一、利用套叠PCR技术改造酵母表达载体pAO815的研究（论文文献综述）
魏子翔[1]（2021）在《疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的理性设计及高效表达研究》文中提出疏棉状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）脂肪酶由于其具有的良好耐温特性,被广泛地应用于饲料、油脂加工和生物柴油等领域。另一方面,应用领域的拓展对脂肪酶的特性和经济性提出了更高的要求。为了使脂肪酶可以更好地应用于相应的领域中,本研究通过理性设计T.lanuginosus脂肪酶,获得到了高酶活与高耐热性的脂肪酶品种,为脂肪酶的应用奠定基础。为了获得具有高酶活和高耐热性的脂肪酶菌株,本研究对T.lanuginosus脂肪酶典型结构域lid和loop区域的系统发育分析,找到并选定合适的突变位点。通过将第91位Gly突变为Ala和将227位的Leu突变为Gly,分别优化了脂肪酶lid区域和loop区域的结构以提高酶活与温度稳定性。构建毕赤酵母Pichia pastoris表达系统并获得了脂肪酶活性和耐高温特性显着提高的脂肪酶重组子PAO815-tll2a,经诱导表达后与野生型T.lanuginosus脂肪酶的酶活比较,酶活力提高了251.8%,同时进行了酶学性质的测定,其突变体脂肪酶TLL2A的高温稳定性显着提升,在80℃下放置12 h后仍保留78.94%的酶活。利用设计后的脂肪酶基因构建多拷贝载体,并用荧光定量PCR测定了P.pastoris脂肪酶基因的拷贝数。优化并完成了在50-L发酵罐中的高密度发酵,并测定了产酶能力,四拷贝脂肪酶TLL2Q在50-L发酵罐中发酵,诱导168 h后其上清液酶活达到29,000 U/m L。通过对脂肪酶TLL的理性设计,成功设计并获得了一种新型的高活性、耐高温的脂肪酶品种TLL2A,并实现了高效表达,为其产业化和工业应用奠定了基础。
成静[2]（2020）在《基因剂量及基因突变对β-半乳糖苷酶表达的影响》文中研究表明β-半乳糖苷酶（EC3.2.1.23）属于糖苷水解酶类,它可以水解乳糖,生成半乳糖与葡萄糖。β-半乳糖苷酶是一类被众多权威机构认定为安全无毒的生物酶制剂,该酶可以广泛应用在医药、食品、环境保护和基因工程等方面。在食品和医药领域,通过水解食物中的乳糖,可使乳糖不耐受症状得到缓解,为人们生活水平的提高起到了极大的帮助作用。为了获得高产β-半乳糖苷酶的菌株方便其在工业中应用,本文人工合成了一个来源于米曲霉（Aspergillus oryzae）的β-半乳糖苷酶基因Aogal,并将其转入毕赤酵母（Pichia pastoris）中进行表达;通过ONPG法测定其活性,表达载体p AO815-Aogal经诱导表达后,菌株中活性最高的是89.16 U/m L;对酶学性质进行测定表明,p AO815-Aogal的最适温度60°C,最适p H 5.0,在30°C、40°C和50°C孵育30 min后,酶活性仍可保留80%以上。为提高Aogal的表达量,本研究在对Aogal的密码子偏好性进行分析后,重新构建了表达载体p AO815-Aogal-1,经密码子偏好性优化后Aogal-1酶活最高为196.76 U/m L,比原基因提高了2倍左右,且在优化后Aogal-1的最适p H和温度均未发生改变。在对密码子偏好性的优化后,又尝试通过搭桥法对Aogal-1进行定点突变以获得更高产量的菌株,但当经过发酵诱导后,目的蛋白虽表达成功,但蛋白表达量未得到明显提升,且酶活低至12.90 U/m L。本研究进一步通过同尾酶法构建了β-半乳糖苷酶Aogal-1的二拷贝和三拷贝表达载体。其中一拷贝表达菌株的平均酶活117.04 U/m L,二拷贝表达菌株的平均酶活210.07 U/m L,比一拷贝菌株提高了44.28%;三拷贝表达菌株的平均酶活403.01U/m L,比一拷贝表达菌株酶活提高70.96%。将二拷贝表达酵母菌株B-3高密度发酵,酶活在诱导24-96 h之间增长迅速,然后渐渐趋于平稳;在诱导72 h后酶活4044.61U/m L,是原摇瓶发酵72 h时的11.02倍;诱导结束后,该菌株发酵酶活达到6335.39U/m L。
陈祺琛[3]（2018）在《基因剂量及基因突变对β-甘露聚糖酶表达的影响》文中提出甘露聚糖酶通过对甘露聚糖类物质的降解,可有效地提高饲料的营养利用率。本研究根据GenBank上黑曲霉（Aspergillu niger）CBS 513.88基因序列,通过毕赤酵母偏好性优化β-甘露聚糖酶基因,人工合成全基因MANsyn,并连接至毕赤酵母表达载体pAO815,构建β-甘露聚糖酶重组表达质粒pAO815-MANsyn,之后成功电转化至毕赤酵母X-33中表达,获得一株酶活最高的菌株,其最适反应温度为70℃,最适pH为5.0,最大酶活能达到450 U/mL。反应体系中加入终浓度为5 mM/L的Mg2+能使该β-甘露聚糖酶的酶活大幅提高126%。随后,本研究成功利用同尾酶法构建了β-甘露聚糖酶二拷贝、三拷贝、四拷贝重组表达质粒,并成功电转化至毕赤酵母中表达,二拷贝的酵母菌株酶活能达到539 U/mL,较单拷贝酵母菌株提高了20%,三拷贝的酵母菌株酶活能达到605U/mL,较单拷贝酵母菌株提高了34%,四拷贝的酵母菌株酶活能达到710 U/mL,较单拷贝酵母菌株提高了58%。本研究进一步设计了β-甘露聚糖酶单点突变基因,并连接至赤酵母表达载体pAO815上,电转至毕赤酵母中表达。结果表明:有一株正向突变,突变位点为Arg208Lys。在37℃条件下酶活较之单拷贝提高了13 U/mL,约5%左右。本研究将四拷贝重组表达菌株摇瓶发酵酶活最高的一株进行14 L水平发酵罐发酵,取发酵96 h时的发酵上清液,稀释10000倍后,在最适温度70℃,最适pH5.0的条件下,测得酶活为10810 U/mL,蛋白含量为4.09 g/L。本研究成功地获得了高产甘露聚糖酶菌株,为该酶的产业化及在饲料业等领域的应用奠定了基础。
彭小波[4]（2018）在《果胶裂解酶在毕赤酵母中高效表达及酶学性质分析》文中提出果胶是一类广泛存在于植物细胞壁中的多糖,对细胞的结构稳定有着重要影响。果胶主链为聚半乳糖醛酸（PGA）,且有不同程度的甲酯化和乙酰化等修饰。果胶对果汁、果酒等饮料的加工、饲料的营养利用以及造纸和麻类脱胶等均有显着影响。果胶裂解酶可有效降解果胶,在食品、饮料、饲料和造纸等方面具有广阔前景。本文将枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）三个果胶裂解酶基因pelA、pelB和pelC分别克隆到毕赤酵母（Pichia pastoris）中,进行诱导表达,并获得了其表达蛋白。试验进一步分析了表达产物的酶学特性;为提高表达量,本研究优化了pelA基因的密码子,并构建了pelAO和pelC的多克隆串联表达盒。本研究的主要内容为:（1）本研究首先克隆了果胶裂解酶pelA基因。结果表明在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21中,在低温16℃诱导后,酶活为285 U/mL;而pelA在酵母中表达量很低,发酵液浓缩约50倍后,酶活仅为250 U/mL。我们将pelA序列参考毕赤酵母密码子偏好性进行了优化,通过合成获得优化基因pelAO。摇瓶发酵表明pelAO的表达量较pelA提高明显,发酵上清酶活达到330 U/mg。本研究进一步构建了pelAO的多拷贝载体。所获得的酵母重组子表达能力分析表明:二拷贝、三拷贝、七拷贝的酶活分别是单拷贝的300%、320%和350%。多拷贝菌株经14 L高密度发酵比活力达到3620 U/mg。酶学性质分析表明,PelA属于内切碱性果胶裂解酶。（2）本研究克隆了果胶酶pelB和pelC,并将pelB和pelC分别在毕赤酵母中表达,研究了其酶学性质。pelB和pelC表达的蛋白分别为38 kDa和45 kDa左右,其最适温度为50℃和60℃,最适pH为9.0和9.6。PelB和PelC酶活分别为3.6 U/mg和1.7 U/mg,明显低于PelA的活性。三维结构模拟表明:PelB酶活低可能是因为其活性中心裂缝太浅;PelC活性低可能是高度的糖基化影响到了活性。本研究克隆了枯草芽孢杆菌的果胶酶基因pelA、pelB和pelC,并成功地实现了其在毕赤酵母中的高效表达。尽管PelB和PelC的比活力很低,但PelA高比活力、高效的表达为该酶的规模化应用奠定了基础。
