一、膀胱灌注逆转录病毒载体HSV-TK基因治疗大鼠膀胱癌（论文文献综述）
蒋立[1]（2015）在《双歧杆菌介导HSV-tk/GCV治疗大鼠膀胱癌分子机制研究》文中指出膀胱癌（bladder cancer）是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤,同时也是全身十大常见肿瘤之一,严重威胁着人类健康。手术是治疗膀胱癌的主要手段,同时并辅以放化疗以及生物治疗,但复发率高,总体生存率仍不理想。因而,在最新的分子生物学研究成果基础上,进一步研发有效的膀胱癌治疗方法,具有重大的理论和现实意义。当前,基因治疗仍旧占据着肿瘤研究的前沿阵地,其中自杀基因疗法是近年来肿瘤基因治疗研究的主力军,单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（herpes simplex virus thymidine kinase, HSV-TK）/丙氧鸟苷（ganciclovir, GCV）作为目前研究最早最彻底并且最有效的自杀基因系统之一,在肿瘤基因治疗中扮演着不可或缺的角色。就肿瘤基因治疗的载体系统而言,目前主要有病毒载体和非病毒载体（脂质体等）,病毒载体本身有很多局限性,如病毒滴度低、宿主范围有限、插入宿主基因组可能引起突变及病毒本身缺乏安全性等缺点,脂质体等非病毒载体,普遍存在基因转染效率低、缺乏肿瘤特异靶向性等缺点,而双歧杆菌作为一种具有良好肿瘤靶向定植性的厌氧细菌很好的克服以往肿瘤基因治疗中缺乏肿瘤组织靶向性、安全性和转导效率低等“瓶颈”。前期实验中,我们采用双歧杆菌介导的HSV-TK/GCV治疗荷瘤大鼠膀胱癌,发现膀胱肿瘤体积缩小、重量减轻,肿瘤细胞凋亡明显增加。本课题拟在前期研究基础上,对双歧杆菌介导的HSV-TK/GCV治疗荷瘤大鼠膀胱癌组织进行比较蛋白质组学研究,寻求该治疗系统的作用靶标,并剖析靶标的功能,探索用双歧杆菌介导HSV-TK/GCV治疗荷瘤大鼠膀胱癌的分子机制。本论文分为二个部分。第一部分双歧杆菌介导HSV-TK/GCV治疗荷瘤大鼠胱肿瘤的蛋白学研究研究目的：应用iTRAQ蛋白质组学技术研究双歧杆菌介导HSV-TK/GCV治疗大鼠膀胱癌的差异表达蛋白,从整体水平上揭示该治疗系统的作用机制,并筛选关键靶蛋白。研究方法：1.运用N一甲基亚硝基脲（MNU）膀胱灌注法建立大鼠膀胱肿瘤原位模型,诱导结束后经B超检查和病理切片判断是否建模成功。2.然后将建模成功的60只SD大鼠随机分为4组：双歧杆菌/PGEX-5X-1空质粒对照组（BI/PGEX-1）、双歧杆菌/PGEX-tk重组质粒实验组（BI-TK）、双歧杆菌对照组（BI）和生理盐水对照组（normal saline）,每组15只,分别经大鼠尾静脉注射携带空质粒、重组质粒和未携带任何基因的双歧杆菌菌液lml（含婴儿双歧杆菌4.4×109个）以及生理盐水,每周给药1次,共4次。每只SD大鼠每天腹腔注射GCV（50mg/kg）,共4周。3.分别取各组中部分大鼠膀胱癌组织包埋于石蜡中用于后续免疫组化检测,提取各组膀胱癌总蛋白,依照说明书分别标记肽段,114标记生理盐水对照组,115标记BI-TK组,116标记BI/PGEX-1组,117标记BI组。MALDI-TOF/TOF进行质谱分析。4.差异蛋白质分析：利用ProteinPilot软件分析质谱数据,用IPI rat protein database v3.49软件搜索与质谱匹配的蛋白。采用PANTHER classification system （http://www.pantherdb.org）对差异蛋白进行GO分析,运用IPA （http://www.ingenuity.com）对差异蛋白的信号通路进行分析。5.验证差异蛋白的表达：采用蛋白质免疫印迹方法（Western blot）和免疫组化技术检测各组膀胱癌组织中差异蛋白表达情况,从而验证蛋白组学研究的可靠性。研究结果：1.MNU膀胱灌注法建立膀胱癌模型过程中,有7只大鼠因麻醉过量死亡,有5只不明原因死亡,最后剩余63只。经B超检查均发现膀胱内新生物出现,随机抽取3只大鼠取膀胱内新生物病理检查证实为膀胱癌,余下60只大鼠随机分为4组。2.质谱分析结果：实验共鉴定出膀胱癌差异蛋白402个,其中经过治疗系统处理后有192个蛋白表达下调,210个蛋白表达下调。进一步通过生物信息学发现,Peroxiredoxki-Ⅰ （Prx-Ⅰ）与NF-κB信号通路联系紧密,并且经过上述治疗系统处理后Prx-Ⅰ表达明显下调,加之我们前期实验发现该治疗系统能使激活型的Caspase3表达增加,从而导致肿瘤细胞凋亡明显增加,因而Prx-Ⅰ可能参与到该治疗系统的机制当中。3.差异蛋白的功能分析：根据生物信息功能注释,差异蛋白主要参与代谢过程（26.9%）、细胞过程（13.6%）和细胞通讯过程（20.0%）3种生物过程。根据分子功能注释,差异蛋白主要执行催化功能（36.8%）、结合功能（28.4%）和结构性分子功能（15.1%）3种生物功能。根据蛋白种类注释,主要包含氧化还原酶（9.8%）、细胞骨架蛋白（8.9%）、转移酶（7.1%）、核酸结合蛋白（6.8%）及酶调节剂（6.2%）5部分。4. Western Blot检测Prx-Ⅰ的蛋白表达：与其他三组对比,BI-TK组中Prx-Ⅰ蛋白的表达量明显下调（P<0.001）。Westem-blot结果与iTRAQ研究结果一致。5.免疫组化检测Prx-Ⅰ在膀胱癌组织的表达情况。经过该治疗系统处理后的大鼠膀胱癌组织中,Prx-Ⅰ的表达明显降低,表达降低具有显着的统计学差异（P<0.001）。免疫组化结果与iTRAQ和Western Blot结果一致。结论：1.蛋白组学的新技术iTRAQ具有精确的定量效果,而且具有较好的重复性,能够更好地了解双歧杆菌介导HSV-TK/GCV自杀基因治疗系统的相关分子机制,并且寻找到该治疗过程中表达的关键蛋白及信号通路。2. iTRAQ分析并鉴定出治疗前后的大鼠膀胱癌组织中差异表达蛋白402个,其中有192个蛋白表达下调,210个蛋白表达下调。通过生物信息学分析,Prx-Ⅰ与NF-κB信号通路联系紧密,加之前期实验结果,我们推测双歧杆菌介导HSV-TK/GCV自杀基因治疗系统是通过下调Prx-Ⅰ表达然后作用于NF-κB信号通路增加膀胱癌的凋亡从而达到治疗效果。3. Western Blot和免疫组化实验结果与iTRAQ分析结果一致,均证实治疗后Prx-Ⅰ蛋白在大鼠膀胱癌组织中表达水平明显下调,这一方面验证了iTRAQ技术的可靠性,另一方面为进一步研究双歧杆菌介导HSV-TK/GCV自杀基因治疗系统的作用机制提供了关键的候选靶点。第二部分Prx-Ⅰ在膀胱癌细胞中的作用及机制研究研究目的：1.构建Prx-Ⅰ干扰质粒shRNA转染膀胱癌细胞株T24,观察对膀胱癌细胞生物学行为的影响。2.研究Prx-Ⅰ与NF-κB信号通路的关系。研究方法：1.构建3条针对Prx-Ⅰ的干扰shRNA序列以及无关序列作为阴性对照,通过实时定量PCR （qPCR）和Western Blot筛选最适干扰序列。2.CCK8检测沉默Prx-Ⅰ基因表达后膀胱癌细胞T24的细胞增值能力。3.流式细胞仪检测沉默Prx-Ⅰ基因表达后膀胱癌细胞T24的凋亡与细胞周期情况。4.利用Western Blot检测沉默Prx-Ⅰ基因表达后膀胱癌细胞T24细胞核内phospho-NF-KB p50和p65表达,以反映NF-κB信号通路的活化情况。研究结果：1.抑制膀胱癌细胞T24中Prx-Ⅰ表达能抑制其增值能力,与无关序列组（4.51±0.73%）和空白对照组（4.96±0.46%）凋亡率相比,干扰组（21.99±1.10%）凋亡率明显升高（P<0.001）,并且G0/G1期所占比例,干扰组（61.13±.50%）远高于无关序列组（49.62±0.84%）和空白对照组（48.03±1.17%）,故抑制膀胱癌细胞T24中Prx-Ⅰ表达能阻滞膀胱癌细胞周期于G0/G1期（P<0.05）。2.抑制Prx-Ⅰ表达后膀胱癌细胞T24胞核内phospho-NF-KB p50 and p65表达降低。结论：1.抑制Prx-Ⅰ基因表达后可见膀胱癌细胞T24增值能力下降,并且凋亡增加,细胞周期阻滞于G0/G1期。2.抑制Prx-Ⅰ基因表达能抑制膀胱癌细胞T24胞核内phospho-NF-κB p50和p65表达,抑制NF-κB通路活化,从而导致膀胱癌细胞凋亡。
