失显着加重CDAHFD饮食诱导的肝细胞损伤在CDAHFD饮食诱导的情况下,miR-223 KO小鼠的血清肝细胞损伤指标ALT、AST水平较野生型小鼠显着升高（n=4-7/组）。4)Mi R-223缺失不影响CDAHFD饮食诱导的肥胖代谢表型在CDAHFD饮食诱导的情况下,miR-223 KO小鼠体重、血糖水平、体脂率和代谢耗氧量与野生型小鼠相比无显着性差异（n=4-12/组）。4.Mi R-223缺失显着增强中性粒细胞肝脏浸润及炎症反应1)Mi R-223缺失明显增加CDAHFD饮食诱导小鼠肝脏中性粒细胞浸润在CDAHFD饮食诱导的情况下,miR-223 KO小鼠较野生型小鼠肝脏中中性粒细胞明显增多（n=5/组）。2)Mi R-223缺失明显增强中性粒细胞迁移能力在LPS诱导炎症的情况下,miR-223 KO小鼠较野生型小鼠炎症部位中性粒细胞明显增多（n=5/组）。3)Mi R-223缺失明显增加CDAHFD饮食诱导小鼠肝脏中性粒细胞颗粒蛋白表达在CDAHFD饮食诱导的情况下,miR-223 KO小鼠较野生型小鼠肝脏中MPO、LCN2、PR3蛋白水平升高（n=5/组）。4)化浊中药抑制免疫细胞中促炎因子及颗粒蛋白表达5.介导Mi R-223调控中性粒细胞颗粒蛋白关键转录因子的筛选1)Mi R-223调控中性粒细胞颗粒蛋白表达的关键转录因子测序筛选结果通过miR-223敲除和野生型对照小鼠原代中性粒细胞的转录组测序,我们筛选、鉴定出miR-223缺失时显着上调、作为miR-223靶基因并且与四种颗粒蛋白MPO、LCN2、PR3、NE相关的转录因子:Fosl2、Plagl1。2)Mi R-223调控中性粒细胞颗粒蛋白表达的关键转录因子测序筛选结果验证与WT小鼠相比,miR-223 KO小鼠肝脏非实质细胞及原代中性粒细胞中Fosl2、Plagl1的m RNA水平均升高,说明Fosl2、Plagl1是miR-223调控中性粒细胞颗粒蛋白的关键转录因子。3)双荧光素酶报告基因方法检测miR-223与转录因子的相互作用当与含有Fosl2基因3’-UTR序列的重组质粒共转染时,miR-223的过表达导致萤火虫荧光素酶的表达降低,提示miR-223直接作用于Fosl2 m RNA的3’-UTR序列,显着抑制Fosl2的表达。综合上述结果,miR-223通过抑制转录因子Fosl2的表达而抑制中性粒细胞颗粒蛋白表达。6.髓系细胞来源的miR-223在NASH相关肝纤维化中的病理生理学功能1)野生型小鼠骨髓细胞嵌合改变miR-223 KO小鼠经CDAHFD饮食诱导的NASH肝脏炎症及其相关肝纤维化2)野生型小鼠骨髓细胞嵌合不影响miR-223敲除小鼠CDAHFD饮食诱导的肥胖代谢表型五、结论1.本课题采用CDAHFD饮食饲喂10周诱导小鼠NASH相关肝纤维化,该模型小鼠表现出典型的NASH组织病理学特征、肝纤维化及多个肥胖相关代谢表型,可作为研究NASH及其相关肝纤维化病理生理机制和新药干预效果的小鼠模型。2.Mi R-223缺失显着加重模型小鼠的肝脏炎症、肝损伤及肝纤维化。3.Mi R-223缺失显着增强中性粒细胞肝脏浸润及迁移能力,上调NASH状态下肝组织中中性粒细胞颗粒蛋白表达水平。4.Mi R-223通过抑制转录因子Fosl2的表达而抑制中性粒细胞颗粒蛋白表达。5.髓系细胞及其分化的中性粒细胞是介导miR-223调控NASH及其相关肝纤维化的关键细胞。综合上述研究结果,本课题揭示了miR-223通过直接抑制转录因子Fosl2的表达抑制中性粒细胞颗粒蛋白表达,显着减轻NASH肝脏炎症、肝损伤及相关肝纤维化。因此,miR-223、Fosl2和中性粒细胞颗粒蛋白可作为NASH及相关肝纤维化新药研发的潜在靶点。
毛赛[9]（2019）在《1型鸭肝炎强毒对成鸭致病、体内分布及免疫发生特性研究》文中认为1型鸭肝炎病毒（Duck Hepatitis A virus type 1,DHAV-1）是引起雏鸭病毒性肝炎的重要病原,对雏鸭致死率高,而对成年鸭感染无明显临床症状,但系统评估其对成年鸭致病性、体内分布及诱导免疫发生特性等数据较为缺乏,围绕这些科学问题开展系列研究,主要结果如下:1 1型鸭肝炎强毒感染诱发成年鸭急性和慢性肝炎DHAV-1强毒感染160日龄成年鸭,无临床症状。qRT-PCR检测血液病毒持续感染196 d,引起病毒血症的发生。DHAV-1感染后2-10 d,肝脏病毒RNA和3D蛋白阳性,病毒快速复制增殖含量达到107.18.18 copies/g;肝脏病理检测结果显示肝细胞嗜酸性变性并有炎性细胞浸润;血清肝功能指标检测显示ALT、AST和Tbil含量升高,具有急性肝炎的特征。肝脏内病毒持续感染252 d,且在10-252 d肝脏纤维组织增生且伴有肝细胞坏死、脂肪变性、空泡形成和大量炎性细胞浸润等病变;感染后140 d AST>ALT,且白蛋白和白球蛋白比持续降低,提示肝功能持续损伤,具有慢性肝炎的特征。血液和肝脏模式识别受体（PRRs）、白介素（ILs）、干扰素（IFNs）、趋化因子CCL等先天免疫相关因子转录水平的相对定量检测结果显示,DHAV-1感染诱导激活了肝脏和血液的先天免疫系统,且显示TLR-7是主要的PRRs,Th2型细胞因子（IL-4）的上调水平高于Th1型因子。血清抗体IgG、IgM和IgA1检测表明,DHAV-1感染诱导成年鸭有效的体液免疫应答,而肝脏T细胞流式分析结果显示DHAV-1感染诱导肝内间断且微弱的T细胞免疫应答。Pearson相关性分析结果显示IgG、IL-6和IFN-γ上调水平与DHAV-1滴度之间存在负相关性（P<0.01）,参与病毒的清除。2 1型鸭肝炎强毒肾脏分布特性与持续性感染的形成qRT-PCR、免疫组化检测结果显示,DHAV-1感染后在肾小球系膜细胞和血管内皮细胞可检测到病毒,且病毒拷贝数在1 d达到峰值（107.39.39 copies/g）;随后,病毒拷贝数下降,病毒逐渐向肾小管转移,在肾小管持续、分散的分布至224 d。免疫组化检测显示DHAV-1的感染导致肾细胞出现一系列病变,但没有检测到中性粒细胞浸润以及参与T细胞免疫应答的CD4+T细胞和CD8+T细胞的募集。相对荧光定量检测显示先天免疫应答被诱导激活,2-6 d可检测到TLR-7及其介导的抗病毒因子、炎性因子和趋化因子的显着转录上调,但MHC-I/MHC-II和CCL19的转录未见明显变化;Pearson相关性分析显示TLR-7和IL-6与DHAV-1间存在负相关性。