一、聚合酶链反应杂交ELISA对肝炎患者血清HCV RNA的测定和分析（论文文献综述）
陈鑫[1]（2021）在《重组腺相关病毒载体介导的环状RNA circFBXW4在肝纤维化中的功能及机制研究》文中提出肝纤维化（hepatic fibrosis,HF）是由各种感染、免疫反应、理化因素等长时间的刺激下,肝脏中各类细胞外基质（extracellular matrix,ECM）代谢失衡,造成纤维结缔组织异常增生和肝脏结构紊乱。临床上肝纤维化的早期症状并不典型,目前尚缺乏灵敏的早期诊断指标。研究发现,肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）激活并分化为肌成纤维细胞,是细胞外基质分泌的主要细胞来源。因此,肝星状细胞的活化被认为是肝纤维化启动和持续阶段的中心环节。肝星状细胞的活化过程受各种非编码RNA（noncoding RNA,nc RNA）的联合调控,深入研究肝纤维化发生的分子机制将为研发新型治疗手段提供一定的研究基础。非编码RNA在肝纤维化发生、发展的过程中具有重要的调控作用。其中,微小RNA（micro RNA,miRNA）和长链非编码RNA（long noncoding RNA,lnc RNA）在肝纤维化相关的机制探究和临床意义已有大量的研究报道。近年来,环状RNA（circular RNA,circRNA）作为一类新兴的非编码RNA分子被发现,其与各类疾病的生理过程密切相关。内源性circRNAs是通过反向剪切以共价键形成的环状RNA分子,其稳定性高可耐受核酸酶的降解,在不同的物种间具有保守性,在组织和细胞不同的发育阶段和生理状态呈现特异性表达。circRNAs的分子结构特性使其作为新型的临床诊断标记物在开发上具有明显的优势,现已发展成生物医学的热点研究领域之一。circRNAs在各类疾病中的功能及作用机制逐渐引起研究者们的广泛关注,然而,有关circRNAs在肝纤维化中的表达谱分析和具体机制尚有待阐明。在本研究中,构建了小鼠肝纤维化进展和逆转模型,采用肝脏原位灌流技术,分离提取小鼠肝脏的原代肝星状细胞。运用高通量测序技术,分析肝纤维化小鼠原代肝星状细胞中的circRNAs表达谱,鉴定发现大量的circRNAs分子存在差异性表达。其中,circFBXW4的表达水平在肝纤维化进展期显着降低,并随肝纤维化的逆转过程表达恢复,提示circFBXW4可能与肝纤维化发生、发展的病理过程密切相关,引起了我们的重点关注并对其展开了功能学探究。研究中采用重组腺相关病毒为载体,介导circFBXW4靶向肝脏的基因治疗,实验发现提高circFBXW4的水平可抑制肝纤维化过程中的肝损伤,减少肝组织中的纤维增生和胶原沉积,一定程度上修复了肝脏结构紊乱的现象。同时,运用慢病毒生物载体构建了circFBXW4过表达的稳转肝星状细胞株,发现过表达circFBXW4抑制肝星状细胞由静息态向激活态的转化,阻滞其细胞周期,减少活化态肝星状细胞的恶性增殖。此外,利用非病毒载体系统中的阳离子脂质体介导法,发现干扰circFBXW4的生物信号对肝星状细胞具有反向调控功能。以上结果提示,circFBXW4可能是一种抗肝纤维化的RNA分子。在机制探究方面,大部分外显子来源且定位在细胞质中的circRNAs,常通过竞争性内源RNA（competitive endogenous RNA,ce RNA）参与调控目的基因的表达,进而影响生物学功能。因此,本研究进一步运用micro RNAs芯片技术,分析原代肝星状细胞中micro RNAs的差异表达,并通过生物信息学预测circFBXW4可能结合的micro RNAs分子,经验证发现circFBXW4可靶向结合miR-18b-3p,并调控其表达水平。micro RNAs芯片分析及实验检测均发现,miR-18b-3p在肝纤维化的过程中表达上调,其具有促进肝星状细胞中纤维介质表达的功能,并且circFBXW4与miR-18b-3p的表达呈负相关关系。抑癌基因F框/WD-40域蛋白7（F box and WD 40 domain containing protein 7,FBXW7）是miR-18b-3p的靶基因之一,本研究发现circFBXW4通过靶向结合miR-18b-3p进而调控FBXW7信号通路。此课题在动物、组织、细胞、分子等多个维度,进行了关于circFBXW4表型及机制的初步探究。发现circFBXW4是调节肝星状细胞活化和肝纤维化发展的关键生物分子,其可能作为一种预测肝纤维化进展和逆转病理过程的潜在生物标志物。
吴昊[2]（2020）在《长链非编码RNA在肝细胞肝癌临床预后中的作用及机制研究》文中研究指明研究背景和目的肝癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,其发病率高居第六位,死亡率在所有癌症中排名第四位。肝细胞肝癌（Hepatocellularcarcinoma,HCC）是最常见的肝癌类型,占所有原发性肝癌的85-90%,每年有超过60万的人死于HCC,而中国则占其中的50%以上。虽然目前对于肝癌的危险因素、早期诊断、监测方法和治疗技术方面取得了重大进展。但由于其起病隐匿、生长迅速、恶性程度高、且易发生侵袭转移,超过70%的患者在被诊断为HCC时,其疾病的进展程度已经不适合再接受根治性肝切除或肝移植治疗,导致其预后极差,5年生存率低于15%。而判断肝癌患者的预后对于指导患者的个体化治疗,延长患者的总生存期、提高远期治疗效果意义重大。因此,临床上通过使用临床信息和病理学标准建立了各种分期系统,进而预测HCC预后并提供治疗指导。目前,已有的并开展临床使用的预测手段包括甲胎蛋白（Alpha fetoprotein,AFP）、肿瘤淋巴结转移（Tumor-node-metastasis,TNM）分期、Child-Pugh分级等。尽管这些分期系统已被证明有一定的应用价值,但由于未涉及HCC的生物学特征以及肿瘤的遗传和表观遗传学改变等,它们的预测效率仍然有限。长链非编码RNA（Longnon-coding RNA,lncRNA）是一系列转录本大于200个核苷酸且不具备蛋白质翻译功能的RNA分子。但其可在多层面上（表观遗传学、转录调控及转录后调控等）调控靶基因的表达,进而参与到多种关键的生物学过程。并且越来越清楚的是,lncRNA的功能取决于其独特的亚细胞定位。目前,大量的研究数据证实,lncRNA可以通过参与干扰肝癌细胞的细胞周期、侵袭转移、肿瘤微环境中的血管生成、免疫逃逸等多个生物学过程进而调控HCC的发生发展。此外,lncRNA具有重要的预测包括HCC在内的癌症患者的生存能力,提示lncRNA具有进一步指导个体化临床管理的潜在价值。因此,有必要进一步探讨lncRNA在HCC发生发展中的具体作用机制及临床意义。随着高通量技术的发展,公共数据库的出现使研究人员能够用来探究并鉴定潜在的生物标志物,以进行癌症的诊断和预后预测。癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）计划旨在通过大规模的基因组测序和集成的多维分析,对人类肿瘤中主要的致癌基因组进行全面探索,为研究者提供了利用高通量数据和临床特征进行统计分析的巨大机会。目前,已有少量研究通过该数据库,获取HCC患者的RNA测序（RNA-Sequence,RNA-Seq）数据以及相应的临床资料,构建了有效的预测HCC患者生存的预测模型。但相关研究仅基于数据库资料,均未进行临床的实际验证和应用。此外,TCGA数据库中使用的转录谱分析和RNA测序方法昂贵且难以在医院执行。并且,现有研究也没有将LncRNA模型的预测效能与其他临床预测模型进行比较。因此,针对目前的研究现状,我们提出了以下问题:基于TCGA数据库筛选并用于构建模型的lncRNA在临床患者中的表达情况如何?RNA-Seq的结果是否可通过简单的实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测所替代?模型在实际临床患者中的预测效能如何?模型的预测效能是否优于目前已有的临床模型?模型中lncRNA调控HCC的具体作用机制如何?基于以上问题,在本研究中,首先基于TCGA数据库,分析差异表达的lncRNA,并通过分析lncRNA与患者预后的关系,建立了基于lncRNA的预测模型,进而评估其在不同病因HCC患者中的预测效能。我们发现,该预测模型在乙肝相关的HCC患者中具有最佳的预测效率。基于此结果,进一步收集临床进行肝切除术的乙肝相关HCC患者的肝组织及临床资料,并进行随访,通过qRT-PCR检测了 HBV-HCC患者的lncRNA的表达水平,并首次建立了基于qRT-PCR数据的lncRNA预测模型。接下来,通过列线图（Nomogram）的方法拟对lncRNA模型进行优化。此外,进一步将模型的预测效能与其他临床分期系统:TNM,Child-Pugh,Okuda 分期系统（Okudastagingsystem）,巴塞罗那分期（Barcelona-Clinic Liver Cancer,BCLC）,意大利肝癌计划（Cancerof Liver Italian Program,CLIP）评分和香港中文大学预后指数（Chinese University Prognostic Index,CUPI）分级相比。随后,我们进行体外实验,明确了这构成模型的lncRNA在细胞系中的表达和亚细胞定位。并通过生物信息学分析得到lncRNA调控HCC发生发展的潜在作用机制。值得注意的是,lncRNA DDX11反义RNA1（DDX11 antisense RNA 1DDX11-AS1）在我们所构建的调控网络中处于“中心位置”,因此我们选取lncRNA DDX1 1-AS1为进一步研究对象,并进行基因富集分析、体内外实验来深入探究其调控HCC的发生发展的作用机制。本研究为HCC患者的生存预测和个体治疗,建立了有效的lncRNA模型。此外,对构成模型的lncRNA进行了深入探讨,lncRNA可作为HCC患者预后的生物标志物,有望成为临床治疗的有效靶点。第一部分通过TCGA数据库构建预测肝细胞肝癌患者生存的LncRNA模型目的通过对TCGA数据库中HCC患者RNA-Seq数据进行下载和分析,筛选并构建预测HCC患者生存的lncRNA预后模型。并对模型的预测效能及其对不同危险因素的HCC患者的预测效能进行比较和评估。方法1.通过TCGA数据库下载374例HCC患者肝组织及50例正常对照组的RNA-Seq表达谱数据,以及HCC患者相应临床资料,通过Perl以及R软件中“edgeR”包,提取并筛选出差异表达的lncRNA。2.基于差异表达的lncRNA以及患者的生存状态和生存时间,进行单因素及多因素Cox 比例风险回归分析,从中筛选对HCC患者有独立预后作用的lncRNA,并应用R语言构建预后风险预测模型。3.应用lncRNA模型,对370例具有临床预后信息的HCC患者进行风险评分计算,并应用中位值将患者分为高风险组和低风险组,进一步通过K-M分析及ROC曲线来评估风险预测模型的预测效能。4.对肝细胞癌患者进行基于病因的亚组分类,并根据风险评分将每个亚组患者进行分组,并通过K-M（Kaplan-Meier）分析及受试者工作曲线（Receiver operator characteristic curve,ROC）,评估风险预测模型对不同危险因素患者预后的预测效能。结果1.通过TCGA数据库获取了 374例HCC患者肝组织及50例正常对照组的RNA-Seq表达谱数据及相关临床信息,并提取了 lncRNA表达信息,通过差异表达分析,得到1029个上调的lncRNA和58个下调的lncRNA。2.通过单因素和多因素Cox分析,筛选出了能独立预测HCC患者预后的lncRNA,并构建了一个基于5个lncRNA的风险预测模型:Risk score=（0.0448× LINC01116）+（0.2504 × DDX11-AS1）+（0.1001 × C10orf91）+（0.0722 × LUCAT1）+（0.1138 × FIRRE）。3.根据风险评分模型以及中位值,将370名具有生存时间的的HCC患者分为了高风险组和低风险组。K-M曲线显示两组患者生存显着不同。此外,上述模型预测患者3年生存的曲线下面积（Area Under Curve,AUC）为0.710,显示具有较好的预测效能。4.根据TCGA临床数据库中HCC患者的危险因素,对我们纳入的370名有预后信息的患者进行分组:包括饮酒导致的HCC,乙型肝炎病毒相关肝细胞癌（hepatitis B virus-associated hepatocellularcarcinoma,HBV-HCC）,丙型肝炎病毒相关相关HCC,非酒精性脂肪性肝病相关HCC,无危险史相关HCC和其他因素因素HCC。