一、人巨细胞病毒对人脐血巨核系祖细胞生长的影响及作用机制研究（论文文献综述）
南雪[1]（2013）在《Ⅰ 脐带血巨核系祖细胞注射液有效性临床试验研究 Ⅱ 人造血转录因子GATA-1的功能初探》文中提出一、研究背景近年来，我国血源短缺的问题日益严重，当前我国献血量仅为0.84%，远远低于世界高收入国家的4.54%和中等收入国家的1.01%，并且临床用血需求以每年10-15%的速度快速增长，而采血量的增幅，以北京、天津为例，仅为2.9%和6.5%。血液供与求之间巨大的差距，造成我国多个城市用血极度紧张，从而大大影响急重症患者的临床治疗。在军事医学方面，血液保障也占有举足轻重的作用。现代战争是在核武器威胁下的以高技术兵器为主的战争，核武器、化学或者生物武器损伤成为战斗减员的重要因素之一。其中核化生武器所造成的骨髓损伤抑制及其并发的血小板减少和贫血危害巨大。因此，亟待寻找一种合适有效的“人工血液”替代一部分临床用血，不仅可以缓解临床输血的压力，而且对战时血液保障提供了技术支持与储备，具有重要的社会价值与战略意义。众所周知，造血干细胞具有自我更新与多向分化潜能的优势，已成功地应用于恶性肿瘤、各种血液性疾病等的支持治疗和免疫治疗。我室前期的研究结果表明，脐带血含有丰富的造血干/祖细胞，其增殖能力强，分裂期细胞多，在适宜的扩增时间及合理的细胞因子组合下，可以在扩增造血细胞的同时定向诱导其分化，产生大量功能细胞，如巨核系祖细胞、红系祖细胞、粒系细胞等，以及分化终末期的血小板、红细胞、树突状细胞、NK细胞等。根据上述研究基础，我室研发出两种新的脐带血造血细胞产品---“脐带血红系祖细胞注射液”和“脐带血巨核系祖细胞注射液”，均获得国家食品药品监督管理局（SFDA）临床试验批文。如果通过这两种细胞产品的临床试验，证实其安全性及有效性，并获得临床使用许可，这将是输血治疗以及造血支持治疗中的一次重要的技术突破。那么选择什么样的疾病作为临床试验的适应症来证实我们研发的细胞产品的生物安全性与治疗有效性呢？恶性肿瘤是严重威胁人们生命健康的一类重大疾病。放化疗是恶性肿瘤的主要治疗方法，然而却可导致严重的造血损伤，从而引起红细胞、白细胞、血小板的产生减少、破坏加重，表现为贫血、出血、感染等，严重者可致死亡。特别是恶性血液病患者，不仅普通的放化疗可以导致造血损伤，而且造血干细胞移植（HSCT）的预处理治疗、移植物抗宿主病（GVHD）将进一步加重造血损伤。目前临床上已用重组的红细胞生成素（EPO）、粒/单细胞集落刺激因子（G-CSF/GM-CSF）来改善由于化疗引发的贫血和粒细胞减少，然而目前还没有一种能够有效改善放化疗后血细胞减少的药物。另一种最常用的治疗方式是输注血小板与红细胞，这种治疗方式对于防止患者自发性出血以及改善患者贫血症状，保证抗癌药物、化疗药物按规定的疗程用完起到重要的辅助治疗作用。据统计，美国每年为缓解化疗后引起的血细胞减少消耗的血液量约200万单位，中国每年用血量超过1500万单位。然而，血液供应的缺口严重影响这些患者的治疗。此外，反复输注血小板面临血小板输注无效，反复输注红细胞可致含铁血黄素沉着，引起继发性血色病，导致肝硬化、心力衰竭、糖尿病、性腺功能障碍等一系列输血并发症，同时也不可避免地增加了血源性感染及输血反应发生的概率。面对上述恶性肿瘤放化疗后血细胞减少症的治疗现状，我们根据脐带血来源的血细胞产品制备周期、保存时效等特点，通过与多家临床单位的反复咨询沟通，选择了这种定期或择机择时进行输血治疗的内科系统疾病例如恶性肿瘤放化疗后的造血损伤作为我们细胞产品适合应用的疾病类型，并以恶性肿瘤尤其是恶性血液病放化疗后的造血损伤为适应症开展临床试验研究，如果能解决这部分患者血液来源以及治疗效果的问题，那么将具有重要的社会价值与经济效益。二、研究目的本研究针对前期已获SFDA临床试验批文的“巨核系祖细胞注射液”，选择可以定期或择机择时进行输血治疗的恶性肿瘤尤其是恶性血液病放化疗后造血损伤为适应症，并依据适应症的特点对细胞产品的制备技术与质控标准等进行相应修改、补充、调整及完善，随后开展临床试验研究，证实细胞产品的生物安全性及治疗有效性，继而获得国家相关主管部门的临床使用许可，为临床成分输血和战时血液保障提供新的血细胞来源。同时，由于这两项脐带血造血细胞产品是严格遵守《中华人民共和国药品管理法》及参考国际相关标准研发的新型治疗性干/祖细胞产品，在临床试验过程中将严格按照临床试验批件、国家卫生部《医疗技术临床应用管理办法》以及参照国际干细胞研究学会《干细胞临床转化指南》等相关标准进行研究，为干细胞从基础研究到临床应用的转化探索出一条规范之路。三、主要研究内容与方法：1.根据“脐带血巨核系祖细胞注射液”Ⅰ期安全性临床试验研究结果，修改并完善细胞产品的标准化制备操作规程、质量控制操作规程、运输与保存操作规程、临床输注标准化操作规程。2.建立并制定“脐带血巨核系祖细胞注射液”有效性临床试验研究方案，建立并制定标准化临床有效性指标检测操作规程。3.整理“脐带血巨核系祖细胞注射液治疗肿瘤放化疗后血小板减少临床试验研究”相关材料，申报总后勤部卫生部临床新技术批文，并开展有效性临床试验研究。4.建立并制定“脐带血巨核系祖细胞注射液”的有效性临床试验标准化研究方案，确保临床试验数据的标准、真实、可控及科学。5.完成临床试验研究的细胞产品的制备、质控及指标检测，并收集、整理、分析临床有效性试验数据。四、实验结果1.通过整理与分析脐带血巨核系祖细胞Ⅰ期临床试验的细胞产品的制备、质控数据及临床生物安全性试验数据，修改与完善了细胞产品的标准化制备操作规程、质量控制操作规程、运输与保存操作规程、临床输注标准化操作规程、原始试验记录（样表）等文件。2.整理申报总后勤部卫生部临床新技术“脐带血巨核系祖细胞注射液治疗肿瘤放化疗后血小板减少临床试验研究”有关细胞制备与质量控制部分的材料，并于2011年5月获得批文。3.从2011年10月至2013年04月，共制备“脐带血巨核系祖细胞注射液”45例。经检定，细胞状态良好，细胞扩增率达5-10倍，细胞存活率均为90%以上，巨核系祖细胞特异性表面标志CD41的表达率为40-60%，细菌及真菌检测、支原体检测、内毒素检测等均为阴性，45例细胞产品全部符合质量控制标准。4.从2011年10月至2013年04月，共制备“脐带血巨核系祖细胞注射液”45例，均顺利完成临床输注。在可评价有效性的病例中，初步证实可明显升高患者血小板数量。
