一、艾灸血清对肿瘤浸润淋巴细胞增殖和表型的影响（论文文献综述）
亓润智[1]（2021）在《基于肿瘤细胞外泌体调控TAM细胞极化探讨双参颗粒抑制肺癌的作用机制》文中研究指明研究背景肺癌在我国及世界范围内的发病率、死亡率均居前列。尽管越来越多的肺癌被早期诊断和治疗,新的免疫治疗药物不断问世,放射治疗技术得到不断提升,肺癌患者的总生存时间仍没有得到明显延长,生活质量没有得到明显改善。ⅠA期肺癌患者的5年生存率为83%,ⅢA期患者仅为36%,晚期肺癌患者5年生存率仅3.5%。肺癌的整体中位生存期仍未突破1年。如何减少早期肺癌患者术后复发转移,延长晚期肺癌患者生存期,抑制肺癌进展仍然是目前亟待解决的医学难题。随着大量临床研究证实中医药防治肺癌的有效性,以及基础实验研究对中医药防治肺癌的机制探讨不断深入,中医药在肺癌防治中的地位也逐渐上升。越来越多的研究发现中医药防治肺癌的机制可能与调控肿瘤微环境密切相关。肺癌属中医学“肺积”范畴。《医宗必读》中提到:“积之成也,正气不足,而后邪气踞之”。邪之所凑,其气必虚,正气亏虚则气血阴阳失和,脏腑机能紊乱,气机升降失调。随着中医肿瘤理论的发展,“正虚”是肺癌重要的发病基础已逐渐成为中医肿瘤学术界的共识。肺癌的病机多为虚实夹杂,虚证常见阴虚或气阴两虚,实证多见气滞、痰凝及血瘀,病位在肺,与脾、肾密切相关。气阴两虚、瘀血内阻是肺癌形成与进展的重要因素。肺为娇脏,易受外邪,伤及肺气与肺阴,肺主气功能受损,一身之气不足则邪毒内盛,气不行血、癌毒阻络,则见瘀血内停,瘀毒互结,逐渐形成癌肿。益气养阴活血法是防治肺癌的重要治法之一。双参颗粒由三七、西洋参、冬虫夏草组成,三七活血化瘀兼能补血;西洋参健脾益气而不燥,并能养阴生津;冬虫夏草补益肺肾。三药共奏益气健脾养阴、补益肺肾、金水相生之效,扶正以治本,活血化瘀以治标。临床研究也证明,益气养阴活血法是中医药防治肺癌的重要治法,在临床应用广泛并取得良好疗效。但由于中医临床证候的复杂性,以及中医辨证论治处方的多样性,使中医“益气养阴活血法”防治肺癌的理论未能在细胞分子层面得到很好的验证。我们前期预实验发现双参颗粒可以抑制荷Lewis肺癌小鼠移植瘤的生长,减少自发肺癌小鼠模型肺部肿瘤形成。同时,对双参颗粒干预后的自发肺癌小鼠与未经过双参颗粒干预的小鼠肺组织进行全转录组测序分析。结果提示在经过双参颗粒干预后,巨噬细胞迁移抑制因子（Macrophage migration inhibitory factor,MIF）,巨噬细胞标志蛋白（MannosereceptorCtype 1,MRC1/CD206）,含锌指转录因子（Kruppel-like factors,KLF）家族如 KLF4、KLF2,基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases,MMPs）家族,以及非编码 RNA（Non-coding RNA）如microRNA-34a（miR-34a）、microRNA-21（miR-21）的表达以及外泌体相关基因表达存在差异。这些差异基因都与肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages,TAMs）表型、功能调控以及外泌体功能密切相关,基于TAMs极化在调控肿瘤微环境影响肿瘤生长中的重要作用,我们从TAMs与肿瘤细胞外泌体入手,探讨双参颗粒抑制荷Lewis肺癌的作用是否与肿瘤细胞外泌体调控TAMs表型和功能相关。研究目的本研究拟通过体内实验与体外实验,借助分子生物学技术,探明双参颗粒抑制肿瘤生长是否与肺癌细胞外泌体调控TAMs表型与功能相关,以及初步探讨双参颗粒通过外泌体影响TAMs极化的机制是否与MIF-miR-34a-KLF4通路相关,为中医药“益气养阴活血法”防治肺癌提供客观依据。研究方法1.构建荷Lewis肺癌小鼠模型,以高、中、低三个剂量的双参颗粒对荷Lewis肺癌小鼠进行干预,观察各组小鼠移植瘤的体积、移植瘤质量,验证以益气养阴活血为治法的双参颗粒对小鼠肺癌的抑制作用。2.通过流式细胞术、免疫荧光染色法,分别对小鼠脾脏、移植瘤组织的M1型与M2型TAMs进行检测,观察双参颗粒对TAMs表型的影响。3.通过Lewis与M1型巨噬细胞混合皮下接瘤的方法,构建M1型TAMs过表达的小鼠肺癌移植瘤模型。观察移植瘤体积与质量,并通过流式细胞术检测小鼠M1型TAMs比例、M2型TAMs比例;免疫组织化学染色检测M1型TAMs标志蛋白一氧化氮合酶（inducible Nitric Oxide Synthase,iNOS）表达;Western Blot法检测肿瘤组织中精氨酸酶1（Arginase-1,ARG1）、iNOS的表达,探讨双参颗粒抑制Lewis肺癌的作用与TAMs极化的相关性。4.通过流式细胞术、Western Blot法检测小鼠体内调节性T细胞（Regulatory T cells,Tregs）比例、记忆T细胞比例,肿瘤组织中转化生长因子-β（Transforming growth factor-β,TGF-β）、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）、MMP-9、MIF的表达,探讨双参颗粒调控肿瘤微环境,调节TAMs功能与调控TAMs极化的相关性。5.构建MIF+/+Lewis稳定转染细胞株、shMIF Lewis稳定转染细胞株,通过双参颗粒含药血清的干预,观察双参颗粒对小鼠肺癌细胞MIF表达的影响。6.提取各组肺癌细胞外泌体,qPCR法检测外泌体中miR-34a表达,观察双参颗粒对Lewis细胞来源外泌体中MIF下游靶基因miR-34a的影响,探讨双参颗粒是否通过影响MIF调节外泌体miR-34a的表达。7.收集双参颗粒干预后的MIF+/+Lewis细胞、MIF+/+Lewis细胞、Lewis细胞、shMIF Lewis细胞来源外泌体;并将各组外泌体对巨噬细胞进行干预,观察各组外泌体对巨噬细胞表型的影响,探讨双参颗粒能否通过肺癌细胞来源外泌体影响巨噬细胞极化,以及这一作用与MIF的关系。8.观察各组肺癌细胞外泌体干预后的巨噬细胞中KLF4基因的表达;探讨经双参颗粒干预后的肺癌细胞外泌体影响巨噬细胞极化与功能的作用是否与MIF-miR-34a-KLF4 通路相关。研究结果1.经双参颗粒干预后,荷Lewis肺癌小鼠移植瘤体积与质量减小,随着双参颗粒剂量的增加,其抑制肿瘤体积与质量的作用逐渐增强,高剂量双参颗粒对肿瘤体积与质量的抑制作用最强。2.高、中、低三个剂量的双参颗粒均能减少小鼠脾脏M2型TAMs 比例,增加M1型TAMs比例,但双参颗粒抑制M2型TAMs比例的作用未表现出与双参颗粒剂量有明确负相关。小鼠脾脏M1型TAMs 比例与双参颗粒剂量呈正相关,随双参颗粒剂量增大M1型TAMs比例逐渐增加。移植瘤组织中CD86的表达与双参颗粒的剂量呈正相关,CD206的表达与双参颗粒的剂量呈负相关。3.与经典的荷Lewis肺癌小鼠模型比较,荷Lewis+M1混合移植瘤小鼠模型的肿瘤体积减小,脾脏M1型TAMs比例明显升高。双参颗粒对Lewis+M1混合移植瘤小鼠模型进行干预后,M1型TAMs 比例增加,小鼠肿瘤体积进一步减小,提示双参颗粒抑制Lewis肺癌的作用可能与增加M1型TAMs比例相关。4.双参颗粒可以减少荷Lewis+M1混合移植瘤小鼠肿瘤组织中肿瘤微环境因子 ARG1、TGF-β、MMP-9、VEGF、MIF 的表达,增加 iNOS 的表达。5.双参颗粒能够增加CD8+中枢性记忆T细胞比例,并且与M1型TAMs 比例呈正比;降低CD8+效应性记忆T细胞比例,与M1型TAMs比例呈反比。同时,双参颗粒可以增加CD4+CD25+T细胞比例,减少CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例。6.通过慢病毒稳定转染细胞技术成功构建了 MIF+/+Lewis、shMIFLewis稳定转染肺癌细胞株,并分别在基因与蛋白水平进行了验证。7.MIF+/+Lewis细胞外泌体中miR-34a表达减少。双参颗粒含药血清在体外可以抑制MIF+/+Lewis细胞MIF蛋白与RNA的表达,同时增加MIF+/+Lewis细胞外泌体中miR-34a的表达。8.成功提取MIF+/+Lewis、shMIFLewis、Lewis细胞来源外泌体,并对巨噬细胞进行干预,成功检测到巨噬细胞吞噬外泌体过程。MIF+/+Lewis细胞来源外泌体在体外可以增加M2型巨噬细胞比例,降低M1型巨噬细胞比例;而经双参颗粒含药血清干预后的MIF+/+Lewis细胞,其外泌体能够逆转这一作用,增加M1型巨噬细胞比例。9.MIF+/+Lewis细胞外泌体在体外可以增加巨噬细胞中KLF4基因的表达;经双参颗粒含药血清干预后的MIF+/+Lewis细胞外泌体能够减少巨噬细胞KLF4基因的表达。研究结论1.双参颗粒可以抑制小鼠肺癌,其作用机制可能与调控小鼠TAMs向M1型极化相关;肺癌细胞中的MIF可能是双参颗粒的作用靶点之一。2.双参颗粒可以通过肺癌细胞来源的外泌体调控TAMs极化,其机制可能与MIF-miR-34a-KLF4 通路相关。3.中医益气养阴活血法防治肺癌的分子生物学机制可能与调节肿瘤细胞外泌体,调控TAMs极化与功能,重塑肿瘤微环境相关。
姜涛[2]（2021）在《丹参联合三氧化二砷瘀毒同治调控糖酵解逆转巨噬细胞极化的抗肝癌机制研究》文中研究指明目的 对肿瘤“瘀毒”病因病机理论的源流,以及基于“瘀毒”理论所衍生的治则治法和组方用药进行研究。论证“瘀毒”理论指导下丹参联合三氧化二砷治疗肝癌的有效性,并研究其作用机制。以方证因,以方证机,验证“瘀毒”病因病机理论的科学性,并为其提供一定的实验支撑。方法 通过理论研究与实验研究相结合的方式,以理论研究指导实验研究,以实验研究反证并支撑理论研究。1.理论研究:通过查阅古今文献,总结团队相关研究成果,分析“瘀”和“毒”作为肿瘤病因病机的优势和局限性,对“瘀毒”理论产生的原因进行剖析,阐述“瘀毒”理论的含义和价值。基于肿瘤“瘀毒”理论,研究“祛瘀”和“祛毒”的代表性治则治法,分析其适用情况,探讨不同阶段的瘀毒同治治疗原则和治疗方案。基于“瘀毒”理论,枚举代表性的瘀毒同治药物,论证丹参联合三氧化二砷的理论合理性和科学性。2.实验研究:基于“瘀毒”理论,筛选合适的丹参提取物,并与三氧化二砷联用,获得肝癌抑制效果较佳,正常细胞杀伤较小的联用组合,并分析其最佳药物配比关系。在此基础上,建立Hep1-6原位移植瘤和H22皮下移植瘤模型,验证联合用药的体内外抗肝癌效果。以巨噬细胞极化和糖酵解作为机制研究出发点,通过流式细胞术、免疫荧光染色、病理学染色、PCR技术、Western Blot等技术检测巨噬细胞分型情况,并通过原代巨噬细胞体外诱导模型验证对巨噬细胞极化的影响。通过转录组测序技术研究联合用药对巨噬细胞糖酵解网络的调控作用,选取与糖酵解密切相关的HIF-α/NF-κB、AMPK信号通路开展研究,阐明其起效的分子机制。结果1.“瘀毒”理论的产生是“瘀”“毒”病因病机理论的延伸和发展,其出现是中医内在发展规律所决定的。其中,中医对肿瘤疾病认识的深入,中医理论自身的发展,现代医学理论的充分融入均是其形成的重要促进因素。2.以活血化瘀、破血逐瘀、清热解毒、以毒攻毒为代表的治法及药物配伍是瘀毒同治的核心治疗方案。依据患者病情、病性、病位的不同,可以选择不同的同治方案,其中活血化瘀联合以毒攻毒是各阶段均合适的瘀毒同治方案。3.丹参联合三氧化二砷的药物组合是基于活血化瘀、以毒攻毒治法下,合理的瘀毒同治药物配伍形式,该配伍形式兼具了肿瘤杀伤力强、不易伤正的特点,并规避了促肿瘤转移的风险。4.丹参中的隐丹参酮是联合三氧化二砷治疗肝癌的较佳瘀毒同治组分,二者配伍可在体内外有效抑制肝癌进展,最佳配比为10:1左右。5.隐丹参酮联合三氧化二砷治疗肝癌的机制与促进巨噬细胞的激活,提升其吞噬能力,促使其向M1型巨噬细胞活化,抑制其向M2型巨噬细胞活化有关。6.隐丹参酮联合三氧化二砷通过激活AMPK信号通路、抑制HIF-α/NF-κB信号通路实现对巨噬细胞和肿瘤细胞的糖代谢调控。二者联合促进巨噬细胞的糖酵解并抑制肿瘤细胞的糖酵解,促进葡萄糖的重分配,以达到逆转巨噬细胞极化,抑制肝癌细胞增殖的目的。结论“瘀毒互结”是肿瘤的核心病因病机,活血化瘀、以毒攻毒是瘀毒同治的科学治法,丹参联合三氧化二砷是有效的配伍组合。中医“瘀毒”理论可以有效的应用于肝癌的治疗,值得临床进一步深入研究。
张知云[3]（2021）在《电针足三里激活迷走神经调控乳腺癌小鼠炎性水平和抗肿瘤免疫功能的研究》文中研究指明研究背景炎性水平和免疫功能与肿瘤的发生发展密切相关,而作为促进肿瘤进展的重要危险因素,炎性因子能通过多种机制抑制荷瘤机体的抗肿瘤免疫应答,其中一种方式是诱导髓系免疫抑制细胞（myeloid-derived suppressive cells,MDSC）的大量扩张和激活,不同程度地破坏CD8+T细胞和自然杀伤（naturalkiller,NK）细胞的增殖、迁移和活化。减轻荷瘤机体的炎性水平以解除免疫抑制状态进而增强抗肿瘤免疫功能已成为肿瘤治疗的重要策略。针灸对多种免疫效应分子和细胞具有良好的调控作用,能有效增强机体的免疫功能。此外,针灸干预能减轻过度的炎性反应,在多项炎性疾病的临床研究中均显示出良好疗效。有关针灸抗炎效应机制的研究表明,激活迷走传出神经抑制过度产生的炎性因子是电针足三里发挥抗炎作用的重要途径。研究目的及意义探索电针足三里能否通过迷走传出神经抑制荷瘤小鼠的炎性水平,减轻免疫抑制状态,增强抗肿瘤免疫功能,减缓肿瘤的进展,为扩大针灸在肿瘤的临床应用提供一定的科学依据。研究方法第一部分:将雌性BALB/c小鼠随机分为正常对照组、模型组和电针组,在模型和电针组小鼠右侧第二乳垫下注射4T1-luc2小鼠乳腺癌细胞制备原位乳腺癌模型,对电针组小鼠的双侧足三里行电针干预（0.1 mA,2/15 Hz,30 min）,隔日一次。使用游标卡尺测量并计算肿瘤体积;采用活体成像技术在体检测瘤体的位置、面积和荧光强度;电针干预结束后取出瘤体和脾脏称重比较,以整体观察小鼠的肿瘤生长情况。第二部分:采用MSD多因子和Western Blot技术检测实验小鼠血清和肿瘤局部组织内炎性细胞因子肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor,TNF）-α、白细胞介素（interleukin,IL）-1β和IL-10的含量,同时采用HE染色观察荷瘤小鼠肿瘤局部组织内的炎性浸润情况,以观察电针对乳腺癌模型小鼠的抗炎作用。第三部分:采用流式细胞术分析实验小鼠外周血、脾脏和肿瘤局部组织内的抗肿瘤免疫细胞CD8+T细胞和NK细胞的比例,同时采用Western Blot技术分析肿瘤局部组织内穿孔素和颗粒酶B的蛋白表达水平,以评价荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫功能。第四部分:采用流式细胞术分析实验小鼠外周血、脾脏和肿瘤局部组织内免疫抑制细胞MDSC的比例,采用Western Blot技术分析肿瘤局部组织内环氧合酶-2（Cyclooxygenase 2,COX-2）和精氨酸酶-1（Arginase-1,Arg-1）的蛋白表达水平;此外,分离正常小鼠的脾T细胞与模型组和电针组荷瘤小鼠的脾MDSC进行体外共培养,采用CellTrace Far Red检测T细胞的增殖水平,流式细胞术分析CD25分子的表达量以显示T细胞的活化水平,以分析荷瘤小鼠体内的免疫抑制状态。第五部分:共包括三个部分。实验一验证了电针足三里对荷瘤小鼠迷走传出神经的作用:首先采用荧光免疫组织化学技术对荷瘤小鼠脑干迷走神经背核（dorsal motor nucleus of vagus,DMV）内胆碱乙酰转移酶（Choline acetyltransferase,ChAT）阳性神经元的c-Fos进行标记,观察迷走传出神经元的激活水平;其次,采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测小鼠血浆和肿瘤局部组织内乙酰胆碱（acetylcholine,ACh）的水平,以反映迷走传出神经被激活后的效应。