然后在每组患者中,再根据风险评分和截点值将患者分为高风险组和低风险组。通过K-M及ROC分析,我们发现该模型对于乙肝相关HCC患者具有最好的预测效能（3-年AUC=0.811）。结论通过分析TCGA数据库中HCC患者的lncRNA表达及临床信息,构建了一个新型的lncRNA风险评估模型,可有效预测HCC患者的生存。lncRNA预测模型对HBV-HCC患者具有最好的预测效能。第二部分应用LncRNA模型预测乙肝相关肝细胞肝癌肝切除术后患者的生存目的上一步结果显示模型对于HBV-HCC具有最好的预测效能。接下来的研究我们将选取临床HBV-HCC患者作为研究对象,收集临床HBV-HCC患者的组织、临床及生存信息。qRT-PCR检测并明确LINC01 116,DDX11-AS1,LUCAT1,C10orf91和FIRRE的表达。由于前期该模型的建立是基于RNA-Seq数据基础上的,而考虑到临床可行性,我们基于qRT-PCR结果,并结合临床患者总生存时间（Overall survival,OS）及生存状态,重新构建基于qRT-PCR数据的预测临床HBV-HCC患者预后的lncRNA模型,并评估模型的预测效能。分析模型与临床病理资料的相关性,并通过列线图的方法拟优化lncRNA预测模型。最后,比较lncRNA 模型与 TNM、Child-Pugh、Okuda、BCLC、CLIP 及 CUPI 分期系统对HBV-HCC患者预后的预测效能。方法1.收集50例肝切除术后HBV-HCC患者以及10例正常对照者的肝脏组织,通过qRT-PCR检测构成模型的5个lncRNA的表达。2.通过单因素及多因素COX回归分析,重新构建基于qRT-PCR结果的针对临床HBV-HCC患者的lncRNA预后预测模型。3.根据lncRNA模型计算患者的风险评分,根据中位值将50例HBV-HCC患者分为高风险组和低风险组,通过K-M分析及ROC曲线来评估风险预测模型的预测效能。4.收集并统计纳入临床研究队列的50例经肝切除术后的HBV-HCC患者相应的实验室检查及手术病理数据。通过单因素和多因素Cox风险比例分析,评估lncRNA模型是否可作为预测HBV相关HCC患者生存的独立预测因子。5.在4-lncRNA预测模型的基础上,联合患者的临床数据,构建列线图,试图优化目前模型的预测效能,并通过C指数（C-index）和校准曲线来评估列线图的预测效能。6.通过K-M分析及ROC曲线来评估,并比较lncRNA模型、TNM、Child-Pugh、Okuda、BCLC、CLIP及CUPI分期系统对HBV相关HCC患者预后的预测效能。结果1.LINC01116,LUCAT1,DDX11-AS1,C10orf91 和 FIRRE 在 HBV 相关HCC患者肝组织中的表达水平,均明显高于正常对照肝组织。与我们前期从TCGA数据库中所得到的结果一致。2.单因素回归分析显示,5个lncRNA均与HBV相关HCC患者生存相关。但是在COX多因素回归分析中,lncRNAC10orf91的风险比（Hazardratio,HR）从单因素的>1变成了在多因素COX分析中HR<1,提示该lncRNA在模型中不稳定,并可能与其它lncRNA之间存在较大的相互关系,进而会影响模型的稳定性。因此,我们将C10orf91剔除,重新进行多因素COX分析,重新构建了基于4个lncRA(（LINC01116,LUCAT1,DDX11-AS1和FIRRE）的,适用于HBV相关HCC肝切除术后患者生存预测的模型。3.K-M分析显示,低风险组患者的总生存时间（3.67±0.09年）明显长于高风险的HBV-HCC患者（2.01±0.25年）。此外,通过ROC曲线分析显示4-lncRNA预测模型的预测效能优于DDX11-AS1,LUCAT1,LINC01116和FIRRE,3年生存预测的AUC为0.875(95%置信区间,95%Confidence interval,95%（CI=0.769-0.981）4.单多因素分析显示,4-lncRNA标记可作为临床术后HBV相关HCC患者的独立预测因子。此外,高风险组患者白蛋白水平明显低于低风险组（P=0.004）。高风险组与低风险组患者的Child-Pugh分级有明显差异（P=0.042）。5.基于来自多元分析的独立因素,进一步建立了列线图。除模型外,我们纳入的因素还包括ALP和肿瘤最大直径。我们发现虽然列线图的C指数略高于单纯的lncRNA预测模型,但两者相比较并没有统计学差异（P=0.175）。此外,nomogram模型的校准曲线在1年、2年及3年中均显示与参考线偏差较大,反应其预测与实际关系一致性较低。进一步通过ROC分析表明,lncRNA预后模型对2年和3年生存率要优于列线图模型,具有最佳预测效率。综上所述,结合临床指标所构建的列线图模型,其预测效能并不优于lncRNA模型。6.通过比较 lncRNA 模型与 TNM、Child、Okuda、BCLC、CLIP 及 CUPI 分期系统在预测HBV相关HCC患者生存的预测效能。结果显示,基于qRT-PCR的lncRNA风险评分模型具有最佳预测效能（AUC=0.897,95%CI=0.733-0.96）。结论通过TCGA数据库及临床数据库,建立了一种有效的基于qRT-PCR的4-lncRNA模型,该模型的预测效能优于TNM、Child、Okuda、BCLC、CLIP及CUPI分期系统,可用于术后HBV-HCC患者的生存预测和治疗指导。第三部分LncRNA模型预测肝细胞肝癌患者生存的机制研究目的通过前两部分的研究,我们基于TCGA数据库,同时联合临床队列,建立了有效的lncRNA模型来预测HCC患者的生存,接下来将针对lncRNA模型调控HCC的机制进行进一步探究。方法1.通过qRT-PCR检测lncRNA在正常肝细胞系LO2和HCC细胞系（Huh7,HepG2,MHCC97-h,LM3）中的表达情况。并采用荧光原位杂交（Fluorescent in situ hybridization,FISH）实验,明确 LINC01116,LUCAT1,DDX11-AS1 和FIRRE的亚细胞定位。2.通过TCGA数据库下载RNA-Seq以及微小RNA测序（microRNA-Sequence,miRNA-Seq）数据,通过Perl以及R软件提取并筛选差异表达的mRNA以及差异表达的miRNA,用于机制分析。3.采用 miRcode 数据库、miRTarBase 和 TargetScan 数据库筛选 lncRNA-miRNA-mRNA 关系,拟构建内源竞争 RNA（competingendogenous RNA,ceRNA）机制。此外,采用皮尔逊相关系数用于评估lncRNA和mRNA之间的共表达关系。筛选分别与LINC01116,LUCAT1,DDX11-AS1和FIRRE具有相关性的mRNA（R>0.4,并且P<0.05）,接下来从以上的mRNA中进一步筛选,选取与至少两个lncRNA的表达变化高度相关的mRNA。最后使用Cytoscape软件来构建和可视化的ceRNA以及lncRNA-mRNA共表达网络。4.通过基因功能注释（Gene Ontology,GO）和京都市基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）信号通路来分析并显示lncRNA拟调控基因的富集通路。结果1.与正常肝细胞系相比,LINC01116,LUCAT1,DDX1 1-AS1 和 FIRRE 在4种HCC细胞系中均表达升高。FISH结果显示,LINC01116和DDX11-AS1在细胞核和细胞质中均表达,lncRNALUCAT1和FIRRE主要富集在细胞质中,少数富集在细胞核中。2.通过选取P<0.05和log2差异倍数（log2 foldchange,log2FC）绝对值≥1为纳入条件,共筛选出来差异表达的mRNA共4851个,其中有表达水平高于正常对照组的mRNA有3769个,表达水平低于于正常对照组的差异mRNA有1082个。此外,分析并筛选了差异表达的miRNA共250个（|log2FC|≥1,P<0.05）,其中表达水平高于正常对照组的miRNA共222个,表达水平低于于正常对照组的miRNA共28个。3.LINC01116,LUCAT1,DDX11-AS1 和 FIRRE 这 4 个 lncRNA 均没有筛选出潜在的ceRNA网络。接下来通过计算皮尔逊相关系数相关系数以及维恩图（Venndiagram）分析表明,筛选出97个至少与两个lncRNA具有共表达关系的蛋白编码基因。并最终通过Cytoscape构建了可视化的共表达网络,结果显示,lncRNA DDX1 1-AS1处于调控网络的中心位置,提示其在HCC进展中发挥重要作用。4.GO分析的结果表明,lncRNA相关的基因显着富集了 9个GO途径,主要为调控染色体和细胞周期相关。KEGG富集分析证实,这些lncRNA调控的蛋白编码基因富集在细胞周期相关途径,叉头转录因子（Forkheadbox O,FOXO）信号传导通路,以及与癌症发生发展密切相关的过氧化物酶体增殖物激活受体（Peroxisomeproliferator-activated receptor,PPAR）信号传导途径以及经典的 p53信号通路。此外,富集的通路还集中在与肝脏功能关的初级胆汁酸的生物合成通路,以及多种细胞代谢通路。结论构建了 lncRNA模型调控HCC进展的作用网络,并对lncRNA影响HCC进展进而预测肝细胞肝癌患者生存的作用机制进行了全面分析。此外,发现lncRNA DDX11-AS1处于调控网络的中心位置,提示其在HCC进展中发挥重要作用。该部分的研究为进一步深入探究lncRNA在HCC中的作用提供了方向。第四部分模型中LncRNA DDX11-AS1在肝细胞肝癌中的作用机制研究目的第三部分的研究表明,lncRNA DDX11-AS1处于调控网络的“中心位置”,提示其在调控HCC进展中发挥最为重要作用。因此,在该部分的研究中我们将选择DDX11-AS1为研究对象,进一步通过体内外实验探究DDX11-AS1调控HCC的具体作用机制。方法1.将TCGA数据库中的HCC患者,根据DDX11-AS1的表达水平,将患者分为高表达组和低表达组,通过基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）分析,预测DDX1 1-AS1高表达组中所富集的通路。2.收集15例HCC患者及8例正常对照组患者的肝组织,采用免疫组织化学染色以及FISH实验,分别检测CD31又称血小板-内皮细胞粘附分子（Platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1/CD31）和 DDX11-AS1 在肝组织中的表达水平,并分析肝组织中DDX11-AS1与CD31表达的关系。3.收集患者临床资料,通过卡方检验,比较分析DDX11-AS1的表达与HCC患者临床病理特征的相关性。4.筛选DDX11-AS1表达高的HCC细胞系,通过构建小干扰RNA（Small interfering RNA,siRNA）,来敲降HCC系中DDX11-AS1的表达。荧光显微镜下观察转染效率,并通过qRT-PCR检测敲降效能。5.采用共培养小室,构建敲减DDX11-AS1的HCC细胞与人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）的共培养体系。通过细胞划痕实验和Transwell实验、检测与DDX11-AS1敲减共培养体系中HUVEC的迁移能力。6.通过基质胶小管形成实验,检测与lncRNA DDX1 l-AS1敲减共培养体系中HUVEC的迁移及官腔形成能力。7.通过 qRT-PCR及酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）,检测敲减lncRNADDX11-AS1的HCC细胞及上清液中主要血管生成因子的表达情况。结果1.GSEA分析显示,DDX11-AS1高表达组,富集在包含“血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）信号通路”在内的与血管再生相关通路,因此我们将研究重心放在其是否可调控HCC的血管再生方向。2.HCC患者肝组织内DDX11-AS1表达与CD31表达均明显高于正常对照组。此外,DDX11-AS1表达与反应血管再生程度的CD31表达呈正相关。3.IncRNA DDX11-AS1 的表达除与患者谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase,ALT）及碱性磷酸酶（Alkalinephosphatase,ALP）的表达相关外,与患者的肿瘤个数及是否有有血管侵犯密切相关。4.通过检测DDX11-AS1在HCC细胞系内的表达情况,我们选取Huh7和MHCC97h两个细胞系进行接下来的干扰实验。此外,选取siRNA-2用于敲降lncRNA DDX11-AS1 的表达。5.细胞功能学实验显示,干扰lncRNA DDX11-AS1可以抑制Huh7以及MHCC97h细胞共培养体系中HUVEC细胞的迁移能力。6.此外,干扰lncRNA DDX11-AS1也可明显可以抑制Huh7和7MHCC97h细胞共培养体系中HUVEC细胞的血管形成能力。7.qRT-PCR实验结果发现,干扰Huh7中lncRNADDX11-AS1表达后,血管内皮生长因子 A（vascularendothelial growth factorA,VEGFA）、血管生成素1（Angiogenin-1,Ang-1）和血管生成素 2（Angiogenin-2,Ang-2）表达明显降低（P<0.05）。此外,我们进一步通过ELISA的方法检测细胞上清中VEGFA、Ang-1和Ang-2的含量,干扰DDX11-AS1的表达后,Huh7肝癌细胞上清的VEGFA表达和Ang-2的表达水平明显下降。结论DDX11-AS1通过影响肿瘤细胞产生并释放VEGFA等血管再生因子,从而间接调控HCC的血管生成并影响HCC的发生发展。