刘颖[2]（2011）在《人脐血基质细胞联合移植促进造血细胞归巢植入及支持造血重建的实验研究》文中认为造血微环境（hematopoietic inductive microenvironment,HIM）是支持和调节造血干/祖细胞（haemopoietic stem/progenitor cell,HSPC）生长发育的内环境,其结构和功能的完整统一是维系造血功能正常进行的重要环节。作为造血微环境的重要组成部分,基质细胞可能通过形成造血干细胞（hematopoietic stem cell,HSC）生长的“龛”,分泌造血生长因子（hematopoietic growth factor,HGF）和细胞外基质（extracellular matrix,ECM）等参与造血细胞的自我更新、增殖分化和归巢定位,在免疫调节方面也具有重要的作用。深入探讨基质细胞对骨髓造血功能的影响,从修复或重建骨髓微环境正常功能入手治疗造血功能损伤具有重要的理论价值和实际意义。基质细胞由间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）分化而来,是一个包括成纤维细胞、内皮细胞、成骨细胞、脂肪细胞、巨噬细胞和网状细胞等成分复杂的异质细胞群。自1977年Dexter在体外培养出人骨髓基质细胞（human bone marrow stromal cells,hBMSCs）获得成功后,人们对hBMSCs进行了深入的研究。经实验研究和临床实践证实,hBMSCs体外培养扩增联合HSC回输是重建造血功能的有效方法。但hBMSCs来源受限,采集骨髓增加供者痛苦和风险,且细胞数量及增殖分化潜能随供者年龄增加而下降。自体移植中患者自身基质细胞存在异常,而异体移植亦有可能带来移植物抗宿主病（graft-versus-host disease,GVHD）等免疫相关问题,均限制了hBMSCs在临床上的广泛运用。人脐血来源丰富,取材方便,具有未成熟的干/祖细胞比例高且免疫原性较低等特点,在多种造血系统恶性疾病临床治疗中具有潜在的应用价值。本课题组长期从事人脐血源基质细胞（human umbilical cord blood-derived stromal cells,hUCBDSCs）及脐血造血微环境的研究,前期研究通过特定的细胞因子使hUCBDSCs得以有效扩增,扩增后的hUCBDSCs在细胞成分和免疫表型上与hBMSCs相似,能够分泌表达多种细胞因子,具备造血基质细胞的基本特征。以hUCBDSCs为滋养层的培养体系能有效支持脐血CD34+细胞体外扩增,特别对于促巨核细胞集落形成单位（colony forming unit-megakaryocte,CFU-Mk）形成的作用明显优于hBMSCs,提示hUCBDSCs在促进巨核系增殖分化成熟方面可能具有重要的意义。深入探讨hUCBDSCs移植在体内支持和调控造血、重建造血微环境的作用可为造血功能损伤修复治疗提供新的思路。基于上述分析,本课题首先建立两种不同来源基质细胞滋养层（hUCBDSCs和hBMSCs）培养体系,采用CCK-8法和Transwell法分别观察两种基质细胞对脐血单个核细胞（human umbilical cord mononuclear cells,hUCB-MNCs）增殖、粘附和迁移的影响,并采用RT-PCR法检测hUCBDSCs对归巢相关分子mRNA的表达情况。在此基础上建立BABL/c小鼠造血微环境辐照损伤模型,采用hUCB-MNCs单移植,或分别联合两种不同来源基质细胞共移植的方法,比较观察两种基质细胞促进造血细胞体内归巢与植入、重建造血微环境及支持造血重建的作用,为安全有效的临床移植治疗提供新的辅助措施和手段。方法:1.体外构建hUCBDSCs和hBMSCs两种不同来源基质细胞滋养层培养体系。采用CCK-8法和Transwell法分别检测两种基质细胞对hUCB-MNCs体外增殖、粘附和迁移的影响;采用RT-PCR法检测hUCBDSCs对归巢相关因子（SDF-1、CXCR-4、ICAM-1、VCAM-1、HCAM、PECAM-1、Fn）mRNA的表达情况。2.以近交系BABL/c小鼠作为受体鼠,经60COγ射线致死剂量8.5 Gy全身照射预处理后分别接受不同剂量hUCB-MNCs（2、4、6或8×106/只）单移植,或联合hUCBDSCs（2×106/只）共移植,移植后第6周流式细胞仪检测小鼠骨髓人源CD45+细胞植入率。3.采用CM-DiI荧光染料预染hUCB-MNCs,辐照后BABL/c小鼠分别接受hUCB-MNCs（2×106/只）单移植,或联合两种不同来源基质细胞（2×106/只）共移植。激光共聚焦显微镜追踪观察移植后荧光标记hUCB-MNCs在小鼠体内的迁移分布情况,比较各组造血细胞归巢率。4.辐照后小鼠分别接受hUCB-MNCs（2×106/只）单移植,或联合两种不同来源基质细胞（2×106/只）共移植。观察移植后各组小鼠存活情况,记录生存率;动态检测外周血血象恢复情况,骨髓组织病理切片观察骨髓病理变化;不同时相点计数各组小鼠骨髓成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）、脾集落形成单位（CFU-S）、粒/巨噬细胞集落形成单位（CFU-GM）和巨核细胞集落形成单位（CFU-Mk）产率。结果:1. hUCBDSCs对脐血单个核细胞体外增殖、粘附和迁移能力的影响同hBMSCs共培养组和hUCB-MNCs单独培养组相比较,hUCB-MNCs在hUCBDSCs共培养条件下增殖能力显着增强。两种基质细胞均能促进hUCB-MNCs的粘附,且共培养后hUCB-MNCs迁移能力也显着（P<0.05）强于无基质细胞支持对照。hUCBDSCs明显表达与造血细胞归巢植入密切相关的粘附分子、细胞因子及受体（SDF-1、CXCR-4、ICAM-1、VCAM-1、HCAM、PECAM-1、Fn）mRNA,揭示其对造血细胞在体内的归巢和植入具有重要作用。2. hUCBDSCs联合移植促进造血细胞归巢和植入辐照后小鼠分别接受不同剂量hUCB-MNCs（2、4、6或8×106/只）单移植,或联合hUCBDSCs（2×106/只）共移植。采用不同剂量的hUCB-MNCs单移植后的植入率随hUCB-MNCs输注量增加而增长。hUCBDSCs联合移植能不同程度提高小鼠骨髓中人CD45+细胞植入比例,尤其当输注低剂量hUCB-MNC（s2×106/只）时,hUCBDSCs共移植较单移植的植入率提高最为显着。激光共聚焦显微镜下观察CM-DiI标记的hUCB-MNCs在移植后2～3天主要归巢至骨髓和脾脏。移植后48小时,hUCBDSCs共移植组归巢率显着（P<0.05）高于hBMSCs共移植组和单移植组,显示移植后早期hUCBDSCs能促进造血细胞向骨髓迁移归巢。