实验二观察了激活α7nAchR对乳腺癌模型小鼠免疫功能与炎性反应的作用:将正常和乳腺癌模型小鼠随机分为正常对照组,二甲基亚砜（dimethylsulfoxide,DMSO）组和 PNU-282987 组,对 DMSO 组小鼠腹腔注射DMSO,PNU-282987组小鼠腹腔注射选择性α7亚型烟碱受体（α7 subunit ofthe nicotinic acetylcholine receptors,α7nAchR）激动剂 PNU-282987（0.1 mg/kg）,隔日注射一次,游标卡尺测量并计算肿瘤体积,并进行活体成像检测,干预结束后取出脾脏和瘤体称重;MSD多因子技术检测外周血和肿瘤局部组织内炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-10的含量;流式细胞术分析外周血和脾脏内的CD8+T细胞、NK细胞和MDSC的比例。实验三采用了膈下迷走神经切断术进行了反向验证:对小鼠行膈下迷走神经切断术或假手术后接种4T1-luc2细胞制备原位乳腺癌模型,再随机分为手术-模型组（VNX）、手术-电针组（VNX-EA）、假手术-模型组（sVNX）和假手术-电针组（sVNX-EA）,对VNX-EA和sVNX-EA组小鼠双侧足三里行电针干预,干预结束后对小鼠进行活体成像检测并取出瘤体和脾脏称重,采用流式细胞术分析各组小鼠外周血和脾脏内的CD8+T细胞、NK细胞和MDSC的比例。研究结果第一部分:电针足三里可有效减缓乳腺癌模型小鼠肿瘤的进展。接种4T1-luc2细胞的第18天,电针组小鼠的肿瘤体积开始低于模型组（P<0.05）,且持续到接种后第22天（P<0.05）;活体成像结果显示,与模型组小鼠相比,电针组小鼠瘤体的成像面积减小,荧光强度降低（P<0.05）,重量明显减轻（P<0.01）。此外,荷瘤小鼠出现明显脾肿大,而电针组小鼠脾肿大程度较模型组减轻（P<0.01）。第二部分:电针足三里减轻了乳腺癌模型小鼠系统性和肿瘤局部炎性水平。荷瘤小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-10的含量均显着上升（P<0.001）,电针干预后,小鼠血清（P<0.01）和肿瘤局部组织（P<0.05）中促炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的水平降低,抗炎性细胞因子IL-10无明显变化（P>0.05）。HE染色结果显示,电针组小鼠肿瘤局部的炎性浸润情况较模型组减轻。第三部分:电针足三里对乳腺癌模型小鼠的抗肿瘤免疫细胞具有明显的促进作用。荷瘤小鼠外周血和脾脏内CD8+T细胞和NK细胞的比例均显着降低（P<0.001）,电针干预后,外周血、脾脏和肿瘤局部组织内CD8+T细胞（外周血,P<0.01;脾脏,P<0.05;肿瘤局部组织,P>0.05）和NK细胞（P<0.05）的比例均升高。此外,电针组小鼠肿瘤局部组织内穿孔素（P<0.05）和颗粒酶B（P<0.01）的蛋白表达水平较模型组明显增高。第四部分:电针足三里能有效抑制乳腺癌模型小鼠的MDSC。荷瘤小鼠外周血、脾脏和肿瘤局部组织内出现大量MDSC（P<0.001）,电针干预后,小鼠外周血（P<0.05）、脾脏（P<0.001）和肿瘤局部组织内（P<0.05）MDSC的比例均明显降低,MDSC的扩张程度减轻。此外,电针组小鼠肿瘤局部组织中COX-2（P<0.05）和Arg-1（P<0.05）的蛋白表达水平明显低于模型组。体外共培养结果显示,相比较与模型组小鼠MDSC共培养的T细胞,与电针组小鼠MDSC共培养的T细胞增殖和活化的程度升高（P<0.05）。第五部分:迷走传出神经参与了电针足三里对乳腺癌模型小鼠炎性水平与免疫功能的调控作用。实验一中,荷瘤小鼠脑干DMV区ChAT+神经元的c-Fos表达量在电针干预后显着增多,血浆和肿瘤局部组织内ACh的水平也明显升高。实验二中,从肿瘤生长情况来看,相比于DMSO组,PNU-282987组小鼠肿瘤生长速度减慢（P<0.05）,瘤体的成像面积和荧光强度降低（P<0.05）;多因子检测结果显示,相比于DMSO组,PNU-282987组小鼠血清TNF-α和IL-1β的含量明显降低（P<0.05）,IL-10无明显变化（P>0.05）;在肿瘤局部组织内,PNU-282987 组小鼠 TNF-α 和 IL-1β 的含量无明显变化（P>0.05）,IL-10 的含量明显升高（P<0.05）;流式细胞术结果显示,相比于DMSO组,PNU-282987组小鼠脾脏内的CD8+T细胞比例回升（P<0.05）,NK细胞比例无明显变化（P>0.05）,同时,外周血和脾脏内MDSC的比例降低（P<0.05）。实验三中,对实验小鼠行膈下迷走神经切断术或假手术后,相比于sVNX组,sVNX-EA组小鼠的瘤体成像面积缩小,荧光强度降低（P<0.05）,瘤体（P<0.05）和脾脏（P<0.01）的尺寸减小,重量减轻;外周血和脾脏内CD8+T细胞和NK细胞的比例升高,MDSC的比例下降。而相比于VNX组,VNX-EA组小鼠瘤体的成像面积、荧光强度、瘤体和脾脏的尺寸及重量、外周血和脾脏内的CD8+T细胞、NK细胞以及MDSC的比例均无明显改变。研究结论电针足三里可能通过激活迷走传出神经,减轻荷瘤小鼠系统性和肿瘤局部的炎性水平,促进CD8+T细胞和NK细胞的比例和细胞杀伤功能,同时降低MDSC的比例和免疫抑制水平,增强荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫功能,减缓肿瘤的生长。
原凌燕[4]（2021）在《基于转录组数据挖掘分析免疫标志物与恶性黑色素瘤转移机制的研究》文中指出背景:恶性黑色素瘤（Malignant Melanoma,MM）是极具侵袭力的恶性肿瘤之一,具有发病隐匿,易转移,治疗反应差的特点,死亡病例占皮肤肿瘤总死亡病例的80%。多数患者确诊之前就已经发生远处转移,由于晚期有效的治疗方法和治疗药物有限,伴发转移患者总生存期仅为6-9个月,3年生存率不足15%。目前,即使包括最新获批用于转移性黑色素瘤的分子靶向治疗药物KRAS抑制剂和抗细胞毒性T淋巴细胞抗原（CTLA）-4抗体Ipilimumab在内的免疫治疗的受益群体也相当有限,而且几乎无法预测不同个体伴随治疗的严重副作用。因此,鉴定筛选与恶性黑色素瘤的预后高特异、高选择性相关的标志物,筛选出新治疗方法的获益群体,并据此预测预测筛选开发针对性的治疗方法,对改进MM的治疗至关重要,这也很可能有助于发现未来针对性研发MM新药的潜在靶点。目的:分析和筛选MM原发病例样本和转移病例样本中的差异表达基因,构建预后风险模型,并探索预后风险模型基因对肿瘤微环境的影响,分析基因标志物与MM恶性程度和免疫耐受复杂特性的关系,获取基因标志物影响黑色素瘤恶性表型相关的功能证据,为改善MM转移患者的临床治疗决策和相关新药研发提供参考依据。方法:（1）筛选基因标志物:1)以生物信息学方法,获取和清洗TCGA数据库的MM病例的基因组表达谱、生存数据,因为数据库中缺乏恶性黑色素瘤原发病例和转移病例的配对样本,所以根据数据库中恶性黑色素瘤病例的临床特征、治疗干预措施等,我们严格制定纳入和排除标准,保证原发病例样本和转移病例样本的一般资料具有可比性后,进行两组样本的差异表达基因分析;2)使用Imm Port（The Immunology Database and Analysis Portal）数据库的免疫相关基因数据集,取交集匹配出免疫相关基因标志物。3)为了保证预后时间的准确性,我们使用观察到的生存间隔时间（observed survival interval,OBS,即从TCGA采样到患者死亡或最后一次随访的时间间隔）代替总生存时间（overall survival,OS）;为了排除病例临床表型和治疗干预措施等因素的影响,我们纳入了年龄、性别、AJCC分期、Clark评分、Breslow厚度值进行单变量和多变量逐步Cox风险比例回归分析以构建预后基因标志物的预测模型,并通过R软件的“survminer”软件包构建,根据ROC曲线下面积验证模型的有效性。4)通过CIBERSORTx反卷积方法重构MM样本的免疫浸润淋巴细胞的相对含量丰度,“Spearman”相关性分析确定预后模型基因与免疫浸润淋巴细胞的相关性;5)本研究还收集MM单细胞测序数据,通过单细胞组学数据对转移预后基因标志物与肿瘤微环境的浸润淋巴细胞亚组进行相关性分析并比较计算结果,进一步对反卷积计算的结果加以验证。（2）验证基因标志物:1)利用人类蛋白质图谱（The human protein atlas,HPA）数据库的人类肿瘤样本免疫组学数据验证基因标志物,包括目标蛋白在细胞内的定位、肿瘤组织中的表达水平及免疫组化的特征等;针对缺乏免疫组化数据的目标靶基因,使用TCGA泛癌数据验证该基因对多种肿瘤的预后作用;2)利用分子生物学方法,通过Cas9技术基于向导RNA（small guide RNA,sg RNA）敲除CXCR4,构建敲除目标基因的恶性黑色素瘤细胞系sg-A375细胞,通过划痕实验、Transwell实验、CCK-8实验获取CXCR4影响黑色素瘤细胞恶性生物学行为的功能证据,以实验研究验证CXCR4基因对A375细胞侵袭和转移的促进作用。结果:（1）通过一系列分析,构建了一个可以预测MM转移患者预后的由6个免疫相关基因（immune-related genes,IRGs）-SLPI,S100A7,LYZ,CCL19,CXCR4和CD79A-组成的基因标志物模型,该模型能够在训练集中区分转移MM患者的预后风险,（TCGA,n=226,log-rank test,P<0.001）;且6-IRGs是MM独立的预后危险因素,不受性别、年龄和病理分期等临床特征的影响（HR=20.84,95%CI:5.00-86.93,P<0.001）;在GEO独立数据集中的验证结果显示该模型对转移患者的预后也能做出有效预测（GSE19234,n=106,log-rank test P<0.001,GES53118,n=79,log-rank test,P<0.001）,并通过ROC曲线验证模型的有效性;通过CIBERSORTx重构免疫浸润细胞的含量丰度,6个IRGs与免疫浸润细胞及免疫检查点基因（immune-checkpoint genes,ICGs）均具有一定的相关性。（2）通过GEO（GSE72056）单细胞测序数据集,运用单细胞分析软件及方法分析了MM转移病例样本中的细胞特征和聚类分型。结果显示,样本细胞注释后分为18类,与免疫微环境有关的肿瘤细胞亚群包括B细胞、DC细胞、成纤维细胞、粒细胞集落刺激因子、CD34造血干细胞、神经上皮细胞、神经元细胞、嗜中性粒细胞、NK细胞、前体CD34B细胞、晚期CD34B细胞、早幼粒细胞、T细胞和组织干细胞。与原发病例样本的肿瘤微环境比较,上述细胞（除NK细胞和T细胞）在淋巴结转移病例样本的含量丰度有显着差异（P<0.001）;单细胞中检测到的3个基因标志物（CXCR4,LYZ和CD79A）与上述差异细胞具有显着的相关性（P<0.001）。其中,CXCR4和多种免疫浸润细胞具有较高的相关性,因此CXCR4作为后期的实验验证对象,进行生物实验验证其功能。（3）通过HPA数据库中102例MM样本的免疫组化数据验证分析了筛选出的5个IRGs（SLPI,S100A7,LYZ,CCL19和CD79A）的蛋白组化结果显示在恶性黑色素瘤中均可以看到5个基因的蛋白免疫组化的染色;CXCR4和免疫浸润细胞呈高度相关,但是CXCR4在HPA数据库缺少蛋白组化数据,因此,为深入探讨CXCR4在肿瘤中的功能,基于TCGA泛癌的数据,分析CXCR4出恶性黑色素瘤之外的多种肿瘤的预后风险比（hazard radio,HR）,将CXCR4对不同肿瘤患者预后的HR进行Meta分析。结果显示,CXCR4对胃癌、骨肉瘤、卵巢癌、肺腺癌、肾透明细胞癌、头颈部癌、食管腺癌和宫颈癌的OS有预测作用（P<0.001）,其中,在胃癌和肾透明细胞癌的预后是保护性因素（HR<1）,在其余肿瘤的预后为危险性因素（HR>1）。CXCR4对于多种肿瘤患者的无复发生存时间（Relapse-Free Survival,RFS）预后HR的Meta分析结果显示,CXCR4的高表达对胃癌、卵巢癌、肺腺癌、肾透明细胞癌和膀胱癌具有预后预测作用（P<0.001）,在胃癌、肺腺癌和肾透明细胞癌患者的RFS是保护性因素（HR>1）,而在卵巢癌还和膀胱癌中是高风险因素（HR>1）。（4）通过生物实验验证CXCR4与MM的增殖、转移功能关联:使用Cas9技术,利用sg-RNA转染敲除CXCR4后构建MM的CXCR4基因敲除细胞系A375细胞（sg-A375）,然后通过划痕实验和Transwell小室实验检测sg-A375细胞的迁移及穿透力,获取CXCR4与黑素瘤恶性行为相关功能的证据。与A375细胞比较,sg-A375细胞的划痕实验修复能力和迁移及侵袭能力显着下降。结果证实敲除CXCR4可抑制黑素瘤增殖、侵袭、迁移过程,表明MM中CXCR4高表达和患者预后不良相关。结论:（1）通过TCGA数据库筛选获得6个IRGs（SLPI,S100A7,LYZ,CCL19,CXCR4和CD79A）组成的可用于MM转移患者预后预测的免疫相关基因标志物（immune-related gene signature,IRGS）,经GEO不同维度的独立数据集验证该6个IRGs组成的IRGS模型具有很好的适用性。（2）转移MM病例的单细胞分析结果说明:转移病例样本中的B细胞、粒细胞集落刺激因子、中性粒细胞和成纤维细胞的浸润,与MM患者预后相关,同时上述浸润细胞含量丰度和免疫预后基因表达呈显着正相关。（3）HPA数据库验证基因标志物的结果显示,除CXCR4外,其余SLPI,S100A7,LYZ,CCL19和CD79A5个基因蛋白可以在数据库验证;基于泛癌数据的meta分析结果显示,CXCR4对多种肿瘤患者的OS和RFS均具有较好的预测作用。对不同的肿瘤,CXCR4具有不同的预后判断价值。（4）CXCR4不仅促进A375细胞的增殖和克隆,还与细胞的迁移和侵袭行为密切相关,说明CXCR4可能通过影响免疫微环境而改变患者的预后。