3 1型鸭肝炎强毒对淋巴器官的组织嗜性qRT-PCR、免疫组化检测显示,淋巴器官是DHAV-1强毒感染重要靶器官,在脾脏、哈氏腺、胸腺和法氏囊检测到病毒RNA、衣壳蛋白和3D蛋白,且持续感染周期长,在224 d依然能检测到病毒。另外,Pearson相关性分析显示,淋巴器官的病毒含量与血液病毒含量间具有显着相关性。免疫相关因子相对转录量的检测显示,淋巴器官的PRRs、IFNs、ILs、MHC、CCL等先天免疫因子被诱导上调,但不同器官之间的免疫应答有明显的差异;趋化T淋巴细胞向外周迁移的CCL21在胸腺持续转录上调,水平高于次级淋巴器官和外周器官。Pearson相关性分析显示IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6与DHAV-1间具有直接负相关性;比较各因子的表达以及病毒的清除差异发现,IFN-γ是最有效的抗DHAV-1因子。4 1型鸭肝炎强毒感染消化系统特点及诱导黏膜免疫感染后0.5 d,胰腺、食管和肠道各段均能检测到病毒;12 d回肠病毒含量达到峰值（107.28.28 copies/g）,直肠在4 d达到峰值（107.71.71 copies/g）,胰腺、食管、十二指肠、空肠和盲肠的病毒含量均在1 d达到峰值,分别是106.77、107.37、106.97、107.10和107.15copies/g。比较肠道各部位病毒含量发现,回肠的病毒含量在感染后10-168 d高于其他部位,在其他感染时期直肠的病毒含量最高。食管的病毒含量居于第二位,胰腺的病毒含量最低且感染周期最短,感染后196 d未检测到病毒。间接ELISA检测到胆汁内产生抗DHAV-1特异性的IgG、IgM和IgA,IgG的最高效价高于IgM和IgA,高滴度的IgG出现在感染后21-56 d,而IgA抗体在1-112 d持续大量产生,是感染周期中的主要抗体;食管和肠道分泌液抗体的检测结果也显示IgA是主要的黏膜免疫抗体。免疫组化检测显示在食管和肠道各部位能检测到IgA+细胞。5 1型鸭肝炎强毒感染生殖系统特点及诱导黏膜免疫DHAV-1强毒感染后0.5 d,在种鸭的卵巢和输卵管各段检测到病毒,病毒含量呈现峰值(107.29和107.82.82 copies/g)的是漏斗部和膨大部;卵巢和子宫的病毒含量在4 d达到峰值(107.28和106.94.94 copies/g);峡部和阴道在感染后1 d达到峰值(106.91和107.14copies/g)。总的看,卵巢病毒含量低于输卵管,但在感染后280 d仍能检测到病毒;阴道病毒含量整体上高于其他部位,并且膨大部和阴道病毒持续感染到280 d,而输卵管其他部位在280 d未检测到病毒。生殖系统的黏膜免疫应答被激活,卵巢和输卵管分泌液内检测到特异性IgG、IgM和IgA抗体,IgG抗体滴度在各部位差异不显着（P>0.05）,IgM滴度在膨大部和阴道分泌液较高,IgA在膨大部分泌液较高且高于IgG和IgM;卵巢和输卵管检测到IgA和IgA+细胞,但不能完全清除病毒,诱发病毒持续性感染。。综上,DHAV-1强毒感染成年鸭无临床症状,致早期（2-10 d）急性肝炎、后转化为慢性肝炎（10-252 d）。病毒在肝脏、肾脏、血液、淋巴器官、消化系统和生殖系统的分布和感染刺激成年鸭先天性和适应性免疫系统激活,诱导干扰素和炎性因子的转录上调,诱导血清特异性抗体产生的能力强,而诱导胆汁、消化道和生殖道分泌液特异性抗体产生和肝、肾T细胞应答的能力弱。肾小管细胞免疫缺失是DHAV-1强毒不能完全被清除、导致持续性感染发生的重要原因。
崔鹤[10]（2019）在《FAdV-4抚顺分离株对SPF鸡胚肝组织氧化损伤的研究》文中研究说明禽心包积液-肝炎综合征（Hydropericardium hepatitis syndrome,HHS）是由血清4型禽腺病毒（Fowl adenovirus serotype-4,FAdV-4）引起的禽高度接触性传染病。该病1987年首次在巴基斯坦安哥拉地区爆发,因此又称为禽“安卡拉病”,目前该病在匈牙利、印度、美国、巴西、波兰等多国均曾发生。FAdV-4感染能够引发机体免疫抑制,导致其他疾病继发感染性增强。家禽感染后,以心包积液和肝脏坏死为主要病理变化,但是目前关于FAdV-4对禽类肝组织氧化损伤的影响尚不明确。本试验将探讨FAdV-4对SPF鸡胚肝组织造成的氧化损伤情况。本研究利用实验室保存的FAdV-4抚顺株,接种11日龄SPF鸡胚尿囊腔,感染7d后剖检,观察其损伤情况,同时采取鸡胚肝组织。一部肝组织用10%福尔马林固定,制作石蜡切片,HE染色后进行组织病理学观察;另一部分肝组织,用于肝组织氧化损伤研究:一是肝组织氧化损伤相关指标:利用试剂盒检测鸡胚肝脏中丙二醛（MDA）含量、总超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活力;二是探讨肝组织氧化损伤Nrf2/HO-1通路:运用荧光定量PCR方法检测Nrf2、HO-1的mRNA水平;采用蛋白免疫印迹技术判断肝细胞中细胞浆、细胞核内Nrf2蛋白表达情况,从而探讨FAdV-4对SPF鸡胚肝脏氧化损伤机理。结果:鸡胚感染FAdV-4后可见鸡胚发育迟缓,剖检可见肝脏呈现黄绿色,表面有出血斑点。组织病理学结果显示,感染鸡胚肝细胞发生严重的水泡变性,细胞核碎裂、溶解,中央静脉和窦状隙扩张,充满大量红细胞。与对照组相比,试验组MDA含量极显着升高（p<0.01）,SOD活力极显着下降（p<0.01）,说明FAdV-4能够破坏鸡胚肝脏氧化还原稳态。细胞浆中Nrf2蛋白表达量显着下降（p<0.05）,细胞核中Nrf2蛋白表达量显着升高（p<0.05）,试验组Nrf2及HO-1 mRNA表达量极显着下降（p<0.01）,该结果表明FAdV-4能够激活Nrf2,发生了核转位,但抑制了肝细胞中Nrf2/HO-1通路关键因子Nrf2和HO-1的表达。综上所述,SPF鸡胚感染抚顺株FAdV-4后,能够引起明显眼观病理变化和组织病理学损伤,并诱发肝脏发生氧化损伤反应。Nrf2/HO-1通路中关键因子的表达情况表明,FAdV-4可能通过下调Nrf2/HO-1通路,从而诱导SPF鸡胚肝脏发生氧化损伤。本试验结果为揭示FAdV-4感染SPF鸡胚肝组织氧化损伤的机制提供了理论依据,同时为有效防治心包积液-肝炎综合征、针对Nrf2/HO-1通路中关键分子药物的研发奠定了基础。
二、HCV RNA含量与肝脏组织病理学损伤之间的关系（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HCV RNA含量与肝脏组织病理学损伤之间的关系（论文提纲范文）