周守军[2]（2014）在《MUC4在膀胱癌中的表达及其启动子驱动HSV-tk腺病毒靶向杀伤膀胱癌细胞的研究》文中研究表明膀胱癌是我国泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一，其中移行细胞癌占膀胱癌90%以上。膀胱癌的发生进展是复杂的、多因素、多步骤的病理变化过程，既有内在的遗传因素，又有外在的环境因素，具有异源性、多中心、易复发及复发后恶性度增加的特点。目前大多数膀胱癌病因学研究集中于基因的改变。正常膀胱细胞恶变始于细胞DNA的改变，原癌基因突变后变为癌基因后，使细胞无节制的分裂，导致膀胱癌复发和进展。膀胱癌发生的另一个重要分子机制是编码调节细胞生长、DNA修复或凋亡的蛋白抑癌基因失活，使DNA受损的细胞不发生凋亡，导致细胞生长失控。此外，某些编码生长因子或其受体的正常基因的扩增或过表达，也与膀胱癌的发生进展相关。目前膀胱癌治疗以手术为主，辅以术后膀胱灌注化疗，但术后高复发率严重影响患者的生活质量。因此，研究膀胱癌的发生、发展、侵袭、转移等分子机制，对探寻膀胱癌真正理想治疗措施将具有十分重要意义。目前研究表明，膀胱癌的复发、浸润和转移由肿瘤细胞多种生物学行为决定，其中肿瘤细胞的粘附能力在肿瘤的复发、浸润及转移进展中具有重要作用。研究发现黏蛋白（mucin，MUC）与多种肿瘤的复发、浸润、转移有关。MUC4是黏蛋白家族中的重要一员，研究发现其具有潜在癌基因特性，可作为部分肿瘤发展进程中的标记物。目前研究表明，MUC4在胰腺癌、卵巢癌、食管鳞状细胞癌、头颈部鳞状细胞癌等多种恶性肿瘤中均存在异常表达，可作为它们发展进程中的标记物。同时，研究发现MUC4可通过多种机制参与肿瘤发生、发展，如细胞间粘附、细胞信号转导、细胞凋亡等。近年来研究发现，MUC1与泌尿生殖肿瘤密切相关。运用单克隆抗体检测膀胱癌组织，发现癌组织样本中MUC1表达率较非癌组织明显增高，证实MUC1在膀胱癌组织中异常高表达，可能是膀胱恶性演进和淋巴结转移的标志。同时还有MUC1基因在前列腺癌和肾癌中均存在异常表达，且肾癌中其表达高低与其转移及预后相关的研究报道。MUC1基因与泌尿生殖肿瘤，特别是与膀胱癌的发生和发展密切相关，我们课题组在前期应用二代基因测序技术对膀胱肿瘤外显子捕获的研究中发现：MUC4基因在膀胱肿瘤组织中高表达。目前国内外关于MUC4基因在膀胱癌中的研究极少，而同为黏蛋白家族的重要成员MUC4是否与膀胱癌密切相关？因此，本课题进行了以下两部分的实验研究。第一部分：膀胱癌细胞株及膀胱癌组织中MUC4基因的表达目的：探讨MUC4基因在HT1376、T24膀胱癌细胞株、膀胱癌组织、癌旁组织及正常膀胱粘膜组织中的表达情况。方法：运用荧光定量PCR （QT-PCR）和Western blot方法检测HT1376、T24两种膀胱癌细胞株及正常膀胱粘膜上皮细胞株中MUC4基因mRNA与蛋白的表达。应用QT-PCR检测9对匹配的膀胱癌、癌旁组织及正常膀胱粘膜组织，共27例标本中MUC4mRNA的表达，其中膀胱癌组织均为移行细胞癌，病理证实浅表性6例，浸润性3例。应用免疫组化检测64例膀胱组织（癌组织34例，癌旁组织20例，正常组织10例）中MUC4蛋白表达情况。结果：通过QT-PCR检测MUC4的mRNA表达：在HT1376、T24细胞株及正常膀胱粘膜上皮细胞株中其相对表达量分别为13.746±0.309、3.501±0.286、0.914±0.100；在9对匹配组织中，其在癌、癌旁及正常膀胱粘膜中相对表达量分别为10.673±2.797、2.679±0.488、0.610±0.294。与正常膀胱粘膜相比，MUC4的mRNA在膀胱癌细胞株及膀胱癌组织中呈高表达，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与癌旁组织相比，MUC4mRNA在膀胱癌组织中表达量高于癌旁组织，差异具有统计学意义（P＜0.05）；其在癌旁组织中表达高于正常膀胱粘膜，差异具有统计学意义（P＜0.05）。通过Western blotting检测，MUC4蛋白在HT1376、T24膀胱癌细胞株中呈高表达，在HT1376细胞中表达量高于T24细胞，差异具有统计学意义（P＜0.05）。34例膀胱癌组织中，免疫组化检测显示MUC4蛋白阳性表达27例，阳性率为79.4%；20例癌旁组织中MUC4阳性表达10例，阳性率为50.0%；10例正常组织中MUC4阳性表达3例，阳性率30.0%，组间差异有统计学意义（P<0.05）；癌旁组织和正常组织中MUC4蛋白表达的结果与mRNA的表达情况相似。MUC4蛋白表达与膀胱癌临床分期无关，与膀胱癌病理分级相关（P＜0.05）。结论：MUC4基因在HT1376、T24膀胱癌细胞株、膀胱癌组织中呈高表达；初步认为MUC4蛋白表达程度与膀胱癌病理分级相关，提示MUC4基因可能作为高级别膀胱癌的候选靶基因，在膀胱癌进展中发挥重要作用。第二部分：MUC4启动子驱动HSV-tk腺病毒对膀胱癌细胞靶向杀伤作用目的：探讨MUC4启动子驱动HSV-tk腺病毒靶向杀伤膀胱癌细胞并引起细胞的凋亡。方法：克隆MUC4启动子活性序列，利用重组荧光素酶检测系统检测其在HT-1376和T24两种膀胱癌细胞中的转录活性，以腺病毒系统为载体，构建MUC4启动子驱动下的HSV-tk重组腺病毒，激活MUC4启动子信号调控的转录活性，驱动下游HSV-tk基因，与GCV联合，检测其对上述两种膀胱癌细胞的细胞毒作用。结果：通过构建稳定表达MUC4基因ATG上游启动子区域的重组腺病毒质粒，在HT-1376和T24膀胱癌细胞中具有强转录活性，而在对照组HFL1肺成纤维细胞中几乎无转录活性，提示MUC4启动子对其下游HSV-tk基因表达的转录调控具有肿瘤细胞特异性。本研究结果表明MUC4启动子驱动下的HSV-tk重组腺病毒与GCV联合能够诱导HT-1376和T24膀胱癌细胞凋亡，产生特异性靶向细胞毒作用。结论：通过激活MUC4启动子信号调控的转录活性，在MUC4启动子驱动下的HSV-tk重组腺病毒联合GCV对和HT-137和T24膀胱癌细胞具有较强靶向杀伤作用。