张利[5]（2021）在《CXCL13趋化型CAR-T细胞对骨肉瘤治疗及其机制的研究》文中指出骨肉瘤（Osteosarcoma,OS）是一种多发病于青少年的恶性肿瘤,易发生肺转移。对于转移性的骨肉瘤,手术治疗和放化疗的临床治疗效果不佳,患者的五年生存率低于30%,目前缺少有效的治疗方案。嵌合抗原受体T细胞疗法（Chimeric antigen receptor T,CAR-T）对肿瘤细胞的杀伤并不需要依赖于MHCI（Major histocompatibility complex class I molecule）类分子,可以有效的防止肿瘤逃逸。实体瘤特殊的免疫微环境使得CAR-T细胞很难浸润到肿瘤组织中,即使浸润到肿瘤组织中,也会因严峻的免疫抑制性环境而耗竭。NKG2D（Natural killer group 2D）是一种NK（Nature killer）细胞表面激活受体,当其与配体结合后通过激活下游信号通路使NK细胞释放各种细胞因子,进而发挥其杀伤肿瘤作用。在我们的研究中发现,OS组织中NKG2D配体蛋白MICA/B（MHC class I chain-related protein A/B）高表达,同时趋化因子CXCL13（chemokine C-X-C motif ligand 13）促进了骨肉瘤的转移和侵袭。CXCR5（C-X-C chemokine receptor type5）为CXCL13的受体;CXCL13可以趋化CXCR5+T淋巴细胞归巢到肿瘤组织发挥抑制肿瘤的作用。本研究制备人源和鼠源的CXCR5共表达的NKG2D-CAR-T细胞,探究CAR-T细胞的对骨肉瘤治疗作用及相关机制。第一部分共表达CXCR5的NKG2D-CAR-T细胞治疗骨肉瘤的研究制备人源对照CAR-T（Mock-CAR-T）,NKG2D-CAR-T和CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞。对比于NKG2D-CAR-T细胞,CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞向CXCL13细胞因子的趋化能力和对靶细胞的杀伤能力明显加强;CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞激活相关的分子如TNF-α（Tumor necrosis factorα）、IFN-γ（Interferonγ）、CD107a和Gzm B（Granzyme B）的表达量显着提高,体外增殖能力显着增强,并且PD-1（Programmed cell death-1）和TIM-3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3）的表达水平更低。RNA测序结果显示CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞在增殖、记忆性分化、抵抗免疫耗竭和NFAT通路相关的基因表达显着提高。通过Western blotting、钙信号检测和NFAT-Jurkat报告基因等方法验证显示CXCR5-NKG2D-CAR-T通过CXCL13/CXCR5/Ca2+/NFAT信号轴提高了CAR-T细胞的综合效果。体内实验使用U-2OS细胞对NSG小鼠进行皮下荷瘤,建立骨肉瘤模型,检测CAR-T细胞对荷瘤小鼠的肿瘤杀伤情况。与NKG2D-CAR-T细胞相比,CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞可以在体内存活时间更长,血液中CD8+T淋巴细胞的比例升高,实现更好的肿瘤趋化效果和对肿瘤的抑制能力。第二部分CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞对骨肉瘤肿瘤免疫微环境的影响构建鼠源的Mock-CAR-T,NKG2D-CAR-T和CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞以及鼠源的CXCL13过表达骨肉瘤细胞系。对比于鼠源的NKG2D-CAR-T细胞,CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞的体外趋化能力明显提高;并且展现出更强的骨肉瘤细胞杀伤能力;与细胞杀伤相关的分子如Gzm B,CD107a和IFN-γ的表达量明显提高;体外增殖能力得到明显的增强;并显着降低了耗竭相关的PD-1的表达量。将鼠源的骨肉瘤细胞注射到小鼠胫骨内进行原位建模。对比于鼠源的NKG2D-CAR-T细胞,鼠源的CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞在体内的存活时间、CD8+T淋巴细胞的比例和记忆性T细胞的分化方面展现出优势;并产生更好的肿瘤和淋巴结的归巢能力;产生更强肿瘤抑制效果;并显着降低了肿瘤中髓系来源的抑制性细胞（Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）、肿瘤相关的巨噬细胞（Tumor-associated macrophages,TAMs）和调节性T细胞（Regulatory T cells,Tregs）的比例;对抑制性的骨肉瘤免疫微环境有较好的改善作用。结论:CXCR5的共表达显着提高了NKG2D-CAR-T细胞的肿瘤趋化和杀伤能力,并改善了骨肉瘤免疫微环境,本研究为骨肉瘤的CAR-T细胞免疫疗法提出了一种新的方案。
王一同[6]（2021）在《华蟾素注射液治疗结肠癌腹水的优效人群分析及对VM的作用机制研究》文中研究指明研究背景恶性腹水是晚期结肠癌患者的常见并发症,是临床治疗的难点。西医目前主要采用腹腔穿刺置管引流、全身化疗或联合腹腔灌注化疗等方法,但恶性腹水患者多为肿瘤晚期,经过多程放、化疗治疗,体质较差,再次化疗的敏感性及耐受性降低,且恶性腹水多为血性,无法大量置管引流,使腹胀、喘憋等症状持续存在,严重影响生活质量。因此需探索更为温和、有效的治疗方法。中药腹腔灌注,可避免口服汤药引起的胃肠不适,副反应小,近年来广泛应用于恶性腹水的临床治疗。本团队致力于华蟾素注射液腔内灌注治疗研究多年,发现华蟾素注射液对恶性浆膜腔积液有一定的疗效,庄等研究发现,华蟾素注射液腔内灌注治疗恶性浆膜腔积液,有效率为66.42%;杨等研究发现,华蟾素注射液腔内灌注对于恶性胸水有效率为60.00%;袁等研究发现,华蟾素注射液对于消化系统肿瘤来源恶性腹水有效率为75.4%,疗效更好,但前期研究对于不同癌种患者分层后病例数较少,未进行具体分层讨论。恶性腹水的生成与血管新生密切相关。本团队前期基础研究发现华蟾素注射液能够降低恶性腹水中的红细胞数量,使腹水颜色变浅,推测华蟾素注射液可能通过抑制肿瘤血管新生干预恶性腹水的生成。血管生成拟态（Vasculogenic Mimicry,VM）是近年来提出的全新肿瘤血管新生模式,可能与传统内皮细胞参与的肿瘤血管新生共同促进恶性腹水的生成。既往多数研究关注在华蟾素对内皮细胞参与的肿瘤血管新生的影响,鲜有研究探究华蟾素对VM形成的影响。研究目的临床部分:明确华蟾素注射液腹腔灌注治疗对于结肠癌这一单一病种来源的恶性腹水的疗效及该治疗方法对应的优效人群特征,以期为华蟾素注射液腹腔灌注治疗结肠癌恶性腹水提供更为个体化的临床指导。实验部分:由临床现象探索内在机制。以VM为新切入点,通过体内、体外实验观察华蟾素注射液对结肠癌HCT116细胞VM形成的影响及作用机制,从而更为全面地从肿瘤血管新生角度阐述华蟾素注射液腹腔灌注抑制结肠癌恶性腹水的作用机制。研究方法临床部分:采用单臂回顾性研究方法,收集2010年1月1日～2020年12月31日于北京中医药大学东方医院肿瘤科行华蟾素注射液腹腔灌注治疗的结肠癌恶性腹水的患者临床资料,从腹水量控制率、腹水质改善率、KPS评分改善情况及患者生存期方面进行疗效评价,同时评价安全性。进一步对比不同因素（如肿瘤原发病特点、转移情况、整体及局部中医辨证分型、合并全身治疗等）对疗效的影响,从中筛选优效病例,总结优效人群特征。实验部分:（1）采用结肠癌HCT116细胞腹腔+脾脏原位接种法建立BALB/C裸鼠结肠癌血性腹水模型;观察造模前后及华蟾素注射液干预前后裸鼠一般体征、体重、腹围、腹水量、腹水红细胞数量及腹腔转移瘤瘤重等。（2）采用CoCl2化学诱导建立结肠癌HCT116细胞体外缺氧模型;采用CCK-8实验、细胞划痕实验、Transwell实验检测缺氧微环境及华蟾素注射液对结肠癌HCT116细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。（3）采用Matrigel基质胶细胞三维培养建立结肠癌HCT116细胞体外VM模型;通过PAS-CD31组织化学与免疫组化双染法显示结肠癌HCT116细胞体内VM的形成;显微镜下计数VM形成数目,观察缺氧微环境及华蟾素注射液对结肠癌HCT116细胞体内、体外VM形成的影响。（4）采用RT-qPCR、Western-blot实验检测缺氧微环境及华蟾素注射液对结肠癌 HCT116 细胞 VM 形成相关靶点 HIF-1α、VEGF、MMP2、MMP9、VE-cadherin mRNA及蛋白表达的影响。研究结果临床部分:（1）腹水量疗效评价:研究共纳入135例患者。灌注后腹围较灌注前显着减小（P<0.01）;完全缓解2例,部分缓解25例,稳定56例,合计有效83例,无效52例,总有效率61.5%。（2）腹水质疗效评价:灌注后腹水红细胞数、腹水肿瘤标记物、腹水乳酸脱氢酶水平较灌注前显着下降（P<0.01）;腹水红细胞较治疗前下降≥25%者94例,总有效率74.0%;腹水肿瘤标记物较灌注前下降≥25%者70例,总有效率55.1%,其中CEA、CA199、CA724水平下降显着,铁蛋白水平较灌注前差异无统计学意义（P>0.05）;腹水乳酸脱氢酶较治疗前下降≥25%者50例,总有效率39.4%。（3）KPS评分疗效评价:灌注后KPS评分较灌注前显着提高（P<0.01）;较治疗前提高者41例,较治疗前稳定者82例,较治疗前减少者12例。（4）生存情况疗效评价:纳入患者截至末次随访,仍存活者2例,腹水生存期为1～31个月,平均腹水生存期5.66±4.59个月,中位腹水生存期4.00个月;腹水1年生存率为9.6%,2年生存率为3.7%,未见大于3年生存者。（5）安全性评价:出现不良反应者27例,占比20.0%,主要不良反应为腹痛（10例）、发热（11例）、恶心呕吐（3例）、腹泻（3例）,多可耐受或对症治疗后可较快缓解,为1级轻度不良反应。未见由药物引起的骨髓抑制、肝、肾功能异常及心电图改变,未见腹腔感染、肠梗阻、消化道出血等严重并发症,安全性良好。（6）短期疗效优效人群特征分析:对于男性、有饮酒史、左半结肠、灌注前血液NLR≤2.81、初诊即诊断恶性腹水、血性腹水、全身辨证含瘀毒证,全身辨证非肝肾阴虚证、局部辨证为湿热毒证及合并全身中医治疗患者的腹水量控制方面疗效更好,其中结肠癌位置、腹水性质、合并全身中医治疗是影响腹水量控制率的独立预后因素;对于有饮酒史、无肝转移、有腹腔淋巴结转移、无胆红素升高、血性腹水、局部辨证为湿热毒证及合并全身中医治疗患者的腹水颜色改善方面疗效更好,其中肝转移、胆红素升高、腹水性质、局部辨证为影响腹水颜色改善率的独立预后因素。（7）长期疗效优效人群特征分析:有家族史、左半结肠、无肝转移、无脑转移、转移部位≤2个、灌注前无血中乳酸脱氢酶升高、初诊即诊断恶性腹水、全身辨证非肝肾阴虚证、无不良反应及腹水量得到控制的患者腹水生存期更长,但与外部研究结果对比生存期未见明显延长。实验部分:（1）结肠癌HCT116细胞腹腔+脾脏原位接种可建立较为稳定的BALB/C裸鼠结肠癌血性腹水模型;Matrigel基质胶细胞三维培养可建立结肠癌HCT116细胞体外VM模型。（2）华蟾素注射液腹腔注射可抑制结肠癌血性腹水的生成、降低腹水中红细胞数目,抑制结肠癌腹腔转移瘤的生成。（3）缺氧微环境可促进结肠癌HCT116细胞迁移、侵袭,增强体外VM的形成能力。（4）华蟾素注射液可逆转缺氧对HCT116细胞造成的不良影响,抑制其增殖、迁移、侵袭及体内、体外VM的形成。（5）缺氧微环境可上调HCT116细胞HIF-1α、VEGF、MMP2、MMP9、VE-cadherin mRNA及蛋白的表达,华蟾素注射液干预后可抑制HIF-1α、VEGF、MMP2、VE-cadherinmRNA及蛋白表达,对MMP9 mRNA及蛋白未见显着影响。研究结论临床部分:（1）华蟾素注射液腹腔灌注可有效抑制结肠癌恶性腹水的产生,延缓病情进展,降低腹水中的红细胞数量,提高KPS评分,改善患者生活质量,安全性良好;（2）左半结肠癌、无肝转移、无胆红素升高、血性腹水、局部辨证为湿热毒证及合并全身中医治疗的患者是华蟾素注射液腹腔灌注治疗的优效人群,通过人群特征初步筛选后用药可提高临床疗效。实验研究:华蟾素注射液腹腔灌注抑制结肠癌血性腹水的机制,可能与其逆转肿瘤缺氧微环境,下调HIF-1α、VEGF、MMP2、VE-cadherin mRNA及蛋白的表达从而抑制结肠癌细胞体内、体外VM的形成,同时抑制结肠癌细胞增殖、迁移及腹腔侵袭有关。
赵亚楠[7]（2021）在《NLRP3炎症小体及γδT17/MDSCs在淋巴瘤免疫稳态失衡中的作用及机制研究》文中认为第一部分 NLRP3炎症小体介导的免疫抑制在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的作用和机制研究研究背景:弥漫性大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）是最常见的侵袭性非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin lymphoma,NHL）,占所有NHL的30-35%。利妥昔单抗联合化疗作为一线治疗手段显着提高了疗效,但仍有三分之一以上的患者难治或复发。90%的难治/复发病例不能通过常规挽救化疗和自体干细胞移植得到缓解。免疫疗法近年来在肿瘤治疗领域取得重要进展,例如免疫检查点阻断剂（ICB）、CAR-T疗法等,已在多种实体瘤中取得一定的疗效,但在DLBCL患者中反应欠佳。因此,探索DLBCL发病过程中调节免疫稳态的相关机制,评估高危因素,对于提高DLBCL的治疗效果十分重要。炎症反应是肿瘤发生的关键因素之一。炎症小体可介导炎性细胞因子释放,产生炎症级联反应,促进形成适合肿瘤细胞生长的炎性微环境。NLRP3炎性小体是研究最广泛的炎症小体,外来病原体入侵或体内细胞的损伤和死亡,可招募、组装并激活NLRP3炎症小体,活化caspase-1,切割IL-1β和IL-18前体,产生有活性的IL-1β和IL-18,从而介导机体的免疫应答,促进机体清除病原体和内源性损伤。此外,NLRP3炎症小体在肿瘤的发生发展中起着重要的调节作用。既往研究表明,NLRP3炎症小体在乳腺癌、纤维肉瘤和胃癌等多种恶性肿瘤中发挥促癌作用,并且NLRP3及其效应细胞因子IL-1β和IL-18可促进免疫抑制性肿瘤微环境形成,参与肿瘤的免疫逃逸。因此,NLRP3炎症小体诱导的免疫抑制可能是肿瘤发生的机制之一。本课题组前期研究发现,初诊NHL患者血清中IL-18升高,治疗缓解后降低;且淋巴瘤细胞株中的NLRP3炎症小体可被活化,伴随NLRP3炎症小体相关基因的表达升高。然而,NLRP3炎症小体在DLBCL发病中的作用尚不清楚。肿瘤细胞可通过多种方式抑制机体的抗肿瘤免疫应答,逃逸宿主的免疫监视。免疫检查点是免疫细胞或肿瘤细胞上表达的调节免疫稳态的分子,对防止自身免疫反应过度激活起着重要作用。然而,肿瘤中过度表达的免疫检查点可使机体免疫功能受到抑制,导致肿瘤的免疫逃逸,例如肿瘤细胞表达的程序性细胞死亡配体1（PD-L1）,与活化T细胞上表达的程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）结合并传递抑制性信号,诱导肿瘤免疫耐受。免疫抑制也是淋巴系统恶性肿瘤发生发展的重要因素之一。研究表明,恶性B淋巴细胞可通过高表达PD-L1逃避免疫监视。另外,肿瘤免疫微环境还存在髓系来源的抑制细胞（MDSCs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）及调节性T细胞（Tregs）等抑制免疫功能的细胞。研究证实,DLBCL中MDSCs可通过IL-10、S100A12及PD-L1介导T细胞功能抑制。近期研究报道,NLRP3炎症小体/IL-1β途径可促进头颈部鳞状细胞癌的肿瘤发生,阻断该途径延缓了肿瘤生长,并伴随着效应T细胞数量的增加和免疫抑制性细胞的减少。鉴于NLRP3炎症小体在肿瘤发生和免疫抑制中的重要作用,我们推测,DLBCL中NLRP3炎症小体异常活化通过介导肿瘤免疫逃逸促进淋巴瘤发生发展。目前,DLBCL中免疫抑制的调节机制尚不明确,对于DLBCL中NLRP3炎症小体的作用及免疫调节机制的深入认识,有助于识别新的生物标志物,逆转免疫抑制状态,并改善DLBCL患者免疫治疗反应。研究目的:本课题拟研究NLRP3炎症小体在DLBCL发病中的作用及其对肿瘤免疫应答的影响,分析其与临床特征和预后的相关性;体内验证NLRP3炎症小体对淋巴瘤小鼠发病的影响;探讨NLRP3炎症小体对T细胞表型和功能的影响及其参与淋巴瘤免疫抑制的作用及机制;探索NLRP3抑制剂对免疫检查点阻断疗法的影响。预期目标的实现,将揭示NLRP3炎症小体介导的免疫失衡在DLBCL发生发展中的作用及机制,为DLBCL提供新的预后标志物和治疗靶点。研究方法:1.收集35例初诊DLBCL肿瘤组织和35例正常淋巴组织（14例扁桃体组织,7例腋窝淋巴结,7例支气管淋巴结和7例胃周淋巴结）,制备微阵列组织芯片。（1）免疫组化染色评估DLBCL肿瘤组织和正常组织中NLRP3炎症小体效应细胞因子（IL-1β、IL-18）的水平,分析NLRP3炎症小体活化与DLBCL临床特征的关系。（2）免疫组化染色检测PD-L1的水平,分析PD-L1的表达与临床特征的关系。（3）分析IL-1β或IL-18表达与PD-L1表达的关系。2.收集初诊、缓解和难治/复发阶段的DLBCL患者外周血标本,同时收集健康对照者及其他类型NHL患者外周血标本,分离外周血单个核细胞（PBMCs）。