3.hUCBDSCs联合移植修复受损微环境,支持造血重建两种基质细胞共移植组在移植后均能促进小鼠存活,血象恢复较快,在移植后28天内恢复至照射前水平。其中,hUCBDSCs共移植组血小板受抑程度较轻,回升也较快,并于移植后21天恢复至照射前水平;h BMSCs共移植组白细胞于移植后10天迅速回升,在此后恢复趋势高于hUCBDSCs共移植组;共移植两组间血红蛋白变化趋势无显着性差异。hUCBDSCs联合移植移植后促进骨髓组织恢复,重建受损微环境,提高CFUs（CFU-F,CFU-S,CFU-GM,CFU-Mk）产率,特别是CHU-Mk数量较h BMSCs联合移植增多,提示hUCBDSCs对于促巨核系增殖分化具有重要作用。结论:1. hUCBDSCs能促进脐血单个核细胞增殖、粘附和迁移,且促增殖能力较h BMSCs强。人脐血源基质细胞显着表达一些归巢相关因子的mRNA。2. hUCBDSCs联合移植能提高移植后小鼠造血植入率,特别当造血细胞输注为低剂量时,这种作用更加显着。3. hUCBDSCs联合移植能促进造血细胞早期迁移归巢至骨髓和脾脏,提高归巢效率。4. hUCBDSCs联合移植能提高小鼠存活,促进移植后造血重建并修复受损微环境。
黄媚贤,刘文君,郭渠莲,陈军红,施翰[3]（2010）在《人巨细胞病毒感染对脐血红系祖细胞发育过程中Hoxb2,Hoxb4基因表达的影响》文中认为背景:人巨细胞病毒感染可损害造血系统,甚至造成骨髓衰竭。人巨细胞病毒感染抑制红系祖细胞增殖和分化,是否与受染红系祖细胞增殖的基因异常表达有关?目的:观察人巨细胞病毒和/或全反式维甲酸对人脐血造血干细胞向红系祖细胞定向增殖分化过程进行干预后Hoxb2、Hoxb4基因表达的变化。方法:取12例正常足月顺产新生儿断脐后的胎盘段脐血,采用造血干细胞体外培养技术及实时荧光定量聚合酶链反应方法,以人巨细胞病毒-AD169和（或）6×10-8mol/L的全反式维甲酸持续干预人脐血造血干细胞向红系定向增殖分化过程,检测空白组、全反式维甲酸组、人巨细胞病毒组、全反式维甲酸+人巨细胞病毒组在培养第3,7,10天红系祖细胞Hoxb2、Hoxb4基因的表达情况。结果与结论:各组Hoxb2、Hoxb4基因均在增殖分化的第3天已有表达,第7天表达明显增加,第10天表达最强烈。与空白组相比,人巨细胞病毒组明显下降;与人巨细胞病毒组相比,全反式维甲酸+人巨细胞病毒组的Hoxb2、Hoxb4基因表达量明显增加（P<0.05）。提示人巨细胞病毒可能通过调控Hoxb2、Hoxb4基因异常表达而引起造血功能异常;Hoxb2、Hoxb4均与红系造血有相关性;6×10-8mol/L全反式维甲酸能显着上调正常红系祖细胞Hoxb2、Hoxb4基因的表达,也能上调经人巨细胞病毒感染的红系祖细胞Hoxb2、Hoxb4基因的表达。
高蕾[4]（2008）在《人脐血源基质细胞促进巨核细胞增殖作用及机制探讨》文中研究说明造血功能障碍是恶性肿瘤化学药物治疗和大剂量放射线治疗、放射源意外泄漏和核战争条件下急性放射损伤的主要并发症之一。其中,巨核细胞损伤导致的血小板减少除输注血小板外,尚缺乏有效的治疗手段。血小板生成素（thrombopoietin,TPO）作为刺激巨核细胞增殖和血小板生成的重要细胞因子仍存在治疗后产生抗凝血抗体、加重出血的危险性。如何安全有效地促进血小板数量和功能的恢复,尚需探索。造血微环境（hematopoietic inductive microenvironment,HIM）是支持和调节造血细胞生长发育的内环境,具有促进巨核细胞增殖分化、成熟产板的作用。因此,从修复或重建骨髓造血微环境正常功能入手治疗巨核细胞损伤,是一个值得探索的领域。骨髓基质细胞（human bone marrow stromal cells,hBMSCs）是造血微环境的主要成分,自1977年Dexter在体外培养出骨髓基质细胞获得成功后,人们对BMSCs进行了深入的研究。目前,骨髓基质细胞体外培养扩增联合造血干细胞回输经实验和临床验证是重建造血功能损伤的有效方法。由于自体移植中患者自身造血微环境异常,而异体移植又存在组织相容性的问题,限制了骨髓基质细胞在临床上的广泛运用。人脐血中的细胞成分丰富且较骨髓和外周血更原始,具有来源广泛,采集方便,免疫原性弱和长期造血重建的特点,已成为新的造血干细胞来源。本课题组长期从事人脐血源基质细胞（human umbilical cord blood-derived stromal cells,hUCBDSCs）及脐血造血微环境的研究,前期研究经体外培养扩增获得hUCBDSCs,证明其具备造血基质细胞的基本特征和造血调控功能的物质基础,以hUCBDSCs为滋养层的体外扩增体系促进巨核细胞集落（colony forming unit-megakaryocte,CFU-Meg）形成的作用明显优于hBMSCs,提示hUCBDSCs在促进巨核细胞增殖分化方面可能具有特殊的意义,对其作用特点和机制的深入研究可为巨核细胞损伤修复治疗提供新的思路。鉴于此,本课题在构建巨核细胞/hUCBDSCs共培养模型和裸鼠造血微环境损伤模型的基础上,观察hUCBDSCs体外促进巨核细胞增殖和体内重建造血微环境、促进巨核细胞生成和血小板数量恢复的作用。从TPO途径、SDF-1途径和间隙连接细胞间通`讯三个方面深入探讨hUCBDSCs促进巨核细胞增殖和移植裸鼠血小板恢复的可能机制,为安全有效促进血小板功能和数量恢复提供新的辅助治疗措施。方法:1.观察人脐血源基质细胞促进巨核细胞系HEL增殖的体外研究实验分组:①HEL细胞悬浮培养组;②HEL细胞/hBMSCs共培养组;③HEL细胞/hUCBDSCs共培养组。倒置显微镜和扫描电镜观察HEL细胞和基质细胞的位象关系;CCK8法绘制HEL细胞生长曲线;流式细胞仪检测HEL细胞的细胞周期和凋亡坏死情况,透射电镜观察HEL细胞超微结构。2.观察人脐血源基质细胞移植重建造血微环境促进巨核细胞生成的在体研究对裸鼠实施不同辐照剂量照射,观察裸鼠辐照后不同时相点血象、骨髓象、CFU-F等指标变化,探索适宜本研究的造血微环境损伤动物模型的辐照剂量。根据上述实验结果,选定5.0Gy作为造血微环境损伤动物模型的辐照剂量;实验分组:①生理盐水组;②hBMSCs组;③hUCBDSCs组。观察不同移植组造血微环境重建和巨核细胞、血小板数量恢复情况。动态观察CM-DiI标记hUCBDSCs裸鼠体内迁移情况。3.人脐血源基质细胞促进巨核细胞增殖的机制研究3.1 TPO途径在人脐血源基质细胞促进巨核细胞增殖中的作用ELISA法动态检测hBMSCs和hUCBDSCs培养上清TPO浓度;激光共聚焦、流式细胞仪检测不同培养条件下HEL细胞C-mpl蛋白表达,RT-PCR检测HEL细胞C-mpl mRNA表达水平。