张向领[5]（2018）在《扩展青霉脂肪酶氧阴离子洞结构突变株的表达及性质鉴定》文中提出为探究氧阴离子洞结构对扩展青霉脂肪酶的底物选择性的影响,本研究采用体外构建高拷贝重组载体的方法,将实验室课题组已经筛选出来的氧阴离子洞结构突变体进行重组载体的构建、转化及表达,最后检测分析了突变体脂肪酶在催化活性方面的变化。研究内容包括以下几点:1.脂肪酶突变体基因的扩增设计L133M、L133A、H131E/L133A,3种突变体脂肪酶的引物,进行质粒PCR,并转化到感受态细胞E.coli BL21（DE3）,挑选转化子进行测序验证。2.多拷贝重组载体的构建将PEL与载体pA0815连接并转化,获得单拷贝重组表达载体pA0815-m-PEL。酶切获得单拷贝表达盒,并将其与单拷贝重组载体进行连接及转化。获得两拷贝表达载体pA0815-m-2PEL。同理得到pA0815-m-3PEL，pA0815-m-4PEL重组质粒载体。3.脂肪酶突变体在毕赤酵母中的表达及其酶学性质的研究将四拷贝重组质粒表达载体pA0815-m-4PEL,转化到毕赤酵母感受态细胞GS115。经过初筛、复筛鉴定,得到多拷贝酵母工程菌GS-pA0815-m-4PEL。将筛选获得的酵母转化子进行发酵表达,并检测分析突变型脂肪酶在催化活性及底物选择性等方面性质的变化。（1）检测野生型脂肪酶（WT）与突变体L133M、L133A、H131E/L133A对5种不同链长底物（4-硝基苯基丁酸酯、4-硝基苯基已酸酯、4-硝基苯基辛酸酯、4-硝基苯基月桂酸酯、4-硝基苯基棕榈酸酯）的比活力。测定结果显示:脂肪酶突变体L133M、L133A、H131E/L133A对4-硝基苯基丁酸酯的比活力分别是野生型脂肪酶的0.75倍、2.61倍、2.25倍;对4-硝基苯基已酸酯的比活力分别是野生型脂肪酶的0.72倍、2.27倍、1.93倍;对4-硝基苯基辛酸酯的比活力分别是野生型脂肪酶的0.45倍、1.51倍、0.96倍;对4-硝基苯基月桂酸酯的比活力分别是野生型脂肪酶的0.84倍、3.93倍、5.53倍;对4-硝基苯基棕榈酸酯的比活力分别是野生型脂肪酶的0.59倍、9.42倍、8.82倍。（2）检测野生型脂肪酶（WT）与突变体L133M、L133A、H131E/L133A对手性化合物（R,S）-扁桃酸乙酯的底物选择性及催化活性。测定结果显示:脂肪酶突变体L133M、L133A、H131E/L133A对R-扁桃酸乙酯的比活力分别是野生型脂肪酶的1.89倍、11.1倍、13.2倍。对S-扁桃酸乙酯的比活力分别是野生型脂肪酶的0.68倍、0.70倍、0.62倍。与野生型脂肪酶相比,突变体L133A、H131E/L133A表现出“新”的底物选择性,对手性化合物（R,S）-扁桃酸乙酯表现出较好的对映选择性。
谢盛[6]（2017）在《扩展青霉脂肪酶的定向进化及稳定性的提高》文中提出为了提高扩展青霉脂肪酶的稳定性,本研究采用了定点饱和突变的方法对影响酶稳定性的关键位点进行饱和突变,筛选出脂肪酶稳定性得到提高的突变菌株,并对其酶学性质进行测定和分析,主要有以下几个方面的内容。一、突变体文库的构建和高稳定性突变体的筛选对脂肪酶的83位点、92位点和151位点进行定点饱和突变,然后转化大肠杆菌感受态细胞。并筛选出稳定性比野生型提高的5个突变株:E83N、E83P、E83P、D92N 和 D151Y。二、多拷贝基因工程菌的构建扩展青霉脂肪酶PEL基因片段PCR扩增后,经EcoRⅠ酶切,异丙醇沉淀回收、与线性化后,并与去磷酸化的pA0815连接。转化Top10感受态细胞后,长出的转化子使用新设计的pAO-PEL引物进行菌液PCR鉴定,得到连接方向正确的单拷贝表达载体pA0815-lip.用BglII和BamHI双酶切pA0815-lip得到含5’（BglII）-AO X-lip-TT-3’（BamHI）的表达框,表达框经异丙醇沉淀回收、后与BamHI单酶切并去磷酸化的pA0815-lip连接,转化Top10感受态细胞。对长出的转化子用BglII和Ba mHI双酶切,然后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定连接方向是否正确,得到正确连接的2拷贝表达载体pAO815-21ip。同理得到pA0815-3lip,pA0815-4lip表达载体。将得到的多拷贝表达载体pA0815-xlip经SalI酶线性化后,电转化毕赤酵母GS115,最后用YPOM平板鉴定得到的多拷贝基因工程菌GS-pA0815-xlip。三、多拷贝基因工程菌的表达及酶学性质的研究将上述得到的多个突变体毕赤酵母基因工程菌分别摇瓶发酵,并对收集到的脂肪酶的酶学性质进行了比较研究。（1）在37 ℃下测定E83V、E83P、E83N、D92N、D151Y等脂肪酶突变体对pNPB的比活力。其比活力分别为野生型脂肪酶的2.1倍,0.9倍,2.6倍,3.0倍,1.2倍。（2）野生型PEL（WT）和D151Y的Tm值大约为40.7℃,E83N 的 Tm 值约为 39.2℃（比野生型 Tm值低了 1.5℃）。D92N、E83P、E83V等突变体的Tm值分别为44.6℃,45.9℃,46.3℃.（分别比野生型Tm值提高了 3.9 ℃,5.2 ℃,5.6 ℃）。（3）用 10%乙醇处理 24h 后,E83N、D151Y 和 WT残留酶活分别为22.9%,36.3%和34.2%,而E83P残留酶活有70%（明显高于野生型）,E83V和D92N残余的酶活也比野生型高。（4）在40 ℃条件处理下,WT的半衰期（T1/2）约为1h,而突变体E83N、E83P、E83V、D92N、D151Y的半衰期分别约为0.9h,2.0h,2.8h,2.0h,1.1h.分别是WT的0.9倍,2.0倍,2.8倍,2.0倍,1.1倍。（5）在10%不同有机溶剂处理24h下,五种突变体表现出不同的耐受性。经过甲醇处理后,WT相对残余酶活为24%,而E83V、D92N和D151Y相对残余酶活分别为56%,45%,43%（较WT有较大提高）。经过乙醇处理后,WT相对残余酶活只有31%,而E83P、E83V和D92N相对残余活分别为66%,71%,82%（较WT有明显提高）。经过二甲基亚砜处理后,WT和E83N相对残余酶活都为43%,E83V、D151Y相对残余酶活分别为62%,55%（较WT有较小幅度提高）,E83P和D92N较WT反而下降。经过丙酮处理后,WT、E83N和E83P相对残余酶活都为33%左右,而E83V、D92N和D151Y相对残余酶活分别为61%,54%,62%（较WT有较大提高）。经过乙腈处理后,WT的相对残余酶活为32%,E83P、D92N较WT相对残余酶活反而下降,而E83N、E83V和D151Y有较小幅度提高。
陈云华,李慧,张光亚,葛慧华,李夏兰[7]（2016）在《阿魏酸酯酶O42807在毕赤酵母GS115中的表达》文中认为研究阿魏酸酯酶O42807基因（fae）在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达及重组阿魏酸酯酶的酶学特性.化学合成fae基因序列,构建分泌型重组质粒pPIC9K-fae,经线性化后电转化至毕赤酵母GS115,对筛选出的高活性转化子进行诱导表达.SDS-PAGE分析显示:发酵上清液为单一条带,表观相对分子质量为42ku,酶活为78.49nkat·mL-1,比活力为524.38nkat·mg-1,最适反应温度为50℃,在4045℃温度范围内较稳定,最适反应pH值为5.05.5,且在pH值为6.0时,稳定性较好;金属离子K+,Ca2+,Na+对其活性有促进作用,Fe2+,Zn2+有一定的抑制作用,而Mn2+,Cu2+对其有明显的抑制作用.