王珵珵[3]（2020）在《针对丙型肝炎病毒E2包膜糖蛋白后层结构域开发相应中和抗体》文中研究说明丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus,HCV）是一种小型的单股正链带包膜的RNA病毒,系黄病毒科,丙型肝炎病毒属。目前已经鉴定出八种基因型和八十六个亚型。丙型肝炎病毒感染引发不同程度的肝炎,从轻症肝炎,到肝硬化,甚至肝癌。丙型病毒肝炎危机全球3.5亿多人的生活质量,大约40%到95%的丙肝病毒感染者会发展为慢性丙肝病毒感染,即血液中持续存在丙肝病毒RNA。慢性丙肝病毒感染因此成为一个全球性的健康问题。在2016年,世界卫生组织制定全球抗肝炎策略,目标在2030年消除病毒性肝炎对人类健康的威胁。随着对丙肝病毒的结构及其生活周期的深入了解,最新研发的一种多基因型直接抗病毒药物（direct acting antivirals,DAA）的临床应用彻底改变了传统的丙肝治疗。这种靶向HCV编码蛋白的DAA疗法能够治愈90%以上的感染患者,其中包括HCV感染的晚期肝病患者。但是随着病毒耐药性的形成,治疗失败也常有发生。而目前仍存在的困难包括:在低收入国家能获得诊断的人数少,治疗成本高以及没有抗HCV疫苗的问题。因此,研制预防性疫苗是控制全球丙肝病毒感染的必要手段。HCV的E1和E2包膜糖蛋白会在病毒表面形成异质二聚体,通过与宿主细胞受体结合介导病毒的进入。在过去的几十年内,人们在体外表达的E1E2异质二聚体往往质量不高,因而难以对其结构和功能进行研究。基于对HCV包膜糖蛋白的部分已知结构及对比其他黄病毒包膜蛋白特点,推测E2蛋白是经典的融合蛋白,而E1可能是参与融合的蛋白。E2包膜糖蛋白的胞外域是呈球形的非延伸的折叠,并分为不同的两层:包括有前层结构域及中央免疫球蛋白折叠结构域的前层,和后层（Back layer,BL）。有研究发现E1和可溶性E2糖蛋白的后层结构域（soluble E2-Back layer domain,sE2-BLd）之间存在关键相互作用,而sE2-BLd与E1相互作用正参与HCV包膜与细胞膜融合发生显着构象变化的过程中。我们实验室前期实验结果发现HCV包膜糖蛋白sE2-BLd以可溶形式,在HCV进入宿主细胞过程中发挥抑制作用。为研究E2-BLd多肽是否可以作为免疫原引发机体产生中和HCV的免疫反应,我们构建了用于表达E2,E2-BLd的质粒。为优化E2-BLd的表达,我们还对其中未配对的半胱氨酸进行了突变,避免蛋白聚集的形成。将构建的这些质粒转染哺乳动物细胞中表达带有组氨酸标签（histidine-tag,his-tag）的蛋白,发现这些组氨酸标签蛋白难以纯化。因此,为提升蛋白产量,我们构建了带谷胱甘肽巯基转移酶标签（glutathione S-transferase tag,GST-tag）的质粒,用于在大肠杆菌DE3菌株（Escherichia coli DE3/BL21,E.coli DE3/BL21）中表达可溶性重组蛋白,其蛋白产量足够用于建立酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）。之后,我们决定采取直接将质粒电脉冲到小鼠肌肉中表达E2和E2-BLd,这种DNA免疫方法同时具备操作方便和免疫原纯度高的优势。细胞培养扩增的HCV病毒（Cell-culture grown HCV,HCVcc）可用于研究病毒复制过程中吸附和入侵阶段的机制。为了评估E2-BLd抗体对病毒感染的潜在保护效果,我们分离免疫小鼠血清并检测其对HCVcc病毒的中和能力。但未检测到E2和E2-BLd免疫的小鼠产生了具有中和病毒效力的特异性免疫应答。然而,我们采用蛋白免疫印迹实验（Western Blotting,WB）和酶联免疫吸附实验却能检测到小鼠血清中存在能够识别来自HCV病毒H77毒株和J6毒株抗原的特异性抗体。综上所述,我们通过DNA免疫小鼠的方法获得了抗HCV核心蛋白,E2和E2-BLd（来源HCV H77毒株）的多克隆抗体,证实我们的免疫方法有效。为后续研究E2-BLd抗体抑制HCV进入宿主细胞奠定了生物学基础。
魏杰[4]（2020）在《Id1通过E2F4实现对HBV转录和复制的抑制作用及其机制研究》文中研究表明目的:乙型肝炎病毒（HBV）是一种小病毒基因组的部分双链DNA病毒,HBV导致的慢性乙肝仍然是一个全球公共卫生问题,即使得益于乙肝疫苗和抗病毒药物的临床应用,目前全世界仍超过2亿人患有慢性乙肝,乙肝的长期发展又会导致肝硬化和肝癌的发生,对人类的身体健康造成严重威胁。Id1蛋白是分化抑制因子（Id1-4）中的一员,属于bHLH转录因子家族,由于Id1缺少了与DNA结合的碱性（basic）区,导致Id1蛋白通过与其他bHLH转录因子结合形成异源二聚体从而抑制了bHLH转录因子对下游靶基因的调控。Id1的功能主要与促进细胞增殖和抑制分化相关,许多参与调控细胞增殖的基因,同样参与HBV的表达调控,此外如E2F4转录因子也属于H（helix）超家族,已被报道与Id2存在相互作用,而该因子在HBV的复制调控中的作用还未见报道。因此本文重点研究了宿主因子Id1及相互作用的转录因子E2F4在HBV复制和转录过程中的调控作用及其分子机制,其研究结果进一步丰富宿主因子对HBV的调控网络,并有助于基于该机制研发新的抗病毒药物。方法:1,在临床样本中,运用qRT-PCR和western blot实验分析HBV相关的肝细胞肝癌中癌旁与肿瘤的HBV pgRNA的转录水平以及Id1和HBV核心蛋白的表达水平。2,在细胞水平和动物水平,同样应用western blot实验比较HBV复制阳性和HBV复制阴性的细胞以及HBV转基因小鼠和非转基因小鼠中Id1的表达水平。3,进一步应用western blot分析HBV四种蛋白（HBc/p/s/x）对Id1的影响以及研究HBV在HepG2-NTCP感染模型中对Id1的作用。4,运用Id1Ad感染HBV复制的细胞（HepG2.2.15,HepAD38和HepG2-HBV1.1）实现Id1蛋白的过表达,分别应用Southern blot实验,ELISA和western blot检测HBV DNA,HBeAg和HBc水平变化;应用qPCR检测HepG2.2.15细胞中HBV cccDNA和pgRNA的变化。5,运用pCDNA3.1-Id1转染HBV感染HepG2-NTCP模型,应用qPCR检测其中HBV DNA的变化。6,应用靶向Id1的shRNA1/2干扰序列降低HepG2.2.15和HepG2-HBV1.1细胞中的Id1水平,分别应用Southern blot实验,ELISA和western blot检测HBV DNA,HBeAg和HBc水平变化。7,通过尾静脉注射Id1Ad感染HBV-TgM,在体内小鼠过表达Id1,同样应用Southern blot和qPCR检测小鼠肝脏组织中HBV DNA的变化,应用western blot和IHC检测肝组织细胞Id1和HBc蛋白的变化,采用ELISA检小鼠血清中HBeAg的变化。8,通过qRT-PCR和western blot筛查Id1过表达对调控HBV的经典宿主因子的影响。9,通过qRT-PCR筛查HBV复制的细胞中的mRNA水平发生改变的HLH转录因子。10,构建潜在的发生变化的HLH因子的过表达质粒,通过筛查它们对HBV Cp启动子的影响,特别是E2F4发挥了对Cp启动子活性显着的促进作用。11,进一步研究比较了E2F4在HBV复制的HepG2.2.15,HepAD38和HepG2-HBV1.1细胞中以及25对临床样本中癌组织和癌旁组织的各自表达情况。12,利用E2F4Ad感染HepG2.2.15和HepG2-NTCP细胞过表达E2F4,应用qPCR检测其中HBV DNA和pgRNA的变化。13,免疫荧光试验,免疫共沉淀实验和GST-pulldown实验检测E2F4与Id1之间的相互作用。14,胞浆胞核蛋白分离联合western blot试验检测HBV复制和Id1对细胞中E2F4的核内外分布的影响。15,HepG2.2.15分别在过表达E2F4和干扰Id1以及过表达Id1和干扰E2F4之后,Southern blot检测HBV DNA的复制水平。16,ChIP实验检测Cp启动子是否招募E2F4蛋白,Id1对该招募的影响。17,应用体外EMSA实验检测Cp启动子和E2F4蛋白是否存在直接相互作用。18,根据E2F4的二级结构和识别位点规律,生物信息学进行分析E2F4在Cp启动子上存在的潜在识别位点,构建相应的启动子突变体,应用荧光素酶活性实验验证潜在位点的缺失是否导致E2F4对HBV的调控受阻。19,体外SPR实验和ITC实验检测E2F4截短蛋白和Cp启动子DNA链的相互结合作用。20,根据潜在位点构建相应的HBV1.3倍体突变体,通过ChIP实验检测突变的Cp启动子对E2F4的招募情况。21,在Huh7细胞中转染HBV1.3倍体突变体,qPCR检测该细胞分别感染E2F4Ad和Id1Ad后HBV DNA的变化,ELISA检测细胞上清中HBeAg的变化。22,生物信息学比对分析常见的四种HBV基因型（Gt A/B/C/D）中E2F4潜在识别位点的保守性,进而应用southern blot和qPCR检测E2F4和Id1对四种HBV复制调控作用的普适性。结果:1,在25对HBV相关的肝癌与癌旁组织样本中,癌旁样本的pgRNA整体表达水平大约是肝癌组织的两倍（P<0.05）,其中20对样本的HBc的蛋白水平在癌旁组织中明显高于癌组织,有18对样本的Id1的蛋白表达水平在肝癌组织中明显高于癌旁。2,在HBV稳定复制的细胞和HBV瞬时转染的细胞中Id1 mRNA和蛋白水平均明显低于非HBV复制的对照肝癌细胞。3,在HBV感染细胞模型中,HBV的感染导致Id1的蛋白水平明显减少,过表达HBV相关蛋白HBp和L-HBs同样导致Id1蛋白水平的降低,HBV转基因小鼠的肝组织中,Id1蛋白水平也显着低于普通C57小鼠。4,Id1过表达可显着抑制HBV复制细胞（HepG2.2.15,HepAD38和HepG2-HBV1.1细胞）中HBV DNA复制中间体,pgRNA和HBc的表达水平,上清中HBeAg的分泌水平（P<0.01）,此外过表达Id1也显着下调HepG2.2.15细胞中HBV cccDNA的复制水平和Cp启动子的活性（P<0.05）。5,下调Id1的表达可显着促进HBV复制细胞（HepG2.2.15和HepG2-HBV1.1细胞）中HBV DNA复制中间体和HBc的表达水平,上清中HBeAg的分泌水平（P<0.05）。6,Id1过表达可显着抑制HBV转基因小鼠肝组织中HBV DNA复制水平和HBc的表达水平,也导致血清HBeAg分泌水平的显着下降（P<0.05）。7,在HepG2.2.15细胞中,Id1过表达没有导致经典的HBV调控因子发生明显变化,但HBV的复制导致4种HLH因子mRNA（E2F4,TCF3,E40和USF1）发生显着上调和2种HLH因子（Clock和HIF1α）的显着下调。8,E2F4过表达可以显着促进HBV Cp启动子活性和上调HBV pgRNA,HBV DNA的复制。9,在HBV复制的细胞中E2F4蛋白水平明显高于对照肝癌细胞;在HBV相关的肝癌临床样本中,E2F4的整体蛋白水平在癌旁组织中明显高于癌组织（P<0.05）。10,通过IP和GST-pulldown实验表明E2F4和Id1存在相互作用,Id1的过表达减弱了HBV复制引起的p130和E2F4的核转移。11,过表达E2F4可以进一步促进干扰Id1导致HBV DNA的上调,相反过表达Id1并没有显着抑制干扰E2F4导致HBV DNA的下调。12,ChIP实验证实E2F4能被Cp启动子招募,Id1的过表达同样也阻止了Cp启动子对E2F4的招募作用。13,EMSA实验中,随着E2F4截短蛋白(E2F41-180)的增加,Cp启动子的迁移速率明显下降,并且Cp冷探针可以竞争结合E2F4截短蛋白。14,生物信息学表明E2F4在Cp上存在潜在的识别位点5’-1758TTAAAGGTC1766-3’,该位点的缺失导致E2F4对HBV Cp启动子活性的促进作用消失;在相应的HBV1.3突变体（HBV1.3 mut2.3）中,E2F4和Id1都失去了对HBV的调控作用。15,SPR和ITC实验表明包含5’-1758TTAAAGGTC1766-3’的Cp2短链可以直接与E2F4的DNA识别区域相互结合。16,进步分析发现5’-1758TTAAAGGTC1766-3’在HBV Gt A/B/C/D基因型中高度保守,并且E2F4和Id1对这四种基因型的HBV的调控具有普适性。结论:在本研究中,我们阐明了Id1及其相互作用的转录因子E2F4在HBV复制和转录中的协同调控作用。研究结果显示,无论是在HBV复制背景下的细胞水平还是组织水平中,Id1表达水平均显着下调,而E2F4表达水平则显着上调;E2F4可以通过上调HBV Cp启动子活性从而促进HBV复制和相应的转录;上游Id1分子则通过与E2F4相互作用抑制其核内转移,导致HBV的复制和转录受抑制;5’-1758TTAAAGGTC1766-3’是E2F4在Cp启动子上的直接识别位点,在HBV A/B/C/D四种基因型中高度保守,是Id1和E2F4实现对四种基因型HBV调控的基础。我们的研究进一步完善了宿主因子对HBV的调控网络,为研发新的抗病毒策略提供了新的思路。