喻备[3]（2013）在《婴儿双歧杆菌介导HSV-TK/GCV治疗大鼠膀胱癌的实验研究》文中进行了进一步梳理目的：评价婴儿双歧杆菌（BI）介导单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）/更昔洛韦（GCV）自杀基因治疗系统对SD大鼠膀胱癌的治疗效果，探讨其诱导大鼠膀胱癌组织细胞的凋亡及对大鼠膀胱癌组织Fas/FasL mRNA和蛋白表达的影响。方法：（1）构建重组质粒pGEX-TK。（2）构建婴儿双歧杆菌介导HSV-TK/GCV自杀基因治疗系统。（3）N－甲基亚硝基脲（MNU）膀胱灌注法诱导建立大鼠膀胱肿瘤模型，并随机分为生理盐水/GCV对照组（生理盐水组）、BI-pGEX-5X-1/GCV组（空质粒组）和BI-pGEX-TK/GCV治疗组（重组质粒组）。分别将生理盐水、BI-pGEX-5X-1、BI-pGEX-TK经尾静脉注射到各组荷瘤大鼠体内，联合腹腔注射GCV，疗程共4周。（4）治疗4周后，称取各组膀胱癌组织重量；TUNEL法检测各组肿瘤组织凋亡；RT-PCR、蛋白质印迹法（WB）检测各组肿瘤组织Fas/FasL mRNA及蛋白表达水平。结果：（1）成功构建重组质粒pGEX-TK。（2）成功构建婴儿双歧杆菌介导HSV-TK/GCV自杀基因治疗系统。（3）重组质粒组荷瘤大鼠膀胱重量与空质粒组及生理盐水组相比明显降低，具有统计学意义（P<0.01）。（4）TUNEL法检测发现各组均出现不同程度的肿瘤细胞凋亡，与空质粒组及生理盐水组相比，重组质粒组凋亡最为显着（P<0.01）。（5）与空质粒组及生理盐水组相比，重组质粒组的荷瘤大鼠膀胱癌肿瘤组织细胞Fas/FasL mRNA及其蛋白表达明显上调（P<0.05）。结论：（1）双歧杆菌介导HSV-TK/GCV自杀基因治疗系统对大鼠膀胱肿瘤生长有明显抑制作用。（2）双歧杆菌介导HSV-TK/GCV自杀基因治疗系统对大鼠膀胱肿瘤的抑瘤作用可能通过激活Fas/FasL凋亡途径，诱导大鼠膀胱肿瘤细胞的凋亡产生的。
殷祥瑞[4]（2013）在《双歧杆菌介导HSV-tk/GCV治疗大鼠膀胱癌的实验研究》文中研究说明目的：观察双歧杆菌介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）/丙氧鸟苷（GCV）治疗系统治疗大鼠膀胱癌的疗效及初步探讨其可能的作用机制。方法：N-甲基亚硝基脲（MNU）膀胱灌注法诱导大鼠膀胱肿瘤成功后随机分为3组，经大鼠尾静脉分别给予生理盐水（A组）、双歧杆菌/PGEX-5X-1空质粒（B组）、双歧杆菌/PGEX-tk重组质粒（C组），联合腹腔灌注GCV治疗，治疗结束后对比各组膀胱重量，TUNEL法检测各组凋亡情况，运用RT-PCR和Western blot方法检测各组肿瘤组织细胞色素C（Cyt-C）和caspase-9的mRNA和蛋白的表达。结果：C组膀胱重量明显低于A组和B组（P<0.001）；TUNEL法检测发现各组均出现不同程度的肿瘤细胞凋亡，以C组最为明显；C组中细胞色素C和caspase-9的mRNA和蛋白表达水平明显高于A组和B组（P<0.05）。结论：双歧杆菌介导的HSV-TK/GCV治疗系统治疗大鼠膀胱癌疗效显着；该治疗系统可能通过以细胞色素C为中心的内源性凋亡途径导致膀胱癌细胞凋亡。
喻备,王亚荣,殷祥瑞,唐伟[5]（2012）在《婴儿双歧杆菌介导HSV-TK/GCV自杀基因治疗系统对大鼠膀胱癌组织细胞凋亡及Fas/FasL表达的影响》文中提出目的评价婴儿双歧杆菌（BI）介导单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）/更昔洛韦（GCV）自杀基因治疗系统对SD大鼠膀胱癌的治疗效果,探讨其诱导大鼠膀胱癌组织细胞的凋亡及对大鼠膀胱癌组织Fas/FasL mRNA和蛋白表达的影响。方法 N-甲基亚硝基脲（MNU）膀胱灌注法诱导建立大鼠膀胱肿瘤模型,并随机分为生理盐水/GCV对照组（生理盐水组）、BI-pGEX-5X-1/GCV组（空质粒组）和BI-pGEX-TK/GCV治疗组（重组质粒组）。分别将生理盐水、BI-pGEX-5X-1、BI-pGEX-TK经尾静脉注射到各组荷瘤大鼠体内,联合腹腔注射GCV,治疗4周后,称取各组膀胱癌组织质量。TUNEL法检测各组肿瘤组织凋亡,RT-PCR、蛋白质印迹法（Western blot）检测各组肿瘤组织Fas/FasL mRNA及蛋白表达水平。结果与空质粒组及生理盐水组比较,重组质粒组荷瘤大鼠膀胱质量明显降低（P<0.01）;TUNEL法检测发现各组均出现不同程度的肿瘤细胞凋亡,与空质粒组及生理盐水组比较,重组质粒组凋亡最为显着（P<0.01）;与空质粒组及生理盐水组比较,重组质粒组的荷瘤大鼠膀胱癌肿瘤组织细胞Fas/FasL mRNA及其蛋白表达明显上调（P<0.05）。结论双歧杆菌介导HSV-TK/GCV自杀基因治疗系统对大鼠膀胱肿瘤生长有明显抑制作用,可能通过激活Fas/FasL凋亡途径,诱导大鼠膀胱肿瘤细胞的凋亡,从而发挥抑瘤作用。
吴刚[6]（2012）在《裸小鼠膀胱癌红色荧光原位模型的建立及丝裂霉素C膀胱灌注化疗的初步研究》文中指出研究背景：膀胱癌是我国最常见的泌尿系恶性肿瘤。膀胱癌的发生发展的生物学机制尚未完全明确,要研究膀胱癌及其治疗方法,开发治疗药物,建立理想的动物模型是必不可少的。由于原位移植模型能在动物上更好的模拟膀胱癌在人体中的生长情况,所以在众多的膀胱癌模型方法当中,当前大多数学者都致力于膀胱癌原位移植模模型的研究。膀胱癌原位移植模模型的建立方法也有很多,通常都是采用不同的方法破坏膀胱粘膜再灌注肿瘤细胞或者开腹直接将肿瘤细胞种植到膀胱壁内来构建模型。其中开腹直接将肿瘤细胞种植到膀胱壁内的方法具有成瘤率极高、成瘤时间短等优点,现已被广泛应用。但存在对动物损伤大,易感染等缺点,更简便、损伤更小的构建方法成为一个研究热点。通过我们自制的简易工具经尿道进行膀胱粘膜的切割能有效的损伤膀胱粘膜且能对损伤的位置具有选择性,对动物的损伤也更小。对已生长肿瘤的动物,传统的方法是在一定时间内的某几个特定的时间杀死动物进行观察,但随着分子影像学在近几年的飞速发展,使得对动物模型进行实时、非侵入性的观察已成为可能。尤其是小动物活体成像系统,以其高灵敏度、无需放射剂等特点更是为动物模型带来了极大的发展。目前,已经建立以绿色荧光蛋白（Green fluorescence protein, GFP）基因作为报告基因的膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤的原位GFP肿瘤的荧光模型。但目前红色荧光蛋白（Red fluorescence protein, RFP）用于构建肿瘤模型还不多见,我们用带有红色荧光蛋白的慢病毒载体标记人膀胱癌EJ细胞,以此细胞来构建原位膀胱癌模型。采用Roper活体动物荧光成像系统在体、动态非侵入性的观察肿瘤的生长过程。膀胱癌单纯手术切除术后复发率高,最常用的方法手术切除并结合抗癌药物的膀胱灌注,丝裂霉素C （Mitomycin C, MMC）是临床上常用的膀胱癌术后化疗药物之一,MMC的作用原理是可使膀胱癌细胞的DNA解聚并阻碍DNA的复制,从而抑制肿瘤细胞分裂,达到抗肿瘤的目的。我们在成功建立膀胱癌移植瘤模型后,对裸小鼠以MMC进行膀胱灌注化疗,空白组、对照组与药物治疗组通过统计分析观察MMC灌注的疗效。第一部分慢病毒介导的红色荧光蛋白报告基因对人膀胱癌EJ细胞的标记目的：以慢病毒介导红色荧光蛋白标记膀胱癌EJ细胞,并探索标记后的EJ细胞与标记前的细胞生物学特性有无明显变化以及红色荧光蛋白基因能否在EJ细胞稳定而持久的表达。为第二部分实验中构建裸小鼠膀胱癌红色荧光裸小鼠移植瘤模型作细胞准备。方法：人膀胱癌EJ细胞常规培养、传代,分成2组,在细胞处于对数生长期、状态最佳时以不同病毒感染复数（M0I）进行RFP慢病毒（Lentivirus）对EJ细胞感染的预实验,第l组在完全培养基中直接加入病毒液感染,第2组在感染时添加聚凝胺（Polybrene）,在荧光显微镜下观察细胞荧光的情况,在荧光显微镜下RFP荧光细胞记数,计算不同MOI值下细胞的感染率,获得最佳的MOI值、观察添加Polybrene对转染率有无明显提高并以最佳MOI值转染EJ细胞。获得持续性RFP阳性表达的EJ细胞（RFP/EJ）后继续培养传代到第3代后,每天进行细胞计数,连续计数8天后绘制成细胞生长曲线,划痕实验检测细胞迁徙能力。冻存细胞2个月后复苏观察荧光情况。将两种细胞分别种植于裸小鼠皮下,观察肿瘤生长情况并用动物活体荧光成像系统进行荧光观察。