王义春[8]（2015）在《玉米赤霉烯酮降解酶高效分泌表达及其酶学特性研究》文中进行了进一步梳理玉米赤霉烯酮是一类主要由禾谷镰刀菌产生的具有致癌作用的次级代谢产物,它能污染许多经济作物并引起全世界的食品和饲料安全问题,从而带来巨大的经济损失。如何安全有效的对污染的粮食或饲料进行脱毒处理,一直是一个比较棘手的问题。传统物理脱毒和化学的脱毒方法操作性较差,容易破坏粮食的营养成分,也容易引入二次污染。生物降解去除毒素具有反应条件温和、无有害试剂残留的优点,受到人们的青睐。本研究在前人研究的基础上,以zlhy-6为目标基因,对p AO815和外源基因进行改造和构建,以得到高效分泌玉米赤霉烯酮降解酶的工程菌,并对降解酶的性质进行了研究,得出如下结论:1.ZEN降解酶基因zlhy-6根据毕赤酵母基因密码子偏好性优化,经优化的序列前端引入α信号肽编码序列后,送公司利用化学方法合成。通过反复酶切酶连的方法,利用毕赤酵母表达载体p AO815构建含不同拷贝zlhy-6的重组表达载体,重组质粒转入大肠杆菌TOP10,经抗性筛选,对阳性克隆进行酶切鉴定,证明重组质粒构建成功。经过酶切鉴定,我们得到了重组表达载体p AO815-α-zlhy-6、p AO815-（α-zlhy-6）2、p AO815-（α-zlhy-6）4、p AO815-（α-zlhy-6）6,分别含1、2、4、6个zlhy-6拷贝。2.得到的一系列重组载体线性化后电击转化毕赤酵母GS115,经组氨酸缺陷型平板、SDS-PAGE筛选阳性转化子。并且通过SDS-PAGE比较不同转化子的蛋白表达情况,对转化子发酵液酶活进行比较,以得出ZEN降解酶分泌量最高、酶活力最高的转化子。不同拷贝转化子中以p AO815-（α-zlhy-6）4转化子蛋白分泌量最高,相应具有较高的降解ZEN能力,发酵液中酶活力达10 U/m L。3.用p AO815-（α-zlhy-6）4转化子上清液进行酶活性试验,反应1 h,重组酶对水溶液中20μg/m L ZEN的降解率可达到99%以上;用发酵液处理含2 mg/kg ZEN的玉米碴,当酶添加量为0.5 m L/g（V/W）时,玉米碴中的ZEN降解率达到75.51%左右;发酵液处理污染ZEN的玉米蛋白粉时,当酶添加量为2 m L/g（V/W）时,样品中ZEN的降解率达到了92.4%。4.进一步研究了温度、p H、金属离子等对酶活性的影响。明确了该酶的最适反应温度为37℃,最适反应p H为8。Li+及Mg2+对该酶有激活作用,Cu2+、Mn2+、Co2+、Ca2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+、EDTA等对该酶有抑制作用。5.采用化学修饰的方法对ZEN降解酶的功能基团进行探究,结果表明该酶的活性中心与丝氨酸和赖氨酸密切相关。本研究结果为玉米赤霉烯酮降解酶的工业化生产,降低ZEN的危害,保障粮食和饲料安全提供一定的技术支持。
庹德财[9]（2015）在《番木瓜畸形花叶病毒检测鉴定及侵染性克隆构建与应用》文中研究说明番木瓜（Carica papaya L.）是海南重要热带经济果树之一,除了番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus, PRSV）和番木瓜花叶病毒（Papaya mosaic virus, PaMV）对番木瓜种植造成严重的病害之外,本研究于2012年首次在海南东方市转基因抗PRSV的番木瓜植株上,发现一种新的危害番木瓜栽培的番木瓜畸形花叶病毒（Papaya leafdistortion mosaic virus, PLDMV）。以上三种病毒在番木瓜上的病症极为相似,在田间难以通过症状表现进行鉴别,给防治工作带来极大的困难。为此,本研究建立了灵敏快速检测这三种病毒的反转录-环介导等温扩增（Reverse transcription loop mediated isothermal amplification, RT-LAMP）和多重RT-PCR的方法。目前,对PLDMV的致病机理的研究较少,而植物病毒侵染性cDNA克隆是研究病毒基因功能的重要工具。本研究通过对PLDMV海南东方市分离物（PLDMV-DF）全长基因组序列进行测定并对其分子特征进行生物信息学分析,并成功构建了可系统侵染番木瓜的PLDMV-DF全长cDNA克隆和表达GFP的PLDMV-DF病毒表达载体,为进一步研究该病毒基因功能、病症发生及病毒致病机理奠定了基础。另外,利用表达GFP的PLDMV-DF侵染性克隆和番木瓜叶片原生质体的RNA干扰体系,快速筛证了靶向PLDMV CP基因的具有较高沉默效率的ihpRNA载体,为后续进行转基因抗PLDMV研究奠定了基础。主要研究结果如下：（1） PLDMV的发现与寄主范围本研究首次在中国大陆报道发现了PLDMV,对其寄主范围鉴定发现PLDMV-DF既能侵染转基因抗PRSV番木瓜也能侵染非转基因番木瓜,但不能侵染西葫芦（Cucurbita pepo）和本生烟（Nicotiana benthamiana）.（2）克隆了PLDMV-DF分离物全长基因组序列PLDMV-DF分离物全长基因组序列由10153nt组成（GenBank登录号：JX974555）。5’端和3’端UTR分别为134nt和209nt,含一个编码3269个氨基酸的多聚蛋白和一个编码75个氨基酸的小ORF。与日本J56P、台湾KS和CZ分离物的全长核苷酸序列相似性为94.3%-94.9%,氨基酸序列相似性为95.9%-96.3%。核苷酸及氨基酸序列的进化树分析显示,PLDMV-DF分离物与日本J56P分离物为一支,表明PLDMV-DF分离物与地理位置相对较远的日本分离物J56P可能具有共同的进化起源。（3）建立了RT-LAMP和多重RT-PCR检测方法成功建立了检测PLDMV、PRSV和PaMV三种病毒的RT-LAMP可视化检测体系和同时检测这三种病毒的多重RT-PCR检测方法。利用多重RT-PCR对海南岛内番木瓜病毒病害发病生态进行调查发现,PRSV、PLDMV和PapMV的发病率分别为：54.5%,27.3%和0.9%,而且首次发现PRSV和PLDMV存在混合感染的现象17.3%。（4）利用In-Fusion融合的方法快速获得PLDMV-DF的全长cDNA侵染性克隆,成功地通过体外转录获得了具有侵染活性的病毒RNA转录本为了克服其在E.coli细胞中的不稳定性,本研究采用插入内含子intron2和intron IV2的策略[内含子intron2插入到P3（第3709/3710nt）区域；intron IV2插入到CI（第5028/5029nt）区域；内含子intron2和intron IV2分别插入到P3（第3709/3710nt）和CI（第5028/5029nt）区域],成功构建了2个侵染性克隆：pT7-FL-In2（内含子intron2插入到P3（第3709/3710nt）区域）和PT7-FL-In2/IV2（内含子intron2和intron IV2分别插入到P3（第3709/371011t）和CI（第5028/5029nt）区域）。pT7-FL-In2和pT7-FL-In2/IV2体外转录产物接种番木瓜都表现出系统性侵染,未添加帽子结构类似物的体外转录产物接种的侵染效率达到58.8%-61.1%,而添加帽子结构类似物的体外转录产物接种的侵染效率高达73.7%-75.0%。（5）利用酵母同源重组系统,建立了一种改良的快速构建植物病毒侵染性克隆的方法,成功地通过农杆菌接种获得了具有侵染活性的PLDMV-DF侵染性克隆本实验对酵母同源重组系统方法进行改进,成功构建了两种适用农杆菌侵染法接种的PLDMV-DF侵染性克隆p35S-FL和p35S-FL-In2（内含子intron2插入到P3（第3709/3710nt）区域）,共获得4个农杆菌克隆p35S-FL39-12、p35S-FL39-34和p35S-FL-In22-1、p35S-FL-In22-3。以上4个克隆与构建的PLDMV-DF的沉默抑制子HC-Pro瞬时表达载体pBI121-HC-Pro混合接种番木瓜植株的侵染效率（85.7%-91.4%）比单独接种的侵染效率（64.7%-69.4%）高,而且能提前2-3天表现出症状。（6）利用改良的酵母同源重组系统,将PLDMV-DF改造为病毒表达载体,在番木瓜中GFP获得系统性表达利用改进后酵母重组方法,成功构建了在PLDMV-DF的P1与HC-Pro之间和NIb与CP之间插入gfp外源基因的病毒表达载体P35S-FL-P1/GFP-8、p35S-FL-P1/GFP-9、p35S-FL-P1/GFP-In2-5、p35S-FL-GFP/CP-23-1、p35S-FL-GFP/CP-38-1和p35S-FL-GFP/CP-38-2。GFP获得系统性表达的克隆为p35S-FL-P1/GFP-9、p35S-FL-GFP/CP-38-1和p35S-FL-GFP/CP-38-2,侵染效率达73.5%-93.9%,在共聚焦荧光显微镜和UV灯下都能检测到GFP发光,,western blot检测到GFP表达。而p35S-FL-P1/GFP-9的位点突变影响其病症,可能突变为弱毒株,可用于交叉保护防治PLDMV。而p35S-FL-GFP/CP-23-1的位点突变影响GFP表达,但不影响其侵染性（66.7%）,但病症延迟30-40天。在接种90天后,gfp报告基因从插入位点会发生丢失现象。（7）利用表达GFP的PLDMV-DF侵染性克隆和番木瓜叶片原生质体的RNA干扰体系,快速筛证了靶向PLDMV CP基因的具有较高沉默效率的ihpRNA载体利用OZ-LIC法,成功构建了4种不同CP基因片段长度的ihpRNA植物表达载体pRNAi-CP879、pRNAi-CP400、pRNAi-CP326和pRNAi-CP140。在接种克隆p35S-FL-GFP/CP-38-1的番木瓜原生质体中,通过共聚焦荧光显微镜和RT-PCR分析,快速验证出pRNAi-CP879、pRNAi-CP400和pRNAi-CP326有较高的沉默效率