3.2 SDF-1途径在人脐血源基质细胞促进巨核细胞增殖中的作用ELISA法动态检测hBMSCs和hUCBDSCs培养上清SDF-1浓度;激光共聚焦、流式细胞仪检测不同培养条件下HEL细胞CXCR4蛋白表达,RT-PCR检测HEL细胞CXCR4 mRNA表达水平。3.3间隙连接细胞间通讯在人脐血源基质细胞促进巨核细胞增殖中的作用荧光漂白恢复（FRAP）技术检测细胞间通讯功能;激光共聚焦显微镜观察共培养条件下HEL细胞和hUCBDSCs Cx43蛋白表达;RT-PCR法检测共培养条件下HEL细胞和hUCBDSCs Cx43 mRNA水平表达情况。透射电镜观察共培养条件下HEL细胞和hUCBDSCs细胞连接处超微结构。结果:1.倒置显微镜观察,HEL细胞粘附在hUCBDSCs表面,呈球形,随培养时间的延长,HEL细胞数量逐渐增多;扫描电镜观察发现HEL细胞可通过伪足粘附于hUCBDSCs表层,或龛于hUCBDSCs融合所形成的“网眼”中,甚至移行到hUCBDSCs层下,部分hUCBDSCs胞膜突起与多个HEL细胞粘附,形成“放射状”排列。HEL细胞生长曲线显示HEL/hUCBDSCs组细胞生长速度最快;细胞周期结果显示HEL/hUCBDSCs组S+G2/M期细胞比例最高（P<0.05）,突显出hUCBDSCs在巨核细胞增殖中的特殊促进作用。凋亡率结果显示三组之间无显着性差异（p>0.05）。2.裸鼠接受不同剂量辐照所表现出来的血象变化程度不同,5.0Gy组裸鼠有明显骨髓抑制和CFU-F计数降低,且在照射后自行恢复,是裸鼠造血微环境损伤的理想辐照剂量。移植裸鼠实验结果显示:基质细胞有明显的促进血小板恢复的作用,其中hUCBDSCs作用最强。采用CM-DiI标记hUCSDCs移植裸鼠,激光共聚焦显微镜观察发现:hUCSDCs在肝脏、脾脏和肺脏组织间隙短暂“停留”后,迅速“归巢”至骨髓重建损伤造血微环境。3.人脐血源基质细胞促进巨核细胞增殖的机制研究3.1 ELISA检测结果显示hUCBDSCs分泌表达TPO水平明显高于hBMSCs,分泌高峰稍迟于hBMSCs,传代后hUCBDSCs培养上清中的TPO浓度仍高于hBMSCs。流式细胞仪和激光共聚焦检测均显示其C-mpl蛋白的表达明显增强;RT-PCR检测不同培养条件下HEL细胞C-mpl mRNA表达情况,结果显示无显着性差异;3.2 ELISA结果显示:体外液体培养前6天,hUCBDSCs和hBMSCs SDF-1分泌水平相当,6天后hUCBDSCs SDF-1分泌水平明显高于hBMSCs,传代后hUCBDSCs培养上清中的SDF-1浓度仍高于hBMSCs;流式细胞仪和激光共聚焦检测均显示与hUCBDSCs和hBMSCs共培养的HEL细胞CXCR4蛋白表达明显减弱,且可在部分HEL细胞胞浆中发现红色点状荧光;RT-PCR检测不同培养条件下HEL细胞CXCR4 mRNA表达情况,结果显示无显着性差异;3.3在本试验条件下,荧光漂白恢复技术检测结果提示hUCBDSCs和HEL细胞之间无明显荧光物质交换,而相互粘连的hUCBDSCs的荧光强度在淬灭后荧光迅速恢复;激光共聚焦显微镜观察共培养条件下HEL细胞Cx43表达较弱,呈均匀分布,hUCBDSCs Cx43表达较强,可见呈点状群聚分布的高亮斑块;RT-PCR检测在HEL/hUCBDSCs共培养体系中,HEL细胞Cx43 mRNA的表达明显低于hUCBDSCs。结论:1.人脐血源基质细胞具有促进巨核细胞增殖的作用:①生长曲线――细胞扩增速度加快;②细胞周期――S+G2/M期细胞比例明显增多;③扫描电镜――可见hUCBDSCs粘附、龛合、包裹HEL细胞;④透射电镜――可见大量增殖旺盛的HEL细胞和核分裂相;2.人脐血源基质细胞具有重建移植裸鼠造血微环境和促进巨核细胞和血小板数量和功能恢复的作用;3. hUCBDSCs通过分泌高水平TPO,上调巨核细胞C-mpl蛋白的表达,促进巨核细胞增殖、分化、产板;4. hUCBDSCs通过分泌高水平SDF-1,促进巨核细胞的迁移和增殖,在迁移的过程中巨核细胞表面CXCR4表达降低,形成“内吞小泡”,调控巨核细胞的迁移;5.本试验条件下,hUCBDSCs和HEL细胞间未检测到间隙连接细胞间通讯,提示GJIC功能对hUCBDSCs促进巨核细胞增殖的作用不明显。
姚军霞,刘莉,刘仲萍,黄士昂[5]（2007）在《人巨细胞病毒对巨核细胞生长的影响及其反义寡核苷酸的抗病毒活性》文中指出目的探讨人巨细胞病毒（HCMV）对人巨核系祖细胞的抑制作用及其机制,初步研究HCMV反义寡核苷酸（ASON）的抗病毒感染作用。方法采用体外悬浮培养巨核系细胞,观察HCMV AD169株对巨核系祖细胞生长的影响。用流式细胞术检测HCMV感染巨核系细胞上HCMV pp65抗原的表达。用HCMV感染经ASON预处理的巨核细胞,计数存活巨核细胞数,用FACS检测巨核细胞上HCMV pp65蛋白表达,并用MTT法测定ASON的细胞毒性。结果HCMV AD169株在体外能明显抑制巨核系祖细胞的增殖,悬浮培养第12天,与对照组相比,HCMV感染组的巨核细胞数减少了67.86%（P<0.05）。HCMV感染的巨核系细胞有HCMV pp65抗原的表达,其表达率为（24.5±3.1）%。0.08μmol/L的UL36反义寡核苷酸（UL36Anti）能对抗HCMV的作用,使巨核细胞数保持在未被感染时的水平,与HCMV感染组巨核细胞数比较有显着差异（P<0.05）。UL36Anti组巨核细胞上几乎无HCMV pp65蛋白的表达。MTT结果表明UL36Anti显着影响细胞生长的浓度为90μmol/L。结论HCMV感染引起的血小板减少与其抑制巨核系祖细胞增殖有关。特异的ASON有一定的抗HCMV活性,有可能作为一种新的手段用于HCMV感染引起的血小板减少症的防治。