结果：采用RFP慢病毒（Lentivirus）成功的对EJ细胞的进行感染,添加聚凝胺（Polybrene）组在相同MOT值感染时的阳性率未明显高于未添加组的感染率；转染最佳的MOI值为20；感染后的细胞能在荧光显微镜下显示出较强的荧光,在体外可稳定表达及传代；冻存细胞2个月后复苏,细胞的转染率无明显变化；细胞生长曲线实验以及划痕试验显示,转染前后EJ细胞生长增殖速度无明显差异,转染后EJ细胞迁徙能力良好。将两种细胞分别种植于裸小鼠皮下,均可成瘤,种植RFP/RJ的裸鼠生长的皮下肿瘤在活体动物荧光成像系统下可发出红色荧光。结论：通过RFP慢病毒（Lentivirus）标记的EJ细胞,能够长时间的、稳定的在体外表达,且细胞特性与标记前无明显变化,可以用其进行下一部分建模实验。第二部分裸小鼠膀胱癌红色荧光原位移植瘤模型的建立及丝裂霉素C膀胱灌注化疗目的：以人膀胱癌EJ细胞为实验细胞、采用经腹膀胱壁下肿瘤细胞种植法和自制负压膀胱粘膜切割器经尿道切割膀胱粘膜损伤法来建立裸小鼠膀胱癌移植瘤模型；以红色荧光蛋白标记后的人膀胱癌EJ细胞为实验细胞、采用经腹膀胱壁下肿瘤细胞种植法建立裸小鼠膀胱癌红色荧光原位模型,建模成功后以丝裂霉素C膀胱灌注化疗,观察并分析治疗效果。方法：1.采用膀胱壁下细胞悬液注射法构建裸小鼠膀胱癌模型,病理切片证实膀胱癌的发生。2.以自制膀胱粘膜切割器法切割膀胱粘膜,病理切片证明能有效损伤膀胱粘膜,并在此法基础上膀胱灌注人膀胱癌EJ细胞构建裸小鼠膀胱癌模型。病理切片证实膀胱癌的发生。3.精心选取雌性裸小鼠60只,6周龄,体重18g±1.5g,随机分成空白组、对照组、药物治疗组,每组20只。空白组予生理盐水膀胱灌注,对照组、药物治疗组采用膀胱壁下细胞悬液注射法构建裸小鼠膀胱癌模型,活体动物荧光成像系统观察裸小鼠。4周后药物治疗组予丝裂霉素行膀胱灌注化疗,每周1次,每次1小时,一共进行4次。对照组4周后予生理盐水进行膀胱灌注。于第4周末、第8周末在对照组及用药组中随机抽取2只裸小鼠并处死,行膀胱病理学检查。于第9周第一天处死全部实验裸小鼠,以裸小鼠膀胱相对重量（即膀胱绝对重量与体重的比值）作为膀胱肿瘤的生长参数进行统计分析。活体动物荧光成像系统动态观察建模过程中肿瘤的变化。结果：1.以红色荧光蛋白标记后的人膀胱癌EJ细胞（RFP/EJ）成功构建膀胱癌红色荧光移植模型,膀胱壁下细胞悬液注射法建模成功率均可达到100%,自制膀胱粘膜切割器法成功率为60%。通过病理切片可证明使用自制膀胱粘膜切割器损伤膀胱粘膜并可采用此法构建膀胱癌移植瘤模型。活体动物荧光成像系统可观察到裸小鼠膀胱位置发出红色荧光。2.以膀胱相对重量作为膀胱肿瘤的生长参数,通过统计学分析,证明丝裂霉素C膀胱灌注能有效抑制裸小鼠EJ膀胱癌。结论：使用RFP/EJ建立裸小鼠红色荧光移植瘤模型以及使用活体动物荧光成像系统动态观察肿瘤生长情况是肿瘤模型研究当中的一种较新的、简便的、损伤小的方法,为肿瘤模型的研究提供了一些新的思路。丝裂霉素C作为目前临床上最为常用的膀胱癌灌注化疗药物,在裸小鼠膀胱癌的治疗当中是有效的,对丝裂霉素C的临床应用亦有一定的借鉴作用。此外,自制的膀胱粘膜切割器作为一种新型的、损伤极小的破坏裸小鼠膀胱粘膜的新方法,可以在今后的膀胱癌模型研究中推广使用。
朱煊[7]（2012）在《重组慢病毒CXCR7-shRNA对人膀胱癌细胞生物学行为影响的研究》文中认为第一章趋化因子受体CXCR7在人膀胱癌中的表达情况目的研究CXCR7在人膀胱癌中的表达情况并筛选高表达CXCR7的人膀胱癌细胞株进入后续实验方法1.采用免疫组织化学SABC法检测人膀胱癌、癌旁组织以及非癌膀胱组织中CXCR7的表达情况：分析CXCR7表达情况与膀胱癌病理分级、分期的关系；2.采用实时荧光定量PCR检测人膀胱癌5637和T24细胞株中CXCR7-mRNA的表达情况结果1CXCR7在膀胱癌中的表达明显要高于癌旁组织（p<0.05）及非癌膀胱组织（p<0.05）,癌旁组织和正常膀胱组织之间CXCR7的表达差异无显着性（p=0.55）；2.膀胱癌组织中CXCR7的表达量与癌细胞病理分级（p=0.011）及病理分期（p<0.05）相关。膀胱癌分化越差、分期越晚,CXCR7的表达量越高；3.CXCR7-mRNA在人膀胱癌5637细胞株中表达高于T24细胞株结论1.CXCR7在膀胱癌组织中高表达,且其表达水平与膀胱癌病理分级、分期呈正相关；2.人膀胱癌5637细胞株中CXCR7高表达,进入后续实验第二章构建以慢病毒为载体的CXCR7-shRNA目的筛选有效CXCR7-siRNA并构建LV-CXCR7-shRNA方法1.设计三条CXCR7-siRNA序列,构建pSilencerTM4.1-CXCR7-shRNA和pcDNA3.1（+）-CXCR7过表达质粒共转染293T细胞后,通过QPCR和western blot筛选干扰效果最佳的CXCR7-siRNA序列；2.以干扰效果最佳的CXCR7-siRNA为基础,采用Invitrogen公司生产的三质粒慢病毒载体系统（包括pAJ-U6--CMV-GFP/PuroR、 pMD2.G和psPAX2）构建LV-CXCR-shRNA,为后续实验做准备结果1.将构建成功的pSilencerTM4.1-CXCR7-shRNA-1、2、3干扰质粒,与pcDNA3.1（+）-CXCR7过表达质粒共转染293T细胞后,细胞中CXCR7-mRNA和蛋白表达明显下调（p<0.05）,CXCR7-mRNA表达下调比例分别为93.0%、91.54%和89.06%。2.以CXCR7-siRNA-1为基础构建的LV-CXCR7-shRNA测序结果显示,重组质粒无突变和插入,结果符合预期；3.重组慢病毒质粒大量包装后滴度测定结果为4.2×108,符合后续实验要求结论CXCR7-siRNA-1为干扰效果最好序列,以此序列为基础成功构建LV-CXCR7-shRNA第三章LV-CXCR7-shRNA干扰质粒对人膀胱癌5637细胞生物学行为的影响目的研究LV-CXCR7-shRNA对5637细胞的干扰效果方法将培养好的5367细胞分为三组：实验组转染LV-CXCR7-shRNA质粒；阴性对照组转染LV-shRNA阴性对照质粒；空白组转染空白慢病毒质粒。转染后,1.分别采用QPCR和western blot检测各组细胞中CXCR7-mRNA和蛋白的表达情况；2.MTT实验检测各组细胞的增殖能力；3.Transwell实验检测各组细胞的侵袭能力结果1.所构建的重组质粒均成功转染至各组5637细胞中；2.经过QPCR及western blot检测,shRNA组（实验组）细胞中的CXCR7-mRNA和相应蛋白的表达量较Con组（阴性对照组）和NC组（空白组）明显下调（p<0.05）；3.MTT实验显示shRNA组细胞增殖能力较Con组和NC组下降（p<0.05）;4.Transwell实验显示shRNA组细胞侵袭能力较Con组和NC组下降（p<0.05）结论CXCR7与人膀胱癌5637细胞株的增殖能力和侵袭性相关,通过LV-CXCR7-shRNA下调CXCR7的表达可降低5637细胞的增殖和侵袭能力