周选围[10]（2014）在《灵芝木质素降解酶系相关基因的克隆与酵母表达》文中研究指明白腐真菌具有较强降解木质纤维素的能力，灵芝属是白腐真菌中的一大类，对其分类，降解木质纤维素高产菌株筛选方法和相关基因的系统研究，对利用灵芝降解木质纤维素和环境应用有着积极的推动作用。该研究利用灵芝中的真菌免疫调节蛋白（FIP）基因、细胞核核糖体ITS1-5.8S-ITS2序列和线粒体核糖体小亚基V4-V6区（mt SSU rDNA V4-V6）序列分析了20个灵芝菌株的遗传多样性；在此基础上建立了从灵芝中筛选漆酶高产菌株的方法，利用外显子拼接法和cDNA末端快速扩增技术分别克隆了灵芝菌株漆酶（Lac）和灵芝锰过氧化酶（MnP）基因序列，并将两个基因在毕赤酵母中进行了表达。研究结果表明：①不同的标记基因对对灵芝区分能力不同；②灵芝00679产漆酶能力最强；克隆到的灵芝00679和灵芝50817菌株漆酶cDNA全长序列分别为1566bp和1563bp，编码521和520个氨基酸，均属于多铜氧化酶家族；构建了灵芝00679漆酶基因（GlLac）表达载体pPICZαA-GlLac，并在毕赤酵母X33中进行了有效表达；③克隆到的灵芝锰过氧化物酶cDNA序列全长1337bp，编码363个氨基酸，蛋白质包括一个木质素氧化酶的催化位点，属于类似于植物的氧化酶超家族；构建了灵芝MnP的酵母表达载体pAO815-GlMnP，成功转化毕赤酵母SMD1168，表达出了有活性的灵芝锰过氧化物酶。主要结论：使用FIP基因可区分赤芝组和紫芝组，使用细胞核核糖体ITS1-5.8S-ITS2基因序列可区分来自不同地区的赤芝，使用mt SSU rDNA V4-V6序列能将赤芝中的不同菌株进行更好地区分。从灵芝中成功克隆到的漆酶cDNA序列编码520个氨基酸的蛋白质，属于多铜氧化酶家族，克隆到的灵芝锰过氧化物酶全长cDNA序列编码363个氨基酸的蛋白质，属于类似于植物的氧化酶超家族，这两个基因均能在酵母中有效表达。该研究为进一步利用漆酶和锰过氧化物酶于环境修复和木质素的降解奠定了基础。
二、利用套叠PCR技术改造酵母表达载体pAO815的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、利用套叠PCR技术改造酵母表达载体pAO815的研究（论文提纲范文）
（1）疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的理性设计及高效表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 脂肪酶概述 |
| 1.1.1 脂肪酶的来源 |
| 1.1.2 脂肪酶的催化机制 |
| 1.1.3 脂肪酶应用 |
| 1.2 异源表达系统 |
| 1.2.1 大肠杆菌表达系统 |
| 1.2.2 巴斯德毕赤酵母表达系统 |
| 1.3 脂肪酶的分子改造方法 |
| 1.3.1 定向进化 |
| 1.3.2 理性设计 |
| 1.3.3 半理性设计 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 2 脂肪酶TLL的理性设计与克隆表达 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 脂肪酶表达载体的构建 |
| 2.2.2 脂肪酶重组表达载体的转化 |
| 2.2.3 脂肪酶工程菌株的诱导表达 |
| 2.2.4 脂肪酶TLL的理性设计 |
| 2.2.5 脂肪酶TLL的定点突变 |
| 2.2.6 突变脂肪酶的克隆与表达 |
| 2.2.7 脂肪酶TLL突变前后酶学性质比较 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 重组质粒的构建与鉴定 |
| 2.3.2 脂肪酶TLL的表达与活性测定 |
| 2.3.3 基因的理性设计 |
| 2.3.4 重组质粒的验证 |
| 2.3.5 脂肪酶突变前后酶学性质的比较 |
| 2.4 讨论 |
| 3 脂肪酶的高效表达研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 多拷贝载体的构建 |
| 3.2.2 荧光定量PCR检测脂肪酶多拷贝重组子的拷贝数 |
| 3.2.3 脂肪酶工程菌株在发酵罐中的表达与优化 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 多拷贝载体的构建 |
| 3.3.2 荧光定量PCR检测结果 |
| 3.3.3 脂肪酶TLL2Q在50-L发酵罐中的表达情况 |
| 3.4 讨论 |
| 4 总结与展望 |
| 4.1 总结 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（2）基因剂量及基因突变对β-半乳糖苷酶表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 绪论 |
| 1.1 β-半乳糖苷酶的简介 |
| 1.1.1 β-半乳糖苷酶的定义 |
| 1.1.2 β-半乳糖苷酶的来源和比较 |
| 1.1.3 β-半乳糖苷酶的催化机制 |
| 1.2 β-半乳糖苷酶的应用 |
| 1.2.1 β-半乳糖苷酶在医药面的应用 |
| 1.2.2 β-半乳糖苷酶在食品方面的应用 |
| 1.2.3 β-半乳糖苷酶在环境保护方面的应用 |
| 1.2.4 β-半乳糖苷酶在基因工程方面的应用 |
| 1.3 产β-半乳糖苷酶菌株的培育 |
| 1.3.1 β-半乳糖苷酶的提取 |
| 1.3.2 β-半乳糖苷酶菌株的选育 |
| 1.4 提高蛋白表达水平的策略 |
| 1.4.1 密码子优化 |
| 1.4.2 多拷贝质粒构建 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 2 原始基因与密码子优化后的β-半乳糖苷酶 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 工具酶和试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 培养基及使用溶液 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 β-半乳糖苷酶表达载体的构建 |
| 2.2.2 β-半乳糖苷酶毕赤酵母工程菌的构建 |
| 2.2.3 β-半乳糖苷酶重组菌株的诱导表达 |
| 2.2.4 β-半乳糖苷酶酶学性质的测定 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 β-半乳糖苷酶表达载体的构建 |
| 2.3.2 β-半乳糖苷酶酵母工程菌的构建 |
| 2.3.3 β-半乳糖苷酶酵母工程菌的诱导表达 |
| 2.3.4 β-半乳糖苷酶的酶学性质 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 3 β-半乳糖苷酶的定点突变 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 突变菌株表达质粒p AO815-4IUG-4 及酵母重组菌的构建 |
| 3.2.2 pAO815-4IUG-4 毕赤酵母工程菌的诱导表达 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 突变菌株表达质粒p AO815-4IUG-4 及酵母重组菌的构建 |
| 3.3.2 pAO815-4IUG-4 酵母重组菌的表达 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 4 基因剂量对β-半乳糖苷酶表达的影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株和质粒 |
| 4.1.2 工具酶和试剂 |
| 4.1.3 实验设备 |
| 4.1.4 培养基及使用溶液 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 Aogal-1基因二、三拷贝表达载体的构建 |
| 4.2.2 多拷贝毕赤酵母重组菌株的构建与表达 |
| 4.2.3 荧光定量PCR鉴定酵母基因组中外源基因拷贝数方法的建立 |
| 4.2.4 毕赤酵母重组菌株的高密度发酵 |
| 4.2.5 高密度发酵后SDS-PAGE凝胶电泳分析及酶活的测定 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 Aogal-1基因二、三拷贝表达载体的构建 |
| 4.3.2 多拷贝毕赤酵母重组菌株的构建与表达 |
| 4.3.3 荧光定量PCR鉴定酵母基因组中插入的外源基因拷贝数 |
| 4.3.4 p AO815-Aogal-2 菌株的高密度发酵 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（3）基因剂量及基因突变对β-甘露聚糖酶表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 β-甘露聚糖酶的简介 |
| 1.1.1 β-甘露聚糖酶的来源 |