周小莹[6]（2007）在《rAAV介导TPO基因修饰的骨髓MSCs对巨核系造血生成的作用研究》文中研究表明目的：对于肿瘤患者在接受高剂量放疗、化疗后，或非化疗的病人如骨髓异常增生综合征，先天性血小板减少性紫癜，慢性肝脏疾病等，血小板减少症引起的出血是患者死亡的主要原因之一。血小板输注治疗是目前严重血小板减少症的唯一的紧急治疗措施。但是，血小板输注仍然存在如异体免疫反应，感染抗原的传播，输注反应等严重的问题。因此，本研究拟通过rAAV介导TPO基因修饰骨髓MSCs，并探讨其对巨核系造血的作用。方法与结果：1．骨髓间质干细胞的分离与培养本研究采用密度梯度离心法结合贴壁法体外培养获取人骨髓MSCs，分别诱导MSCs向成骨和成脂肪分化，采用Von Kossa法和油红0染色分别检测诱导后的成骨细胞和脂肪细胞。结果表明通过体外原代和传代培养获得高效扩增能力的MSCs，随着传代次数的增加，细胞的增殖能力下降。向成骨诱导2周左右Von Kossa法染色可见大量黑色钙盐沉积；向成脂诱导3周油红0染色显示大量红色脂滴。2．骨髓MSCs条件培养液对诱导人巨核细胞系Meg-01细胞分化的作用收集骨髓MSCs的条件培养液（MSCs-CM），将MSCs-CM加入早期巨核祖细胞Meg-01细胞系的培养体系中，诱导Meg-01巨核细胞系分化成熟。NF-E2表达是巨核细胞生成血小板所必需的，RT-PCR结果表明，MSCs-CM处理的Meg-01细胞系NF-E2表达增强，说明MSCs-CM能促进巨核细胞分化成熟。Altas cDNA expression array结果表明，与对照组比较（无MSCs-CM作用的Meg-01细胞），MSCs-CM作用的Meg-01细胞中7个基因表达上调，5个基因表达下调。通过对差异表达的基因进行分析，其中与细胞周期中有丝分裂有关的基因，如microtubule-associated protein、CDC20表达下调；与细胞内Ca2+相关细胞内信号传导分子，如calcium／calmodulin-dependent prote in kinaseⅣ表达上调，与JAK3途径有关细胞内信号传导分子，如Janus kinase 3表达上调；与凋亡相关的基因tumor necrosis factor、adenosine A1 receptor表达上调；巨核细胞分化成熟的基因PDGF-A表达上调。这些结果为进一步研究MSCs-CM对巨核细胞的调节作用提供了分子基础。3．骨髓MSCs条件培养液联合TPO或IL-11对巨核系细胞体外生成的影响有文献报道血小板生成素（thrombopoietin，TPO）或白细胞介素11（interleukin-11，IL-11）是有效促进巨核细胞生成的细胞因子，本研究中比较骨髓MSCs-CM，MSCs-CM联合TPO或MSCs-CM联合IL-11对体外培养条件下骨髓来源的巨核系细胞生成的影响。结果表明：MSCs-CM，MSCs-CM联合TPO或MSCs-CM联合IL-11均能促进巨核系祖细胞和成熟巨核细胞的生成。与MSCs-CM单用或TPO单用比较，MSCs-CM和TPO联用后对巨核系祖细胞和成熟巨核细胞的生成有明显促进作用，TPO与MSCs-CM具有协同作用；而IL-11与MSCs-CM联合后，与MSCs-CM单用或IL-11单用比较，对巨核系细胞生成没有统计学差异，IL-11与MSCs-CM不具有协同作用。结果说明MSCs-CM与TPO联合培养体系将成为促进巨核系细胞生成的一种有效方法。4．获取携带TPO基因的重组腺相关病毒载体本研究中通过RT-PCR从人胎肝中扩增出1059bp大小的TPO基因，将其克隆入pAAV-IRES-GFP质粒中，通过酶切和测序鉴定，成功地构建了重组pAAV-TPO-IRES-GFP（pAAV-TPO）质粒；然后采用磷酸钙共沉淀法将三质粒pAAV-TPO，pAAV-RC，pHelper共转染HEK293细胞，包装含有TPO基因的rAAV-TPO-IRES-GFP（rAAV-TPO）；通过“氯仿处理-PEG／NaCl沉淀-氯仿抽提”三步法纯化获得rAAV-TPO；通过SDS-PAGE蛋白电泳和点杂交检测，获得高纯度的滴度为2×1011vg／ml的rAAV-TPO。然后，我们用rAAV-TPO-IRES-GFP（rAAV-TPO）转染MSCs，TPO基因修饰的MSCs在mRNA水平和蛋白水平TPO的表达明显增加，流式细胞仪检测其GFP的表达率为23.0％±7.18％。5．rAAV介导TPO基因修饰的MSCs对巨核系细胞体外生成的影响收集TPO基因修饰MSCs的条件培养液（TPO／MSCs-CM），分析比较TPO／MSCs-CM和MSCs-CM对体外条件下诱导人骨髓来源的巨核系细胞生成的作用，结果表明，MSCs-CM和TPO／MSCs-CM均能促进巨核系祖细胞和CD41阳性表达的巨核细胞生成，其中TPO／MSCs-CM促进巨核系细胞生成的作用明显强于MSCs-CM，说明用rAAV作为载体介导TPO基因修饰的骨髓MSCs（TPO／MSCs）有望成为促进巨核系细胞生成的安全有效的新方法。6．共移植TPO基因修饰的MSCs对NOD／SCID小鼠巨核系造血生成的作用在体外实验的基础上，我们用NOD／SCID小鼠实验进一步深入探讨TPO／MSCs对巨核系细胞生成的作用。经X射线照射后的NOD／SCID小鼠，输注人骨髓单个核细胞（Mononuclear cells，MNCs），同时共移植人骨髓来源的MSCs或者TPO基因修饰的MSCs（TPO／MSCs），比较TPO／MSCs或MSCs对动物体内巨核系细胞生成的作用。结果表明：MSCs与MNCs或TPO／MSCs与MNCs共移植小鼠后，在小鼠的各个组织（包括骨髓、外周血、脾脏和肝脏）中能检测到人源细胞的Alu序列基因。共移植MSCs与MNCs或TPO／MSCs与MNCs后在骨髓和外周血中对人CD45阳性细胞植入率没有差别。共移植MNCs与MSCs或MNCs与TPO／MSCs后，在小鼠骨髓中人源CD41阳性巨核细胞分别为0.98±0.65％和3.46±1.73％；小鼠骨髓每2×105个单个核细胞生成的CFU-MK数分别为6.20±3.70和20.40±7.16；用HE染色后观察成熟多倍体巨核细胞，骨髓中分别为3.40±1.14和12.60±5.45、脾脏中分别为2.20±0.84和6.80±1.64、肝脏中分别为0和0.80±0.44。此外，移植后每3天计数外周血血小板数，结果表明共移植MSCs与MNCs或TPO／MSCs与MNCs均能促进小鼠体内血小板生成；并且TPO／MSCs+MNCs组更能明显地减轻外周血血小板下降的程度，能保持血小板在一定水平，同时缩短血小板恢复的时间，更加快速地促进血小板的恢复。结论：本研究在体外成功地分离培养出具有高效扩增能力和分化潜能的人骨髓MSCs；并且通过rAAV载体有效地介导TPO在MSCs中的表达，获得TPO基因修饰的MSCs（TPO／MSCs）；进一步研究表明TPO基因修饰的MSCs条件培养液（TPO／MSCs-CM）对于促进骨髓巨核系细胞生成的作用明显优于单独MSCs-CM，用TPO基因修饰的MSCs（TPO／MSCs）与骨髓单个核细胞（MNCs）共移植照射后的NOD／SCID小鼠，其对小鼠体内巨核系造血生成的作用明显优于共移植MSCs与MNCs。