翟振兴[8]（2012）在《携带E1A-雄激素受体（AR）的膀胱肿瘤特异性溶瘤腺病毒的抗膀胱肿瘤研究》文中认为目的：研究重组腺病毒Ad/PSCAE/UPII/E1A-AR, Ad/PSCAE/UPII/E1A, Ad/PSCAE/UPII/Luc的体内外抗膀胱肿瘤效应,探索其中可能存在的机制,为膀胱癌的临床研究提供基础理论和基本数据,为膀胱癌的治疗提供一种的新的治疗策略。方法：HEK293扩增重组腺病毒,氯化铯密度梯度离心,TCID50测定滴度,经PCR确认各基因片段的正确性。重组腺病毒感染膀胱肿瘤细胞EJ、5637、BIU87、T24,正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1及肝癌细胞SMMC-7721,联合雄激素受体激动剂R1881及雄激素受体拮抗剂氟他胺进行干预,观察细胞形态学变化,MTT法进行抗细胞增殖研究,结晶紫染色检测细胞毒性。RT-PCR、western blot检测E1A基因的转录和翻译。为了研究重组腺病毒发挥作用的可能机制,我们检测了caspase3的酶活性、细胞周期的变化,透射电镜观察感染病毒后的膀胱肿瘤细胞的超微结构变化,TUNEL观察肿瘤细胞的凋亡。另外,建立皮下膀胱肿瘤裸鼠模型,随机分为4组：生理盐水组、Ad/PSCAE/UPII/E1A-AR处理组、Ad/PSCAE/UPII/E1A处理组、Ad/PSCAE/UPII/Luc处理组。给予瘤体内多点注射重组腺病毒。实验结束时对肿瘤及主要脏器进行取材,HE染色观察病理学变化；提取组织RNA及蛋白,RT-PCR、western blot检测E1A基因的转录和翻译。电镜观察肿瘤组织内病毒的分布。结果：成功获得高滴度、高纯度重组腺病毒,重组腺病毒可有效抑制膀胱肿瘤细胞的增殖,并呈剂量、时间依赖性,而对正常膀胱上皮细胞及非膀胱肿瘤细胞未见明显影响。R1881可增强重组腺病毒的抗增殖效应,而氟他胺对该效应未见明显影响。通过流式细胞仪检测细胞周期,发现重组腺病毒感染后G1期膀胱肿瘤细胞明显增多；与Ad/PSCAE/UPII/Luc相比,Ad/PSCAE/UPII/E1A-AR、 Ad/PSCAE/UPII/E1A感染后的膀胱肿瘤细胞具有较高的caspase3酶活性。透射电镜显示重组腺病毒感染后的膀胱肿瘤细胞内出现大量病毒颗粒,并见到染色质凝聚、核断裂,而未感染重组腺病毒的膀胱肿瘤细胞内未发现该现象。通过免疫荧光染色发现AR位于细胞核内,而CAR位于细胞膜表面。TUNNEL分析发现重组腺病毒Ad/PSCAE/UPⅡ/E1A、Ad/PSCAE/UPII/E1A-AR感染后的膀胱肿瘤细胞在荧光显微镜下可看到大量凋亡细胞。通过RT-PCR及western blot发现感染Ad/PSCAE/UPⅡ/E1A、Ad/PSCAE/UPII/E1A-AR后的膀胱肿瘤细胞高表达E1A,而正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1未检测到。与Ad/PSCAE/UPⅡ/Luc治疗组、生理盐水组相比,Ad/PSCAE/UPⅡ/E1A、Ad/PSCAE/UPII/E1A-AR显着抑制荷瘤裸鼠肿瘤的生长,抑制率达77%,并可显着延长荷瘤鼠的寿命。HE染色显示Ad/PSCAE/UPⅡ/E1A、Ad/PSCAE/UPII/E1A-AR治疗组裸鼠肿瘤组织内见大量坏死灶,而肝、肺、脑内未见明显变化。透射电镜显示实验组裸鼠肿瘤组织胞浆内见大量病毒颗粒,排列呈晶格状。结论：重组腺病毒经HEK293细胞扩增后,经过纯化及鉴定,获得了较高纯度和滴度的重组腺病毒；含有E1A-AR的重组腺病毒对膀胱肿瘤细胞具有显着抗增殖效应,R1881可以促进该增殖效应,而氟他胺对该增殖效应不能造成影响；重组腺病毒可诱导膀胱肿瘤细胞凋亡,阻滞细胞周期于G1期；人膀胱癌EJ细胞株成功建立膀胱癌移植瘤裸鼠动物模型,为研究人类膀胱癌提供可靠依据；重组腺病毒有效抑制荷瘤裸鼠肿瘤生长,延长荷瘤鼠寿命。含有E1A-AR的重组腺病毒首次用于研究人膀胱癌,为人类膀胱癌的治疗提供新的策略；
傅崇德,王志平[9]（2009）在《重组腺病毒治疗膀胱癌的研究进展》文中进行了进一步梳理
瞿长宝[10]（2009）在《Scopadulciol在Ad-hTERT-HSV-TK/GCV系统对膀胱癌治疗中增效作用的实验研究》文中认为膀胱癌是我国泌尿外科最常见的肿瘤之一,占全身恶性肿瘤发病率的第八位,其特点是术后复发率高,严重威胁着人类的健康和生命。目前膀胱癌的治疗以手术切除为主,放、化疗为辅,但其疗效并不确定,特别是对于大多数中晚期膀胱肿瘤,尤其伴有局部扩散或远处转移者,目前的治疗效果均不理想。随着分子生物学技术及基因工程的发展,肿瘤的分子生物学机制得到进一步的阐明,肿瘤的基因治疗技术也随之迅速发展,为膀胱癌的治疗提供了一种新的且具有希望的手段。肿瘤的基因治疗是指在基因水平上通过载体系统将治疗基因导入肿瘤及其相关组织并有效表达从而达到治疗目的。肿瘤的基因治疗根据治疗机理不同,目前可分为免疫基因治疗、纠正性基因治疗、自杀基因治疗、反义核酸治疗、耐药基因治疗、联合基因治疗等。其中自杀基因（suicide gene）治疗备受关注,是一种有效和具有临床应用潜力的治疗策略。自杀基因治疗是将编码某些特定酶的基因导入肿瘤细胞,这些酶可将无活性或低毒的药物前体转化为具有较强细胞毒性的药物,从而杀死肿瘤细胞。HSV-tk/GCV是研究最为深入的一种自杀基因系统,HSV-tk酶可将GCV磷酸化为GCV一磷酸,继而在哺乳动物细胞TK酶的催化下最终转化为GCV三磷酸,抑制DNA聚合酶的活性,掺入DNA合成,产生细胞毒性。而且研究发现该方法还具有“旁观者效应”,即转染细胞可以杀死附近未转染细胞的特性,从而弥补转染效率低的缺陷,发挥更强大的治疗作用。肿瘤细胞的无限增殖是恶性实体瘤的主要特性。肿瘤的无限增殖能力主要靠端粒酶的激活来不断地维持端粒的长度而达到的。端粒酶在大多恶性肿瘤细胞中处于激活状态而在正常细胞中却没有活性或者活性很低,是目前所报道最为广谱的肿瘤生物分子标记。人端粒酶逆转录酶（human telomerase transcriptase,hTERT）是维持端粒酶活性所必需的催化亚单位,它的表达调控在转录水平上。利用hTERT启动子来调控病毒携带的目的基因,理论上可以使病毒选择在端粒酶阳性的肿瘤细胞中表达目的基因。我们以往的实验证明,与GCV联合作用下,hTERT启动子控制下的HSV-tk基因的表达能特异地杀伤膀胱癌253J细胞,而对正常细胞MRC-5无明显杀伤作用,且具有明显的旁观者效应;异种动物移植253J细胞后,HSV-tk/GCV系统对体内膀胱肿瘤的生长也有明显的抑制作用;Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统对肿瘤的杀伤及抑制作用随着GCV剂量的增加而增强。但由于GCV的细胞毒性较大,使其临床应用将受到一定限制。在此基础上,我们设立本课题研究,在构建出hTERT启动子调控的携带自杀基因HSV-tk的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk基础上,通过体外和体内实验,将Scopadulciol（SDC）与Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统联合应用,对其选择性杀伤肿瘤细胞的效果进行评估,观察SDC对Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统肿瘤杀伤作用的增强效应,并对其抗肿瘤机制进行初步探讨。本实验共分三个部分。一、hTERT启动子调控的HSV-tk基因重组腺病毒载体的构建目的:构建一种受hTERT启动子调控的、腺病毒介导的自杀基因转移系统Ad-hTERT-HSV/tk。方法:利用DNA重组技术,首先构建一种携带hTERT启动子和HSV/tk基因的重组腺病毒质粒,然后在293细胞包装成携带受hTERT启动子调控HSV/tk基因表达的重组腺病毒ad-hTERT-HSV/tk。同时构建CMV启动子调控的、携带自杀基因HSV/tk的重组腺病毒Ad-CMV-HSV/tk以及携带报告基因EGFP的重组腺病毒Ad-CMV-EGFP和Ad-hTERT-EGFP作为对照。应用QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒提取腺病毒DNA,对该4种病毒进行PCR鉴定。腺病毒的扩增及纯化采用293细胞及氯化铯纯化常规方法,病毒滴度测定采用TCID50法。