| 1.1.2 β-甘露聚糖酶对底物的作用方式 |
| 1.2 β-甘露聚糖酶的应用 |
| 1.2.1 β-甘露聚糖酶在饲料中的应用 |
| 1.2.2 β-甘露聚糖酶在医药方面中的应用 |
| 1.2.3 β-甘露聚糖酶在食品方面中的应用 |
| 1.2.4 β-甘露聚糖酶在造纸工业上的应用 |
| 1.2.5 β-甘露聚糖酶在洗涤工艺中的应用 |
| 1.2.6 β-甘露聚糖酶在其他方面的应用 |
| 1.3 酵母表达系统 |
| 1.3.1 毕赤酵母表达载体 |
| 1.3.2 毕赤酵母外源蛋白的表达与修饰 |
| 1.4 基因剂量对毕赤酵母表达系统的影响 |
| 1.4.1 多拷贝方法的分类 |
| 1.4.2 多拷贝表达载体的构建方法 |
| 1.5 快速PCR定点突变 |
| 1.6 β-甘露聚糖酶的研究进展 |
| 1.7 本课题研究目的及意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 工具酶和试剂 |
| 2.1.3 培养基以及所用溶液 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 β-甘露聚糖酶基因MANsyn的克隆和毕赤酵母工程菌的构建 |
| 2.2.2 重组菌pAO815-MANsyn的摇瓶发酵和诱导表达 |
| 2.2.3 重组菌pAO815-MANsyn的摇瓶发酵的酶活测定 |
| 2.2.4 β-甘露聚糖酶的蛋白含量测定 |
| 2.2.5 β-甘露聚糖酶的酶学性质分析 |
| 2.2.6 TLC薄层层析还原糖分析 |
| 2.3 重组质粒pAO815-MANsyn多拷贝重组子的构建与表达 |
| 2.3.1 重组质粒pAO815-MANsyn多拷贝重组子的构建 |
| 2.3.2 多拷贝重组表达菌株的构建和表达 |
| 2.4 β-甘露聚糖酶多拷贝酵母重组菌株MANsyn基因拷贝数的检测 |
| 2.4.1 荧光定量PCR标准质粒的构建 |
| 2.4.2 荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 2.4.3 重组酵母菌株中MANsyn基因拷贝数的检测 |
| 2.5 基因突变对β-甘露聚糖酶重组表达的影响 |
| 2.6 β-甘露聚糖酶重组表达酵母的14L高密度发酵 |
| 2.6.1 种子培养基与发酵培养基的制备及接种 |
| 2.6.2 发酵流程(14L发酵罐) |
| 第三章 实验结果和讨论 |
| 3.1 实验结果 |
| 3.1.1 β-甘露聚糖酶毕赤酵母表达质粒的构建 |
| 3.1.2 β-甘露聚糖酶的酶活测定 |
| 3.1.3 β-甘露聚糖酶的蛋白含量测定 |
| 3.1.4 β-甘露聚糖酶多拷贝重组表达质粒的构建 |
| 3.1.5 荧光定量PCR检测多拷贝重组表达菌株MANsyn基因插入拷贝数 |
| 3.1.6 基因剂量对β-甘露聚糖酶表达的影响 |
| 3.1.7 基因突变对β-甘露聚糖酶重组表达的影响 |
| 3.1.8 β-甘露聚糖酶14L水平的高密度发酵 |
| 3.1.9 β-甘露聚糖酶的酶学性质研究 |
| 3.1.10 TLC薄层层析分析水解产物 |
| 3.2 讨论 |
| 3.2.1 基因剂量对β-甘露聚糖酶表达的影响 |
| 3.2.2 基因突变筛选正向突变菌株 |
| 第四章 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（4）果胶裂解酶在毕赤酵母中高效表达及酶学性质分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 第一章 前言 |
| 1.1 果胶质 |
| 1.2 果胶的应用及提取 |
| 1.2.1 果胶的应用 |
| 1.2.2 果胶的提取方法 |
| 1.3 果胶酶及其分类 |
| 1.3.1 果胶酶 |
| 1.3.2 果胶酶分类 |
| 1.4 果胶酶酶活测定方法 |
| 1.5 果胶酶的应用 |
| 1.5.1 工业领域 |
| 1.5.2 食品和饲料领域 |
| 1.6 蛋白表达系统 |
| 1.6.1 原核系统表达策略 |
| 1.6.2 真核表达系统 |
| 1.6.3 提高毕赤酵母表达量策略 |
| 第二章 果胶裂解酶基因pelA的异源表达及酶活分析 |
| 2.1 实验仪器设备 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株和质粒 |
| 2.2.2 酶和试剂 |
| 2.2.3 培养基 |
| 2.2.4 引物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 pelA在E.coil BL21中表达 |
| 2.3.2 pelA在P.pastoris中表达 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 原核表达载体p ET28a-pelA的构建 |
| 2.4.2 PelA的表达及酶活力测定 |
| 2.4.3 表达载体pAO815-pelA的构建 |
| 2.4.4 PelA在毕赤酵母中的表达及酶活测定 |
| 2.4.5 菌落PCR验证 |
| 2.4.6 蛋白浓缩 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 pelAO在 P.pastoris中高效表达及基因剂量效应 |
| 3.1 仪器与设备 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 pelAO工程菌的构建 |
| 3.3.2 多拷贝表达载体的构建 |
| 3.3.3 酶活测定 |
| 3.3.4 荧光定量PCR检测基因拷贝数 |
| 3.3.5 蛋白含量的测定 |
| 3.3.6 高密度发酵流程 |
| 3.3.7 高密度发酵策略 |
| 3.3.8 细胞活力检测 |
| 3.3.9 PelA酶学性质分析 |
| 3.4 实验结果与分析 |
| 3.4.1 多拷贝工程菌的构建 |
| 3.4.2 蛋白定量标曲测定 |
| 3.4.3 拷贝数的检测 |
| 3.4.4 pelA多拷贝菌株的摇瓶发酵 |
| 3.4.5 14-L高密度发酵 |
| 3.4.6 PelA酶学性质分析 |
| 3.4.7 PGA的酶解产物分析 |
| 3.4.8 果胶降解工艺优化 |
| 3.4.9 PelA的糖基化位点分析 |
| 3.4.10 PelA蛋白的结构模拟 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 PelA蛋白分析 |
| 3.5.2 基因剂量对表达量的影响 |
| 3.5.3 PelA抗逆性分析 |
| 3.5.4 果胶降解工艺 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 果胶酶基因pelB和pelC在P.pastoris中表达 |
| 4.1 实验仪器设备 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 pelB和pelC工程菌的构建 |
| 4.3.2 pelC多拷菌株的构建及摇瓶发酵 |
| 4.3.3 PelB和PelC的酶学性质分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 表达载体pAO815-pelB的构建 |
| 4.4.2 pelB重组子的检测 |
| 4.4.3 pelC多拷贝载体的构建 |
| 4.4.4 pelC多拷贝菌株的表达 |
| 4.4.5 PelB和PelC酶学性质分析 |
| 4.4.6 PelB和PelC的糖基化位点预测 |
| 4.4.7 PelB和PelC的结构模拟 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 5.1 主要内容 |
| 5.2 主要结论 |
| 5.3 本研究的意义及创新性 |
| 5.3.1 研究的意义 |
| 5.3.2 创新性 |
| 5.4 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A |
| 附录B |
| 附录C |
| 攻读学位期间的主要成果 |
（5）扩展青霉脂肪酶氧阴离子洞结构突变株的表达及性质鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中文文摘 |
| 绪论 |
| 1.1 脂肪酶的研究进展 |
| 1.1.1 脂肪酶的来源 |
| 1.1.2 脂肪酶的应用 |
| 1.1.3 脂肪酶的性质 |
| 1.1.4 脂肪酶的催化机制 |
| 1.2 脂肪酶高表达策略 |
| 1.2.1 高效表达质粒构建策略 |
| 1.2.2 表达系统 |
| 1.2.3 友酵条件优化 |
| 1.3 手性化合物 |
| 1.3.1 手性化合物的简介 |
| 1.3.2 手性化合物研究进展 |
| 1.3.3 脂肪酶在手性化合物研究中的应用 |
| 1.4 本课题研究的思路及意义 |
| 第一章 扩展青霉脂肪酶突变体基因的扩增及重组质粒的构建 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料 |
| 1.2.1 菌株与质粒 |
| 1.2.2 主要试剂 |
| 1.2.3 主要仪器 |
| 1.2.4 主要试剂及培养基配置 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 设计寡核苷酸引物 |