（1）检测DLBCL患者抗肿瘤免疫应答能力:流式细胞术检测外周血中T细胞和NK细胞比例,检测T细胞和NK细胞表面免疫检查点分子（TIM-3、PD-1、BTLA、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、CD160）的表达,检测T细胞分泌细胞因子能力（IFN-γ、TNF-α）及NK细胞脱颗粒能力（颗粒酶、穿孔素、CD107a）,判断T细胞和NK细胞功能是否受损。分析外周血T细胞表达免疫检查点水平与DLBCL临床特征和预后的关系。（2）流式细胞术检测外周血中MDSCs及其亚群（PMN-MDSCs、M-MDSCs）和Tregs的比例,判断免疫抑制性细胞在DLBCL中是否扩增。（3）实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测NLRP3炎症小体相关基因（IL1B、IL18、NLRP3、ASC、CASP1、NFKB1）在PBMCs中的表达,比较DLBCL患者和健康对照中的表达差异。3.体外培养DLBCL细胞株（OCI-LY3、RC和DB）,对细胞株进行不同处理:①对照组:PBS处理;②活化组:利用脂多糖（LPS）和三磷酸腺苷（ATP）活化NLRP3炎症小体;③抑制组:在加入LPS和ATP同时,利用NLRP3抑制剂MCC950抑制NLRP3炎症小体活化。（1）提取不同处理组细胞的总蛋白,Western Blot方法验证各组DLBCL细胞株NLRP3炎症小体活化状态。（2）将不同处理组的OCI-LY3和RC细胞株分别与健康志愿者的PBMCs进行间接共培养,分别共培养3、7、10天后,收集共培养体系的PBMCs,进行流式细胞术检测,分析T细胞的比例和表型。4.NLRP3炎症小体介导淋巴瘤免疫失衡的体内研究:（1）A20淋巴瘤小鼠模型构建:体外培养小鼠淋巴瘤细胞株A20细胞,接种于4周龄雌性BALB/c小鼠前肢背部皮下,设置:①对照组:腹腔注射无菌PBS;②NLRP3抑制组:腹腔注射MCC950阻断NLRP3炎症小体活化。比较两组小鼠淋巴瘤生长情况,分析阻断NLRP3炎症小体活化对小鼠淋巴瘤生长的影响。（2）ELISA检测淋巴瘤小鼠肿瘤匀浆和血浆中IL-1β和IL-18的水平,Western Blot检测小鼠肿瘤和脾脏中NLRP3炎症小体相关蛋白的表达,评估体内应用MCC950是否能抑制小鼠NLRP3炎症小体活化。（3）WesternBlot检测小鼠肿瘤组织PD-L1及相关信号通路分子的表达,分析抑制NLRP3炎症小体对PD-L1表达及相关信号通路的影响。（4）淋巴瘤小鼠抗肿瘤免疫应答检测:分离对照组和NLRP3抑制组小鼠PBMCs、脾细胞、腋窝/腹股沟淋巴结细胞和肿瘤细胞,流式细胞术检测不同部位T细胞表面PD-1和TIM-3的表达,T细胞比例及其产生IFN-γ、TNF-α和Granzyme B的能力,以及免疫抑制性细胞MDSCs、TAMs和Tregs的比例,分析阻断NLRP3炎症小体活化后荷瘤小鼠体内免疫应答的变化。（5）对A20淋巴瘤小鼠分别注射anti-IL-1β和anti-IL-18抗体,观察抑制IL-1β和IL-18活性对小鼠淋巴瘤生长的作用。流式检测小鼠外周血、脾脏、淋巴结和肿瘤等部位T细胞比例及其表面PD-1、TIM-3的表达,以及MDSCs、TAMs和Tregs的比例,分析阻断IL-1β和IL-18活性对淋巴瘤小鼠免疫应答的影响。Western Blot检测小鼠肿瘤组织PD-L1及相关信号通路分子的表达,分析阻断IL-1 β和IL-18活性对PD-L1表达的影响。（6）对A20淋巴瘤小鼠分别注射PD-L1抗体、NLRP3抑制剂MCC950,观测对小鼠淋巴瘤生长的抑制作用,分组如下:①PD-L1抗体组:腹腔注射抗小鼠PD-L1抗体;②NLRP3抑制组:腹腔注射MCC950;③联合组:腹腔注射MCC950和PD-L1抗体;④对照组:腹腔注射等量IgG。比较各组小鼠抗肿瘤免疫应答的差异:流式检测外周血、脾脏、淋巴结和肿瘤中T细胞的比例、表型和功能,以及免疫抑制性细胞的比例变化,分析NLRP3抑制剂和PD-L1抗体之间的相互作用。5.统计分析:使用SPSS 21和GraphPad Prism 7软件对数据进行分析。数据表示为平均值±标准差或中位数±数据范围或四分位数间距。所用数据为三次独立重复实验的结果。利用Student t检验和Mann-Whitney U检验评估P值,用Pearson相关系数检验相关性,P值小于0.05表示差异具有统计学意义。研究结果:1.IL-18在DLBCL肿瘤组织中显着升高且与PD-L1表达呈正相关。（1）组织芯片染色结果显示,DLBCL肿瘤组织IL-18表达水平明显升高,且与生发中心型DLBCL（GCB-DLBCL）相比,非GCB型（non-GCB）DLBCL具有更高水平的IL-18。进一步亚组分析发现,IL-18和IL-1β在CD10（-）和MUM1（+）的患者中表达水平更高。（2）组织芯片染色结果显示,DLBCL肿瘤组织PD-L1表达水平较正常淋巴组织明显上调,且PD-L1表达与DLBCL生存不良的独立预测因子Ki-67表达成正相关。而且,肿瘤微环境中PD-L1与IL-18的表达水平成正相关。（3）RT-qPCR结果显示,与健康对照相比,DLBCL患者PBMCs中的IL1B和IL18基因表达明显上调。2.流式细胞术检测发现,DLBCL患者抗肿瘤免疫应答受到抑制。（1）流式检测T细胞和NK细胞产生细胞因子水平,发现:与健康对照相比,DLBCL初诊患者外周血CD3+T细胞分泌TNF-α和IFN-γ的水平明显减少,NK细胞（CD3-CD56+）比例显着降低,NK细胞产生穿孔素和颗粒酶的水平明显下降。（2）流式检测免疫检查点分子表达,发现:与健康对照相比,DLBCL初诊患者外周血中T细胞表面PD-1和TIM-3的阳性率明显上升,NK细胞表面TIM-3和BTLA的表达明显升高。进一步分析患者临床资料发现,PD-1+T细胞比例与血清乳酸脱氢酶（LDH）水平呈正相关。而且,T细胞表达PD-1和TIM-3水平与淋巴瘤Ann Arbor分期和国际预后指数（IPI）有关,Ann Arbor Ⅲ/Ⅳ期的DLBCL患者较Ⅰ/Ⅱ期的患者外周血中PD-1+T细胞和TIM-3+T细胞比例明显升高,IPI≥3分的患者较IPI0-2分的患者PD-1+T细胞和TIM-3+T细胞比例明显升高,提示DLBCL患者T细胞表面PD-1和TIM-3表达的增多与不良预后相关。（3）流式检测免疫抑制性细胞比例,发现:与健康对照相比,DLBCL初诊患者外周血中MDSCs和Tregs细胞的比例明显增高,而治疗后缓解的DLBCL患者Tregs比例较初诊患者明显下降,难治/复发DLBCL患者Tregs比例较缓解患者明显升高。3.体外实验证实,DLBCL细胞株的NLRP3炎症小体可被活化并影响PD-L1表达。（1）WesternBlot结果显示:与对照组相比,LPS和ATP处理后,OCI-LY3、RC和DB细胞的蛋白裂解产物中,IL-1β（p17）和PD-L1蛋白水平明显升高;MCC950处理后,OCI-LY3、RC和DB细胞的蛋白裂解产物中,IL-1β（p17）和PD-L1表达明显下调。（2）体外活化或抑制RC或OCI-LY3细胞的NLRP3炎症小体,并与PBMCs共培养,流式结果显示:共培养7天后,RC细胞和OCI-LY3细胞的共培养体系中,NLRP3炎症小体活化组的CD8+T细胞比例均较对照组显着降低,而NLRP3炎症小体抑制组的CD8+T细胞比例较活化组显着升高。4.体内实验证实,MCC950体内阻断NLRP3炎症小体活化可抑制淋巴瘤生长,降低PD-L1表达。（1）我们通过向BALB/c小鼠皮下注射同系A20淋巴瘤细胞株建立了小鼠淋巴瘤模型,接种后7天左右,小鼠右侧斜肋部皮下出现肉眼可见的肿瘤,接种后14天左右,小鼠肿瘤负荷明显增加。至观察终点处死小鼠,ELISA结果显示,肿瘤组织匀浆中IL-1β和IL-18水平明显升高。（2）Western Blot结果证实:腹腔注射MCC950使小鼠肿瘤和脾脏中NLRP3炎症小体效应产物IL-1β和IL-18水平显着降低,并且显着下调淋巴瘤小鼠模型肿瘤中的PD-L1和磷酸化STAT3（pSTAT3）的蛋白水平。（3）分析NLRP3炎症小体与小鼠淋巴瘤生长的关系,发现观察终点时,NLRP3抑制组淋巴瘤小鼠的肿瘤体积和肿瘤重量明显低于对照组。5.流式结果显示,MCC950体内阻断NLRP3炎症小体活化可提高淋巴瘤小鼠的T细胞比例及其产生TNF-α的水平,减少PD-1+或TIM-3+T细胞比例,降低免疫抑制性细胞的水平。（1）与对照组相比,NLRP3抑制组小鼠肿瘤浸润CD8+T细胞明显增多,脾脏CD3+、CD4+、CD8+T细胞比例明显升高,脾脏CD3+T细胞产生TNF-α的水平明显增加,而分泌IFN-γ的水平下降。（2）与对照组相比,NLRP3抑制组小鼠脾脏和淋巴结中CD3+T细胞表达PD-1和TIM-3的比例显着降低。（3）与对照组相比,NLRP3抑制组MDSCs和TAMs比例在小鼠肿瘤、外周血、脾脏中显着降低,Tregs细胞比例在肿瘤和脾脏中显着降低。6.体内中和IL-18可抑制淋巴瘤生长,降低免疫抑制性细胞比例。（1）将淋巴瘤小鼠分别注射IL-1β或IL-18中和抗体,发现观察终点时,anti-IL-1β组和anti-IL-18组小鼠淋巴瘤大小均显着低于对照组。（2）流式结果显示:与对照组相比,anti-IL-18组小鼠肿瘤、外周血和淋巴结中CD8+T细胞比例均显着增加;anti-IL-1β组小鼠淋巴结中CD8+T细胞比例增加,而外周血中CD8+T细胞比例降低。（3）流式检测T细胞表面PD-1和TIM-3的表达,结果显示:anti-IL-18组小鼠外周血和淋巴结中CD8+T细胞表达PD-1降低,肿瘤、外周血和脾脏中CD4+T细胞表达PD-1的比例降低,且肿瘤浸润T细胞表达TIM-3降低;而anti-IL-1β组小鼠T细胞表达PD-1百分比无明显变化,肿瘤T细胞表面TIM-3表达升高。（4）流式检测免疫抑制性细胞的比例,发现:anti-IL-18小鼠外周血MDSCs和TAMs比例均明显低于对照组,且anti-IL-18组小鼠肿瘤和脾脏的Tregs比例较对照鼠显着降低;anti-IL-1 β组小鼠外周血MDSCs和TAMs也明显低于对照组,而Tregs比例无明显改变。（5）Western Blot检测小鼠肿瘤组织PD-L1及相关信号通路分子的表达,发现anti-IL-18和anti-IL-1β组小鼠肿瘤组织中PD-L1和pSTAT3蛋白表达水平均较对照显着降低。7.NLRP3炎症小体抑制剂和PD-L1抗体对于抑制淋巴瘤生长具有拮抗作用。（1）在本研究中,我们分别用MCC950、anti-PD-L1抗体单一处理或MCC950联合anti-PD-L1抗体处理淋巴瘤小鼠模型,观察对小鼠淋巴瘤生长的影响,结果显示,单用MCC950或anti-PD-L1抗体均能减小淋巴瘤小鼠的肿瘤负荷,而联用MCC950和anti-PD-L 1抗体降低了肿瘤抑制效果。（2）流式分析发现,与对照相比,anti-PD-L1抗体能显着提高肿瘤浸润性CD8+T细胞和总T细胞的比例,并增加脾脏CD8+T细胞IFN-γ和TNF-α产生;而联合MCC950后,肿瘤CD8+T细胞比例及脾脏CD8+T细胞产生IFN-γ和TNF-α的水平明显低于单用anti-PD-L1组。以上结果说明,NLRP3抑制剂会破坏由PD-L1抗体提高的CD8+T细胞比例和产生细胞因子能力。（3）流式分析发现,anti-PD-L1组小鼠脾脏和淋巴结中PD-1+T细胞比例明显高于对照组和MCC950组,而联合组小鼠的脾脏和淋巴结中PD-1+T细胞的百分比也明显高于单用MCC950组。此外,与MCC950组相比,anti-PD-L1组肿瘤浸润的MDSCs和TAMs的百分比均显着提高,而且联合用药组小鼠肿瘤中的MDSCs和TAMs比例也明显高于单用MCC950组。可见,PD-L1抗体在一定程度上破坏了由NLRP3抑制剂降低的免疫抑制因素。结论:1.DLBCL患者中NLRP3炎症小体异常活化,肿瘤组织中效应细胞因子IL-18表达上调,且与共抑制配体PD-L1表达成正相关。2.DLBCL患者体内抗肿瘤免疫应答受到抑制,肿瘤微环境中PD-L1表达增加,外周免疫抑制性细胞群体MDSCs、TAMs和Tregs明显扩增,T细胞表达PD-1和TIM-3增加,与DLBCL不良预后相关。3.阻断NLRP3炎症小体活化可显着抑制小鼠淋巴瘤进展,增强抗肿瘤免疫应答,降低免疫抑制性细胞数量。而且,NLRP3炎症小体主要通过效应因子IL-18介导淋巴瘤中免疫应答的调节。4.A20淋巴瘤小鼠模型体内阻断NLRP3炎症小体活化可拮抗PD-L1抗体对肿瘤的抑制作用。第二部分 γδT17和MDSCs在胃MALT淋巴瘤微环境免疫稳态失衡中的作用及机制研究研究背景胃粘膜相关淋巴组织（Mucosa-associated lymphoid tissue,MALT）淋巴瘤的发生发展与幽门螺杆菌（Helicobacter Pylori,HP）感染导致的胃粘膜区域免疫稳态失衡密切相关。胃MALT淋巴瘤是慢性炎症转化为肿瘤的典型疾病类型。胃粘膜局部微环境中大量免疫细胞浸润、细胞因子产生等导致的免疫稳态失衡,在胃MALT淋巴瘤的发生发展中起重要作用,因此探究其潜在的免疫调节机制对于明确炎症-肿瘤转化的机制意义重大。髓系来源的抑制细胞（Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）由处于早期分化阶段的髓系细胞组成。生理状态下MDSCs处于静息状态,缺乏免疫抑制活性。在各种病理状态下,MDSCs被募集到淋巴器官或肿瘤组织中,通过细胞间接触或可溶性细胞因子的作用,产生广泛的免疫抑制作用。MDSCs主要通过抑制T细胞、NK细胞功能介导肿瘤免疫耐受。研究发现,MDSCs中高活性的精氨酸酶1（Arginase 1,Arg-1）消耗TCR合成的原料L-精氨酸,并抑制细胞周期相关蛋白Cyclin D3、CDK4的表达,导致T细胞增殖阻滞。MDSCs通过诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase,iNOS）产生一氧化氮,诱导T细胞凋亡。除此之外,MDSCs还能通过促进调节性T细胞（Tregs）聚集发挥免疫抑制作用。由此可见,MDSCs在肿瘤免疫耐受中扮演重要角色。胃粘膜免疫是机体整个免疫网络的重要组成部分,具有独特的结构和功能,其中γδT细胞的富集是胃粘膜区域免疫的重要特性。γδT细胞在胃肠道粘膜中含量丰富,对于维持胃粘膜微环境稳态、抵御外来微生物入侵及调节获得性免疫应答起重要作用。yδT细胞可分泌多种细胞因子,按功能不同可划分为分泌IFN-y的γδT1和分泌IL-17的γδT17,其中的T17的作用日益受到重视。γδT17在纤维肉瘤、皮肤癌、结肠癌、卵巢癌等多种肿瘤的微环境中大量浸润,通过促进血管生成、肿瘤侵袭以及诱导免疫耐受等发挥促癌作用。研究表明,HP感染相关的慢性胃炎可引起γδT细胞大量活化18,而且在胃MALT淋巴瘤微环境中存在IL-17的高表达19,20。然而,关于γδT17在胃MALT淋巴瘤中的作用尚不清楚,有待于进一步研究。近年研究显示,γδT17可通过募集和激活MDSCs来介导结直肠癌和肝细胞癌肿瘤微环境中的免疫耐受。在结肠癌微环境中,IL-23诱导γδT17细胞极化,分泌IL-17、IL-8、TNF-α和GM-CSF等细胞因子,招募并激活MDSCs。在肝癌微环境中,活化的γδT17产生大量IL-17,可促使肿瘤细胞分泌CXCL5,进而招募MDSCs;同时,MDSCs通过分泌IL-23和IL-1β促进γδT17极化,形成正反馈环路,进一步介导肿瘤免疫耐受。由此我们推测,HP感染引起胃粘膜局部慢性炎症,微环境免疫稳态失衡,γδT17被激活,通过分泌IL-17等细胞因子,募集MDSCs,介导肿瘤细胞免疫逃逸,参与胃MALT淋巴瘤发生发展。研究目的本项目拟以胃MALT淋巴瘤区域免疫微环境为切入点,研究γδT17、MDSCs及相关细胞因子在胃MALT淋巴瘤免疫失衡中的关键作用,探索胃MALT淋巴瘤从炎症向肿瘤转化过程中的免疫调节机制。研究方法1.利用H.felis给BALB/c小鼠灌胃,构建小鼠胃MALT淋巴瘤模型,利用快速尿素酶实验和PCR方法检测细菌定植情况,利用H&E染色和免疫组化鉴定小鼠胃粘膜病理特征,动态监测小鼠胃组织成瘤情况。