结果:成功构建了4种重组腺病毒Ad-CMV-HSV/tk、Ad-hTERT-HSV/tk、Ad-CMV-EGFP和Ad-hTERT-EGFP,按需要在293细胞内扩增后以氯化铯密度梯度离心法进行纯化,TCID50法测得病毒滴度分别为4×1010pfu/ml,1×1011pfu/ml,1.2×1011pfu/ml和3.7×1010pfu/ml。二、Scopadulciol对Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统杀伤253J细胞增效作用的体外试验研究目的:我们将SDC与我们构建的具有肿瘤特异性的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统联合应用,通过体外实验观察该系统对膀胱癌253J细胞的杀伤作用,深一步研究SDC对重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统在杀伤膀胱癌细胞中的增效作用。方法:（1）细胞培养:膀胱癌细胞253J培养取含10%新鲜胎牛血清的RPMI1640培养基;人正常肺成纤维细胞株MRC-5取MEM培养基;置5%CO2孵箱中,饱和湿度及37℃培养。（2）观察SDC对Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统体外杀伤膀胱癌细胞的增效作用:将253J以及MRC-5细胞分别接种于24孔板中,每孔3×104个细胞,将两种细胞分为6组,即Ad-hTERT-HSV-tk+GCV+SDC组、Ad-hTERT-HSV-tk+GCV组、单纯Ad-hTERT-HSV-tk组、GCV+SDC组、单纯GCV组、单纯SDC组,空白对照以PBS替代。各组分别加入或不加入上述重组腺病毒（MQI=100）,5%CO2孵箱37℃培养90分钟,更换完全培养液,24小时后分别加入5%血清培养液含GCV100μmol/L,含SDC0.1μmol或5%血清培养液含GCV100μmol/L或含SDC0.1μmol ,37℃,5%CO2孵箱培养,每种情况均重复3孔,继续培养48小时,四唑盐比色试验法（MTT）测定细胞生长存活率。（3）SDC对不同配伍浓度的Ad-hTERT-HSV-tk和GCV对膀胱肿瘤细胞的杀伤作用:将生长良好的膀胱癌细胞253J以及正常的成纤维细胞MRC-5分别按1×104个细胞/孔接种于96孔板;培养24h后,按MOI=100加入Ad-hTERT-HSV-tk,每30min轻摇一次;24h后分别加入5%血清培养液含GCV（0、1、10、100、1000μmol/L）,含SDC（0、0.04或0.1μmol）, 37℃5%CO2孵箱培养;每3d换一次上述培养液,6d后,四唑盐比色试验法（MTT）测定细胞存活率,分别比较不同浓度的GCV、SDC杀伤效果的差异。（4）体外旁杀伤效应观察:将Ad-hTERT-HSV-tk按MOI=100转染253J细胞;24h后将上述肿瘤细胞和未转染Ad-hTERT-HSV-tk的肿瘤细胞以不同比例混合培养,共分5组（0、30%、50%、70%、100%）;在5组253J肿瘤细胞培养液中分别加入GCV使其浓度为100μmol/L或浓度为100μmol/L的GCV联合应用SDC0.04μmol,空白对照组未按相同转染比例混合后以PBS替代GCV和SDC,每种情况重复3孔;6d后分别进行MTT测定细胞存活率,比较杀伤效果。结果:（1）重组腺病毒对253J和MRC-5细胞的转染效率倒置荧光显微镜下观察显示,加入重组腺病毒Ad-hTERT-EGFP,MRC-5细胞未见明显荧光表达。而Ad-hTERT-EGFP对253J细胞的转染率随重组腺病毒的MOI增高而增加,当MOI为0时,无荧光表达;MOI为1时,仅少数细胞有荧光（7.5%）;MOI为10时,40.7%的253J细胞EGFP表达阳性;MOI=100时,88.3%的253J细胞EGFP表达阳性;MOI=1000时,所有细胞均出现荧光。提示Ad-hTERT-EGFP对两细胞的转染率有明显差异。（2）SDC对HSV-TK激酶作用的GCV在膀胱肿瘤基因治疗中的增效作用:Ad-hTERT-HSV-tk+GCV+SDC组253J细胞存活率明显低于MRC-5细胞（P<0.001）;Ad-hTERT-HSV-tk+GCV组253J细胞存活率亦低于MRC-5细胞（P<0.001）;单纯Ad-hTERT-HSV-tk组、GCV+SDC组、单纯GCV组、单纯SDC组,对两种细胞株均无明显的杀伤作用。Ad-hTERT-HSV-tk + GCV + SDC组253J细胞存活率明显低于Ad-hTERT-HSV-tk+GCV组（P<0.01）。（3）SDC对不同配伍浓度的Ad-hTERT-HSV-tk和GCV对膀胱肿瘤细胞体外旁杀伤效应:以MQI=100的Ad-hTERT-HSV-tk感染253J细胞后,不同浓度的GCV联合应用不同剂量SDC,作用于253J细胞,结果显示,GCV联合应用SDC后,253J细胞的存活率明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）,提示Ad-hTERT-HSV-tk+GCV对253J细胞的杀伤作用随着GCV浓度的增加而逐渐增强的基础上,联合应用SDC后,对253J细胞的杀伤作用有明显增强作用。（4）体外旁杀伤效应的观察:tk阳性的253J细胞所占比例分别为0、30%、50%、70%、100%的几组253J细胞,经GCV和/或SDC作用后,结果提示,丙氧鸟苷在杀死tk阳性253J细胞的同时,也可以杀死与其共同培养的tk阴性253J细胞,随着tk阳性253J细胞比例的增加,混合细胞的存活数量明显减少（P<0.05）;其联合应用SDC后,杀伤作用又有明显增强。三、Scopadulciol对Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统对膀胱癌治疗中增效作用的体内实验研究目的:我们将SDC与我们构建的具有肿瘤特异性的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统联合应用,通过体内实验观察该系统对膀胱癌253J细胞的杀伤作用及抑制肿瘤生长作用,深一步研究SDC对重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统在杀伤膀胱癌细胞中的增效作用。方法:（1）裸鼠膀胱癌模型的建立及分组:将膀胱癌细胞用无菌生理盐水配成1×107细胞/ml的细胞悬液。在小鼠右前肢腋窝皮下注入0.2m1细胞悬液。观察小鼠肿瘤生长情况,当肿瘤生长至直径约为6mm和/或体积为100mm3时,将荷瘤裸鼠随机分为4组,每组4只, A组为Ad-hTERT-HSV/tk+GCV+SDC组;B组为Ad-hTERT-HSV/tk+GCV组;C组为Ad-hTERT-HSV/tk+SDC组;D组为对照组,裸鼠体内每天仅注射PBS。（2）Ad-hTERT-HSV-tk/GCV/SDC治疗肿瘤的疗效观察:肿瘤生长抑制的观察:自注射药物开始,每7天用圆规和游标卡尺测量肿瘤大小,计算肿瘤的体积,描绘肿瘤的生长曲线,共观察6周。观察结束后处死裸鼠,解剖观察瘤体的大体形态,取对照组和治疗组的肿瘤组织称重。按（1-治疗组重量/对照组重量）×100%计算肿瘤生长抑制率。结果:Ad-hTERT-HSV-tk/GCV/SDC对荷瘤裸鼠膀胱癌的生长抑制的影响:BALB/C裸鼠皮下接种253J细胞2周后,可见所有的裸鼠均有肿瘤生长,成瘤率为100%,肿瘤直径约0.5cm-0.6cm。