| 1.3.2 突变体重组质粒pET-47b(+)-m-PEL的构建 |
| 1.3.3 大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备及转化 |
| 1.4 结果 |
| 1.4.1 野生型重组质粒模板pET-47b(+)-PEL验证 |
| 1.4.2 质粒PCR产物鉴定 |
| 1.4.3 转化子的筛选及鉴定 |
| 1.5 讨论 |
| 第二章 扩展青霉脂肪酶多拷贝重组载体的构建 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 质粒与菌体 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 设计寡核苷酸引物 |
| 2.3.2 含有EcoR Ⅰ酶切位点PEL目的基因片段的获得 |
| 2.3.4 pAO815质粒提取 |
| 2.3.5 单拷贝重组载体pAO815-m-PEL的构建 |
| 2.3.6 Top10感受态细胞的制备和转化 |
| 2.3.7 重组质粒pAO815-m-PEL的鉴定 |
| 2.3.8 多拷贝表达载体pAO815-m-XPEL的构建 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 pAO815-m-PEL单拷贝重组表达载体的构建 |
| 2.4.2 多拷贝重组表达载体pAO815-m-XPEL的构建 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 扩展青霉脂肪酶的表达及酶学性质研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 菌体 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要仪器及试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 毕赤酵母GS115感受态的制备与转化 |
| 3.3.2 重组酵母的鉴定及诱导表达 |
| 3.3.3 SDS-PAGE鉴定 |
| 3.4 扩展青霉脂肪酶酶学性质测定 |
| 3.4.1 脂肪酶酶活测定 |
| 3.4.2 脂肪酶的酶活单位定义 |
| 3.4.3 对硝基苯酚的标准曲线测定 |
| 3.4.4 (R,S)扁桃酸乙酯的标准曲线测定 |
| 3.5 实验结果与分析 |
| 3.5.1 多拷贝转化子GS-pA0815-m-4PEL的筛选 |
| 3.5.2 脂肪酶的诱导表达 |
| 3.5.3 绘制对硝基苯酚标准曲线 |
| 3.5.4 突变脂肪酶(粗酶)的酶活力分析 |
| 3.6 分析与讨论 |
| 第四章 总结与展望 |
| 4.1 创新点 |
| 4.2 总结 |
| 4.3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）扩展青霉脂肪酶的定向进化及稳定性的提高（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中文文摘 |
| 绪论 |
| 1.1 简介 |
| 1.1.1 蛋白质的热稳定性 |
| 1.1.2 蛋白质热稳定性类型 |
| 1.1.3 热稳定性蛋白酶的优点 |
| 1.1.4 热稳定性酶的应用 |
| 1.1.5 酶的热失活 |
| 1.1.6 影响蛋白质热稳定性的因素 |
| 1.1.6.1 疏水相互作用 |
| 1.1.6.2 氢键 |
| 1.1.6.3 盐桥 |
| 1.1.6.4 二硫键 |
| 1.1.6.5 芳香环的相互作用 |
| 1.1.6.6 包装效率 |
| 1.1.6.7 稳定的α-螺旋结构 |
| 1.1.6.8 氨基酸的组成 |
| 1.1.6.9 不稳定区域的锚定 |
| 1.1.6.10 寡聚化 |
| 1.1.6.11 亚基之间的相互作用 |
| 1.1.6.12 翻译后修饰 |
| 1.1.6.13 与金属离子结合 |
| 1.2 酶稳定性改造的策略和研究进展 |
| 1.2.1 理性设计 |
| 1.2.2 非理性设计 |
| 1.2.3 半理性设计 |
| 1.3 定向进化筛选策略 |
| 1.3.1 表型观察选择和筛选 |
| 1.3.2 微孔板滴定法 |
| 1.3.3 各种展示技术 |
| 1.3.4 流式细胞分选技术 |
| 1.4 B因子简介 |
| 1.5 本课题研究的思路及意义 |
| 第一章 扩展青霉脂肪酶83,92及151位点突变体文库的构建和筛选 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料 |
| 1.2.1 菌株与质粒 |
| 1.2.2 主要试剂 |
| 1.2.3 主要仪器 |
| 1.2.4 主要试剂及培养基配置 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 设计寡核苷酸引物 |
| 1.3.2 重组质粒PET-47b(+)-PEL的构建 |
| 1.3.3 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备及质粒的转化 |
| 1.3.4 脂肪酶突变体的筛选 |
| 1.3.5 脂肪酶突变体的鉴定 |
| 1.4 结果 |
| 1.4.1 PET-47b(+)质粒验证 |
| 1.4.2 PET片段鉴定 |
| 1.4.3 PET-47b(+)-PEL质粒鉴定 |
| 1.4.4 突变体质粒验证 |
| 1.4.5 稳定性提高突变体的筛选 |
| 1.5 讨论 |
| 第二章 扩展青霉脂肪酶多拷贝基因工程菌的构建 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 菌体 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 设计寡核苷酸引物 |
| 2.3.2 有EcoRⅠ酶切位点PEL片段的获得 |
| 2.3.3 pAO815质粒提取 |
| 2.3.4 一拷贝克隆载体pAO815-PEL的构建 |
| 2.3.5 TOP10感受态的制备和转化 |
| 2.3.6 重组质粒pAO815-PEL的鉴定 |
| 2.3.7 多拷贝表达载体pAO815-xlip的构建 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 pAO815-LIP单拷贝表达载体的构建 |
| 2.4.2 多拷贝表达载体pAO815-XLIP的构建 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 多拷贝基因工程菌的脂肪酶表达及酶学性质的研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 菌株 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 毕赤酵母GS115感受态的制备与转化 |
| 3.3.2 重组酵母的鉴定及诱导表达 |
| 3.3.3 SDS-PAGE鉴定 |
| 3.4 重组酵母脂肪酶酶学性质测定 |
| 3.4.1 测重组酵母脂肪酶酶活 |
| 3.4.2 重组酵母脂肪酶的酶活单位定义 |
| 3.4.3 对硝基苯酚的标准曲线测定 |
| 3.4.4 用不同浓度的乙醇处理测突变脂肪酶的稳定性 |
| 3.4.5 用相同浓度的乙醇处理不同时间测突变脂肪酶的稳定性 |
| 3.4.6 用相同浓度的不同有机溶剂处理测突变脂肪酶的稳定性 |
| 3.4.7 用不同温度处理测突变脂肪酶的稳定性 |
| 3.4.8 在40℃处理不同的时间测突变脂肪酶的稳定性 |
| 3.5 实验结果与分析 |
| 3.5.1 多拷贝基因工程菌GS-pAO815-xlip的筛选 |
| 3.5.2 脂肪酶的诱导表达 |
| 3.5.3 对硝基苯酚标准曲线 |
| 3.5.4 突变脂肪酶比活力分析 |
| 3.5.5 突变脂肪酶稳定性测定 |
| 3.6 分析与讨论 |
| 第四章 总结与展望 |
| 4.1 创新点 |
| 4.2 总结 |
| 4.3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）阿魏酸酯酶O42807在毕赤酵母GS115中的表达（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.1.1菌株和质粒 |
| 1.1.2主要试剂和培养基 |
| 1.2 pAO815-fae表达载体的构建 |
| 1.3 pPIC9K-fae表达载体的构建 |
| 1.4 fae在毕赤酵母中的表达 |
| 1.5 重组阿魏酸酯酶酶活测定 |
| 1.6 重组阿魏酸酯酶粗酶酶学性质的研究 |
| 1.6.1最适反应温度的测定 |
| 1.6.2温度稳定性的测定 |
| 1.6.3最适反应pH值的测定 |
| 1.6.4 pH值稳定性的测定 |
| 1.6.5金属离子对重组阿魏酸酯酶酶活的影响 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 pAO815-fae和pPIC9K-fae表达载体的构建 |
| 2.2 fae在毕赤酵母中的表达 |
| 2.3 重组阿魏酸酯酶粗酶的酶学性质 |
| 2.3.1最适反应pH值和pH值稳定性的测定 |