姚军霞,刘筱萍,宋善俊[7]（2006）在《人巨细胞病毒体外感染巨核系细胞的实验研究》文中指出目的探讨人巨细胞病毒（HCMV）对人巨核系细胞的抑制作用及其机制。方法采用体外悬浮培养巨核系细胞技术,观察HCMV AD169株对巨核系祖细胞生长的影响;用聚合酶链反应（PCR）检测HCMV感染巨核系细胞中HCMV即刻早期蛋白（IE）DNA的表达;用流式细胞术检测HCMV感染巨核系细胞上HCMVpp65抗原的表达。结果HCMV AD169株在体外能明显抑制巨核系细胞的增殖。悬浮培养第12天,与对照组相比,HCMV感染组的巨核细胞数减少了82.19%（P<0.05）。HCMV感染巨核系细胞有IE蛋白DNA和pp65抗原的表达,其感染率为（24.5±3.1）%。结论HCMV AD169株在体外能抑制巨核系细胞的增殖,提示HCMV感染引起的血小板减少与其抑制巨核系细胞增殖有关。
李宏颖,刘文君,郭渠莲,邓正华,林江[8]（2006）在《巨细胞病毒感染对淋巴系祖细胞增殖的影响及其干预措施》文中进行了进一步梳理目的探讨人类巨细胞病毒（HCMV）对淋巴系祖细胞（CFU-TL）体外增殖的影响、作用机制及其干预措施。方法本实验共分为空白对照组、灭活对照组、HCMV感染组、更昔洛韦（GCV）干预组、黄芪注射液（AMI）干预组5组。采用甲基纤维素半固体培养CFU-TL集落,不同浓度HCMV-AD169 持续攻击CFU-TL,用AMI、GCV粉剂干预,观察CFU-TL集落形成;用四甲基偶氮唑盐法测HCMV对宿主细胞增殖活性的影响;用PCR检测CFU-TL集落细胞内HCMV-AD169DNA。结果 1．与空白对照组及灭活对照组比较,各病毒感染组CFU-TL集落产率明显减少、维持时间明显缩短（P均<0．01）,抑制程度与病毒感染滴度呈剂量依赖关系;2．HCMV感染48、72、96、120 h对宿主细胞增殖活性的影响与对照组比较均有显着差异（F分别为11．412, 18．058,13．259,56．360 P均<0．01）。3．PCR检测到HCMV感染组CFU-TL集落细胞内HCMV-AD169DNA。4.与HCMV感染组比较,HCMV+AMI组、HCMV+GCV组CFU-TL集落产生率明显增加,集落维持时间均显着延长（P均<0.01）。结论 HCMV在体外能抑制CFU-TL集落的增殖和分化;HCMV感染患儿免疫功能低下可能与HCMV直接抑制CFU-TL有关;GCV、 AMI在体外能有效干预HCMV感染所致的CFU-TL增殖抑制的发生。
张曦[9]（2006）在《VCAM-1基因修饰人脐血源基质细胞移植重建造血微环境功能》文中研究指明骨髓造血微环境（hematopoietic inductive microenvironment,HIM）是造血干/祖细胞生长发育的“土壤”,基质细胞作为造血微环境中的重要成分,不仅与造血干/祖细胞的归巢定位、增殖分化和自我更新密切相关,而且在某些血液系统疾病的发生、发展和转归过程中具有非常重要的作用,探讨基质细胞在造血调控中的作用需继续深入。人脐血中的细胞成分丰富且较骨髓和外周血更原始;脐血细胞具有来源广泛、采集方便、GVHD轻和高增殖的特点,临床应用前景广阔。目前对造血基质细胞的研究主要侧重于骨髓基质细胞,而对于脐血中是否存在基质细胞,脐血源基质细胞的生物学特点如何,能否作为一种新型的造血基质细胞来源等问题尚缺乏系统深入的研究;血管细胞粘附分子（vascular cell adhsion molecule-1,VCAM-1）是骨髓基质细胞参与造血调控不可缺少的粘附分子,它与受体整联蛋白（Integrin）家族中的α4β1特异性结合能起到固定造血干细胞于骨髓基质的作用,对造血干/祖细胞的增殖、分化、迁移中发挥重要调控作用。鉴于此,本课题将人脐血CD34+细胞,采用Dexter贴壁细胞培养体系行脐血源基质细胞培养,探讨人脐血细胞体外扩增基质细胞的可行性和有效性;研究人脐血源基质细胞微环境的造血支持作用;构建荧光蛋白标记的VCAM-1腺病毒载体并转染人脐血源基质细胞,移植给造血微环境辐射损伤裸鼠,探讨其对重建造血微环境功能及促进造血损伤修复的作用,为平战条件下造血功能损伤的救治提供新的辅助治疗措施。1.研究内容及方法:1.1分离人脐血CD34+细胞,采用Dexter贴壁细胞培养体系行脐血源基质细胞培养、传代扩增,采用光镜,电镜、组织细胞化学、免疫细胞化学和流式细胞仪等技术对脐血源基质细胞进行鉴定;1.2采用DNA重组技术,将目的基因VCAM-1克隆至含有报告基因EGFP的穿梭质粒;在BJ5183细胞中与腺病毒基因组进行同源重组,产生重组腺病毒;在脂质体介导下,将重组的腺病毒表达质粒转染293细胞,使腺病毒在293细胞中包装复制,并对转染后的293细胞进行荧光观测,检测培养上清目的蛋白的表达;用高效转染载
陈艾[10]（2006）在《人类巨细胞病毒感染对脐血粒单系祖细胞增殖过程中HOXA5，HOXB6基因表达的影响》文中指出目的:本课题主要探讨人类造血干祖细胞（Hematopoietic Stem-Progenitor Cell,HSPC）向粒单系（Colony Fortming Unit-Granulocyte-macrophage,CFU-GM）增殖过程中HOXB6,HOXA5基因表达的情况,并且用人类巨细胞病毒（Human Cytomegalovirus,HCMV）和/或全反式维甲酸（all-trans-retinoticacid,ATRA）进行干扰,以探讨HCMV、ATRA在此过程中对HOXB6、HOXA5基因的影响,以进一步明确HCMV抑制脐血粒单系祖细胞增殖的机制,以及ATRA能有效治疗粒系白血病,尤其是急性早幼粒细胞白血病的可能机制。方法:1.脐血标本由本院产房提供,取自正常足月顺产新生儿断脐后的胎盘段脐血。2.实验分组。实验分4组:（1）空白对照组:不加病毒液,代之等量IMDM加入基本培养体系。（2）HCMV组:HCMV—AD169滴度为组织培养半数感染量(tissue culture infectious,TCID50)10-4.5/0.1ml,按100TCID50 0.1ml感染培养体系。（3）ATRA组:加入ATRA稀释液0.1ml,终浓度60nmol/（?）l。（4）HCMV+ATRA组:同时加入HCMV—AD169病毒稀释液0.1ml及ATRA0.1ml,终浓度同上。3.采用造血祖细胞体外培养技术,以HCMV—AD169和/或ATRA持续干扰人类造血干祖细胞,观察正常组、HCMV—AD169组、ATRA组、以及ATRA+HCMV组的人类造血干祖细胞经人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony-stimulating,GM-CSF）诱导