选用瘤体大小一致的裸鼠分组实验,可见C、D各组裸鼠肿瘤生长迅速,瘤的体积无显着性差异（p>0.05）,根据肿瘤的体内生长曲线,C、D各组的肿瘤均呈持续快速生长,生长曲线大致相同（p>0.05）;B组肿瘤生长受到明显抑制,与C、D两组相比,具有显着性差异（P<0.01）;A组抑制肿瘤作用明显,随着治疗进展,肿瘤生长呈停滞或缩小趋势,与B组相比具有显着性差异（P<0.01）,与C、D两组相比差异显着性更为明显（P<0.001）。结论1、本研究成功构建了分别由hTERT启动子和CMV启动子调控的携带HSV-tk基因和EGFP基因的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV/tk、Ad-CMV-HSV/tk、Ad-hTERT-EGFP和Ad-CMV-EGFP。对其进行纯化、扩增后具有较高滴度。2、通过体外实验证明,联合应用GCV情况下,hTERT启动子控制下HSV-tk基因的表达能特异地杀伤膀胱癌细胞253J,在此基础上,该系统联合应用SDC后,Ad-hTERT-HSV/tk/GCV系统对膀胱癌细胞253J的杀伤作用又有了明显的增强。3、通过体内实验证明,联合应用SDC后,Ad-hTERT-HSV/tk/GCV系统对膀胱癌细胞253J的杀伤作用及对肿瘤生长的抑制作用也有明显的增强。
二、膀胱灌注逆转录病毒载体HSV-TK基因治疗大鼠膀胱癌（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、膀胱灌注逆转录病毒载体HSV-TK基因治疗大鼠膀胱癌（论文提纲范文）
（1）双歧杆菌介导HSV-tk/GCV治疗大鼠膀胱癌分子机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 双歧杆菌介导HSV-TK/GCV治疗荷瘤大鼠胱肿瘤的蛋白组学研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Prx-Ⅰ在膀胱癌细胞中的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间发表论文情况 |
（2）MUC4在膀胱癌中的表达及其启动子驱动HSV-tk腺病毒靶向杀伤膀胱癌细胞的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 膀胱癌细胞株及膀胱癌组织中 MUC4 基因的表达 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MUC4 启动子驱动 HSV-tk 腺病毒靶向杀伤作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 展望 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论及创新点 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 英文缩略词表 |
| 致谢 |
（3）婴儿双歧杆菌介导HSV-TK/GCV治疗大鼠膀胱癌的实验研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验程序和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（4）双歧杆菌介导HSV-tk/GCV治疗大鼠膀胱癌的实验研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（5）婴儿双歧杆菌介导HSV-TK/GCV自杀基因治疗系统对大鼠膀胱癌组织细胞凋亡及Fas/FasL表达的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 药品与试剂: |
| 1.1.2 动物: |
| 1.1.3 仪器: |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 大鼠膀胱癌模型的建立及分组: |
| 1.2.2 各组荷瘤大鼠膀胱质量测定: |
| 1.2.3 TUNEL法原位检测膀胱肿瘤细胞的凋亡及半定量分析: |
| 1.2.4 半定量RT-PCR检测Fas、Fas L m RNA水平: |
| 1.2.5 Western blot检测大鼠膀胱肿瘤Fas/Fas L蛋白表达: |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 大鼠膀胱癌建模及病理结果 |
| 2.2 各组荷瘤大鼠膀胱质量比较 |
| 2.3 大鼠膀胱肿瘤组织中凋亡细胞分布及变化 |
| 2.4 大鼠膀胱肿瘤组织Fas/Fas L m RNA表达 |
| 2.5 大鼠膀胱肿瘤组织Fas/Fas L蛋白表达 |
| 3 讨论 |
（6）裸小鼠膀胱癌红色荧光原位模型的建立及丝裂霉素C膀胱灌注化疗的初步研究（论文提纲范文）
| 目录 |
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 略缩词 |
| 前言 |
| 第一部分 慢病毒介导的红色荧光蛋白报告基因对人膀胱癌EJ细胞的标记 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 裸小鼠膀胱癌红色荧光原位模型的建立及丝裂霉素C膀胱灌注化疗 |
| 实验动物、材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 附录 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）重组慢病毒CXCR7-shRNA对人膀胱癌细胞生物学行为影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 英汉缩略词对照表 |
| 前言 |
| 第一章 趋化因子受体CXCR7在人膀胱癌中的表达情况 |
| 前言 |
| 1. 研究材料 |
| 2. 研究方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第二章 构建以慢病毒为载体的CXCR7-shRNA |
| 前言 |
| 1. 研究材料 |
| 2. 研究方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第三章 LV-CXCR7-shRNA干扰质粒对人膀胱癌5637细胞生物学行为的影响 |
| 前言 |
| 1. 研究材料 |
| 2. 研究方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 综述三 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间公开发表论文 |
（8）携带E1A-雄激素受体（AR）的膀胱肿瘤特异性溶瘤腺病毒的抗膀胱肿瘤研究（论文提纲范文）
| 英文缩写索引 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 重组腺病毒的扩增及鉴定 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 载体及细胞株 |
| 1.1.2 主要溶液的配制 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 细胞的复苏、培养及冻存 |
| 1.2.2 重组腺病毒的扩增和纯化 |
| 1.2.3 重组腺病毒滴度的测定 |
| 1.2.4 重组腺病毒的鉴定 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 细胞病变效应(CPE) |