| 2.3.2金属离子重组阿魏酸酯酶酶活性的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结束语 |
（8）玉米赤霉烯酮降解酶高效分泌表达及其酶学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 玉米赤霉烯酮污染与毒害 |
| 1.1.1 玉米赤霉烯酮的污染现状 |
| 1.1.2 玉米赤霉烯酮的毒害作用 |
| 1.2 玉米赤霉烯酮脱毒技术研究进展 |
| 1.2.1 物理脱毒方法 |
| 1.2.2 化学脱毒方法 |
| 1.2.3 生物降解方法 |
| 1.3 外源蛋白毕赤酵母表达研究进展 |
| 1.3.1 毕赤酵母表达系统特点 |
| 1.3.2 毕赤酵母表达系统组成 |
| 1.3.3 外源基因表达的影响因素 |
| 1.4 玉米赤霉烯酮降解酶表达研究现状 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 1.6 主要研究内容 |
| 第二章 玉米赤霉烯酮降解酶基因多拷贝表达载体构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料与试剂 |
| 2.2.2 仪器与设备 |
| 2.2.3 方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 单拷贝表达载体的构建 |
| 2.3.2 多拷贝表达载体的构建 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 玉米赤霉烯酮降解酶毕赤酵母表达 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料与试剂 |
| 3.2.2 仪器与设备 |
| 3.2.3 试验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 重组蛋白的诱导表达筛选及鉴定 |
| 3.3.2 重组蛋白诱导时间和表达量分析 |
| 3.3.3 重组蛋白的ZEN降解活性测定 |
| 3.3.4 玉米碴中ZEN的降解 |
| 3.3.5 玉米蛋白粉中ZEN的降解 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 玉米赤霉烯酮降解酶酶学特性 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料与试剂 |
| 4.2.2 仪器与设备 |
| 4.2.3 试验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 温度对降解活性的影响 |
| 4.3.2 pH对降解活性的影响 |
| 4.3.3 金属离子对降解酶活性的影响 |
| 4.3.4 EDTA对降解活性的影响 |
| 4.3.5 降解酶功能基团探究 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）番木瓜畸形花叶病毒检测鉴定及侵染性克隆构建与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 番木瓜环斑病毒的研究 |
| 1.1.1 PRSV的发现与地区分布 |
| 1.1.2 PRSV的病症与传播途径 |
| 1.1.3 PRSV的寄主范围与生物型 |
| 1.1.4 PRSV的生物学特征及基因结构与功能 |
| 1.2 番木瓜畸形花叶病毒的研究 |
| 1.2.1. PLDMV的发现与地区分布 |
| 1.2.2. PLDMV的病症与传播途径 |
| 1.2.3. PLDMV的寄主范围与生物型 |
| 1.2.4. PLDMV的生物学特征及基因结构 |
| 1.3 番木瓜花叶病毒的研究 |
| 1.3.1. PaMV的发现与地区分布 |
| 1.3.2. PaMV的病症与传播途径 |
| 1.3.3. PaMV的寄主范围及生物学特征 |
| 1.4 植物病毒的检测方法 |
| 1.4.1. 生物学检测法 |
| 1.4.2. 形态学检测法 |
| 1.4.3. 免疫学检测法 |
| 1.4.4. 分子生物学检测法 |
| 1.5 全长cDNA侵染性克隆研究进展 |
| 1.5.1. 体外转录cDNA侵染性克隆 |
| 1.5.2. 体内转录cDNA侵染性克隆 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料和病毒株 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 菌株及载体 |
| 2.1.4 培养基及主要试剂配方 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 植物总RNA的提取及纯度检测 |
| 2.2.2 机械摩擦接种PLDMV及体外转录产物 |
| 2.2.3 酵母感受态细胞的制备、转化及质粒提取 |
| 2.2.4 农杆菌化学转化感受态细胞的制备及转化 |
| 2.2.5 PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、回收、T/A克隆及测序与数据分析 |
| 2.2.6 cDNA第一链的合成及3'RACE |
| 2.2.7 5'RACE |
| 2.2.8 In-Fusion反应 |
| 2.2.9 番木瓜叶片总DNA和总蛋白的提取 |
| 2.2.10 Western blot分析检测GFP表达 |
| 2.2.11 番木瓜叶肉原生质体的分离及转化 |
| 2.2.12 PLDMV的鉴定及病症表现 |
| 2.2.13 PLDMV、PRSV和PaMV RT-LAMP可视化检测技术的建立 |
| 2.2.14 PLDMV、PRSV和PaMV的多重RT-PCR检测方法的建立 |
| 2.2.15 构建体外转录的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆pT7-FL |
| 2.2.16 构建含内含子的体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 |
| 2.2.17 体外转录的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆的侵染性分析 |
| 2.2.18 酵母重组系统构建体内转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 |
| 2.2.19 体内转录的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆侵染性分析 |
| 2.2.20 酵母重组系统构建PLDMV-DF表达GFP的病毒表达载体 |
| 2.2.21 PLDMV-DF病毒表达载体的表达分析 |
| 2.2.22 植物ihpRNA表达载体在番木瓜原生质体中沉默效果的验证 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1. PLDMV的发现与病症 |
| 3.1.1 番木瓜叶片总RNA的质量检测 |
| 3.1.2 PLDMV的鉴定发现 |
| 3.1.3 PLDMV-DF在番木瓜、西葫芦及本生烟草上的病症表现 |
| 3.2. PLDMV-DF分离物全长基因组序列的测定 |
| 3.2.1. 构建pMD-A、pMD-B、pMD-C、pMD-D、pMD-E和pMD-F |
| 3.2.2. 5'/3'RACE及质粒pMD-5R和pMD-3R的构建 |
| 3.3. PLDMV-DF分离物全长基因组的结构分析 |
| 3.3.1. PLDMV-DF分离物全长基因组的序列和ORF结构分析 |
| 3.3.2. PLDMV-DF分离物ORF编码的多聚蛋白酶切位点分析 |
| 3.3.3. PLDMV-DF分离物的全长核苷酸和氨基酸的相似性分析 |
| 3.3.4. PLDMV-DF与Taiwan-CZ、Taiwan-KS、Japan-J56P进化树分析 |
| 3.4. PLDMV、PRSV和PaMV RT-LAMP可视化检测技术的建立 |
| 3.4.1. PLDMV、PRSV和PaMV RT-LAMP引物设计 |
| 3.4.2. PRSV RT-LAMP检测方法的最佳反应体系和反应条件 |
| 3.4.3. PLDMV RT-LAMP检测方法的最佳反应体系和反应条件 |
| 3.4.4. PaMV RT-LAMP检测方法的最佳反应体系和反应条件 |
| 3.4.5. PLDMV RT-LAMP的特异性与灵敏度分析 |
| 3.4.6. PRSV RT-LAMP的特异性与灵敏度分析 |
| 3.4.7. PLDMV、PRSV和PaMV RT-LAMP的特异性检测 |
| 3.5. PLDMV、PRSV和PaMV的多重RT-PCR检测方法的建立 |
| 3.5.1. 引物的特异性及多重RT-PCR最适引物对的筛选 |
| 3.5.2. 单一RT-PCR和多重RT-PCR反应体系及条件的优化 |
| 3.5.3. 单一PCR和多重PCR的灵敏度检测 |
| 3.5.4. 单一RT-PCR和多重RT-PCR对田间样品的检测应用 |
| 3.6. 构建无内含子的体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 |
| 3.6.1. 构建pMD-AB、pMD-CD、pMD-EF、pGEM-ABC和pGEM-DEF |