（2）杜仲桃叶珊瑚苷对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 中药杜仲对肝缺血再灌注损伤保护作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）芝麻活性成分调控FXR/SHP/LXR信号改善肝纤维化进程的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 表1 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肝纤维化的研究现状 |
| 1.1.1 化学合成药物抗肝纤维化研究进展 |
| 1.1.2 中药抗肝纤维化研究进展 |
| 1.2 肝纤维化的诱发因素 |
| 1.3 肝纤维化的发展机理 |
| 1.4 调控肝纤维化的信号靶点 |
| 1.4.1 TGF-β/smads调控肝纤维化 |
| 1.4.2 PI3K/Akt/mTOR调控肝纤维化 |
| 1.4.3 TLR4/My D88/NF-kB调控肝纤维化 |
| 1.4.4 FXR/SHP/LXR调控肝纤维化 |
| 1.5 本研究的目的 |
| 第二章 芝麻素通过介导 FXR/SHP 信号交互调控炎症减轻肝纤维化 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料及方法 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 动物饲养 |
| 2.3.2 血清AST/ALT的测定 |
| 2.3.3 制备肝脏切片 |
| 2.3.4 H&E染色 |
| 2.3.5 Masson染色 |
| 2.3.6 Sirius Red染色 |
| 2.3.7 IHC染色 |
| 2.3.8 组织免疫荧光 |
| 2.3.9 实验细胞的培养 |
| 2.3.10 细胞生存率检测 |
| 2.3.11 细胞荧光染色检测 |
| 2.3.12 细胞基因沉默实验 |
| 2.3.13 蛋白印迹实验 |
| 2.3.14 qRT-PCR检测 |
| 2.3.15 统计学处理 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 SES改善血清生化指标升高及组织病理学变化 |
| 2.4.2 SES改善小鼠肝脏胶原沉积 |
| 2.4.3 SES增强FXR/SHP信号干预肝纤维化 |
| 2.4.4 SES抑制肝纤维化中炎症细胞因子的产生 |
| 2.4.5 SES抑制TGF-β诱导的HSCs中纤维化标志蛋白的表达 |
| 2.4.6 SES抑制HSCs中炎症细胞因子的产生 |
| 2.4.7 SES调控FXR介导的SHP信号抑制HSCs的激活 |
| 2.4.8 SES通过siFXR介导SHP减少HSCs的活化 |
| 2.4.9 SES通过调控si SHP介导FXR减少HSCs的活化 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 芝麻酚靶向FXR/LXR信号交互参与巨噬细胞和肝星状细胞串扰改善肝纤维化 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验仪器与试剂 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 实验动物模型建立 |
| 3.3.2 血清AST/ALT测定 |
| 3.3.3 制备石蜡切片 |
| 3.3.4 HE染色 |
| 3.3.5 Masson染色 |
| 3.3.6 Sirius Red染色 |
| 3.3.7 组织免疫荧光染色 |
| 3.3.8 实验细胞培养 |
| 3.3.9 细胞生存率检测 |
| 3.3.10 细胞荧光染色检测 |
| 3.3.11 细胞基因沉默实验 |
| 3.3.12 蛋白印迹实验 |
| 3.3.13 qRT-PCR检测 |
| 3.3.14 RT-PCR检测 |
| 3.3.15 统计学处理 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 DER改善血清生化指标及组织病理学的改变 |
| 3.4.2 DER改善肝纤维化中胶原累积 |
| 3.4.3 DER抑制TAA诱导的小鼠肝脏炎症 |
| 3.4.4 DER参与FXR/LXR信号介导的自噬改善肝纤维化 |
| 3.4.5 DER改善TAA或 RA诱导的血清生化指标及病理学的改变 |
| 3.4.6 DER抑制肝脏自噬 |
| 3.4.7 DER抑制TAA诱导的炎症细胞因子的产生 |
| 3.4.8 DER抑制活化HSCs中纤维化标志蛋白的表达 |
| 3.4.9 DER减少活化HSCs中炎症细胞因子的产生 |
| 3.4.10 DER调控FXR/LXR和自噬信号逆转HSCs的激活 |
| 3.4.11 DER作用同3-MA抑制HSCs的自噬及炎症因子的表达 |
| 3.4.12 DER抑制巨噬细胞的上清液激活的肝星状细胞自噬 |
| 3.4.13 DER抑制巨噬细胞的上清液激活的肝星状细胞炎症的表达 |
| 3.4.14 DER通过siATG7 抑制自噬减少肝星状细胞的激活 |
| 3.4.15 DER调节FXR/LXRα及炎症因子在基因水平上的表达 |
| 3.4.16 DER激活FXR抑制肝星状细胞的激活和自噬 |
| 3.4.17 DER激活LXRs抑制肝星状细胞的激活和自噬 |
| 3.4.18 FXR/LXR参与巨噬细胞和肝星状细胞间的串扰 |
| 3.4.19 DER靶向FXR/LXR交互参与细胞串扰抑制肝星状细胞激活 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 发表论文 |
| 附录2 研究生期间获奖情况 |
（4）穿心莲内酯对酒精性肝损伤保护作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肝脏疾病 |
| 1.2 酒精性肝损伤 |
| 1.2.1 酒精消费的现状 |
| 1.2.2 长期饮酒的危害 |
| 1.2.3 酒精性肝病的临床诊断 |
| 1.2.4 酒精性肝病的流行病学特征 |
| 1.2.5 酒精性肝损伤的危险因素 |
| 1.2.6 酒精性肝损伤的发生机制 |
| 1.2.7 酒精性肝损伤的药物治疗 |