二、人巨细胞病毒对人脐血巨核系祖细胞生长的影响及作用机制研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人巨细胞病毒对人脐血巨核系祖细胞生长的影响及作用机制研究（论文提纲范文）
（1）Ⅰ 脐带血巨核系祖细胞注射液有效性临床试验研究 Ⅱ 人造血转录因子GATA-1的功能初探（论文提纲范文）
| 论文主要缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 脐带血巨核系祖细胞注射液有效性临床试验研究 |
| 引言 |
| 第一节 临床级脐带血巨核系祖细胞注射液的制备技术 |
| 第二节 临床级脐带血巨核系祖细胞注射液产品的质量检测 |
| 第三节 脐带血巨核系祖细胞注射液临床输注及有效性观察 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 人造血转录因子 GATA-1 的功能初探 |
| 引言 |
| 第一节 pBpLV-GATA-1 真核表达载体的构建与表达 |
| 第二节 人造血转录因子 GATA-1 的功能初探 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 研究领域文献综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（2）人脐血基质细胞联合移植促进造血细胞归巢植入及支持造血重建的实验研究（论文提纲范文）
| 中英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 前言 |
| 实验方案与技术路线 |
| 第一部分 人脐血源基质细胞对脐血造血细胞体外增殖、粘附和迁移的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 人脐血源基质细胞联合移植促进脐血造血细胞归巢植入的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 人脐血源基质细胞联合移植修复受损微环境重建造血功能的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述 间充质基质细胞在临床移植中的应用进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的文章 |
（4）人脐血源基质细胞促进巨核细胞增殖作用及机制探讨（论文提纲范文）
| 中英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 人脐血源基质细胞促进巨核细胞增殖作用及机制探讨 |
| 前言 |
| 第一部分 人脐血源基质细胞促进巨核细胞系HEL增殖的实验研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第一部分照片 |
| 第二部分 人脐血源基质细胞移植重建造血微环境促进巨核细胞生成的在体研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分照片 |
| 第三部分 人脐血源基质细胞促进巨核细胞增殖的机制研究 |
| 分题一 TPO途径在人脐血源基质细胞促进巨核细胞增殖中的作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 分题二 SDF-1途径在人脐血源基质细胞促进巨核细胞增殖中的作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 分题三 间隙连接细胞间通讯在人脐血源基质细胞促进巨核细胞增殖中的作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分照片 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述 不同来源基质细胞的生物学特点和临床应用 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 |
（5）人巨细胞病毒对巨核细胞生长的影响及其反义寡核苷酸的抗病毒活性（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 脐血标本和病毒来源 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 人脐血CD34+细胞磁性分选 (MACS磁珠分离系统) |
| 1.4 HCMV感染巨核系祖细胞 |
| 1.5 流式细胞仪分析 |
| 1.6 反义寡核苷酸的合成、实验分组及其抗病毒活性评价 |
| 1.7 MTT法测定ASON的细胞毒性 |
| 1.8 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 CD34+细胞的磁性分选 |
| 2.2 HCMV对巨核祖细胞体外扩增的影响 |
| 2.3 HCMV体外感染巨核细胞 |
| 2.4 ASON对HCMV感染巨核细胞数的影响 |
| 2.5 流式细胞仪检测巨核细胞CD41a与HCMV pp65蛋白表达 |
| 2.6 MTT测定UL36 Anti的细胞毒性 |
| 3 讨论 |
（6）rAAV介导TPO基因修饰的骨髓MSCs对巨核系造血生成的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一章 骨髓间质干细胞的分离与培养 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.1.2.1 人骨髓MSCs的分离和体外培养 |
| 1.1.2.2 MSCs的形态学观察 |
| 1.1.2.3 生长曲线的绘制 |
| 1.1.2.4 人骨髓MSCs的体外诱导分化 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 MSCs的形态学观察和传代培养 |
| 1.2.2 生长曲线的绘制 |
| 1.2.3 人MSCs体外向成骨细胞、成脂细胞诱导分化 |
| 1.3 讨论 |
| 第二章 骨髓MSCs条件培养液对诱导人巨核细胞系Meg-01细胞分化的作用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 骨髓MSCs条件培养液(MSCs-CM)的制备 |
| 2.1.2.2 Meg-01人巨核细胞系细胞NF-E2的表达 |