刘丽莉[5]（2020）在《住院病人丙型肝炎病毒感染的筛查及快速筛查方法的评价》文中研究说明丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus,HCV）因其人群普遍易感性呈全球性流行构成了严重的公共卫生问题。目前,全球约有7,100万HCV感染者,但80%的患者对自身感染不知情。丙型肝炎相关死亡病例逐年增加,带来巨大的经济和社会负担。2016年,WHO提出了彻底消除HCV感染的战略目标。因此,发现和治疗潜在的已感染HCV人群,简化HCV筛查手段,快速提高丙肝诊断率,成为实现目标的必经之路。一方面,我国医院对拟进行手术或侵入性医疗操作的住院病人常规筛查HCV,但缺乏进一步确诊和治疗,对实际筛查情况的认识也不充分。另一方面,基于实验室检测的普遍丙肝筛查难以实现。为快速提高丙肝诊断率和筛查率,充分掌握和利用医院已有的筛查数据,同时开发快速、便捷且成本低的HCV筛查工具必不可少。基于上述原因,本课题针对丙肝病毒感染筛查的策略与方法展开以下两部分研究。第一部分:目的:了解我国不同地区住院患者的HCV筛查情况,并提出更有价值的HCV筛查策略。方法:我们进行了一项包含全国不同地区8家三级甲等医院的多中心研究。收集2016年1月至2016年12月全国不同地区8家三级甲等医院的住院患者信息和HCV筛查结果,计算总体筛查率,比较不同地区、不同年龄组的非肝病相关科室住院患者HCV阳性率。进而推算在现行政策下每年接受筛查的人数及可检测出的HCV抗体阳性患者的数量。制定更好的HCV筛查和管理策略。结果:2016年8个中心的总住院患者850,379人,其中HCV筛查人数为512,938,最终有467,008例（51.20%为男性）非肝病相关科患者纳入研究,非肝病相关科室HCV筛查率大于50%。HCV抗体阳性患者4,129例,总体HCV抗体阳性率为0.88%（95%置信区间[confidence interval,CI],0.85%–0.91%）,男性总体HCV抗体阳性率为0.91%,高于女性的0.85%,差异具有统计学意义。不同年龄组HCV抗体阳性率随着年龄增长而增加,相反,年龄越小,HCV抗体阳性率越低,证实了近年来我国政府针对HCV筛查和防控所做相关努力的积极影响和效果。值得注意的是,40岁以上人群占HCV抗体阳性患者的90.14%（3,722/4,129）,其中,6064岁年龄组阳性率最高。儿科患者HCV抗体阳性率最低为0.13%（95%CI,0.06%–0.20%）,肿瘤科患者HCV抗体阳性率最高,达1.80%（95%CI,1.36%–2.24%）。根据我国卫生和计划生育统计年鉴数据,2016年全国医院总住院患者为1.75亿人次,如果各医院同样能达到50%的筛查率,推算2016年在医院接受丙肝筛查的人数为8,750万人,进一步按照我们的阳性率推算可发现约77万非肝病科丙肝抗体阳性患者。最后,我们提出一种基于加强HCV筛查后管理的建议。结论:八家三级甲等医院住院人群HCV筛查率高达50%以上,加强对已筛查人群的管理,可发现更多的丙肝病毒的感染者,有效提高丙肝诊断率及治疗率。建议有关部门制定对住院患者检查结果充分利用的相关政策,有助于找到中国的千百万已感染患者,加快消除丙肝的步伐。第二部分:目的:HCV快速检测方法的评价性研究,对丙型肝炎病毒抗体口腔分泌物检测试剂进行首次临床效能评价。明确其应用于筛查HCV中的潜在价值,进一步推动清除HCV进程。方法:在不同地区的三家医院进行多中心研究,通过与已有的实验室检测方法对比,评估维尔试剂的敏感性和特异性。应用江苏维尔试剂对所有受试者进行口腔分泌物HCV抗体检测,并应用现有的血清HCV抗体检测试剂（雅培ARCHITECT丙肝抗体检测试剂及英科新创丙肝抗体检测试剂）进行血清HCV抗体检测。对于维尔试剂及雅培试剂结果为阳性的样本,通过HCV RNA检测进一步验证。此外,根据受试者意愿,一部分患者也接受了美国Ora Quick快速丙肝病毒检测试剂的检测及维尔试剂的自采自测。结果:共纳入1,179名受试者,其中慢性丙肝感染者486例,其他非丙肝感染的肝病患者108例,体检人群585例。以雅培血清HCV抗体检测试剂为参考依据,Well口腔分泌物HCV抗体检测试剂（考核试剂）的敏感性为91.88%（95%CI,88.97%–94.09%）,特异性为98.00%（95%CI,96.58%–98.86%）。考核试剂与英科新创生物科技公司的HCV抗体检测试剂的一致性为97.02%（1,138/1,179）。考核试剂与Ora Quick试剂的一致性为98.50%（197/200）。此外,受试者应用考核试剂自我检测结果与研究人员的检测结果高度一致（Kappa=0.979）。HCV RNA检测结果还表明,在39例考核试剂出现假阴性的样本中,仅1例检测到HCV RNA阳性,同时在172例HCV RNA阳性病例中,考核试剂可检测到171例为阳性。结论:口腔分泌物HCV抗体检测试剂具有较高的敏感性和特异性,其诊断能力能够满足HCV筛查需求。该试剂检测快速,无创,不需要仪器,成本低,且易于操作,特别适合用于社区及家庭医疗中的HCV筛查。有望未来用于HCV的全面筛查,识别已感染人群,尽早实现消除HCV的目标。
张超[6]（2020）在《四川省丙型肝炎病毒的感染现状和基因型分布的特征》文中指出研究目的:了解四川省地区HCV感染情况、基本流行性特征以及基因型分布情况。研究方法:通过回顾性研究2014年-2018年期间采集自四川省人民医院4465例就诊患者的血液标本,对患者血液样本的HCV-RNA的病毒载量进行分析。同时,分析基于PCR-荧光探针分型法检测的从2016年-2018年期间收集的467例患者血液标本的HCV基因分型的情况。研究结果:高精度HCV-RNA定量检测确认阳性1647例,阳性率为36.89%,（95%可信区间:35.47-38.31%）,其中813位为男性,阳性率为49.36%;女性为834,阳性率为50.64%。在阳性患者中40<年岁≤60岁患者占55.74%,在2014年-2018年期间41至60岁年龄组的阳性率分别为50.00%,57.94%,55.97%,55.51%和54.08%。每年进行HCV-RNA定量检测的确认阳性率分别为49.28%,48.98%,39.83%,30.47%和31.36%。2016年-2018年的469例HCV-RNA阳性血清标本中,1b型有355例（76.02%）,占主导地位,男性166例（46.76%）和女性189例（53.25%）。研究结论:2014年至2018年四川省人民医院HCV-RNA确诊阳性率呈现逐年下降的趋势,40<年龄≤60岁患者阳性率却呈现一个逐年上升的趋势。四川地域HCV风行的基因型呈现多基因型的散布特色,首要为1b型。了解HCV感染患者的基本情况以及常见的分型,对临床检测与治疗有重要价值。
秦亚娟[7]（2020）在《运用双抗原夹心ELISA法和间接ELISA法检测丙型肝炎病毒抗体结果的一致性比较》文中认为目的:探讨运用双抗原夹心酶联免疫法（ELISA）与间接ELISA法检测丙型肝炎病毒（HCV）抗体结果的一致性。方法:收集2018年1月1日至2018年10月31日新疆医科大学第三附属医院行丙型肝炎病毒抗体测定的176例患者血清标本,应用双抗原夹心ELISA法与间接ELISA法检测,并评估二者一致性及结果不一致的影响因素。结果:入组受试者的平均年龄为55.41±13.52岁。间接法（万泰）、双抗原夹法（万泰）与间接法（金豪）ELISA测定的阳性率分别为74.43%、68.75%和73.30%。前二者检测结果具有强的一致性（κ=0.829;P<0.001）,后二者具有强的一致性（κ=0.847;P<0.001）。分析双抗原夹心ELISA与间接ELISA结果不一致的影响因素为:女性（OR:1.462;P<0.05）,年龄（<35岁;OR:3.667;P<0.05）,肿瘤（罹患恶性肿瘤;OR:3.621;P<0.05）。结论:双抗原夹心ELISA法和间接法ELISA检测丙型肝炎病毒抗体具有较高一致性,女性、年龄小于35岁和罹患恶性肿瘤是结果不一致的重要影响因素,推荐使用双抗原夹心ELISA法进行丙型肝炎病毒抗体的测定。
温桂平[8]（2019）在《戊型肝炎病毒分泌型抗原的发现及其临床应用价值》文中指出戊型肝炎病毒（hepatitis E virus,HEV）是全球范围内急性病毒性肝炎的最主要诱因之一,在一些发展中国家是50%的急性病毒性肝炎病例的诱发病原体,我国是戊型肝炎高发区之一。大部分的戊型肝炎患者,呈现典型的急性肝炎症状,病死率可达1%,孕妇患急性戊肝后症状更为严重,病死率可高达25%。HEV感染在免疫抑制人群中可能发展为慢性化并导致肝脏纤维化进展加快。此外,HEV感染还会导致多种肝外症状。HEV感染的常用诊断指标有HEV IgM、HEV IgG及HEV RNA。HEV IgG用来指示HEV的既往感染和疫苗接种情况。HEVIgM是临床较为常用的诊断指标,主要用于指示HEV感染急性期,但是在恢复期也会有一段时间内呈现阳性。HEV RNA检测是检测病原体的有效方法,是诊断HEV现症感染的重要指标。但RNA检测成本较高,对检测仪器、操作人员以及检测场所均有一定要求,并且对样本的保藏与运输也有较高要求。HEV抗原作为病毒复制的另一重要指标,在HEV诊断上却没有得到较好的应用,主要原因是目前HEV抗原检测试剂灵敏度不足并且血液检测结果易受HEV抗体水平影响。本研究旨在建立灵敏度高、应用范围广的HEV抗原检测方法,并评估HEV抗原指标在临床中的应用价值。首先,本研究基于96株HEV结构蛋白pORF2抗体,筛选获得最优抗体配对,构建了新的HEV抗原检测方法,检测灵敏度为6.3 × 103 copies/mL。与原商品化试剂相比,改善了不同基因型抗原检测能力不一致的问题并且灵敏度提升了10倍以上。应用新的抗原检测方法,本研究发现血清中pORF2有两种存在形式:一种以经典的病毒粒子形式存在,与RNA结合构成病毒衣壳,命名为pORF2C;而另一种新发现的pORF2蛋白不与病毒RNA结合,命名为pORF2s。本研究的结果进一步揭示出两种形式pORF2的表达与orf2基因上的两个同框的AUG密码子有关,第一个AUG密码子位于1stnt,起始pORF2S翻译;而第二个AUG密码子位于46th nt,起始pORF2C的翻译。HEV pORF2s占pORF2抗原的99.9%以上,pORF2s在血清中大量存在并且不与RNA结合的特点,决定了该指标是独立于HEVRNA的诊断新指标。HEV感染恒河猴系列标本的检测结果显示,HEV抗原阳性期与RNA阳性期基本重合,能够有效反映出病毒血症期以及排毒期。相较于原抗原检测试剂,新的抗原检测方法受血清抗体的干扰较小。由于新检测方法在灵敏度及检测周期上的明显优势,实现对原抗原检测试剂的升级替换。基于急性肝炎队列标本,本研究对HEV IgM、HEV RNA与HEV抗原三个戊肝急性期指标进行了比较。