| 1.3 穿心莲内酯 |
| 1.3.1 穿心莲内酯的生物学活性 |
| 1.3.2 穿心莲内酯的临床应用研究 |
| 1.4 选题内容、目的及创新点 |
| 1.4.1 主要研究内容 |
| 1.4.2 本论文的研究目标 |
| 1.4.3 本论文的特色及创新之处 |
| 第2章 穿心莲内酯的文献研究及临床应用现状分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 穿心莲内酯相关研究的文献计量分析 |
| 2.2.1 材料与方法 |
| 2.2.2 结果 |
| 2.3 穿心莲内酯临床应用的病例分析 |
| 2.3.1 对象与方法 |
| 2.3.2 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 穿心莲内酯对酒精性肝损伤的保护作用及其机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 细胞学实验 |
| 3.2.1 材料与方法 |
| 3.2.2 结果 |
| 3.3 动物实验 |
| 3.3.1 材料与方法 |
| 3.3.2 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 酒精性肝损伤的模型 |
| 3.4.2 酒精性肝损伤的判定指标 |
| 3.4.3 酒精性肝损伤的分子机制 |
| 3.4.4 酒精性肝损伤的保护药物 |
| 3.5 不足与展望 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）基于PKCα/Nrf2/ROS通路探讨柔肝化纤颗粒抗肝纤维化大鼠的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1 现代医学对肝纤维化的认识与研究 |
| 1.1 现代医学对肝纤维化流行病学的认识 |
| 1.2 现代医学对肝纤维化发病机制的研究 |
| 1.2.1 肝星状细胞与肝纤维化 |
| 1.2.2 肝细胞与肝纤维化 |
| 1.2.3 枯否细胞与肝纤维化 |
| 1.3 西医治疗 |
| 1.3.1 药物治疗 |
| 1.3.2 肝脏移植 |
| 2 中医药对肝纤维化的认识与研究 |
| 2.1 中医学对肝纤维化病名的沿革 |
| 2.2 中医学中肝纤维化的病因病机 |
| 2.3 中医学对肝纤维化的辨证论治 |
| 2.4 中药对肝纤维化的认识与研究 |
| 2.4.1 单味中药 |
| 2.4.2 中药复方 |
| 2.4.3 针灸治疗及其他 |
| 第二部分 实验内容 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 主要实验试剂配制 |
| 1.4.1 药物 |
| 1.4.2 50%的CCl4 溶液配制 |
| 1.4.3 制备秋水仙碱 |
| 1.4.4 制备10%的水合氯醛 |
| 1.4.5 制备4%多聚甲醛固定液 |
| 1.4.6 封闭液 |
| 1.4.7 2XSDS蛋白上样缓冲液 |
| 1.4.8 电泳液 |
| 1.4.9 1X转膜液 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 肝纤维化大鼠模型的制备及给药方法 |
| 2.1.1 分组方法 |
| 2.1.2 造模方法 |
| 2.1.3 给药方法 |
| 2.2 标本采集 |
| 2.2.1 血清标本的采集 |
| 2.2.2 肝脏病理切片制备 |
| 2.3 HE染色制备 |
| 2.4 Masson染色制备 |
| 2.5 血清中ROS、MDA、SOD、GSH-Px含量的测定 |
| 2.6 肝组织中PKCα、Nrf2、HO-1、NQO1、α-SMA、E-Cadherin、Collagen I、Collagen III m RNA表达 |
| 2.6.1 肝组织样本的采集 |
| 2.6.2 肝组织内总RNA的提取 |
| 2.6.3 RNA浓度的测定 |
| 2.6.4 反转录反应 |
| 2.6.5 Real-time q PCR扩增 |
| 2.7 肝组织中PKCα、Nrf2、HO-1、NQO1、α-SMA、E-Cadherin、CollagenI、Collagen III蛋白的表达 |
| 2.7.1 组织样本的采集 |
| 2.7.2 肝组织内总蛋白的提取 |
| 2.7.3 总蛋白的保存 |
| 2.7.4 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 2.7.5 转膜 |
| 2.7.6 封闭 |
| 2.7.7 孵育抗体 |
| 2.7.8 发光显影 |
| 2.8 统计学处理 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 柔肝化纤颗粒对肝纤维化大鼠肝脏病理学形态的影响 |
| 3.1.1 大鼠一般情况 |
| 3.1.2 肝脏组织肉眼变化 |
| 3.1.3 肝组织病理学观察 |
| 3.2 柔肝化纤颗粒对肝纤维化大鼠血清中ROS、MDA、SOD、GSH-Px的影响 |
| 3.2.1 柔肝化纤颗粒对血清中ROS表达的影响 |
| 3.2.2 柔肝化纤颗粒对血清中MDA含量的影响 |
| 3.2.3 柔肝化纤颗粒对血清中SOD含量的影响 |
| 3.2.4 柔肝化纤颗粒对血清中GSH-Px含量的影响 |
| 3.3 柔肝化纤颗粒对肝纤维化大鼠PKCα/Nrf2 通路中PKCα、Nrf2、HO-1、NQO1、α-SMA、E-Cadherin、Collagen I、Collagen III m RNA表达的影响 |
| 3.3.1 柔肝化纤颗粒对PKCαmRNA表达的影响 |
| 3.3.2 柔肝化纤颗粒对Nrf2 mRNA表达的影响 |
| 3.3.3 柔肝化纤颗粒对HO-1 mRNA表达的影响 |
| 3.3.4 柔肝化纤颗粒对NQO1 mRNA表达的影响 |
| 3.3.5 柔肝化纤颗粒对α-SMA mRNA表达的影响 |
| 3.3.6 柔肝化纤颗粒对E-Cadherin mRNA表达的影响 |
| 3.3.7 柔肝化纤颗粒对Collagen I mRNA表达的影响 |
| 3.3.8 柔肝化纤颗粒对Collagen III mRNA表达的影响 |