2.H.felis感染后不同时间点（8、11、14、19月）分离小鼠的外周血、脾脏及胃组织,流式细胞术检测MDSCs在胃MALT淋巴瘤小鼠模型和对照鼠中的比例。制备小鼠胃组织的石蜡切片,利用免疫荧光和免疫组化检测胃局部MDSCs（Gr-1+CD 11 b+）的数量及其产生Arg-1和iNOS的水平。3.在胃MALT淋巴瘤小鼠模型发病过程中,利用ELISA和RT-qPCR检测胃组织IL-17蛋白水平和Il17a基因表达的变化,通过流式细胞术分析产生IL-17的三种主要细胞γδT17（TCRγδ+IL-17+）、Th17（CD4+IL-17+）和Tc17（CD8+IL-17+）的比例变化,比较γδT17细胞水平在胃MALT淋巴瘤小鼠模型和对照鼠之间的差异,以及随H.felis感染时间延长的变化趋势。4.比较胃MALT淋巴瘤小鼠模型和对照鼠胃局部细胞因子和趋化因子的差异:RT-qPCR检测Toll样受体（Toll-likereceptor,TLR）、细胞因子及趋化因子的表达,ELISA检测IL-1β、IL-23等细胞因子的表达和水平,Western Blot检测NLRP3炎症小体是否在H.felis感染鼠胃组织活化,分析差异表达的细胞因子或趋化因子在胃MALT淋巴瘤小鼠发病中的作用。5.收集胃MALT淋巴瘤初诊患者和健康对照者的外周血标本,并制备胃MALT淋巴瘤组织和正常胃组织的石蜡组织切片。流式细胞术检测外周血中MDSCs（CD45+Lin-CD33+HLA-DR-CD11b+）、Tregs（CD4+CD25+Foxp3+）、γδT17（TCRγδ+IL-17+）、Th17（CD4+IL-17+）和Tc17（CD8+IL-17+）的比例,比较胃MALT淋巴瘤患者和健康志愿者之间的差异。免疫荧光检测MD S C s（CD33+CD11b+）和γδT17（TCRγδ+IL-17+）在胃MALT淋巴瘤肿瘤组织中的浸润,免疫组化检测Arg-1、iNOS、IL-1β和IL-23的表达。6.统计分析:本研究数据以平均数±标准差或中位数±四分位数间距表示,用Student t检验或Mann-Whitney检验评估,使用 SPSS 21 和GraphPad Prism 7对数据进行分析。P值小于0.05差异具有统计学意义。结果1.胃MALT淋巴瘤小鼠模型鉴定:H&E染色结果显示,从灌胃后8个月开始,H.felis感染鼠胃黏膜出现以淋巴细胞聚集为主的淋巴滤泡,且随感染时间延长,H.felis感染鼠胃黏膜的病理损害逐渐加剧;感染后14个月,淋巴细胞明显破坏粘膜肌层,甚至粘膜全层,形成淋巴上皮损害（LEL）,这是胃MALT淋巴瘤的典型特征。免疫组化证实,H.felis感染鼠胃黏膜聚集的淋巴组织主要由CD20+的B淋巴细胞组成。以上结果证实,长期的H.felis感染会导致BALB/c小鼠胃黏膜病理损害,先后出现炎症、淋巴组织增生、淋巴滤泡形成和LEL,此病程演变与人的胃MALT淋巴瘤的形成过程高度一致。2.胃MALT淋巴瘤小鼠胃粘膜区域免疫微环境中MDSCs浸润增多。流式结果显示,H.felis感染早期胃部病变较轻时,感染鼠外周血中MDSCs的比例较对照鼠无明显变化;H.felis感染中后期,胃MALT淋巴瘤小鼠模型的外周血中MDSCs的比例较对照鼠明显升高。免疫荧光和免疫组化证实,与对照鼠相比,Gr-1+CD11b+的MDSCs在胃MALT淋巴瘤小鼠模型的胃组织浸润显着增多,而且胃组织局部的Arg-1分泌明显增多。3.胃MALT淋巴瘤小鼠胃粘膜区域免疫微环境中γδT17大量聚集。RT-qRCR和ELISA结果显示,H.felis感染鼠胃组织IL-17在mRNA和蛋白水平均显着高于对照鼠。同时,免疫组化也证实了 IL-17在胃MALT淋巴瘤小鼠模型淋巴滤泡形成部位的高表达。流式数据显示:与对照鼠相比,H.felis感染后8个月小鼠脾脏γδT细胞的比例明显升高,而CD4+T和CD8+T细胞比例无明显差异;而且,胃MALT淋巴瘤小鼠的脾脏中γδT17在产生IL-17的T淋巴细胞中的比例显着升高,而Th17和Tc17比例在两组小鼠之间无明显变化,提示γδT17是胃MALT淋巴瘤发展过程中调节免疫稳态的主要细胞群体。进一步研究发现,γδT17的比例随着H.felis感染时间的延长逐渐升高,提示的T17与疾病进展的相关性。4.胃MALT淋巴瘤小鼠胃粘膜病变部位参与γδT17极化和募集的细胞因子和趋化因子表达增加。RT-qPCR结果显示,与对照鼠相比,Tlr2、Tlr7和Tlr9基因在H.felis感染后的小鼠胃组织中表达明显升高。Western Blot结果显示,NLRP3炎症小体的活化产物cleaved caspase-1的蛋白水平在H.felis感染后的小鼠胃组织明显增加。ELISA评估小鼠胃组织匀浆中细胞因子的水平,发现与对照鼠相比,IL-1β和IL-23在胃MALT淋巴瘤小鼠模型的胃组织中显着升高。同时RT-qPCR检测发现,Ccr6和Ccl20在胃MALT淋巴瘤小鼠模型胃组织的表达显着高于对照鼠。5.胃MALT淋巴瘤临床标本检测结果:流式检测发现,与健康志愿者相比,胃MALT淋巴瘤患者外周血中MDSCs和Tregs的比例显着升高。免疫荧光和免疫组化证明,胃MALT淋巴瘤患者肿瘤组织中MDSCs和γδT17细胞水平较正常胃组织显着升高,且Arg-1和iNOS在肿瘤微环境中的表达显着上调,同时细胞因子IL-1β和IL-23的表达明显上调。结论1.持续性的H.felis感染可导致小鼠胃组织从胃炎进展到胃MALT淋巴瘤,病理发病过程与人胃MALT淋巴瘤的发生发展高度相似。2.MDSCs在H.felis感染小鼠胃部病变组织和胃MALT淋巴瘤患者肿瘤组织中大量浸润,参与炎症向淋巴瘤的转化。3.胃MALT淋巴瘤小鼠模型胃部病变和胃MALT淋巴瘤患者肿瘤组织中,IL-17分泌增多,γδT17大量聚集,IL-1β、IL-23的激活和CCL20-CCR6的趋化作用可能参与γδT17在病变部位的浸润。γδT17随感染时间延长逐渐增多,可能通过募集MDSCs参与胃MALT淋巴瘤的进展。总之,胃局部免疫稳态失衡是胃MALT淋巴瘤发生发展的重要因素。
刘洪金[8]（2021）在《BUD31和LAMP3在肿瘤基因剪接和免疫调控的作用》文中研究指明mRNA可变剪接在肿瘤发生发展中发挥着重要作用,其功能的失调与肿瘤的发生发展息息相关;mRNA可变剪接在肿瘤演变过程中发挥着举足轻重的作用,很大程度上影响临床患者预后及治疗疗效等,但关于mRNA可变剪接在肿瘤演变过程中机制至今仍未完全阐明。BUD31首次被报道在酵母菌的内含子剪接及mRNA成熟中发挥作用,其功能障碍导致酵母菌特定基因的mRNA成熟受损和基因表达下降,影响着酵母菌的发芽增值和细胞形态。另一篇文献报道BUD31在c-MYC基因驱动的乳腺癌细胞系中通过内含子剪接调控着多个基因表达水平,c-MYC基因激活导致转录水平的上调依赖着剪接体的功能;剪接体成分之一,BUD31功能抑制导致了多个基因功表达水平下降,并增加了 c-MYC基因敲降的细胞合成致死性,这提示BUD31在真核细胞中通过内含子剪接调控基因网络进而发挥重要作用。根据我们前期实验结果,我们发现和正常组织相比,BUD31在肿瘤组织中出现上调表达,这提示BUD31可能在肿瘤演变过程中发挥着重要作用,其作用机制可能也是介导于mRNA剪接体。鉴于mRNA内含子剪接和mRNA可变剪接存在功能的相似性和广泛的交集性,因此我们提出假设BUD31可能不仅仅通过内含子剪接作用机制调控肿瘤基因,也可能通过mRNA可变剪接或两种作用机制同时存在以调控肿瘤基因网络进而促进肿瘤特性发生。本文重点探究BUD31通过mRNA可变剪接或mRNA内含子剪接联合mRNA可变剪接调控肿瘤基因以促进肿瘤发生。首先,我们通过本实验94对食管鳞癌RNA-seq和TCGA食管癌RNA-seq数据进行BUD31 mRNA表达水平分析,结果提示和正常组织相比,食管癌肿瘤组织中BUD31基因表达水平呈现显着上调,随后我们通过TCGA泛癌RNA-seq数据进行分析,结果提示和正常组织相比,BUD31在多个肿瘤组织中呈现显着上调表达,如头颈鳞癌、肺癌、肝癌及乳腺癌。同时,我们也进行BUD31基因表达水平和肿瘤患者临床预后进行生存分析,结果提示在多个肿瘤中,BUD31基因表达水平和患者总生存期呈现显着相关,如头颈鳞癌、恶性胶质瘤、子宫内膜癌,高表达BUD31基因水平的患者临床预后更差,这些结果提示BUD31可能在肿瘤癌特性中发挥着重要作用。接下来,我们通过细胞表型实验证实,BUD31基因的敲降导致了肿瘤细胞恶性表型的降低,如细胞增殖、细胞迁移和细胞侵袭及细胞克隆形成;反之BUD31基因的过表达导致了肿瘤细胞恶性表型的增加。鉴于BUD31基因在多个肿瘤中出现异常上调表达,如食管癌和乳腺癌,BUD31在肿瘤中作用机制具有广泛性,因此我们下载了已公开发表在乳腺癌中BUD31瞬时敲降的RNA-seq数据,进行了基因差异表达分析,共获得750个上调表达基因和940个下调表达基因,随后分别在本实验室94对食管鳞癌RNA-seq数据和TCGA食管癌RNA-seq数据中对以上基因进行基因相关分析,分别获得113个基因和242个基因（其中81个基因为两个数据集所共有）,并找出两个数据集正相关和负相关前10位的基因,其中包括MCM7和CPSF4基因。鉴于MCM7和CPSF4基因在肿瘤中发挥着癌基因作用,二者同时具有多个mRNA转录本及多个蛋白异构体,因此我们选择MCM7和CPSF4两个基因作为典型,以探究BUD31通过mRNA可变剪接或同时通过mRNA可变剪接和内含子剪接发挥着癌基因作用以促进肿瘤发生。为了确认BUD31通过内含子剪接调控基因表达水平,我们瞬时敲降了BUD31基因表达水平,qRT-PCR检测结果提示BUD31表达水平下降导致了多个基因内含子保留率上升和基因表达水平下降,这也和之前文献报道一致。令人惊讶的,我们通过qRT-PCR和WB实验证实,BUD31基因表达水平下降导致MCM7转录本1和MCM7转录本2比例失调及后续MCM7蛋白异构体1和MCM7蛋白异构体2比例失调;反之BUD31基因过表达导致了相反的MCM7 mRNA和蛋白变化情况。接下来我们也在CPSF4基因进行了验证,也取得类似的实验结果。以上结果首次证实BUD31存在mRNA可变剪接作用机制,并通过mRNA可变剪接和mRNA内含子剪接同时调控基因表达水平以促进肿瘤发生。此外,我们还发现了BUD31调控着两个经典癌基因,PIK3CA和c-MYC基因的表达水平,但未检测到这两个基因的内含子保留率显着变化,这可能与CPSF4和MCM7表达水平上升有关。我们通过MCM7和CPSF4基因敲降实验证实了 MCM7和CPSF4在肿瘤发挥着癌基因作用,此外我们在食管肿瘤组织中发现,和正常组织相,肿瘤组织中MCM7蛋白异构1为主要表达形式出现了显着上调表达,而MCM7蛋白异构体2变化不明显。在细胞系中也得到类似的实验结果,这提示MCM7蛋白异构体1发挥着促肿瘤特性作用,这也和BUD31通过上调MCM7蛋白异构体1进而发挥促癌作用一致。为了进一步确认BUD31基因作用机制具有广泛的肿瘤特性,我们选择了其他肿瘤细胞系进行了验证,实验结果和在食管癌细胞结果完全一致,这提示BUD31基因作用机制具有广泛肿瘤特性。综上所述,我们首次发现了BUD31在肿瘤特性中功能作用新机制,即BUD31通过mRNA可变剪接调控着MCM7和CPSF4转录本及蛋白异构体比例变化,发挥促癌作用,并证实BUD31基因通过mRNA内含子剪接和mRNA可变剪接分别调控MCM7和CPSF4表达水平和转录比例变化共同发挥促癌作用。此外,我们通过多种肿瘤细胞系进行了验证,表明BUD31基因的作用机制具有广泛的肿瘤特性,这提示BUD31基因是一个潜在的肿瘤治疗靶基因和广泛肿瘤应用价值,同时也突出了 mRNA可变剪接在肿瘤特性的重要作用。在目前的肿瘤免疫治疗中,以PD-1/PD-L1免疫检查点阻断剂为代表免疫治疗取得一定的治疗效果;但其肿瘤客观有效率仅约40%,部分肿瘤患者对PD-1/PD-L1阻断剂应答不佳,疗效欠佳。部分患者肿瘤组织检测到肿瘤浸润淋巴细胞聚集,但未检测到肿瘤组织PD-L1的表达,这提示肿瘤组织可能通过非PD-1/PD-L1通路负向调控肿瘤免疫,借助于非PD-1/PD-L1肿瘤免疫检查点负向调控肿瘤免疫,进而影响肿瘤微环境,逃避免疫细胞的杀伤。因此,寻找新的免疫检查点对PD-1/PD-L1免疫检查点阻断剂疗效欠佳及开发新的肿瘤免疫手段至关重要。本课题尝试寻找新的肿瘤免疫检查点以探究新的肿瘤免疫负向调控机制和阐述肿瘤免疫微环境。首先,我们根据对本实验94对食管鳞癌RNA-seq数据和TCGA数据进行基因差异表达分析,结果提示和正常组织相比,肿瘤组织中LAMP3（lysosomal associated membraneprotein3,溶酶体相关膜蛋白3）,LAMP家族蛋白的一个成员,表达水平出现显着上调。LAMP3被报道在树突状细胞成熟过程表达,提示LAMP3可能参与正常免疫的调控机制,尤其负向调控免疫反应以防止免疫过激反应。随后我们查询了 HPA数据库中LAMP3数据,结果提示LAMP3极少表达于正常组织中,除了肺脏、阑尾和睾丸;LAMP3广泛表达于免疫细胞不同类型和多种肿瘤组织中,这提示LAMP3可能在免疫细胞和肿瘤细胞中发挥着类型的免疫调控机制,LAMP3参与的免疫调控机制可能广泛存在与免疫系统和肿瘤组织中。此外,我们对TCGA泛癌RNA-seq数据进行基因表达分析,结果提示和正常组织相比,肿瘤组织中LAMP3呈现显着上调表达,如乳腺癌、结肠癌、胃癌和头颈鳞癌。随后进行了生存相关分析,结果提示肿瘤组织中LAMP3表达水平和患者总生存期相关,高表达LAMP3的患者总生存期更短,如乳腺癌、子宫内膜癌和肾癌,这表明LAMP3可能通过肿瘤免疫调控机制在肿瘤特性中发挥着重要作用,并影响着临床预后。接下来,我们进一步对本实验食管鳞癌RNA-seq和TCGA食管癌RNA-seq进行基因表达水平相关性分析,结果均提示肿瘤组织中LAMP3表达水平和多种免疫标志基因表达水平存在显着相关,如CD3E、GZMA、GZMB、GNLY、PRF-1、IFNG等。此外,我们在TCGA乳腺癌和黑色素瘤RNA-seq也进行了基因表达水平相关性分析,结果和食管癌中情况一致,这表明肿瘤组织中LAMP3和免疫功能存在显着相关,可能广泛参与肿瘤免疫调控。本文进一步对LAMP3表达水平和PD-L1表达水平进行相关分析,结果提示LAMP3和PD-L1表达水平不存在相关性,肿瘤组织中同时出现LAMP3和PD-L1高表达的比例约5%,蛋白质BLAST也提示二者不具有任蛋白质相似性或同源性,这提示LAMP3可能通过和PD-L1完全不同的调控机制对肿瘤免疫进行调控。GZMA、GZMB、GNLY和IFNG均出现显着上升,这提示在肿瘤组织中,免疫标志基因表达水平出现了增强,而肿瘤并未得到有效控制,提示肿瘤中出现其他免疫负向调控机制进而导致肿瘤免疫逃逸。最后,本文对本实验64例食管癌组织单细胞数据进行相关分析,结果提示表达CD3e的T淋巴细胞和肿瘤上皮细胞上LAMP3阳性比例呈现显着正相关,效应性T细胞的IL-2水平和肿瘤上皮上LAMP3表达水平呈现显着负相关,这提示LAMP3可能直接参与了肿瘤免疫负向调控。根据实验室数据分析结果提示,肿瘤组织中LAMP3可能参与肿瘤免疫负向调控,进而引起了肿瘤免疫逃逸现象。首先,我们对肿瘤细胞系进行验证发现LAMP3广泛表达于多种肿瘤细胞系和正常细胞系中,这提示LAMP3广泛表达于肿瘤细胞中。接下来,我们通过细胞免疫实验探究LAMP3蛋白是否表达于肿瘤细膜上,结果提示LAMP3蛋白除了表达于肿瘤细胞细胞质内,还表达于肿瘤细胞细胞膜上,这提示肿瘤细胞可能通过细胞膜上LAMP3进行肿瘤免疫负向调控,这为后续的免疫功能实验提供了关键的实验依据。我们成功构建了 KYSE450 LAMP3稳定敲降和稳定过表达细胞系。细胞表型结果实验提示肿瘤细胞LAMP3对细胞增殖无显着影响,但对细胞迁移和细胞侵袭有显着影响,这提示肿瘤细胞通过转移和侵袭发挥肿瘤特性作用。随后T淋巴细胞杀伤实验证实,和对照组相比,LAMP3稳定敲降细胞系对T淋巴细胞杀伤更为敏感;和对照组相比,LAMP3稳定过表达细胞系对T淋巴细胞杀伤不敏感,T淋巴细胞对LAMP3稳定过表达细胞系具有较差的杀伤效果,这提示提示肿瘤细胞LAMP3降低了 T淋巴细胞杀伤能力。免疫细胞和肿瘤细胞共培养实验结果提示,对照组相比,LAMP3稳定敲降组中PBMC多个免疫标志基因表达水平出现显着上升,如GZMA、GZMB、GNLY、PRF-1、IFNG,这提示肿瘤细胞LAMP3负向调控T淋巴细胞免疫功能。此外,我们还发现和对照组相比,LAMP3稳定敲降组中T淋巴细胞功能出现增强时,LAMP3表达水平也出现了显着上升,这也和之前文献报道LAMP3显着上调表达在激活的T淋巴细胞上完全一致,这提示T淋巴细胞的LAMP3表达可能直接负向调控T淋巴细胞功能,是一个全新的潜在免疫检查点。综上所述,肿瘤组织中LAMP3表达水平出现广泛上调,并和患者预后显着相关。肿瘤细胞LAMP3对细胞迁移和细胞转移有显着影响,但对细胞增殖和细胞克隆形成无显着影响。肿瘤细胞LAMP3直接负向调控T淋巴细胞功能,结合LAMP3显着上调表达于激活的T淋巴细胞,表明LAMP3是一个新的肿瘤免疫负向调控分子,很可能是全新的免疫检查点。