| 1.3.2 重组腺病毒的纯化 |
| 1.3.3 TCID50测定腺病毒滴度 |
| 1.3.4 重组腺病毒的鉴定 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 腺病毒载体系统 |
| 1.4.2 重组腺病毒的扩增和纯化 |
| 1.4.3 重组腺病毒的鉴定 |
| 1.5 结论 |
| 第二部分 重组腺病毒的体外实验 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂和细胞株 |
| 2.1.2 主要溶液配制 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 重组腺病毒对肿瘤细胞感染效率的测定 |
| 2.2.2 重组腺病毒抗膀胱肿瘤细胞增殖效应 |
| 2.2.3 R1881、氟他胺对重组腺病毒抗膀胱肿瘤细胞增殖效应的影响. |
| 2.2.4 透射电镜观察 |
| 2.2.5 重组腺病毒对细胞生长周期的影响 |
| 2.2.6 Real-time PCR检测重组腺病毒目的基因的表达 |
| 2.2.7 免疫荧光染色观察CAR及AR的表达 |
| 2.2.8 Western blot检测重组腺病毒目的蛋白的表达 |
| 2.2.9 TUNEL检测细胞凋亡 |
| 2.2.10 Caspase3酶活性检测 |
| 2.2.11 统计学处理 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 重组腺病毒对膀胱肿瘤细胞感染效率的测定 |
| 2.3.2 重组腺病毒抗增殖效应观察 |
| 2.3.3 R1881、氟他胺对重组腺病毒抗增殖效应的影响 |
| 2.3.4 免疫荧光染色观察CAR及AR的表达 |
| 2.3.5 透射电镜观察 |
| 2.3.6 重组腺病毒对细胞周期的影响 |
| 2.3.7 Caspase3酶活性检测 |
| 2.3.8 Real-time PCR检测目的基因的表达情况 |
| 2.3.9 Western blot检测目的蛋白的表达 |
| 2.3.10 TUNEL检测细胞凋亡 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 融合蛋白E1A-AR |
| 2.4.2 重组腺病毒的体外杀伤效应 |
| 2.4.3 重组腺病毒体外诱导肿瘤细胞凋亡及肿瘤治疗策略 |
| 2.5 结论 |
| 第三部分 重组腺病毒的体内实验研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 细胞准备及重组腺病毒 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 主要试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 重组腺病毒的扩增和EJ细胞的培养 |
| 3.2.2 裸鼠膀胱癌动物模型的建立 |
| 3.2.3 重组腺病毒体内抑制肿瘤实验 |
| 3.2.4 肿瘤细胞及主要脏器形态学观察 |
| 3.2.5 电镜观察肿瘤组织内病毒的分布 |
| 3.2.6 重组腺病毒目的基因在体内的表达情况 |
| 3.2.7 重组腺病毒目的蛋白E1A在体内的表达情况 |
| 3.2.8 透射电镜观察肿瘤组织中病毒颗粒 |
| 3.2.9 统计学处理 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 荷瘤鼠肿瘤生长情况 |
| 3.3.2 肿瘤组织及重要组织脏器的病理学检查 |
| 3.3.3 肿瘤组织中E1A基因的表达 |
| 3.3.4 透射电镜结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 膀胱癌动物模型的建立 |
| 3.4.2 携带E1A-AR的重组腺病毒对膀胱移植瘤的作用 |
| 3.5 结论 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（9）重组腺病毒治疗膀胱癌的研究进展（论文提纲范文）
| 一、以复制缺陷型腺病毒作载体导入治疗基因 |
| 1.导入抑癌基因行基因校正治疗: |
| 2.导入细胞因子行免疫基因疗法: |
| 3.导入自杀基因: |
| 4.反义基因疗法: |
| 二、条件复制腺病毒 |
| 1.改造腺病毒复制必需基因, 增强其肿瘤特异性: |
| 2.插入肿瘤组织特异性启动子驱动病毒在膀胱癌中特异性复制: |
| 三、增强腺病毒转染效率的治疗 |
| 四、协同策略 |
| 五、总结 |
（10）Scopadulciol在Ad-hTERT-HSV-TK/GCV系统对膀胱癌治疗中增效作用的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 研究论文 Scopadulciol 在Ad-hTERT-HSV-tk/GCV 系统对膀胱癌治疗中增效作用的实验研究 |
| 引言 |
| 第一部分 hTERT 启动子调控的HSV-TK 基因重组腺病毒载体的构建和制备 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Scopadulciol 对Ad-hTERT-HSV-TK/GCV 系统杀伤 253J 细胞增效作用的体外试验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 Scopadulciol 在Ad-hTERT-HSV-TK/GCV 系统对膀胱癌治疗中增效作用的体内实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 膀胱肿瘤的基因治疗策略 |
| 参考文献 |
| 综述二 基因治疗的载体系统 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、膀胱灌注逆转录病毒载体HSV-TK基因治疗大鼠膀胱癌（论文参考文献）
- [1]双歧杆菌介导HSV-tk/GCV治疗大鼠膀胱癌分子机制研究[D]. 蒋立. 重庆医科大学, 2015(12)
- [2]MUC4在膀胱癌中的表达及其启动子驱动HSV-tk腺病毒靶向杀伤膀胱癌细胞的研究[D]. 周守军. 苏州大学, 2014(04)
- [3]婴儿双歧杆菌介导HSV-TK/GCV治疗大鼠膀胱癌的实验研究[D]. 喻备. 重庆医科大学, 2013(03)
- [4]双歧杆菌介导HSV-tk/GCV治疗大鼠膀胱癌的实验研究[D]. 殷祥瑞. 重庆医科大学, 2013(04)
- [5]婴儿双歧杆菌介导HSV-TK/GCV自杀基因治疗系统对大鼠膀胱癌组织细胞凋亡及Fas/FasL表达的影响[J]. 喻备,王亚荣,殷祥瑞,唐伟. 中国医科大学学报, 2012(10)
- [6]裸小鼠膀胱癌红色荧光原位模型的建立及丝裂霉素C膀胱灌注化疗的初步研究[D]. 吴刚. 广西医科大学, 2012(08)
- [7]重组慢病毒CXCR7-shRNA对人膀胱癌细胞生物学行为影响的研究[D]. 朱煊. 中南大学, 2012(12)
- [8]携带E1A-雄激素受体（AR）的膀胱肿瘤特异性溶瘤腺病毒的抗膀胱肿瘤研究[D]. 翟振兴. 兰州大学, 2012(09)
- [9]重组腺病毒治疗膀胱癌的研究进展[J]. 傅崇德,王志平. 现代泌尿生殖肿瘤杂志, 2009(04)
- [10]Scopadulciol在Ad-hTERT-HSV-TK/GCV系统对膀胱癌治疗中增效作用的实验研究[D]. 瞿长宝. 河北医科大学, 2009(10)