研究显示HEV抗原在急性戊肝诊断中灵敏度为91.4%,特异性为99.8%,阳性预测值为96.0%。HEVIgM灵敏度略优于HEV抗原（92.3%）,但HEV IgM可在发病后持续32周,远长于已知3-4周的HEV感染急性期,这使得HEV IgM阳性预测值仅为64.8%。HEV抗原与HEV IgM联合检测能够有效的增加诊断的准确性,结合HEV RNA辅助诊断,能确诊95.7%的急性戊肝病例,实现经济、有效的急性戊肝诊断。对于厦门合格献血者HEV调查研究显示HEV抗原和HEV RNA的阳性率均为0.28%。对17名HEV RNA和HEV抗原均为阳性的献血者随访跟踪显示,10名献血者出现70天以上的HEV病原体阳性。与典型急性戊肝患者相比,这些HEV携带者体内的病毒水平较低,但是病毒血症、抗原血症时期较长,大部分HEV携带者未出现明显的抗体应答。这些HEV携带者的存在可能是输血安全的潜在威胁。此外,为了拓展HEV抗原检测的应用范围,本研究建立了 HEV抗原检测试纸条,在保持灵敏度不变的情况下,将检测时长缩短至15分钟。同时本研究还建立了基于抗原检测的HEV分类方法,实现不依赖测序的HEV快速分类。此外,本研究还发现HEV抗原在宿主肾脏高丰度聚集,HEV患者尿液中HEV抗原浓度为血液的47-5556倍,显示尿液可能是HEV诊断更好的采样标本。综上所述,本研究通过重新筛选检测抗体配对,研发了新一代HEV抗原检测试剂,并发现其主要诊断靶标并非原本认识的病毒衣壳蛋白pORF2C,而是独立于病毒核酸的分泌型游离抗原pORF2s,该抗原及其产生机制的发现为HEV的诊断提供了新的靶标,也为理解抗原指标的临床意义提供了新的理论基础。在此基础上,本研究将该新靶标应用于急性肝炎诊断及献血者筛查中,优化了 HEV的诊断流程并发现了 HEV新的流行特点。这些研究成果为HEV的精确诊断及致病机制研究提供了有效的工具,此外本研究所发现的分泌型抗原pORF2s也为今后研究HEV的免疫逃逸、免疫耐受、生活史研究提供了重要的思路。
袁志凤[9]（2019）在《日照市无偿献血人群中隐匿性乙肝感染状况的统计分析及研究》文中研究指明目的通过筛查日照市无偿献血者的血液,计算隐匿性乙肝（Occult hepatitis B virus infection,OBI）的阳性率,初步分析OBI在日照市无偿献血人群中的流行状况。探讨OBI可能的发生原因、转化生长因子β1（Transforming growth factorβ1,TGF-β1）在OBI感染发生中的作用,评估输血传播OBI的残余风险,为更好的制定政策,改进血液筛查策略,为临床提供安全血液和血液制品提供思路。方法（1）血液常规检测:收集我站2014年至2018年的无偿献血者样本117395例,酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测血清中的乙肝表面抗原（HBsAg）、丙肝抗体（HCV Ab）、人类免疫缺陷病毒抗原抗体（HIV Ag/Ab）、梅毒螺旋体抗体（TP）含量,统计血清中HBsAg、HCV Ab、HIV Ag/Ab、TP的阳性率,分析本地区献血人群中经输血传播病毒的流行状况。（2）核酸检测技术（Nucleic acid amplification test,NAT）对血液样本中HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA检测:本实验室应用上海浩源和广州中山达安两个厂家的核酸检测系统,对常规筛查合格的92110例样本进行NAT8人份混检,统计HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA阳性率,分析无偿献血人群中OBI的阳性率。探讨OBI在本地区无偿献血人群中的流行状况。（3）对HBsAg合格HBV DNA不合格的样本进行“两对半”检测:核酸检测工作开展以来本实验室共检出HBsAg阴性HBV DNA阳性的样本31例,对这部分样本进行检测乙肝“两对半”,统计分析样本中核心抗体的阳性率,探讨核心抗体与OBI的相关性。（4）聚合酶链式反应技术（Polymerase Chain Reaction,PCR）定量检测:HBV DNA阳性的样本进行定量检测,分析其病毒载量水平。（5）应用ELISA法分别检测健康对照组30例、HBV组30例、OBI组30例样本的血清中TGF-β1表达情况,分析其与OBI的相关性。结果（1）117395例样本中,实验室检测不合格样本共2183例,总不合格率为1.86%,各年份之间的不合格率总体呈逐年下降趋势,有明显统计学差异（?2=709.00,P<0.05）。其中HBsAg不合格样本249例,不合格率为0.21%,各年份之间的不合格率有统计学差异（?2=61.95,P<0.05）。（2）对性别、年龄以及各地区之间做了统计分析,其中性别之间无统计学差异（P>0.05）;HBsAg不合格率在各个年龄段之间的比例分别为:40.2%、23.3%、24.9%、11.6%,其中18-25岁之间的不合格率最高为40.2%;各区县之间比较结果分别为:38.2%、14.5%、26.1%、21.3%,以莒县地区不合格率最高为38.2%。（3）92110例样本中检出HBV DNA有反应性样本31例,阳性率为0.034%;HCV RNA未检出有反应性样本;检出HIV RNA有反应性样本1例,阳性率为0.001%。（4）HBV DNA样本病毒载量很低,结果<20IU/ml的样本占70%以上。（5）OBI组血清TGF-β1水平较健康对照组增高,差异有统计学意义（P<0.05）,OBI组血清TGF-β1水平与HBV组比较无统计学差异（P>0.05）。结论（1）本地区无偿献血人群中OBI的检出率为0.034%。（2）核酸检测应用于血液筛查能缩短病毒检测的“窗口期”,特别对于OBI的检出有重要意义,能降低输血传播乙肝病毒的风险,核酸检测与酶免检测互为补充不能替代。（3）新的血液筛查模式电化学发光法加核酸检测应用于血液筛查具有可行性。（4）血清中免疫因子TGF-β1在OBI的持续感染过程中发挥重要作用。
邬旭龙[10]（2019）在《猪病毒性疫病高通量检测方法的建立和应用及NADC30-like PRRSV与ASFV的监测研究》文中指出我国养猪业正在向规模化和智能化的养殖模式蓬勃发展,养殖规模与管理水平的不对称,使得猪病种类越来越多,病程复杂程度不断加剧,多种疫病的混合感染越来越严重,给临床诊断和治疗带来了困难,严重制约了我国养猪业的发展。许多散户和微型养猪场,尤其是以生活产生的餐厨垃圾作饲料饲喂的猪场,因其饲养管理和疫病防控能力差,导致各种疾病的发生,使猪场对疾病的预防和控制越来越困难。加之我国养猪现状中生猪调运,生物安全防控不到位等因素,加剧了各种病原体在猪场间的传播。多种疾病的感染严重影响猪群健康水平和生物安全体系,而加大了新发动物疫病和重大外来疫病对猪场的威胁。本研究通过建立两种高效、灵敏、自动化的高通量检测方法,对不同养殖场进行病毒性病原分子流行病学调查,并分析了不同养猪场对疾病的有效防控能力,以及新发和外来动物疫病的感染风险,进一步对新发和外来动物疫病猪繁殖与呼吸综合征NADC30-like毒株（NADC30-like PRRSV）和非洲猪瘟（ASF）进行检测和病毒实时监控,主要结果如下:（1）建立了一种毛细管电泳的猪病毒性疫病高通量检测方法,能有效同时对9种猪病原体进行检测,包括PRV、CSFV、FMDV、JEV、PCV2、PRRSV、PEDV、TGEV和PPV,该方法同时检测到9种病毒的最低检测限度为104 copies/μL,具有较高的检测灵敏度,同时具有较好的特异性和重复性。通过对2015-2017年间采集的178份临床样品进行检测,发现病原体感染情况较为严重,特别是多重混合感染情况较为复杂,样品阳性检出率为49.44%,在检出的病毒性疾病中,PRV、PRRSV、PCV2、PEDV所占比例较高,以PCV2和PRRSV混合感染极为严重。因此提高猪场饲养管理水平,建立有效的疾病防治措施显得尤为重要。（2）基于靶序列富集多重PCR（TEM-PCR）技术和液相芯片系统,建立一种同时检测上述9种猪病毒性疫病的高通量检测方法,通过对该方法检测性能的优化和验证,以及临床样品应用及比较,该方法较毛细管电泳检测方法具有更高的灵敏度,能同时检测到9种病毒的最低检测限度为103 copies/μL,特异性和重复性较好。临床样品检测结果与毛细管电泳检测结果高度一致,为猪病高通量的临床鉴别诊断提供一种有力的技术支撑,同时为先进的检测技术应用于兽医临床诊断提供参考。（3）利用建立的两种高通量检测方法,对三种不同类型养猪场采集的341份临床样品进行检测和病原分子流行病学调查研究。根据病原检测结果,初步分析了不同猪场对疾病的有效防控能力,进而推测猪场对新发和外来动物疫病的防控能力及感染易感性。结果显示四川地区养猪场病原阳性检出率均较高,普遍存在多病原混合感染的情况,且较为严重,特别是微型养猪场,其病原感染情况最为严重。进一步通过鉴别诊断方法对近年来国内的新发动物疫病NADC30-like PRRSV进行临床的监测研究,结果可知341份临床样品ADC30-like PRRSV阳性检出率为21.41%,其中微型养猪场的阳性检出率最高,为45.90%,其次为中小型养猪场,阳性检出率为22.03%,最低为规模化养猪场,阳性检出率为11.73%。猪场应进一步完善生物安全措施,做好猪群的饲养管理,结合现有疫苗控制,降低猪场感染的可能。（4）原核表达ASFV pK205R重组蛋白,并进行蛋白纯化和验证。以pK205R为包被抗原,建立一种快速的ASFV间接ELISA抗体检测方法,同时建立了高检测灵敏度的ASFV ddPCR核酸检测方法。分别对2015-2017年间采集的474份样品进行检测,该方法在我国边境及口岸入境动物检验检疫中开展临床示范,同时对四川地区不同养猪场ASFV进行实时监控,检测结果均为阴性,表明在本研究中并未发现ASFV的感染。本研究为国内ASFV的实时监控提供数据参考,同时也为ASFV的检验检疫提供可靠的技术储备。
二、聚合酶链反应杂交ELISA对肝炎患者血清HCV RNA的测定和分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、聚合酶链反应杂交ELISA对肝炎患者血清HCV RNA的测定和分析（论文提纲范文）
（1）重组腺相关病毒载体介导的环状RNA circFBXW4在肝纤维化中的功能及机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验细胞 |
| 2.3 实验物品 |
| 2.4 仪器与设备 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 小鼠肝纤维化形成和逆转模型的建立 |
| 3.2 原位灌流小鼠原代细胞 |
| 3.3 circFBXW4 腺相关病毒载体的构建与鉴定 |
| 3.4 circFBXW4 腺相关病毒的包装 |
| 3.5 小鼠尾静脉注射腺相关病毒 |
| 3.6 血清谷丙转氨酶的测定 |
| 3.7 血清谷草转氨酶的测定 |
| 3.8 肝组织羟脯氨酸的测定 |
| 3.9 肝组织苏木精-依红染色(hematoxylin eosin,HE)染色 |
| 3.10 肝组织Masson染色 |
| 3.11 免疫荧光染色 |
| 3.12 免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)染色 |
| 3.13 肝星状细胞培养 |
| 3.14 脂质体介导细胞转染小干扰 RNA(small interfering RNA,siRNA) |
| 3.15 质粒大提和细胞转染 |
| 3.16 流式分析细胞周期 |
| 3.17 流式分析细胞凋亡 |
| 3.18 CCK8 细胞增殖试验 |
| 3.19 EDU-555 细胞增殖检测 |
| 3.20 DNA提取 |
| 3.21 双萤光素报告基因检测 |
| 3.22 RNA提取 |
| 3.23 细胞质、细胞核RNA分离提取 |
| 3.24 Real-time qPCR |
| 3.25 microRNA qPCR |
| 3.26 冰冻切片RNA荧光原位杂交 |
| 3.27 蛋白提取和变性 |
| 3.28 Western blot |
| 3.29 数据处理方法 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 小鼠肝纤维化模型的构建及鉴定 |
| 4.2 肝脏原代肝星状细胞中circRNAs高通量测序及分析 |
| 4.3 circFBXW4 在肝纤维化进展及逆转过程中的表达变化 |