胡峰[9]（2020）在《非小细胞肺癌中TIGIT在CD8+T细胞的表达及作用机制研究》文中研究说明在肿瘤微环境中肿瘤抗原的持续刺激下,CD8+T细胞会进入机能缺陷或衰竭状态,从而不能有效地阻止癌症的进展。肿瘤细胞表面上调的抑制性配体PD-L1与CD8+T细胞上PD-1的相互作用是介导T细胞衰竭的机制之一;阻断PD-1/PD-L1通路的药物在癌症患者中效果显着。然而,在大部分癌症类型中,只有小部分患者（20～30%）对anti-PD-1/PD-L1免疫治疗产生应答,非应答者一般经历体内T细胞功能短暂激活后疾病继续进展,这可能是因为阻断PD-1通路难以逆转表观遗传修饰上稳定的衰竭型T细胞的命运,提示还有其它机制与PD-1通路协同地调节T细胞衰竭。由于免疫检查点分子可以协同地介导免疫抑制和促进T细胞衰竭,所以需要找出与PD-1通路协同调节T细胞衰竭的免疫检查点分子并尝试通过联合用药（同时阻断不同的通路）来进一步增强效应细胞杀伤癌细胞的活性以改善肿瘤免疫治疗的疗效。TIGIT（具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体）,是对T细胞功能起负调控作用的免疫检查点分子之一,它过表达于多种癌症中,因此我们认为它可能是一个肿瘤免疫治疗的潜在靶点。在本课题研究中,我们研究了TIGIT在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者循环血和肿瘤微环境中CD8+T细胞的表达,及其对抗肿瘤免疫应答的调控。并进一步探究了anti-TIGIT+anti-PD-1联合用药对于肿瘤治疗的改善作用,以期为非小细胞肺癌的临床治疗提供一些借鉴性的理论依据。我们发现,NSCLC患者外周血中CD8+T细胞上的TIGIT以及TIGIT和PD-1的共表达水平均高于健康对照。在NSCLC患者的肿瘤中,TIGIT和PD-1均高表达于CD8+T细胞表面。这些结果表明,在NSCLC患者的肿瘤微环境中,TIGIT和PD-1信号通路可能共同通过调节CD8+T细胞来调控T细胞介导的抗肿瘤免疫。进一步研究证实,TIGIT缺陷（基因敲除或anti-TIGIT抗体治疗）可抑制小鼠肺肿瘤的进展。然后,我们利用LLC小鼠模型来研究TIGIT分子产生免疫抑制的机制:TIGIT随着CD8+T细胞向肿瘤浸润或扩增而上调,在第12天达到最高点后下降,并与PD-1共表达;通过对比野生型小鼠和TIGIT基因敲除小鼠的表型,我们发现TIGIT缺陷可显着提高肿瘤浸润的CD8+T细胞的数量和效应功能,并抑制T细胞衰竭的进程。在LLC小鼠肿瘤模型中,anti-TIGIT和anti-PD-1联合治疗相比于单药治疗可更显着地抑制肿瘤生长。我们对比分析发现,anti-TIGIT+anti-PD-1治疗的小鼠中肿瘤抗原特异性CD8+TIL浸润水平增加且具有更强的细胞因子分泌水平,同时显着下调肿瘤微环境中Treg细胞的功能表型。第一部分TIGIT在非小细胞肺癌患者中的表达目的:探究TIGIT在非小细胞肺癌患者外周血和肿瘤微环境中的表达情况,为后续研究奠定基础。方法:采用流式细胞分析术检测NSCLC患者外周血和肿瘤微环境中CD8+T细胞表面免疫检查点分子TIGIT的表达,并进一步明确PD-1在TIGIT+CD8+T细胞上的水平。利用免疫荧光染色确定TIGIT在NSCLC患者中表达的细胞类型。结果:NSCLC患者外周血中CD8+T细胞上的TIGIT以及TIGIT和PD-1的共表达水平均高于健康对照。患者肿瘤组织中,TIGIT高表达于CD8+T细胞表面,并且PD-1高表达于TIGIT+CD8+T细胞。结论:在NSCLC患者体内TIGIT和PD-1在CD8+T细胞上共同高表达,预示着TIGIT和PD-1信号通路可能共同调节CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫。第二部分TIGIT抑制肺肿瘤免疫反应的机制研究目的:旨在探究TIGIT对肺肿瘤进展的影响,以及TIGIT通过调控CD8+T细胞功能进而影响肿瘤免疫的机制。方法:在TIGIT敲除小鼠和野生型小鼠上分别建立LLC皮下移植肺肿瘤模型,确定TIGIT在小鼠抗肿瘤免疫中的作用。采用流式分析术和免疫荧光染色确定TIGIT分子在肿瘤微环境中表达的细胞类型。同时在LLC小鼠模型中确定PD-1+TIGITCD8+T细胞的作用,以及TIGIT对CD8+T细胞功能的影响。结果:TIGIT缺失或阻断TIGIT对小鼠肺肿瘤生长具有抑制作用。进一步的流式分析表明PD-1+TIGIT-CD8+T细胞是肿瘤微环境中主要的活化细胞毒性淋巴细胞群。阻断TIGIT信号通路可以增强CD8+T细胞的活性。结论:TIGIT可能促进活化的CD8+T细胞向衰竭型T细胞转变,从而抑制肿瘤内CD8+T细胞的增殖和效应功能,使它们不能有效地清除机体内的肿瘤细胞,造成肿瘤进展。第三部分anti-TIGIT与anti-PD-1联合治疗的抑癌效果目的:探讨anti-TIGIT与anti-PD-1联合治疗对肺肿瘤的治疗效果,为肿瘤的抗体药物治疗提供新的思路。方法:在小鼠上建立LLC皮下移植肿瘤模型,然后分别用对照抗体,anti-PD-1,anti-TIGIT和anti-PD-1+anti-TIGIT治疗小鼠,观察肿瘤生长情况。采用流式细胞分析术检测LLC肿瘤模型中肿瘤微环境中浸润的CD8+T和调节性T细胞比例,并进一步探讨不同治疗组CD8+T细胞的功能差异和调节性T细胞的表型改变。结果:anti-TIGIT或anti-PD-1的单一用药可以显着抑制小鼠肺肿瘤生长,而anti-TIGIT和anti-PD-1联合治疗的作用较单一治疗更加明显。并且,anti-TIGIT与anti-PD-1联合治疗可以有效促进肿瘤组织中CD8+T细胞浸润,并且增加CD8+T细胞IFN-γ的分泌。另外,anti-TIGIT与anti-PD-1联合治疗可以降低调节性T细胞表面TIGIT的表达。结论:在LLC小鼠肿瘤模型中,anti-TIGIT和anti-PD-1联合治疗相比于单药治疗可更显着地抑制肿瘤生长。anti-TIGIT和anti-PD-1联合治疗可进一步提高CD8+T细胞的肿瘤浸润和效应功能,并且潜在抑制调节性T细胞的功能。因此,在临床应用中,anti-TIGIT和anti-PD-1联合用药有望进一步改善目前anti-PD-1免疫治疗的疗效。
薛宁[10]（2020）在《灸治乳腺癌：从减轻化疗毒副作用到抑制瘤体生长的探索》文中指出目的:艾灸治疗肿瘤,是当代针灸临床的新课题。如何运用艾灸治疗肿瘤,以往实践多关注于肿瘤放化疗后的毒副作用,对于肿瘤瘤体影响鲜少关注。本研究将以乳腺癌为例,以临床观察艾灸对乳腺癌患者化疗后骨髓抑制、胃肠道等毒副作用为起点,通过设计实验研究艾灸对乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤瘤体生长抑制的影响,并从肿瘤微环境和免疫调节角度探讨艾灸抑制瘤体生长的免疫调节机制,旨在进一步探索“灸治肿瘤”理论与实践提供新的思路和解决方法。方法:临床研究:将符合入组条件的乳腺癌化疗患者随机分为对照组和观察组,每组30例。两组化疗患者均采用化疗周方案,对照组每次化疗前30 min使用注射用盐酸格拉司琼（3 mg+0.9%氯化钠注射液）,静脉滴注;治疗组在对照组基础上化疗当日即配合使用麦粒灸,每次取6 mg艾绒搓为麦粒大小艾柱在患者双侧足三里、及气海、关元穴施灸,每穴9壮,每日1次,连续7天。观察化疗第1、3、7天,两组患者胃肠道反应程度（恶心、呕吐）及骨髓抑制情况（白细胞、血小板和血红蛋白含量）。动物实验研究:将30只BALB/c小鼠按1:4随机分为正常组（6只）和模型组（24只）。将24只雌性BALB/C小鼠接种4T1乳腺癌细胞建立荷瘤模型;造模成功后,模型组随机分为模型对照组、紫杉醇干预组、艾灸干预组和紫杉醇+艾灸干预组,每组6只。模型对照组:自肿瘤细胞接种次日起,不予任何治疗及干预;紫杉醇干预组:当肿瘤长至100-200 mm3后,尾静脉注射cy7紫杉醇0.1 mL（1 mg/mL）;艾灸干预组:将艾绒搓成麦粒大小（约6mg）置于穴位上小鼠双侧足三里穴位处,线香点燃待艾绒烧尽后将直接按灭于施灸处,每穴3壮,每日1次,连续2周;紫杉醇+艾灸干预组:当肿瘤长至100-200 mm3后,尾静脉注射cy7紫杉醇0.1mL（1 mg/mL）后,同时进行艾灸干预。观察2周内小鼠体质量与瘤体体积变化及2周时各组瘤体质量,计算抑瘤率、脾脏指数、胸腺指数,并进行瘤体组织病理形态学观察。血液分析仪测定全血白细胞计数及其分类的分布,ELISA法检测血清中IL-2、IFN-γ、IL-10和TGF-β1的表达,采用免疫组化、Western blot和qPCR检测肿瘤组织中CD-34、HIF-1α、VEGFA、PD-1和PD-L1的表达。结果:1、临床研究中,化疗第3、7天,治疗组患者恶心和呕吐症状与化疗后第1天相比得到明显改善（P<0.05）;与化疗前1天相比,化疗后第1天两组患者的白细胞含量显着性下降（P<0.05）,表明化疗药物会导致患者白细胞数目的下降;治疗组中化疗第3、7天白细胞含量明显高于同期对照组（P<0.05）。两组患者血红蛋白和血小板比较,差异无统计学意义（P>0.05）。2、动物实验研究中,与紫杉醇组相比,艾灸+紫杉醇组小鼠的体重下降趋势明显减缓（P<0.05）;第14天艾灸组出现肿瘤细胞坏死、瘤体生长变缓;与肿瘤模型组小鼠相比,艾灸干预组组小鼠外周血中脏器指数和白细胞总数显着提高（P<0.05）;与紫杉醇组相比,艾灸+紫杉醇组小鼠外周血中脏器指数和白细胞总数显着提高（P<0.05）;与普通对照组相比,肿瘤模型组中IL-2、IFN-γ水平显着降低（P<0.05）,IL-10、TGF-β1水平显着升高（P<0.05）;与模型对照组相比,艾灸干预组中IL-2、IFN-γ水平升高（P<0.05）,IL-10、TGF-β1水平降低（P<0.05）。与模型对照组相比,艾灸组肿瘤组织中CD34、HIF-1α、VEGFA和PD-1、PD-L1蛋白及mRNA的表达降低（P<0.05）。结论:1.临床和动物实验表明,艾灸能够不同程度减轻乳腺癌化疗的毒副作用;且艾灸具有系统性调整的特点。2.动物实验表明,14天艾灸治疗可以出现肿瘤细胞坏死、瘤体生长变缓,呈现抑制瘤体生长的现象。3.艾灸通过增强小鼠免疫功能和调节细胞因子的表达,从而抑制肿瘤细胞生长。4.艾灸抑制肿瘤细胞生长,还可能与抑制肿瘤细胞免疫逃逸有关。
二、艾灸血清对肿瘤浸润淋巴细胞增殖和表型的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、艾灸血清对肿瘤浸润淋巴细胞增殖和表型的影响（论文提纲范文）
（1）基于肿瘤细胞外泌体调控TAM细胞极化探讨双参颗粒抑制肺癌的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 肺癌微环境中外泌体的生物学功能及其临床应用 |
| 1 研究背景 |
| 2 外泌体的形成和特征 |
| 3 外泌体的释放 |
| 4 肺癌微环境中外泌体的功能 |
| 5 外泌体在化疗耐药与靶向治疗耐药中的作用 |
| 6 外泌体在临床诊断和治疗中的应用 |
| 7 肿瘤微环境中外泌体可以作为肺癌的预测指标 |
| 8 讨论 |
| 参考文献 |
| 附表1 外泌体肺癌微环境不同细胞之间的调控 |
| 附表2 外泌体在治疗、诊断与预后中的相关研究 |
| 综述二 中医药调控肿瘤微环境防治肺癌研究进展 |
| 1 肿瘤免疫微环境 |
| 2 中医药对肿瘤相关巨噬细胞极化与功能的调控 |
| 3 中医药对髓源性抑制细胞的调节 |
| 4 中医药对T、B淋巴细胞、NK细胞及免疫靶点的调控 |
| 5 中医药对调节性T细胞的调控 |
| 6 中医药重塑上皮间质转化 |
| 7 中医药对血管生成的作用 |
| 8 中医药对肿瘤相关成纤维细胞的调控 |
| 9 中医药对肿瘤相关树突状细胞的作用 |
| 10 中医药对肿瘤微环境炎症因子的调控 |
| 11 中医药对微环境中外泌体及非编码RNA表达的作用 |
| 12 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 双参颗粒抑制荷Lewis肺癌小鼠移植瘤的药效学实验 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 双参颗粒对荷Lewis肺癌小鼠肿瘤相关巨噬细胞表型的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 双参颗粒干预荷M1型巨噬细胞与Lewis肺癌细胞混合移植瘤小鼠模型的实验研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验四 双参颗粒对小鼠TAM细胞功能因子、记忆T细胞、Treg细胞的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验五 MIF基因过表达与MIF基因干扰稳定转染Lewis细胞株的构建 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验六 双参颗粒含药血清对MIF~(+/+)Lewis及shMIF-Lewis细胞中MIF蛋白表达的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验七 双参颗粒含药血清对Lewis来源外泌体及外泌体中MicroRNA-34a的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验八 双参颗粒含药血清干预MIF~(+/+)Lewis细胞来源外泌体对巨噬细胞表型及KLF4的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附件 |
（2）丹参联合三氧化二砷瘀毒同治调控糖酵解逆转巨噬细胞极化的抗肝癌机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 肿瘤瘀毒病因病机理论研究 |
| 一、肿瘤瘀毒病因病机理论的源流研究 |
| (一) 以瘀作为肿瘤发生发展的核心 |
| 1. 瘀的定义 |
| 2. 瘀成为肿瘤发生发展核心要素的原因 |
| 3. 以瘀作为肿瘤核心病机取得的临床效果和局限性 |
| (二) 以毒作为肿瘤发生发展的核心 |
| 1. 毒的定义 |
| 2. 毒成为肿瘤发生发展核心要素的原因 |
| 3. 以毒作为肿瘤核心病机取得的临床效果和局限性 |
| (三) 瘀毒理论的出现及其出现原因 |
| 1. 瘀毒出现的时间 |
| 2. 瘀毒出现的原因 |
| (四) 当代肿瘤瘀毒理论代表性学者和医家观点 |
| 1. 以周仲瑛、程海波为代表的瘀毒理论 |
| 2. 以张光霁为代表的瘀毒理论 |
| 3. 以郑伟达为代表的瘀毒理论 |
| 4. 以王行宽为代表的瘀毒理论 |
| (五) 总结 |
| 二、瘀毒理论衍生的的治则治法研究 |
| (一) 瘀的治疗原则 |
| (二) 瘀的代表性治疗方法 |
| 1. 活血化瘀 |
| 2. 破血逐瘀 |
| (三) 毒的治疗原则 |
| (四) 毒的代表性治疗方法 |
| 1. 清热解毒 |
| 2. 以毒攻毒 |