| 3.6.2. 构建无内含子的体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 |
| 3.7. 构建含内含子的体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 |
| 3.7.1. 马铃薯ST-LS1和菜豆NiR基因的内含子序列测定 |
| 3.7.2. 构建含intron 2的体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 |
| 3.7.3. 构建含intron IV2的体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 |
| 3.7.4. 构建含intron2/IV2体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 |
| 3.8. 体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆的侵染性分析 |
| 3.8.1. PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆的体外转录 |
| 3.8.2. 体外转录侵染性克隆的体外转录物接种与症状表现 |
| 3.8.3. 体外转录侵染性克隆体外转录物接种后的RT-PCR检测 |
| 3.8.4. 侵染性克隆pT7-FL-In2和pT7-FL-In2/IV2侵染后的内含子检测 |
| 3.9. 酵母重组系统构建体内转录的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 |
| 3.9.1. 构建体内转录的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 |
| 3.9.2. 构建含intron 2的体内转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 |
| 3.10. 体内转录的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆的侵染性分析 |
| 3.10.1. PLDMV-DF的沉默抑制子HC-Pro瞬时表达载体的构建 |
| 3.10.2. 体内转录侵染性克隆农杆菌注射接种与症状表现 |
| 3.10.3. 体内转录侵染性克隆农杆菌注射接种后RT-PCR检测及侵染效率 |
| 3.11. 酵母重组系统构建PLDMV-DF的病毒表达载体 |
| 3.11.1. 构建PLDMV-DF的P1/HC-Pro之间插入GFP的病毒表达载体 |
| 3.11.2. 构建PLDMV-DF的NIb/CP之间插入GFP的病毒表达载体 |
| 3.12. PLDMV-DF病毒表达载体的表达分析 |
| 3.12.1. PLDMV-DF病毒表达载体的农杆菌注射接种与症状表现 |
| 3.12.2. PLDMV-DF病毒表达载体接种后的RT-PCR检测及侵染效率 |
| 3.12.3. PLDMV-DF病毒表达载体的农杆菌注射接种后GFP荧光检测 |
| 3.12.4. PLDMV-DF病毒表达载体的western blot分析 |
| 3.13. 4种不同长度CP基因植物ihpRNA表达载体的构建 |
| 3.14. 植物ihpRNA表达载体沉默效率的检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1. 番木瓜畸形花叶病毒海南东方分离物的鉴定 |
| 4.2. PLDMV-DF全长基因组序列的测定与解析 |
| 4.3. PLDMV、PRSV和PaMV RT-LAMP可视化检测技术的建立 |
| 4.4. PLDMV、PRSV和PaMV的多重RT-PCR检测方法的建立 |
| 4.5. 体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆的构建与侵染性分析 |
| 4.5.1. 无内含子的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆的构建与分析 |
| 4.5.2. 含内含子的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆的构建与分析 |
| 4.6. 体内转录的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆与侵染性分析 |
| 4.7. 插入外源gfp报告基因的PLDMV-DF病毒表达载体的构建与表达 |
| 4.7.1. 在P1/HC-Pro之间插入gfp的病毒表达载体的构建与表达分析 |
| 4.7.2. 在NIb/CP之间插入GFP的病毒表达载体的构建与表达分析 |
| 4.8. 用GFP的病毒表达载体在原生质体中验证ihpRNA载体的沉默效率 |
| 研究结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（10）灵芝木质素降解酶系相关基因的克隆与酵母表达（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 灵芝的分子鉴定和环境生物技术应用 |
| 1.1 灵芝的分类与分布 |
| 1.2 灵芝的鉴定 |
| 1.2.1 灵芝的传统鉴定方法 |
| 1.2.2 灵芝的现代鉴定方法 |
| 1.3 灵芝在木质素降解和环境修复中的应用 |
| 1.3.1 木质素降解和相关酶系 |
| 1.3.2 灵芝中与木质素降解相关的酶 |
| 1.3.3 灵芝木质素修饰酶系的环境应用 |
| 1.3.4 灵芝木质素修饰酶系的应用前景 |
| 第二章 基于特异基因序列分析灵芝菌种间遗传多样性 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 灵芝菌种的培养 |
| 2.3.2 灵芝菌丝体基因组 DNA 的提取 |
| 2.3.3 灵芝真菌免疫调节蛋白基因的克隆和遗传多样性分析 |
| 2.3.4 灵芝细胞核核糖体 ITS1-5.8S-ITS2 的克隆和遗传多样性分析 |
| 2.3.5 灵芝 mt SSU rDNA V4-V6 区的克隆和遗传多样性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 灵芝漆酶高产菌株的筛选、基因克隆、酵母表达 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 灵芝漆酶高产菌株的初步筛选 |
| 3.3.2 漆酶高产菌株的复筛结果 |
| 3.3.3 灵芝漆酶基因的克隆 |
| 3.3.4 灵芝漆酶cDNA序列的拼接 |
| 3.3.5 灵芝漆酶基因的生物信息学分析 |
| 3.3.6 灵芝漆酶基因的酵母表达 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 灵芝锰过氧化酶基因的基因克隆与酵母表达 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 灵芝锰过氧化物酶全长cDNA序列的克隆 |
| 4.3.2 灵芝锰过氧化物酶基因的编码区的性质和结构预测 |
| 4.3.3 灵芝锰过氧化物酶基因编码区的同源性分析 |
| 4.3.4 灵芝锰过氧化物酶基因的进化分析 |
| 4.3.5 灵芝锰过氧化物酶基因的酵母表达 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 研究总结 |
| 5.1.1 综述了灵芝鉴定、木质素降解相关酶的研究现状及环境应用 |
| 5.1.2 采用灵芝特异基因序列进行分子鉴定的研究 |
| 5.1.3 克隆了灵芝漆酶基因并在毕赤酵母中表达 |
| 5.1.4 克隆了灵芝锰过氧化物酶基因并在毕赤酵中表达 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
四、利用套叠PCR技术改造酵母表达载体pAO815的研究（论文参考文献）
- [1]疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的理性设计及高效表达研究[D]. 魏子翔. 武汉轻工大学, 2021(02)
- [2]基因剂量及基因突变对β-半乳糖苷酶表达的影响[D]. 成静. 武汉轻工大学, 2020(06)
- [3]基因剂量及基因突变对β-甘露聚糖酶表达的影响[D]. 陈祺琛. 武汉轻工大学, 2018(01)
- [4]果胶裂解酶在毕赤酵母中高效表达及酶学性质分析[D]. 彭小波. 武汉轻工大学, 2018(01)
- [5]扩展青霉脂肪酶氧阴离子洞结构突变株的表达及性质鉴定[D]. 张向领. 福建师范大学, 2018(09)
- [6]扩展青霉脂肪酶的定向进化及稳定性的提高[D]. 谢盛. 福建师范大学, 2017(06)
- [7]阿魏酸酯酶O42807在毕赤酵母GS115中的表达[J]. 陈云华,李慧,张光亚,葛慧华,李夏兰. 华侨大学学报(自然科学版), 2016(02)
- [8]玉米赤霉烯酮降解酶高效分泌表达及其酶学特性研究[D]. 王义春. 中国农业科学院, 2015(01)
- [9]番木瓜畸形花叶病毒检测鉴定及侵染性克隆构建与应用[D]. 庹德财. 海南大学, 2015(07)
- [10]灵芝木质素降解酶系相关基因的克隆与酵母表达[D]. 周选围. 上海师范大学, 2014(02)