| 3.4 柔肝化纤颗粒对肝纤维化大鼠PKCα/Nrf2 通路中PKCα、Nrf2、HO-1、NQO1、α-SMA、E-Cadherin、Collagen I、Collagen III蛋白表达的影响 |
| 3.4.1 柔肝化纤颗粒对PKCα蛋白表达的影响 |
| 3.4.2 柔肝化纤颗粒对Nrf2 蛋白表达的影响 |
| 3.4.3 柔肝化纤颗粒对HO-1 蛋白表达的影响 |
| 3.4.4 柔肝化纤颗粒对NQO1 蛋白表达的影响 |
| 3.4.5 柔肝化纤颗粒对α-SMA蛋白表达的影响 |
| 3.4.6 柔肝化纤颗粒对E-Cadherin蛋白表达的影响 |
| 3.4.7 柔肝化纤颗粒对Collagen I蛋白表达的影响 |
| 3.4.8 柔肝化纤颗粒对Collagen III蛋白表达的影响 |
| 4.讨论 |
| 4.1 柔肝化纤颗粒抗肝纤维化的理论基础 |
| 4.1.1 柔肝化纤颗粒抗肝纤维化的疗效研究 |
| 4.1.2 柔肝化纤颗粒抗肝纤维化的机制研究 |
| 4.2 氧化应激反应与肝纤维化 |
| 4.3 PKCα/Nrf2/ROS信号通路与肝纤维化 |
| 4.4 α-SMA、E-cadherin与肝纤维化 |
| 4.5 Collagen I、Collagen III表达与肝纤维化 |
| 4.6 展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 氧化应激在肝脏疾病中的作用及相关治疗策略 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及发表论文和参加科研情况说明 |
（6）DNMT3A介导LncRNA ANRIL甲基化促进肝纤维化的分子机制（论文提纲范文）
| 英文缩略词表(Abbreviation) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 临床肝纤维化患者样本中DNMT3A、ANRIL、α-SMA、Collagen I的差异表达 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 小结 |
| 第二部分 小鼠肝纤维化组织和肝星状细胞中DNMT3A、ANRIL、α-SMA、Collagen I的表达及ANRIL启动子区域甲基化水平 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三部分 DNMT3A 介导 ANRIL 甲基化在肝纤维化与 HSCs增殖中的分子作用机制 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 全文总结 |
| 本论文的创新性及特色 |
| 有待进一步研究的问题 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
| 综述 表观遗传调控肝纤维化中炎症与HSCs激活:聚焦DNA甲基化和组蛋白修饰 |
| 参考文献 |
（7）基于微生物组学的慢性肝病临床特点及粪菌移植延缓肝硬化大鼠疾病进程的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 慢性肝病的研究进展 |
| 1.1.1 病毒性肝病 |
| 1.1.2 酒精性肝病 |
| 1.1.3 非酒精性脂肪肝 |
| 1.1.4 药物性肝病 |
| 1.1.5 自身免疫性肝病 |
| 1.2 肠道微生态与慢性肝病的研究进展 |
| 1.2.1 肠道菌群的概念 |
| 1.2.2 肠-肝轴学说 |
| 1.2.3 肠道菌群与慢性肝病的研究进展 |
| 1.2.4 FMT在肝病治疗中的应用进展 |
| 1.3 本课题的设计思路 |
| 第2章 慢性肝病患者肠道菌群结构多样性研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 研究对象与分组 |
| 2.1.2 粪便样本采集与DNA提取 |
| 2.1.3 16S rRNA V4 区扩增与纯化 |
| 2.1.4 16S rRNA测序和生物信息学分析 |
| 2.1.5 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 患者临床信息统计 |
| 2.2.2 16SrRNA测序深度 |
| 2.2.3 慢性肝病患者肠道菌群物种多样性的差异分析 |
| 2.2.4 慢性肝病患者肠道菌群门和属水平的差异性分析 |
| 2.2.5 肝硬化组、LC-HCC组和NLC-HCC组中肠道菌群物种多样性分析 |
| 2.2.6 肝硬化组、LC-HCC组,NLC-HCC组肠道菌群门和属水平的差异性分析 |
| 2.2.7 肠道菌群紊乱与临床因素之间的关系 |
| 2.2.8 肠道菌群紊乱与HCC病因的关联分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 FMT对肝硬化大鼠的治疗作用及机制研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 FMT改善了各组大鼠的生活状态和生存时间 |
| 3.2.2 FMT延缓了各组大鼠的体重下降和腹水形成时间 |
| 3.2.3 FMT减轻肝损伤保护肝功能 |
| 3.2.4 FMT可改善肝硬化大鼠的肝纤维化发展进程 |
| 3.2.5 FMT可降低肝硬化大鼠血清中炎性细胞因子和内毒素含量 |
| 3.2.6 FMT可减少肝硬化大鼠肠道菌群的移位 |
| 3.2.7 FMT可改善肝硬化大鼠肠道粘膜的屏障功能 |
| 3.2.8 FMT抑制了肝硬化大鼠肝组织中TLR4 信号通路 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 FMT对肝硬化大鼠的肠道菌群组成与代谢的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 16SrRNA测序深度 |
| 4.2.2 FMT对肝硬化大鼠肠道菌群多样性的影响 |
| 4.2.3 FMT对肝硬化大鼠肠道菌群门和属水平的影响 |
| 4.2.4 UPLC-Q/TOF-MS的稳定性评估 |
| 4.2.5 FMT对肝硬化大鼠体内代谢组学的影响 |
| 4.2.6 FMT治疗后差异性代谢物鉴别 |
| 4.2.7 FMT对肝硬化大鼠相关代谢通路的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录图 |