| (五) 瘀毒的治疗原则 |
| (六) 瘀毒的代表性治疗方法 |
| 1. 活血化瘀联合清热解毒 |
| 2. 活血化瘀联合以毒攻毒 |
| 3. 破血逐瘀联合清热解毒 |
| 4. 破血逐瘀联合以毒攻毒 |
| (七) 总结 |
| 三、活血化瘀和以毒攻毒治法下的用药研究 |
| (一) 活血化瘀治法下代表性的药物 |
| 1. 丹参 |
| 2. 当归 |
| 3. 赤芍 |
| (二) 以毒攻毒治法下的代表性药物 |
| 1. 以山慈菇为代表的草药类攻毒药 |
| 2. 以斑蝥为代表的动物昆虫类药物 |
| 3. 以雄黄为代表的金石类药物 |
| (三) 丹参联合三氧化二砷瘀毒同治科学性及合理性分析 |
| (四) 以隐丹参酮为代表的中药提取物是否能够代表传统中药的若干问题 |
| (五)总结 |
| 四、瘀毒理论与肝癌 |
| 1. 瘀的形成是肝癌发生的前提 |
| 2. 因瘀致毒,因毒致变是肝癌进展的关键因素 |
| 3. 瘀毒互结是肝癌的核心病因病机 |
| 4. 肝癌巨噬细胞是瘀毒互结的效应靶标 |
| 第二部分 基于瘀毒病因病机理论的实验研究 |
| 一、基于瘀毒理论的丹参联合三氧化二砷药效学研究 |
| (一) 实验材料 |
| 1. 实验药品 |
| 2. 实验细胞系 |
| 3. 实验动物 |
| 4. 实验仪器 |
| 5. 实验试剂及耗材 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 丹参有效成分的提取 |
| 2. 丹参有效成分的溶解 |
| 3. 细胞培养 |
| 4. 细胞增殖抑制实验 |
| 5. 小鼠Hep1-6原位癌模型的建立 |
| 6. 小鼠H22皮下移植瘤模型的建立 |
| 7. 动物分组及给药 |
| 8. 基础指标检测及分析 |
| 9. 病理组织化学染色 |
| 10. 统计学分析 |
| (三) 实验结果 |
| 1. 隐丹参酮是丹参提取物中理想的候选有效成分 |
| 2. 隐丹参酮联合三氧化二砷对肝癌细胞的体外抑制作用 |
| 3. 隐丹参酮联合三氧化二砷对小鼠H22移植瘤的生长抑制作用 |
| 4. 隐丹参酮联合三氧化二砷对小鼠H22移植瘤的增殖抑制作用 |
| (四) 分析与讨论 |
| 二、隐丹参酮联合三氧化二砷逆转巨噬细胞表型转化研究 |
| (一) 实验材料 |
| 1. 实验药品 |
| 2. 实验细胞 |
| 3. 实验仪器 |
| 4. 实验试剂及耗材 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 小鼠血常规及血生化检测 |
| 2. 肿瘤组织中巨噬细胞的分型检测 |
| 3. 原代巨噬细胞的提取 |
| 4. 原代巨噬细胞的鉴定和分型检测 |
| 5. 原代巨噬细胞刺激实验 |
| 6. 原代巨噬细胞的吞噬能力检测 |
| 7. 原代巨噬细胞特征性分泌因子的检测 |
| 8. 统计学分析 |
| (三) 实验结果 |
| 1. 隐丹参酮联合三氧化二砷改善荷瘤小鼠血象并影响单核巨噬细胞 |
| 2. 隐丹参酮联合三氧化二砷改变小鼠肿瘤组织中巨噬细胞的分型 |
| 3. 隐丹参酮联合三氧化二砷体外促进巨噬细胞伪足形成 |
| 4. 隐丹参酮联合三氧化二砷体外增强巨噬细胞的吞噬能力 |
| 5. 隐丹参酮联合三氧化二砷体外促进原代巨噬细胞的激活和M1型活化 |
| (四) 分析与讨论 |
| 三、隐丹参酮联合三氧化二砷通过糖酵解途径调控巨噬细胞的抗肝癌机制研究 |
| (一) 实验材料 |
| 1. 实验药物 |
| 2. 实验仪器 |
| 3. 试剂及耗材 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 细胞糖酵解代谢产物及关键代谢酶的检测 |
| 2. 细胞转录组测序及分析 |
| 3. 糖酵解关键信号通路蛋白和基因检测 |
| 4. 肿瘤细胞和巨噬细胞的葡萄糖竞争实验 |
| 5. 统计学分析 |
| (三) 实验结果 |
| 1. 隐丹参酮联合三氧化二砷体内调节荷瘤鼠糖酵解水平 |
| 2. 隐丹参酮联合三氧化二砷体外促进原代巨噬细胞的糖酵解水平 |
| 3. 隐丹参酮联合三氧化二砷体外抑制H22肝癌细胞的糖酵解水平 |
| 4. 隐丹参酮联合三氧化二砷通过AMPK信号通路促进巨噬细胞糖酵解 |
| 5. 隐丹参酮联合三氧化二砷通过抑制HIF-1α通路抑制H22肝癌细胞糖酵解 |
| 6. 隐丹参酮联合三氧化二砷通过HIF-1α和AMPK信号通路综合调节糖酵解发挥抗肿瘤作用 |
| (四) 分析与讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 文献综述 肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤中的作用及中医药调控研究发展 |
| 1. TAMs的起源和分化 |
| 2. TAMs的类型 |
| 3. TAMs的极化 |
| 4. TAMs调控肿瘤进展 |
| 5. TAMs作为肿瘤治疗的靶点 |
| 6. 中医药对巨噬细胞的影响 |
| 7. 总结 |
| 参考文献 |
（3）电针足三里激活迷走神经调控乳腺癌小鼠炎性水平和抗肿瘤免疫功能的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 电针足三里对乳腺癌模型小鼠肿瘤生长的作用 |
| 一、材料与方法 |
| 1. 实验动物与细胞 |
| 2. 主要实验试剂与仪器 |
| 3. 实验方法 |
| 二、实验结果 |
| 1. 电针足三里对乳腺癌模型小鼠肿瘤生长的作用 |
| 2. 电针足三里对乳腺癌模型小鼠脾脏的作用 |
| 三、小结 |
| 第二部分 电针足三里对乳腺癌模型小鼠的抗炎作用 |
| 一、材料与方法 |
| 1. 实验动物与细胞 |
| 2. 主要实验试剂与仪器 |
| 3. 实验方法 |
| 二、实验结果 |
| 1. 电针足三里对乳腺癌模型小鼠系统性抗炎作用 |
| 2. 电针足三里对乳腺癌模型小鼠肿瘤局部抗炎作用 |
| 三、小结 |
| 第三部分 电针足三里对乳腺癌模型小鼠抗肿瘤免疫细胞的作用 |
| 一、材料与方法 |
| 1. 实验动物与细胞 |
| 2. 主要实验试剂与仪器 |
| 3. 实验方法 |
| 二、实验结果 |
| 1. 电针足三里对乳腺癌模型小鼠外周血内抗肿瘤免疫细胞的作用 |
| 2. 电针足三里对乳腺癌模型小鼠脾脏内抗肿瘤免疫细胞的作用 |
| 3. 电针足三里对乳腺癌模型小鼠肿瘤局部组织内抗肿瘤免疫细胞的作用 |
| 4. 电针足三里对乳腺癌模型小鼠抗肿瘤免疫细胞杀伤功能相关蛋白的作用 |
| 三、小结 |
| 第四部分 电针足三里对乳腺癌模型小鼠免疫抑制细胞的作用 |
| 一、材料与方法 |
| 1. 实验动物与细胞 |
| 2. 主要实验试剂与仪器 |
| 3. 实验方法 |
| 二、实验结果 |
| 1. 电针足三里对乳腺癌模型小鼠外周血内MDSC的作用 |
| 2. 电针足三里对乳腺癌模型小鼠脾脏MDSC的作用 |
| 3. 电针足三里对乳腺癌模型小鼠肿瘤局部组织内MDSC的作用 |
| 4. 电针足三里对乳腺癌模型小鼠MDSC免疫抑制功能相关蛋白的作用 |
| 5. 电针足三里对乳腺癌模型小鼠MDSC免疫抑制功能的作用 |
| 三、小结 |
| 第五部分 迷走神经介导电针足三里调节抗炎-免疫减缓乳腺癌进展 |
| 实验一 电针足三里对乳腺癌模型小鼠迷走传出神经的作用 |
| 一、材料与方法 |
| 1. 实验动物与细胞 |
| 2. 主要实验试剂与仪器 |
| 3. 实验方法 |
| 二、实验结果 |
| 1. 电针足三里对乳腺癌模型小鼠脑干DMV区ChAT阳性神经元的作用 |
| 2. 电针足三里对乳腺癌模型小鼠血浆和肿瘤局部组织内ACh的作用 |
| 实验二 激活α7nAChR对乳腺癌模型小鼠的抗炎-免疫调控作用 |
| 一、材料与方法 |
| 1. 实验动物与细胞 |
| 2. 主要实验试剂与仪器 |
| 3. 实验方法 |
| 二、实验结果 |
| 1. 激活α7nAchR对乳腺癌模型小鼠肿瘤生长的作用 |
| 2. 激活α7nAchR对乳腺癌模型小鼠的抗炎作用 |
| 3. 激活α7nAchR对乳腺癌模型小鼠免疫功能的作用 |
| 实验三膈下迷走神经切断验证电针足三里对乳腺癌模型小鼠的调控作用 |
| 一、材料与方法 |
| 1. 实验动物与细胞 |
| 2. 主要实验试剂与仪器 |
| 3. 实验方法 |
| 二、实验结果 |
| 1. 膈下迷走神经对电针减缓乳腺癌模型小鼠肿瘤生长作用的影响 |
| 2. 膈下迷走神经对电针减轻乳腺癌模型小鼠脾肿大作用的影响 |
| 3. 膈下迷走神经对电针增强乳腺癌模型小鼠抗肿瘤免疫功能作用的影响 |
| 小结 |
| 分析与讨论 |
| 一、对乳腺癌模型小鼠足三里行电针干预的依据及方式 |
| 1. 理论依据 |
| 2. 电针干预方式 |
| 3. 电针干预时程 |
| 二、电针足三里对乳腺癌模型小鼠的抗炎作用 |
| 三、电针足三里对乳腺癌模型小鼠免疫功能的调节 |
| 1. 对抗肿瘤免疫细胞CD8+T细胞和NK细胞的调节 |
| 2. 对免疫抑制细胞MDSC的调节 |
| 3. 体外实验验证电针足三里对乳腺癌模型小鼠MDSC的抑制作用 |
| 四、电针足三里调控乳腺癌模型小鼠炎性水平与免疫功能的相关性 |
| 五、电针足三里对乳腺癌模型小鼠抗炎-免疫调控作用的机制 |
| 1. 迷走传出神经介导电针足三里对乳腺癌模型小鼠的抗炎-免疫调控 |
| 2. 迷走神经与胂瘤进展的相关性 |
| 全文总结及展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 文献综述 针灸通过迷走神经调控免疫炎性反应的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
（4）基于转录组数据挖掘分析免疫标志物与恶性黑色素瘤转移机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 恶性黑色素瘤的流行病学特点及治疗现状 |
| 1.1.2 恶性黑色素瘤分子缺陷的研究进展 |
| 1.1.3 恶性黑色素瘤生物标志物的研究进展 |
| 1.1.4 肿瘤微环境的研究进展 |
| 1.2 研究目的 |
| 1.3 研究内容 |
| 1.4 研究方法 |
| 1.4.1 生物信息学方法 |
| 1.4.2 计算结果的独立数据集验证 |
| 1.4.3 分子生物学实验功能验证 |
| 1.5 技术路线图 |
| 参考文献 |
| 第二章 恶性黑色素瘤Bulk转录组测序数据分析 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.1.1 生物信息学与肿瘤治疗研究 |
| 2.1.2 技术路线图 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 数据来源和分类 |
| 2.2.2 数据预处理和数据质量标准化 |
| 2.2.3 差异基因分析 |
| 2.2.4 基因标志物的Cox风险比例回归分析 |
| 2.2.5 构建基因标志物预后风险模型 |
| 2.2.6 基因标志物通路和功能分析 |
| 2.2.7 反卷积网络重构恶性黑色素瘤的免疫微环境 |
| 2.2.8 预后基因标志物与肿瘤免疫浸润细胞的相关性分析 |
| 2.2.9 恶性黑色素瘤中突变基因分布统计 |
| 2.2.10 肿瘤突变负荷分数的计算和预后分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 患者人口统计学和临床因素 |
| 2.3.2 差异基因与免疫相关基因的识别 |
| 2.3.3 建立免疫相关基因的风险模型 |
| 2.3.4 评估预后模型的预测效果 |
| 2.3.5 基因本体分析与KEGG通路分析 |
| 2.3.6 原发和转移病例样本中肿瘤浸润免疫细胞的差异 |
| 2.3.7 基因标志物与肿瘤免疫微环境的相关性分析 |
| 2.3.8 GEO队列独立数据集验证模型的预后 |
| 2.3.9 GEO队列中恶性黑色素瘤验证集的免疫分析 |
| 2.3.10 评估低危和高危人群之间的免疫情况 |
| 2.3.11 评估基于CD274/PDCD1 转移亚组肿瘤微环境的差异 |
| 2.3.12 MM中的突变图谱 |
| 2.3.13 TMB对恶性黑色素瘤预后的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 恶性黑色素瘤单细胞转录组测序数据验证 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 数据来源 |
| 3.2.2 关键软件及数据库资源 |
| 3.2.3 质控:细胞的选择和过滤 |
| 3.2.4 数据标准化 |
| 3.2.5 识别高变异基因 |
| 3.2.6 中心化(Scaling)分析 |
| 3.2.7 主成分(PCA)分析 |
| 3.2.8 非线性降维(t-SNE) |
| 3.2.9 寻找差异表达的特征(聚类生物标志物) |
| 3.2.10 注释cluster中细胞类型 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 质控和细胞群分类 |
| 3.3.2 数据标准化 |
| 3.3.3 质控和细胞群分类 |
| 3.3.4 PCA降维并提取主成分分析 |
| 3.3.5 T-SNE聚类分析和marker基因 |
| 3.3.6 寻找差异表达的特征 |
| 3.3.7 细胞类型鉴定 |
| 3.3.8 基因标志物与肿瘤浸润免疫细胞的相关性 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 HPA数据库基因标志物的免疫组化分析 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.1.1 人类蛋白质图谱网站数据对基因标志物的验证 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 数据来源与下载 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 蛋白SLPI的免疫组化特征 |
| 4.3.2 蛋白LYZ的免疫组化特征 |
| 4.3.3 蛋白CD79A的免疫组化特征 |
| 4.3.4 蛋白CCL19 的免疫组化特征 |
| 4.3.5 蛋白S100A7 的免疫组化特征 |
| 4.3.6 蛋白CXCR4 对泛癌的预后的meta分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 CXCR4促进 A375细胞的侵袭和转移的实验研究 |
| 5.1 研究背景 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 实验试剂与实验仪器 |
| 5.2.2 仪器和设备 |
| 5.2.3 细胞株选择 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 细胞培养 |
| 5.3.2 Cas9敲除实验 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 构建CXCR4 敲除细胞系模型 |
| 5.4.2 实时荧光定量PCR检测A375细胞CXCR4 mRNA表达 |
| 5.4.3 CXCR4 能够促进A375 细胞克隆集落形成 |
| 5.4.4 CXCR4对A375细胞划痕实验的影响 |
| 5.4.5 CXCR4增强A375细胞转移和侵袭能力 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 结论 |
| 参考文献 |
| 第六章 结论与展望 |
| 附录一 CIBERSORTx计算结果(TCGA) |