| 4.4 环状RNA circFBXW4 的分子组成、稳定性及亚细胞定位 |
| 4.5 重组腺相关病毒载体介导的circFBXW4 过表达对小鼠肝纤维化的影响 |
| 4.6 慢病毒载体介导的circFBXW4 过表达对肝星状细胞活化,增殖及凋亡的影响 |
| 4.7 阳离子脂质体介导的circFBXW4 沉默对肝星状细胞活化及增殖的影响 |
| 4.8 原代肝星状细胞中micro RNA芯片检测及circFBXW4 ceRNA机制分析 |
| 4.9 miR-18b-3p对小鼠肝星状细胞活化的影响 |
| 4.10 原代肝星状细胞中circRNAs-microRNAs-mRNAs分子调控机制的研究 |
| 4.11 阳离子脂质体介导的FBXW7 过表达/沉默对肝星状细胞的影响 |
| 4.12 circFBXW4 靶向miR-18b-3p调控FBXW7 信号通路 |
| 5 讨论 |
| 5.1 第一部分:肝纤维化小鼠的原代肝星状细胞中差异表达的circRNAs高通量测序及分析 |
| 5.2 第二部分:重组腺相关病毒载体、慢病毒载体、阳离子脂质体介导circFBXW4 在体内、体外对肝纤维化和肝星状细胞活化的影响 |
| 5.3 第三部分:circFBXW4 通 过靶向miR-18b-3p调控FBXW7信号通 路的ceRNA机制研究 |
| 6 结论 |
| 7 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 环状RNA在肝脏相关疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
（2）长链非编码RNA在肝细胞肝癌临床预后中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 通过TCGA数据库构建预测肝细胞肝癌患者生存的LncRNA模型 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 附图表 |
| 第二部分 应用LncRNA模型预测乙肝相关肝细胞肝癌肝切除术后患者的生存 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 附图表 |
| 第三部分 LncRNA模型预测肝细胞肝癌患者生存的机制研究 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 附图表 |
| 第四部分 模型中LncRNA DDX 11-AS 1在肝细胞肝癌中的作用机制研究 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文 1 |
| 外文论文 2 |
（3）针对丙型肝炎病毒E2包膜糖蛋白后层结构域开发相应中和抗体（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中文部分 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 丙型肝炎病毒的发现 |
| 1.2 丙型肝炎病毒的病原学 |
| 1.2.1 丙型肝炎病毒基因组及病毒蛋白 |
| 1.2.2 丙型肝炎病毒颗粒的结构 |
| 1.2.3 丙型肝炎病毒生命周期 |
| 1.3 丙型肝炎病毒研究中面临的主要困难 |
| 1.4 丙型肝炎病毒E2包膜糖蛋白后层结构域 |
| 1.5 项目概况 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 质粒构建 |
| 2.1.1 质粒及引物的设计与合成 |
| 2.1.2 构建质粒方法 |
| 2.1.3 质粒扩增 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.2.1 细胞株及细胞培养基 |
| 2.2.2 细胞传代 |
| 2.2.3 细胞冻存 |
| 2.2.4 细胞复苏 |
| 2.2.5 构建稳转细胞株 |
| 2.3 蛋白表达与纯化 |
| 2.3.1 细胞转染 |
| 2.3.2 细胞裂解 |
| 2.3.3 蛋白免疫印迹 |
| 2.3.4 抗体 |
| 2.3.5 考马斯亮蓝染色及丽春红染色 |
| 2.3.6 蛋白表达 |
| 2.3.7 蛋白纯化 |
| 2.4 小鼠免疫 |
| 2.4.1 小鼠 |
| 2.4.2 质粒DNA免疫 |
| 2.4.3 丙型肝炎病毒假病毒颗粒包装 |
| 2.4.4 丙型肝炎病毒传染性颗粒的制备 |
| 2.4.5 病毒滴度的测定 |
| 2.4.6 中和实验 |
| 2.4.7 酶联免疫吸附实验 |
| 2.4.8 免疫血清对病毒抗原的识别 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 哺乳动物细胞表达丙型肝炎病毒包膜糖蛋白 |
| 3.1.1 真核表达载体的构建 |
| 3.1.2 构建表达丙型肝炎病毒包膜糖蛋白的稳转细胞株 |
| 3.1.3 丙型肝炎病毒包膜糖蛋白的表达与纯化 |
| 3.2 原核细胞表达丙型肝炎病毒包膜糖蛋白 |
| 3.2.1 原核表达载体的构建 |
| 3.2.2 优化原核表达条件 |
| 3.2.3 原核表达蛋白的制备与纯化 |
| 3.3 制备丙型肝炎病毒 |
| 3.3.1 丙型肝炎病毒假病毒颗粒的包装 |
| 3.3.2 丙型肝炎病毒传染性颗粒的制备 |
| 3.4 小鼠免疫实验 |
| 3.4.1 小鼠免疫程序 |
| 3.4.2 免疫小鼠血清中和感染性丙型肝炎病毒颗粒 |
| 3.4.3 酶联免疫吸附法检测免疫小鼠血清中特异性抗体 |
| 3.4.4 免疫小鼠血清抗体识别病毒抗原 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
| 英文部分 |
| Abstract |
| Chapter1 Introduction |
| 1.1 Discovery of Hepatitis C Virus |
| 1.2 Etiology of Hepatitis C Virus |
| 1.2.1 HCV genomes and viral proteins |
| 1.2.2 Structure of the hepatitis C virus particle |
| 1.2.3 HCV life cycle |
| 1.3 Major Difficulties in HCV Research |
| 1.4 HCV Glycoproteins E2 Back Layer Domain |
| 1.5 Project Overview |
| Chapter2 Materials and Methods |
| 2.1 Plasmids Construction |
| 2.1.1 Constructs analysis and gene synthesize |
| 2.1.2 Plasmids construction |
| 2.1.3 Constructs amplification |
| 2.2 Cell culture |
| 2.2.1 Cell lines and cell culture medium |
| 2.2.2 Cell passage |
| 2.2.3 Cell cryopreservation |
| 2.2.4 Cell thawing |
| 2.2.5 Stable cell line generation |
| 2.3 Protein expression and purification |
| 2.3.1 Transfection |
| 2.3.2 Cell lysis |
| 2.3.3 Western blotting |
| 2.3.4 Antibodies |
| 2.3.5 Coomassie blue staining |
| 2.3.6 Protein expression |
| 2.3.7 Protein purification |
| 2.4 Mouse immunization |
| 2.4.1 Mice |
| 2.4.2 Plasmid DNA immunization |
| 2.4.3 HCV pseudoparticles packaging and infection |
| 2.4.4 Preparation of cell-culture grown HCV replication |
| 2.4.5 Viral Titration |
| 2.4.6 Neutralization test |
| 2.4.7 Enzyme-linked immunosorbent assay |
| 2.4.8 Recognition of viral antigens by immune serum |
| Chapter3 Results |
| 3.1 Mammalian cells expression of HCV glycoprotein |
| 3.1.1 Construction of eukaryotic expression plasmids |
| 3.1.2 Generating stable cell lines that expressing hepatitis Cvirus glycoproteins |
| 3.1.3 Expression and purification of E2- BLd |
| 3.2 Prokaryotic cells expression of HCV glycoprotein |
| 3.2.1 Construction of prokaryotic expression plasmids |
| 3.2.2 Optimizing prokaryotic expression condition |
| 3.2.3 Preparation and purification of prokaryotic expressed proteins |
| 3.3 Preparation of hepatitis C virus |
| 3.3.1 Hepatitis C virus pseudo particles packaging |
| 3.3.2 Cell culture grown hepatitis C virus preparation |
| 3.4 In vivo expression approach using DNA mouse immunization |
| 3.4.1 Mice immunization strategies |
| 3.4.2 Neutralization ability of the immunized mice sera towards HCVcc |
| 3.4.3 Validate the specific antibodies in mice sera by ELISA |
| 3.4.4 Immunized mice sera recognize viral antigen |
| Chapter4 Discussion |
| Chapter5 Conclusion and prospect |
| References |
| Appendix |
| Acknowledgement |
| About the author |
（4）Id1通过E2F4实现对HBV转录和复制的抑制作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一章 Id1在HBV表达的环境中发生下调 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 比较HBV相关的肝癌组织和癌旁组织中pgRNA的表达水平 |
| 2.2 比较HBV相关的肝癌组织和癌旁组织中Id1和HBc的蛋白表达水平 |
| 2.3 HBV复制在细胞水平对Id1表达水平的影响 |
| 2.4 比较HBV转基因小鼠和普通C57 小鼠中Id1 蛋白表达水平 |
| 2.5 HBV感染HepG2-NTCP对 Id1 表达水平的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 Id1通过抑制核心启动子的活性下调HBV转录和复制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 过表达Id1对HBV复制水平的影响 |
| 2.2 过表达Id1对HBV转录水平的影响 |