| 附录表 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（8）MiR-223/中性粒细胞颗粒蛋白信号轴调控NASH相关肝纤维化的功能和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 NASH相关的肝脏炎症及肝纤维化 |
| 1.1.1 NASH的概念及流行病学特征 |
| 1.1.2 组织病理学特征及诊断标准 |
| 1.1.3 发病机制 |
| 1.2 中性粒细胞与肝脏天然免疫反应、肝脏代谢性炎症及其纤维化 |
| 1.2.1 中性粒细胞概述 |
| 1.2.2 中性粒细胞与肝脏天然免疫反应 |
| 1.2.3 中性粒细胞分泌的天然免疫介导因子 |
| 1.2.4 中性粒细胞在NASH相关的肝脏炎症及肝纤维化过程中发挥重要的生物学功能 |
| 1.3 MiR-223与中性粒细胞功能、肝脏代谢性炎症及肝纤维化 |
| 1.3.1 Micro RNA及 miR-223 概述 |
| 1.3.2 MiR-223调节中性粒细胞功能 |
| 1.3.3 MiR-223在肝脏代谢性炎症及纤维化过程中发挥重要功能 |
| 1.4 拟解决科学问题及研究意义 |
| 1.5 研究策略 |
| 第二章 实验方法、实验材料及仪器设备 |
| 2.1 实验方法 |
| 2.1.1 动物来源及饲养环境 |
| 2.1.2 样品收集 |
| 2.1.3 样品处理 |
| 2.1.4 病理学检测 |
| 2.1.5 蛋白检测 |
| 2.1.6 核酸检测 |
| 2.1.7 生化检测 |
| 2.1.8 肝非实质细胞(non-parenchymal cell,NPC)的分离 |
| 2.1.9 原代中性粒细胞分离、骨髓细胞分离 |
| 2.1.10 双荧光素酶报告基因检测 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 饲料 |
| 2.2.2 化学试剂 |
| 2.2.3 抗体 |
| 2.2.4 引物 |
| 2.3 仪器设备 |
| 2.4 溶液配方 |
| 第三章 NASH相关肝纤维化动物模型的诱导与评价 |
| 3.1 引言 |
| 3.1.1 NAFLD实验动物模型研究的现状与挑战 |
| 3.1.2 NAFLD理想动物模型的标准 |
| 3.1.3 目前NASH的动物模型及其优势和局限 |
| 3.1.4 研究目标与对策 |
| 3.2 NASH相关肝纤维化模型的诱导方案及结果 |
| 3.2.1 模型诱导方案 |
| 3.2.2 模型诱导结果 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 MiR-223 介导NASH相关肝纤维化的病理生理学功能研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 MiR-223 的肝内丰度在CDAHFD饮食饲喂小鼠中显着升高 |
| 4.3 成功获得miR-223 敲除(miR-223 KO或 miR-223-/-)小鼠 |
| 4.4 MiR-223 缺失对CDAHFD饮食诱导的NASH肝脏炎症及其相关肝纤维化的影响 |
| 4.4.1 实验方案 |
| 4.4.2 检测结果 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 MiR-223调控中性粒细胞肝脏浸润及其介导的炎症反应的功能研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 MiR-223 缺失显着增加CDAHFD饮食诱导小鼠中性粒细胞的肝脏浸润 |
| 5.3 MiR-223缺失导致中性粒细胞迁移能力增强 |
| 5.4 MiR-223 缺失显着增加CDAHFD饮食诱导小鼠肝脏中性粒细胞颗粒蛋白的表达 |
| 5.5 多种祛湿化浊中药可抑制免疫细胞中促炎性因子及颗粒蛋白的表达 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 MiR-223调控中性粒细胞颗粒蛋白表达的关键转录因子鉴定 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 技术路线 |
| 6.3 MiR-223调控中性粒细胞颗粒蛋白的关键转录因子的转录组结果 |
| 6.4 MiR-223调控中性粒细胞颗粒蛋白的关键转录因子的转录组测序结果的验证 |
| 6.5 双荧光素酶报告基因方法检测miR-223与转录因子的相互作用 |
| 6.5.1 实验方案 |
| 6.5.2 实验结果 |
| 6.6 MiR-223通过调控转录因子影响中性粒细胞颗粒蛋白的表达 |
| 6.7 小结 |
| 第七章 髓系细胞来源的miR-223在NASH相关肝纤维化中发挥重要功能 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 骨髓嵌合型小鼠的获得及NASH相关肝纤维化模型诱导 |
| 7.3 野生型小鼠骨髓细胞嵌合改变miR-223 敲除小鼠经CDAHFD饮食诱导的NASH肝脏炎症及其相关肝纤维化 |
| 7.3.1 野生型小鼠骨髓细胞嵌合改变miR-223 敲除小鼠经CDAHFD饮食诱导的NASH组织病理学特征 |
| 7.3.2 野生型小鼠骨髓细胞嵌合改变miR-223 敲除小鼠经CDAHFD饮食诱导的肝纤维化 |
| 7.3.3 野生型小鼠骨髓细胞嵌合改变miR-223 敲除小鼠经CDAHFD饮食诱导的肝损伤 |
| 7.4 野生型小鼠骨髓细胞嵌合不影响miR-223 敲除小鼠CDAHFD饮食诱导的肥胖代谢表型 |
| 7.5 小结 |
| 第八章 结论与展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略词 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（9）1型鸭肝炎强毒对成鸭致病、体内分布及免疫发生特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 常用英文缩写词汇 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 1型鸭肝炎概述 |
| 1.1.1 病毒分类 |
| 1.1.2 病原学和基因组结构 |