| 附录二 CIBERSORTx计算结果(GSE19234,GSE53118) |
| 附录三 28 个差异基因的筛选结果 |
| 附录四 相关性分析结果(Primary Samples) |
| 附录五 相关性分析结果(Metastasis Samples) |
| 附录六 相关性分析结果(GSE19234) |
| 附录七 相关性分析结果(GSE72056) |
| 附录八 缩略语表(Abbreviation) |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（5）CXCL13趋化型CAR-T细胞对骨肉瘤治疗及其机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 研究背景及文献综述 |
| 1.骨肉瘤及其治疗现状 |
| 1.1 骨肉瘤的危害 |
| 1.2 骨肉瘤的免疫微环境 |
| 1.3 骨肉瘤的免疫治疗概况 |
| 2.NK G2D配体在骨肉瘤中的表达 |
| 3.趋化因子CXCL13与CXCR5 在肿瘤中的作用 |
| 4.肿瘤微环境 |
| 4.1 肿瘤浸润的MDSCs细胞 |
| 4.2 肿瘤浸润的巨噬细胞 |
| 4.3 肿瘤浸润的Tregs细胞 |
| 5.嵌合抗原受体T细胞免疫疗法及其研究进展 |
| 5.1 CAR-T概述 |
| 5.2 嵌合抗原受体的结构 |
| 5.3 CAR-T细胞治疗研究进展 |
| 6.NFAT信号通路及其作用机制 |
| 第二章 CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞治疗骨肉瘤的研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 CXCL13 与骨肉瘤的关系 |
| 2.3 Mock-CAR、NKG2D-CAR、CXCR5-NKG2D-CAR的构建和T细胞的感染 |
| 2.4 CAR-T细胞的制备 |
| 2.5 CAR-T细胞体外活性研究 |
| 2.6 CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞机制研究 |
| 2.7 CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞治疗骨肉瘤体内研究 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 CXCL13 的表达量与骨肉瘤病人免疫和生存期的关系 |
| 3.2 Mock、NKG2D、CXCR5-NKG2D CAR表达载体、病毒包装和T细胞的感染 |
| 3.3 Mock-CAR-T、NKG2D-CAR-T和 CXCR5-NKG2D-CAR-T体外活性 |
| 3.4 CXCR5增强NKG2D-CAR-T细胞活性的机制研究 |
| 3.5 CXCR5 增强了NKG2D-CAR-T的体内抗肿瘤活性 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第三章 mCXCR5-NKG2D-CAR-T对骨肉瘤肿瘤免疫微环境的影响 |
| 1.引言 |
| 2.实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞的体外活性研究 |
| 2.4 CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞对BALB/c骨肉瘤小鼠的治疗 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 鼠源CAR-T细胞和鼠源靶细胞的制备 |
| 3.2 mCXCR5-NKG2D-CAR-T细胞体外活性检测 |
| 3.3 mCXCR5-NKG2D-CAR-T细胞的体内活性检测 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 参考文献 |
| 简历 |
| 已发表文章 |
| 发表专利 |
| 获得奖励 |
| 致谢 |
| 附件一 RNA测序后定量PCR引物序列 |
（6）华蟾素注射液治疗结肠癌腹水的优效人群分析及对VM的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 恶性腹水的中西医研究进展 |
| 1. 恶性腹水的西医研究进展 |
| 1.1 恶性腹水的形成机制 |
| 1.2 恶性腹水的西医诊断 |
| 1.3 恶性腹水的西医治疗 |
| 2. 恶性腹水的中医研究进展 |
| 2.1 恶性腹水的中医病因病机 |
| 2.2 恶性腹水的中医辨证 |
| 2.3 恶性腹水的中医治疗 |
| 3. 结语 |
| 参考文献 |
| 综述二 血管生成拟态(VM)在结肠癌中的研究进展 |
| 1. 结肠癌VM的发现及生物学特性 |
| 2. VM的形成机制 |
| 2.1 肿瘤缺氧微环境与VM |
| 2.2 肿瘤干细胞与VM |
| 2.3 上皮间质转化与VM |
| 2.4 促血管生成相关因子与VM |
| 2.5 VM形成相关信号通路 |
| 3. VM与结肠癌不良预后的相关性 |
| 4. VM与结肠癌的治疗 |
| 5. 结语 |
| 参考文献 |
| 综述三 华蟾素注射液干预肿瘤血管生成作用的研究进展 |
| 1. 肿瘤血管生成的病理机制 |
| 2. 华蟾素注射液的主要化学成分及其抗肿瘤作用 |
| 3. 华蟾素注射液干预肿瘤血管生成的机制 |
| 3.1 VEGF/VEGFR通路抑制作用 |
| 3.2 MMPs/TIMPs通路抑制作用 |
| 3.3 肿瘤血管内皮细胞诱导凋亡作用 |
| 3.4 其他潜在靶点 |
| 4. 结语 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 临床研究 华蟾素注射液腹腔灌注治疗结肠癌恶性腹水的疗效评价及优效人群分析 |
| 1. 资料与方法 |
| 1.1 研究方法 |
| 1.2 研究对象 |
| 1.3 病例筛选方法 |
| 1.4 治疗方法 |
| 1.5 提取指标 |
| 1.6 疗效评价 |
| 1.7 安全性评价 |
| 1.8 统计方法 |
| 1.9 技术路线图 |
| 2. 研究结果 |
| 2.1 总体资料分析 |
| 2.2 疗效评价 |
| 2.3 安全性评价 |
| 2.4 优效人群特征筛选 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 结肠癌恶性腹水的治疗现状 |
| 3.2 优效人群研究的必要性 |
| 3.3 华蟾素注射液治疗结肠癌恶性腹水的潜在机制 |
| 参考文献 |
| 第三部分 实验研究 基于血管生成拟态(VM)研究华蟾素注射液抑制结肠癌血性腹水的机制 |
| 实验一: 华蟾素注射液抑制裸鼠结肠癌血性腹水生成的研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验二: 华蟾素注射液体外抑制结肠癌细胞增殖、迁移、侵袭的研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验三: 华蟾素注射液体内、体外抑制结肠癌细胞VM形成的研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验四: 华蟾素注射液抑制结肠癌VM形成的机制研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 1. 研究结论 |
| 2. 研究创新性 |
| 3. 不足与展望 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）NLRP3炎症小体及γδT17/MDSCs在淋巴瘤免疫稳态失衡中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 NLRP3炎症小体介导的免疫抑制在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的作用和机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 γδT17和MDSCs在胃MALT淋巴瘤微环境免疫稳态失衡中的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 第三部分 文献综述 炎症、肿瘤和免疫: 微环境中的密切交流 |
| 一、肿瘤中炎症的类型 |
| 二、炎症与肿瘤的发生发展 |
| 三、炎症反应的关键信号通路与肿瘤 |
| 四、炎症和肿瘤免疫 |
| 五、靶向炎症反应和肿瘤治疗 |
| 六、总结和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论着 |
（8）BUD31和LAMP3在肿瘤基因剪接和免疫调控的作用（论文提纲范文）
| 第一部分 BUD31在肿瘤基因剪接机制研究 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 在肿瘤免疫调控中的机制研究 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 文献综述 肿瘤免疫治疗的发展和现状 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（9）非小细胞肺癌中TIGIT在CD8+T细胞的表达及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 TIGIT在非小细胞肺癌患者CD8+T 细胞上的表达 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第二部分 TIGIT抑制肺肿瘤免疫反应的机制研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第三部分 anti-TIGIT与 anti-PD-1 联合治疗的抑癌效果 |
| 一、材料方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述一 TIGIT在肿瘤中的作用及研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 非小细胞肺癌治疗的策略和展望 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文及参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（10）灸治乳腺癌：从减轻化疗毒副作用到抑制瘤体生长的探索（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一章 理论研究 |
| 1. 乳腺癌发病及研究进展 |
| 1.1 国内外流行病学研究 |
| 1.2 发病机制研究 |
| 1.3 分型分类研究 |
| 2. 乳腺癌患者治疗及其毒副作用 |
| 2.1 乳腺癌治疗方法 |
| 2.2 治疗后毒副反应及干预 |
| 3. 灸治肿瘤 |
| 3.1 艾灸减轻化疗后毒副作用 |
| 3.2 艾灸对肿瘤免疫影响的研究 |
| 3.3 艾灸通过调节基因调控、蛋白表达发挥抗肿瘤作用 |
| 3.4 艾灸调节其它因素发挥抗肿瘤作用 |
| 4. 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 艾灸降低乳腺癌化疗所致毒副反应的临床疗效观察 |
| 1. 临床实验资料 |
| 1.1 病例资料 |
| 1.2 诊断标准 |
| 1.3 纳排标准 |
| 1.4 观察指标 |
| 1.5 医学伦理原则与质量控制 |
| 1.6 安全性评价 |
| 1.7 治疗方案 |
| 1.8 统计学方法 |
| 2. 研究结果 |
| 2.1 两组乳腺癌患者基线资料对比 |
| 2.2 两组乳腺癌患者白细胞计数比较 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 艾灸对乳腺癌化疗毒副反应的影响 |
| 3.2 初步结论 |
| 3.3 存在的不足与展望 |
| 参考文献 |
| 第三章 基础实验研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂与仪器 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 试剂配置 |
| 2 方法 |
| 2.1 造模、分组与处理 |
| 2.2 小鼠体质量与肿瘤体积、质量的测定 |
| 2.3 组织病理形态学观察 |
| 2.4 脏器指数测定 |
| 2.5 外周血白细胞及其分类计数检测 |
| 2.6 血清细胞因子检测 |
| 2.7 免疫组化化学技术 |
| 2.8 Western Blot法检测蛋白的表达 |
| 2.9 qPCR检测基因的表达 |
| 2.10 统计学分析 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 不同干预组对乳腺癌小鼠体质量影响 |
| 3.2 不同干预组对乳腺癌小鼠抑瘤效应差异的比较 |
| 3.3 不同干预组对乳腺癌小鼠肿瘤组织形态的影响 |
| 3.4 不同干预组对乳腺癌小鼠脏器指数的影响 |
| 3.5 不同干预组对小鼠外周血中白细胞及其分类计数的影响 |
| 3.6 不同干预组对乳腺癌小鼠血清细胞因子的影响 |
| 3.7 不同干预组对乳腺癌小鼠微血管及微环境相关蛋白的影响 |
| 3.8 不同干预组对乳腺癌小鼠PD-1和PD-L1表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 艾灸抑制肿瘤生长的效应证据 |
| 4.2 艾灸抑制肿瘤瘤体生长的可能机制 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 1. 研究结果与结论 |
| 1.1 研究结果 |
| 1.2 研究结论 |
| 2 问题与展望 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
四、艾灸血清对肿瘤浸润淋巴细胞增殖和表型的影响（论文参考文献）
- [1]基于肿瘤细胞外泌体调控TAM细胞极化探讨双参颗粒抑制肺癌的作用机制[D]. 亓润智. 中国中医科学院, 2021(02)
- [2]丹参联合三氧化二砷瘀毒同治调控糖酵解逆转巨噬细胞极化的抗肝癌机制研究[D]. 姜涛. 浙江中医药大学, 2021(02)
- [3]电针足三里激活迷走神经调控乳腺癌小鼠炎性水平和抗肿瘤免疫功能的研究[D]. 张知云. 浙江中医药大学, 2021
- [4]基于转录组数据挖掘分析免疫标志物与恶性黑色素瘤转移机制的研究[D]. 原凌燕. 兰州大学, 2021(09)
- [5]CXCL13趋化型CAR-T细胞对骨肉瘤治疗及其机制的研究[D]. 张利. 华东师范大学, 2021(12)
- [6]华蟾素注射液治疗结肠癌腹水的优效人群分析及对VM的作用机制研究[D]. 王一同. 北京中医药大学, 2021(01)
- [7]NLRP3炎症小体及γδT17/MDSCs在淋巴瘤免疫稳态失衡中的作用及机制研究[D]. 赵亚楠. 山东大学, 2021(11)
- [8]BUD31和LAMP3在肿瘤基因剪接和免疫调控的作用[D]. 刘洪金. 北京协和医学院, 2021
- [9]非小细胞肺癌中TIGIT在CD8+T细胞的表达及作用机制研究[D]. 胡峰. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(05)
- [10]灸治乳腺癌：从减轻化疗毒副作用到抑制瘤体生长的探索[D]. 薛宁. 南京中医药大学, 2020(01)
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