| 2.3 过表达Id1对HepG2-NTCP模型中HBV复制水平的影响 |
| 2.4 过表达Id1对HBV4个启动子活性的影响 |
| 2.5 沉默Id1对HBV复制水平的影响 |
| 2.6 沉默Id1对HBV转录水平的影响 |
| 2.7 过表达Id1对HBV转基因小鼠HBV复制和转录水平的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 E2F4通过激活核心启动子的活性上调HBV转录和复制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 过表达Id1筛查对HBV转录调控的转录因子的影响 |
| 2.2 HepG2 转染HBV1.1 倍体分析HLH转录因子表达变化 |
| 2.3 过表达E2F4激活HBV核心启动子活性 |
| 2.4 过表达E2F4促进HBV的转录和复制 |
| 2.5 比较HBV相关的肝癌组织和癌旁组织中E2F4的蛋白表达水平 |
| 2.6 沉默E2F4对HBV转基因小鼠HBV复制和转录水平的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 Id1 通过结合E2F4 并阻断其对HBV核心启动子的激活 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Id1抑制E2F4的核转移 |
| 2.2 Id1和E2F4的相互作用 |
| 2.3 E2F4介导Id1对HBV抑制作用 |
| 2.4 E2F4通过识别核心启动子促进HBV的转录和复制 |
| 2.5 Id1阻断核心启动子对E2F4的招募 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 E2F4 通过识别结合Cp启动子上5'-1758TTAAAGGTC1766-3'位点对HBV表达调控中的实现促进作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 筛选E2F4在Cp启动子上的识别位点 |
| 2.2 5 '-1758TTAAAGGTC1766-3'是E2F4和Cp的相互作用的基础 |
| 2.3 5 '-1758TTAAAGGTC1766-3'的突变体导致E2F4和Id1 失去对HBV调控作用 |
| 2.4 5 '-1758TTAAAGGTC1766-3'的保守性是E2F4和Id1对A-D基因型HBV发挥调控作用的基础 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间撰写和发表的文章 |
（5）住院病人丙型肝炎病毒感染的筛查及快速筛查方法的评价（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 丙肝的流行病学 |
| 1.1.1 全球的疾病负担 |
| 1.1.2 各地区流行状况 |
| 1.1.3 全球基因型分布 |
| 1.1.4 传播途径 |
| 1.1.5 特殊人群的流行病学研究 |
| 1.1.6 我国的丙肝流行病学研究 |
| 1.2 HCV病原学 |
| 1.3 HCV感染的自然史 |
| 1.4 丙肝的预防与诊治 |
| 1.4.1 预防措施 |
| 1.4.2 实验室检查 |
| 1.4.3 诊疗及管理 |
| 1.4.4 抗病毒治疗 |
| 1.5 防治丙肝面临的挑战 |
| 1.5.1 WHO的战略目标 |
| 1.5.2 我国丙肝防治面临的挑战 |
| 1.5.3 HCV筛查的必要性及可行性 |
| 1.5.4 HCV筛查策略 |
| 1.5.5 HCV筛查方法 |
| 第2章 住院病人丙型肝炎病毒感染的筛查 |
| 2.1 研究对象和方法 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 研究方法 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 HCV抗体的检测 |
| 2.2.2 主要仪器和试剂 |
| 2.2.3 统计学分析 |
| 2.3 研究结果 |
| 2.3.1 研究对象的选择和分布 |
| 2.3.2 研究人群的人口学特征 |
| 2.3.3 不同性别、年龄间HCV抗体阳性率的比较 |
| 2.3.4 HCV抗体阳性患者年龄分布 |
| 2.3.5 不同地区HCV抗体阳性情况 |
| 2.3.6 不同地区HCV抗体阳性率随年龄的变化情况 |
| 2.3.7 不同科室HCV抗体阳性情况 |
| 2.3.8 全国丙肝抗体检测情况推算 |
| 2.3.9 加强医院内丙肝筛查管理建议 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 丙肝病毒感染快速筛查方法的效能评价 |
| 3.1 研究方法 |
| 3.1.1 总体方案设计 |
| 3.1.2 研究对象 |
| 3.1.3 研究步骤 |
| 3.1.4 主要试剂 |
| 3.1.5 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 考核试剂检测 |
| 3.2.2 参比试剂1检测 |
| 3.2.3 血样采集及处理 |
| 3.2.4 血清样本检测 |
| 3.2.5 数据收集 |
| 3.2.6 统计学分析 |
| 3.3 研究结果 |
| 3.3.1 受试者分布 |
| 3.3.2 各中心检测情况 |
| 3.3.3 人口学资料及临床特征 |
| 3.3.4 检测结果描述性统计 |
| 3.3.5 考核试剂与金标准的一致性 |
| 3.3.6 考核试剂与参比试剂1的一致性 |
| 3.3.7 考核试剂与参比试剂2的一致性 |
| 3.3.8 参比试剂1与金标准的一致性 |
| 3.3.9 参比试剂2与金标准的一致性 |
| 3.3.10 自采自测使用方式的适用性 |
| 3.3.11 病毒学阳性检出率 |
| 3.3.12 假阴性结果分析 |
| 3.3.13 低滴度样本分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 结论 |
| 第5章 本实验创新点及意义 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）四川省丙型肝炎病毒的感染现状和基因型分布的特征（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 HCV病毒 |
| 1.2 HCV基因分型以及病毒载量对于HCV治疗的影响 |
| 1.3 HCV的传输模式 |
| 1.4 HCV基因型在世界范围内感染的情况 |
| 1.5 临床上HCV的诊断 |
| 1.6 临床上HCV的治疗 |
| 1.7 小结 |
| 第二章 资料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 实验室检测 |
| 2.2.1 HCV抗体检测 |
| 2.2.2 高精度HCV RNA定量检测方法 |
| 2.2.3 HCV基因分型检测方法 |
| 2.3 数据分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 HCV感染患者基本特征 |
| 3.1.1 2014-2018 年间进行HCV-RNA检测的就诊者的基本特征 |
| 3.1.2 2014-2018年中HCV阳性患者整体的基本特征 |
| 3.2 HCV阳性感染患者基因分型的分布特征 |
| 3.2.1 在2016-2018年期间四川省HCV阳性患者的基因分型情况 |
| 3.2.2 1b基因亚型患者的性别以及年龄分布情况 |
| 3.2.3 小结 |
| 第四章 全文总结与展望 |
| 4.1 结果分析 |
| 4.1.1 高精度HCV-RNA定量检测结果分析 |
| 4.1.2 HCV基因分型检测结果分析 |
| 4.2 讨论研究的局限性以及未来展望 |
| 4.3 结论和建议 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的成果 |
（7）运用双抗原夹心ELISA法和间接ELISA法检测丙型肝炎病毒抗体结果的一致性比较（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 研究内容与方法 |
| 1.研究材料 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 标本要求 |
| 2.内容与方法 |
| 2.1 主要仪器与试验原理 |
| 2.2 试剂组成与保存方法 |
| 3.质量控制 |
| 4.统计学分析 |
| 5.技术路线图 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学位论文 |
| 导师评阅表 |
（8）戊型肝炎病毒分泌型抗原的发现及其临床应用价值（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1. 戊型肝炎概述 |
| 1.1 戊型肝炎病毒的发现 |
| 1.2 戊型肝炎病毒的病毒粒子 |
| 1.3 戊型肝炎的流行病学 |
| 1.4 戊型肝炎病毒的感染进程 |
| 2. 戊型肝炎病毒病毒学研究进展 |
| 2.1 戊型肝炎病毒基因组 |
| 2.2 戊型肝炎病毒的体外培养系统 |
| 2.3 戊型肝炎病毒的感染及复制过程研究 |
| 3. 戊型肝炎病毒衣壳蛋白表位研究 |
| 3.1 戊型肝炎病毒衣壳蛋白结构研究 |
| 3.2 戊型肝炎病毒衣壳蛋白抗原表位研究 |
| 4. 戊型肝炎病毒感染的临床症状 |
| 4.1 无临床症状的戊型肝炎病毒感染 |
| 4.2 戊型肝炎病毒感染导致的肝内症状 |
| 4.3 戊型肝炎病毒感染导致的肝外症状 |
| 5. 戊型肝炎的诊断 |
| 5.1 免疫电镜 |
| 5.2 核酸检测 |
| 5.3 抗体检测 |
| 5.4 细胞免疫检测 |
| 5.5 抗原检测 |
| 6. 本论文研究思路、目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要实验耗材 |
| 1.3 质粒、菌株、细胞和实验动物 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 培养基及实验用溶液配制 |
| 1.6 引物 |
| 2. 方法 |
| 2.1 分子克隆 |
| 2.2 蛋白表达和纯化 |
| 2.3 蛋白性质鉴定 |
| 2.4 抗体的性质鉴定 |
| 2.5 双抗体夹心ELISA方法 |
| 2.6 基于ELISA和FMIA的HEV抗原检测方法 |
| 2.7 巢式PCR及real-time PCR检测技术 |
| 2.8 细胞生物学实验方法 |
| 2.9 戊型肝炎病毒体外生产和纯化方法 |
| 2.10 起始密码子翻译效率分析 |
| 2.11 戊型肝炎病毒细胞模型研究方法 |
| 2.12 恒河猴模型戊型肝炎病毒攻毒实验及指标检测方法 |
| 2.13 血清HEV抗体检测 |
| 2.14 血清的收集 |
| 2.15 计算机软件辅助设计和分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分: HEV抗原检测方法的建立和靶标分析 |
| 1. HEV抗原检测方法的建立 |
| 1.1 抗体配对的筛选 |
| 1.2 HEV-Ag检测方法对HEV衣壳蛋白的检测分析 |
| 1.3 HEV-Ag检测方法对病毒的检测分析 |
| 1.4 临床血清中HEV-Ag与HEV RNA的相关性初步分析 |
| 2. HEV-Ag检测方法的靶标分析及pORF2~S的发现 |
| 2.1 粪便与血清标本中HEV抗原与HEV RNA的密度分析 |
| 2.2 基于HEV细胞培养模型的HEV抗原检测分析 |
| 2.3 细胞培养上清中的pORF2产生机制探索 |
| 2.4 细胞培养上清中pORF2~S与完整病毒的抗原量差异 |
| 2.5 pORF2~S阅读框的翻译效率分析 |
| 3. HEV-Ag检测方法的初步评估 |
| 3.1 HEV-Ag检测方法在HEV攻毒恒河猴标本中的检测分析 |
| 3.2 HEV-Ag检测方法cut-off值的确定及特异性分析 |
| 4. 第一部分小结 |
| 第二部分: HEV抗原诊断的实际应用 |
| 1. HEV抗原诊断在肝炎人群中的应用 |
| 1.1 肝炎病例基础信息 |