| 1.1.3 流行特点 |
| 1.1.4 体内分布特点 |
| 1.1.5 致病特点 |
| 1.1.6 防治措施 |
| 1.2 鸭抗病毒免疫研究概述 |
| 1.2.1 鸭抗病毒先天性免疫 |
| 1.2.2 鸭抗病毒适应性免疫 |
| 1.2.3 DHAV-1 感染诱导鸭免疫应答研究进展 |
| 1.3 选题目的及意义 |
| 第二章 1型鸭肝炎强毒感染诱发成年鸭急性和慢性肝炎 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病毒 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 试剂与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 试验设计 |
| 2.2.2 样品采集和处理 |
| 2.2.3 RNA的提取 |
| 2.2.4 c DNA的制备 |
| 2.2.5 一步法实时荧光定量检测样品DHAV-1 RNA拷贝数 |
| 2.2.6 相对荧光定量检测肝脏和血液免疫相关因子的转录水平 |
| 2.2.7 DHAV-1 诱导血清特异性抗体IgG、IgM和 IgA1 产生规律 |
| 2.2.8 流式细胞术检测肝脏DHAV-1 特异性CD4+和CD8+T 细胞 |
| 2.2.9 组织病理学检测 |
| 2.2.10 免疫组织化学法检测肝脏内DHAV-13D蛋白的分布 |
| 2.2.11 数据统计和分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 DHAV-1 感染成年鸭的临床和剖检症状 |
| 2.3.2 DHAV-1 在肝脏和血液的感染和增殖规律 |
| 2.3.3 DHAV-1 感染诱发急性和慢性肝炎 |
| 2.3.4 DHAV-1 诱导血清特异性Ig G、Ig M和 Ig A1 抗体的产生规律 |
| 2.3.5 DHAV-1 诱导肝脏内特异性T淋巴细胞反应 |
| 2.3.6 DHAV-1 诱导血液和肝脏先天性免疫应答反应 |
| 2.3.7 DHAV-1 与血液和肝脏免疫应答的相互作用 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 1型鸭肝炎强毒肾脏分布特性与持续性感染的形成 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 病毒 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 试剂与设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 实验设计 |
| 3.2.2 样品采集和处理 |
| 3.2.3 RNA的提取 |
| 3.2.4 c DNA的制备 |
| 3.2.5 一步法实时荧光定量检测DHAV-1 RNA拷贝数 |
| 3.2.6 相对荧光定量检测肾脏免疫相关因子的转录水平 |
| 3.2.7 组织病理学检测 |
| 3.2.8 免疫组织化学法检测DHAV-1 在肾脏的分布特点 |
| 3.2.9 免疫组织化学法检测肾脏特异性CD4/CD8+T 细胞的动态分布 |
| 3.2.10 数据分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 DHAV-1 在成年鸭肾脏的感染和分布特点 |
| 3.3.2 DHAV-1 感染引起肾脏的病理损伤 |
| 3.3.3 DHAV-1 诱导肾脏T细胞免疫应答特性 |
| 3.3.4 DHAV-1 诱导肾脏先天性免疫应答反应特性 |
| 3.3.5 DHAV-1 与肾脏免疫相关因子的相互作用关系 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 1型鸭肝炎强毒对淋巴器官的组织嗜性 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 病毒 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.1.3 试剂与设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 实验设计 |
| 4.2.2 样品采集和处理 |
| 4.2.3 RNA的提取 |
| 4.2.4 c DNA的制备 |
| 4.2.5 实时荧光定量检测DHAV-1 RNA拷贝数 |
| 4.2.6 相对荧光定量检测淋巴器官免疫相关因子的转录水平 |
| 4.2.7 免疫组织化学法检测DHAV-1 在淋巴器官的分布 |
| 4.2.8 数据分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 DHAV-1 在淋巴组织的感染特点 |
| 4.3.2 DHAV-1 诱导模式识别受体的转录变化 |
| 4.3.3 DHAV-1 诱导干扰素的转录变化 |
| 4.3.4 DHAV-1 诱导白介素的转录变化 |
| 4.3.5 DHAV-1 诱导MHC和 BAFF的转录变化 |
| 4.3.6 DHAV-1 诱导趋化因子和β-防御素的转录变化 |
| 4.3.7 DHAV-1 与淋巴器官免疫相关因子的相互作用关系 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 1型鸭肝炎强毒感染消化系统特点及诱导黏膜免疫 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 病毒 |
| 5.1.2 实验动物 |
| 5.1.3 试剂与设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 实验设计 |
| 5.2.2 样品采集和处理 |
| 5.2.3 RNA的提取 |
| 5.2.4 荧光定量检测DHAV-1 RNA拷贝数 |
| 5.2.5 间接ELISA检测胆汁特异性IgG、IgM和 IgA |
| 5.2.6 间接ELISA检测分泌液特异性IgG、IgM和 IgA |
| 5.2.7 免疫组织化学法检测IgA+细胞 |
| 5.2.8 数据分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 DHAV-1 在胰腺、食管和肠道的感染和分布规律 |
| 5.3.2 DHAV-1 诱导胆汁特异性抗体IgG、IgM和 IgA的产生规律 |
| 5.3.3 DHAV-1 诱导食管特异性抗体IgG、IgM和 IgA的分泌规律 |
| 5.3.4 DHAV-1 诱导肠道特异性抗体IgG、IgM和 IgA的分泌规律 |
| 5.3.5 DHAV-1 诱导食管IgA+细胞的分布 |
| 5.3.6 DHAV-1 诱导肠道IgA+细胞的分布 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 1型鸭肝炎强毒感染生殖系统特点及诱导黏膜免疫 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 病毒 |
| 6.1.2 实验动物 |
| 6.1.3 试剂与设备 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 实验设计 |
| 6.2.2 样品采集和处理 |
| 6.2.3 RNA的提取 |
| 6.2.4 荧光定量检测DHAV-1 RNA拷贝数 |
| 6.2.5 间接ELISA检测生殖系统分泌液特异性IgG、IgM和 IgA |
| 6.2.6 免疫组化法检测生殖道IgA+细胞 |
| 6.2.7 数据分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 DHAV-1 在生殖系统的感染和分布规律 |
| 6.3.2 DHAV-1 诱导生殖系统分泌液特异性IgG的产生 |
| 6.3.3 DHAV-1 诱导生殖系统分泌液特异性IgM的产生 |
| 6.3.4 DHAV-1 诱导生殖系统分泌液特异性IgA的产生 |
| 6.3.5 DHAV-1 诱导生殖道IgA+细胞的分布 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）FAdV-4抚顺分离株对SPF鸡胚肝组织氧化损伤的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 综述 |
| 1.1 I群禽腺病毒研究进展 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 理化特性 |
| 1.1.3 流行病学 |
| 1.1.4 流行现状 |
| 1.1.5 病理变化 |
| 1.1.6 FAdV-4 的致病机制 |
| 1.1.7 诊断与防治 |
| 1.2 氧化应激与病毒性肝损伤 |
| 1.3 转录因子NF-E2 相关因子2(Nrf2)的研究进展 |
| 1.3.1 Nrf2 与癌变 |
| 1.3.2 Nrf2 与药物性肝损伤 |
| 1.3.3 Nrf2 与非酒精性脂肪肝损伤 |
| 1.3.4 Nrf2 与纤维性肝损伤 |
| 1.3.5 Nrf2 与病毒性肝损伤 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 毒株 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要溶液配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 病毒TCID_(50)的测定 |
| 2.2.2 SPF鸡胚的感染 |
| 2.2.3 FAdV-4 鉴定 |
| 2.2.4 细菌培养试验 |
| 2.2.5 病理切片的制备与HE染色 |
| 2.2.6 肝组织中MDA含量的测定 |
| 2.2.7 肝组织中GSH-Px及 SOD活力的测定 |
| 2.2.8 肝组织内Nrf2/HO-1 通路中关键因子表达情况的测定 |
| 2.2.9 数据的统计与分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 FAdV-4 的鉴定 |
| 3.2 FAdV-4 病理组织学变化 |
| 3.3 肝组织中MDA含量的变化 |
| 3.4 肝组织中GSH-Px及 SOD活力的变化 |
| 3.5 肝组织内Nrf2/HO-1 通路的表达变化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 鸡胚感染 FAd V-4 后肝脏的病理学损伤 |
| 4.2 鸡胚感染FAdV-4 后氧化/抗氧化相关分子的表达变化 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、HCV RNA含量与肝脏组织病理学损伤之间的关系（论文参考文献）
- [1]肝癌免疫检查点抑制剂相关不良反应管理中国专家共识（2021版）[J]. 施国明,黄晓勇,任正刚,陈漪,程蕾蕾,杜世锁,方艺,葛宁灵,李爱民,李苏,李晓牧,卢倩,陆品相,孙建方,王汉萍,魏来,徐立,杨国欢,曾昭冲,张岚,张力,赵海涛,赵灵,赵明,周爱萍,刘荣乐,刘新会,伍家鸣,张莹,樊嘉,周俭,中华医学会肿瘤学分会肝癌学组. 中华消化外科杂志, 2021(12)
- [2]杜仲桃叶珊瑚苷对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究[D]. 张世龙. 遵义医科大学, 2021(01)
- [3]芝麻活性成分调控FXR/SHP/LXR信号改善肝纤维化进程的机制研究[D]. 侯丽爽. 延边大学, 2021(02)
- [4]穿心莲内酯对酒精性肝损伤保护作用的研究[D]. 宋远. 吉林大学, 2021(01)
- [5]基于PKCα/Nrf2/ROS通路探讨柔肝化纤颗粒抗肝纤维化大鼠的作用[D]. 吕艳杭. 广西中医药大学, 2021
- [6]DNMT3A介导LncRNA ANRIL甲基化促进肝纤维化的分子机制[D]. 杨晶晶. 安徽医科大学, 2021(01)
- [7]基于微生物组学的慢性肝病临床特点及粪菌移植延缓肝硬化大鼠疾病进程的机制研究[D]. 郑瑞鹏. 吉林大学, 2020(01)
- [8]MiR-223/中性粒细胞颗粒蛋白信号轴调控NASH相关肝纤维化的功能和机制研究[D]. 伍莉红. 广东药科大学, 2020(01)
- [9]1型鸭肝炎强毒对成鸭致病、体内分布及免疫发生特性研究[D]. 毛赛. 四川农业大学, 2019(07)
- [10]FAdV-4抚顺分离株对SPF鸡胚肝组织氧化损伤的研究[D]. 崔鹤. 沈阳农业大学, 2019(02)