| 1.2 两个以上HEV指标为阳性的病例类型分析 |
| 1.3 HEV指标单一阳性类型分析 |
| 1.4 各组人群中ALT水平分布和其他肝炎病毒感染情况分析 |
| 1.5 感染病程中HEV相关指标的动态变化 |
| 1.6 HEV相关指标在首诊血清中的诊断性能分析 |
| 2. HEV抗原在献血者中的应用 |
| 2.1 献血者HEV流行情况分析 |
| 2.2 献血者HEV病原体人群跟踪 |
| 2.3 献血者HEV携带者和戊肝患者的比较 |
| 3. 第二部分小结 |
| 第三部分: HEV抗原诊断的拓展 |
| 1. 基于FMIA的HEV抗原检测方法的建立 |
| 1.1 HEV-Ag FMIA试纸条的建立 |
| 1.2 HEV-Ag FMIA与HEV RNA的相关性分析 |
| 1.3 HEV-Ag FMIA、HEV-Ag ELISA和HEV RNA在临床血清中的比较 |
| 2. 基于抗原检测的HEV分类方法的建立 |
| 2.1 特异性识别基因3型和基因4型HEV的抗体6E9的性质鉴定 |
| 2.2 基于抗原检测的HEV分类方法的建立 |
| 2.3 基于抗原检测的HEV分类方法在HEV攻毒发恒河猴标本上的评价 |
| 2.4 基于抗原检测的HEV分类方法在临床戊肝血清中的应用 |
| 3. 尿液中的HEV抗原检测 |
| 4. 第三部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 1. 新旧HEV抗原检测方法对比及在系列标本上的检测差异 |
| 2. HEV分泌型抗原pORF2~S的发现和功能鉴定 |
| 3. 戊肝血清学和病原学指标变化趋势及诊断策略分析 |
| 4. 戊肝患者体内HEV抗原长期阳性的临床现象分析 |
| 5. 正常携带者的意义与隐患的探讨 |
| 6. HEV肝外感染 |
| 第五章 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在校期间的科研成果 |
（9）日照市无偿献血人群中隐匿性乙肝感染状况的统计分析及研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 研究对象和样本采集与处理 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 样本采集与处理 |
| 2 研究的技术路线 |
| 3 主要试剂及仪器 |
| 3.1 主要试剂 |
| 3.2 主要仪器 |
| 4 常规血液筛查模式 |
| 4.1 血清中HBsAg ELISA实验原理及实验步骤 |
| 4.2 血清中Anti-HCV ELISA实验原理及实验步骤 |
| 4.3 血清中HIV-1-Ag/Ab ELISA实验原理及实验步骤 |
| 4.4 血清中TP抗体ELISA实验原理及实验步骤 |
| 4.5 ELISA血液筛查全自动化流程的建立 |
| 4.6 血清中ALT检测的实验原理及实验步骤 |
| 5 NAT技术对血液中HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA进行筛查 |
| 5.1 实验原理 |
| 5.2 实验方法及步骤 |
| 5.3 质量控制 |
| 6 PCR法定量检测HBV DNA |
| 6.1 实验原理 |
| 6.2 实验方法及步骤 |
| 7 电化学发光法检测乙肝“两对半” |
| 7.1 实验原理 |
| 7.2 实验方法及步骤 |
| 8 血清中TGF-β1 定量ELISA检测 |
| 8.1 实验原理 |
| 8.2 实验方法及步骤 |
| 9 统计学方法 |
| 结果 |
| 1 常规血液筛查结果统计分析 |
| 1.1 血清中HBsAg、抗-HCV、HIV-1-Ag/Ab、TP、ALT检测结果统计分析 |
| 1.2 HBsAg阳性样本的统计分析 |
| 2 NAT检测技术对血液筛查结果分析 |
| 2.1 核酸检测HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA阳性率统计分析 |
| 2.2 两个厂家核酸检测系统比较分析 |
| 3 PCR定量检测HBV DNA以及血清学检测“两对半”结果分析 |
| 4 血清中TGF-β1 定量ELISA检测结果分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（10）猪病毒性疫病高通量检测方法的建立和应用及NADC30-like PRRSV与ASFV的监测研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 高通量检测技术 |
| 1.2 毛细管电泳研究进展 |
| 1.2.1 毛细管电泳发展历史 |
| 1.2.2 特点 |
| 1.2.3 毛细管电泳的应用 |
| 1.3 液相芯片研究进展 |
| 1.3.1 液相芯片简介 |
| 1.3.2 液相芯片原理 |
| 1.3.3 液相芯片优势 |
| 1.3.4 应用及展望 |
| 1.4 NADC30-like PRRSV研究进展 |
| 1.4.1 基因序列分析 |
| 1.4.2 流行现状 |
| 1.4.3 致病性及临床表现 |
| 1.4.4 防控措施 |
| 1.5 非洲猪瘟研究进展 |
| 1.5.1 病原学 |
| 1.5.2 流行病学 |
| 1.5.3 临床症状和病理变化 |
| 1.5.4 实验室诊断 |
| 1.5.5 防控措施 |
| 1.6 数字PCR研究进展 |
| 1.6.1 发展历史 |
| 1.6.2 ddPCR原理 |
| 1.6.3 ddPCR应用 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 第二章 猪病毒性疫病毛细管电泳全自动核酸检测方法的建立及应用研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 毒株 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 引物设计 |
| 2.1.6 RNA的提取 |
| 2.1.7 RNA的反转录 |
| 2.1.8 DNA的提取 |
| 2.1.9 重组质粒的制备 |
| 2.1.10 毛细管电泳的预备 |
| 2.1.11 PCR引物验证 |
| 2.1.12 多重PCR反应条件的优化 |
| 2.1.13 毛细管电泳全自动核酸分析 |
| 2.1.14 特异性试验 |
| 2.1.15 灵敏度试验 |
| 2.1.16 重复性试验 |
| 2.1.17 临床样品检测 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 引物验证 |
| 2.2.2 多重PCR反应条件的确定 |
| 2.2.3 毛细管电泳分析结果 |
| 2.2.4 灵敏性试验结果 |
| 2.2.5 特异性试验结果 |
| 2.2.6 重复性试验结果 |
| 2.2.7 临床样品检测结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 靶序列富集多重PCR和液相芯片技术在猪病毒性疫病核酸检测中的应用研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 样品来源 |
| 3.1.2 毒株 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.1.5 引物和探针设计 |
| 3.1.6 核酸提取及重组质粒制备 |
| 3.1.7 Bio-Plex200TM的校正和验证 |
| 3.1.8 微球与探针偶联 |
| 3.1.9 偶联探针质控验证 |
| 3.1.10 TEM-PCR体系的建立及优化 |
| 3.1.11 杂交反应的优化 |
| 3.1.12 杂交结果的判定标准 |
| 3.1.13 特异性试验 |
| 3.1.14 灵敏度试验 |
| 3.1.15 重复性试验 |
| 3.1.16 临床样品检测 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 引物验证 |
| 3.2.2 微球偶联探针验证 |
| 3.2.3 微球计数 |
| 3.2.4 反应体系的确定 |
| 3.2.5 杂交温度的优化 |
| 3.2.6 杂交时间优化 |
| 3.2.7 特异性试验 |
| 3.2.8 灵敏性试验 |
| 3.2.9 重复性试验 |
| 3.2.10 临床样品检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 高通量核酸检测方法对不同养殖场猪病毒性疫病分子流行病学调查及NADC30-like监测研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 毒株 |
| 4.1.2 临床样品 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 核酸提取和制备 |
| 4.1.6 病原检测方法 |
| 4.1.7 猪场疾病有效防控能力分析 |
| 4.1.8 NADC30-like PRRSV检测方法 |
| 4.1.9 NADC30-like PRRSV病毒监测 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 不同猪场病原检测结果 |
| 4.2.2 猪场疾病有效防控能力分析 |
| 4.2.3 NADC30-like检测方法验证 |
| 4.2.4 NADC30-like PRRSV临床检测结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 非洲猪瘟病毒检测方法的建立以及病毒的实时监控 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 样品信息 |
| 5.1.2 毒株 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.1.5 引物设计 |
| 5.1.6 ASFV K205R原核表达系统构建 |
| 5.1.7 间接ELISA检测方法的建立 |
| 5.1.8 非洲猪瘟病毒微滴数字PCR方法的建立 |
| 5.1.9 临床样品检测 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 ASFV K205R基因原核表达 |
| 5.2.2 ASFV K205R ELISA建立 |
| 5.2.3 ASFV ddPCR核酸检测方法的建立 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论与创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、聚合酶链反应杂交ELISA对肝炎患者血清HCV RNA的测定和分析（论文参考文献）
- [1]重组腺相关病毒载体介导的环状RNA circFBXW4在肝纤维化中的功能及机制研究[D]. 陈鑫. 安徽医科大学, 2021(01)
- [2]长链非编码RNA在肝细胞肝癌临床预后中的作用及机制研究[D]. 吴昊. 山东大学, 2020(04)
- [3]针对丙型肝炎病毒E2包膜糖蛋白后层结构域开发相应中和抗体[D]. 王珵珵. 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所), 2020(08)
- [4]Id1通过E2F4实现对HBV转录和复制的抑制作用及其机制研究[D]. 魏杰. 重庆医科大学, 2020(01)
- [5]住院病人丙型肝炎病毒感染的筛查及快速筛查方法的评价[D]. 刘丽莉. 吉林大学, 2020(08)
- [6]四川省丙型肝炎病毒的感染现状和基因型分布的特征[D]. 张超. 电子科技大学, 2020(01)
- [7]运用双抗原夹心ELISA法和间接ELISA法检测丙型肝炎病毒抗体结果的一致性比较[D]. 秦亚娟. 新疆医科大学, 2020(07)
- [8]戊型肝炎病毒分泌型抗原的发现及其临床应用价值[D]. 温桂平. 厦门大学, 2019(08)
- [9]日照市无偿献血人群中隐匿性乙肝感染状况的统计分析及研究[D]. 袁志凤. 青岛大学, 2019(03)
- [10]猪病毒性疫病高通量检测方法的建立和应用及NADC30-like PRRSV与ASFV的监测研究[D]. 邬旭龙. 四川农业大学, 2019(07)