| 2.1.2.3 Atlas Human cDNA Expression Array杂交实验 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 Meg-01人巨核细胞系细胞NF-E2 mRNA的表达 |
| 2.2.2 分析经MSCs-CM处理与未经MSCs-CM处理的Meg-01细胞差异表达的基因 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 骨髓MGCs条件培养液联合TPO或IL-11对巨核系细胞体外生成的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 骨髓MSCs条件培养液(MSCs-CM)的制备 |
| 3.1.2.2 小鼠骨髓细胞悬液制备 |
| 3.1.2.3 成熟巨核细胞体外液体培养 |
| 3.1.2.4 成熟巨核细胞的乙酰胆碱脂酶(AchE)染色 |
| 3.1.2.5 巨核祖细胞的体外扩增 |
| 3.1.2.6 CFU-MK的培养 |
| 3.1.2.7 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 成熟巨核细胞形态 |
| 3.2.2 MSCs-CM对成熟巨核细胞生成数的剂量反应关系 |
| 3.2.3 MSCs-CM联合TPO或IL-11对成熟巨核细胞生成的影响 |
| 3.2.4 MSCs-CM联合TPO或IL-11对巨核系祖细胞生成的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 获取携带TPO基因的重组腺相关病毒载体 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.2.1 人胎肝总RNA的抽提 |
| 4.1.2.2 PCR引物设计与合成 |
| 4.1.2.3 RT-PCR扩增TPO基因 |
| 4.1.2.4 DNA片段回收 |
| 4.1.2.5 DNA重组连接反应 |
| 4.1.2.6 感受态细胞的制备及转化 |
| 4.1.2.7 重组克隆筛选和鉴定 |
| 4.1.2.8 质粒小量提取 |
| 4.1.2.9 质粒大量提取 |
| 4.1.2.10 序列分析 |
| 4.1.2.11 HEK293细胞培养 |
| 4.1.2.12 磷酸钙转染HEK293细胞 |
| 4.1.2.13 回收rAAV |
| 4.1.2.14 病毒纯度的检测 |
| 4.1.2.15 病毒物理滴度的检测 |
| 4.1.2.16 rAAV-TPO转染HEK293细胞 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 pAAV-TPO重组质粒的构建 |
| 4.2.1.1 胎肝总RNA |
| 4.2.1.2 RT-PCR扩增TPO基因 |
| 4.2.1.3 构建pAAV-TPO |
| 4.2.1.4 pAAV-TPO质粒测序鉴定 |
| 4.2.2 病毒的包装与纯化 |
| 4.2.2.1 rAAV-TPO病毒的包装 |
| 4.2.2.2 rAAV-TPO病毒蛋白电泳结果 |
| 4.2.2.3 斑点杂交测定rAAV-TPO的物理滴度 |
| 4.2.2.4 用不同物理滴度的rAAV-TPO转染HEK293细胞 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 以TPO作为目的基因用于基因治疗 |
| 4.3.2 以腺相关病毒载体作为基因治疗载体 |
| 第五章 rAAV介导TPO基因修饰的MSCs对巨核系细胞体外生成的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.1.2.1 人骨髓MSCs的分离和体外培养 |
| 5.1.2.2 rAAV-TPO转染人骨髓MSCs |
| 5.1.2.3 TPO基因修饰的MSCs条件培养液(TPO/MSCs-CM)的制备 |
| 5.1.2.4 人骨髓巨核细胞液体培养体系 |
| 5.1.2.5 CFU-MK的培养 |
| 5.1.2.6 RT-PCR检测骨髓MSCs和TPO基因转染MSCs的TPO表达 |
| 5.1.2.7 细胞蛋白质制备 |
| 5.1.2.8 BCA测蛋白浓度 |
| 5.1.2.9 Western Blot检测骨髓MSCs和TPO基因转染MSCs的TPO表达 |
| 5.1.2.10 流式细胞仪分析 |
| 5.1.2.11 统计学分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 RT-PCR方法检测TPO mRNA的表达 |
| 5.2.2 Western blot检测TPO蛋白质的表达 |
| 5.2.3 转染的MSCs中GFP的表达 |
| 5.2.4 TPO基因修饰的MSCs的条件培养液(TPO/MSCs-CM)对人巨核系细胞生成的作用 |
| 5.2.4.1 TPO/MSCs-CM对液体培养体系中人巨核细胞生成的影响 |
| 5.2.4.2 TPO/MSCs-CM对巨核祖细胞生成的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 共移植TPO基因修饰的MSCs对NOD/SCID小鼠巨核系造血生成的作用 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.1.2.1 分离人骨髓单个核细胞 |
| 6.1.2.2 人骨髓MSCs的分离和体外培养 |
| 6.1.2.3 rAAV-TPO转染人骨髓MSCs |
| 6.1.2.4 细胞移植 |
| 6.1.2.5 移植后检测 |
| 6.1.2.5.1 动物观察 |
| 6.1.2.5.2 移植后小鼠外周血血小板数检测 |
| 6.1.2.5.3 流式细胞仪分析检测人源细胞含量 |
| 6.1.2.5.4 提取基因组DNA,用PCR法检测人特异的Alu序列基因 |
| 6.1.2.5.5 CFU-MK的培养 |
| 6.1.2.5.6 组织学观察 |
| 6.1.2.6 统计学分析 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 经照射小鼠共移植后一般状况观察 |
| 6.2.2 经照射小鼠共移植后外周血血小板数的变化 |
| 6.2.3 经照射小鼠共移植后的组织学观察 |
| 6.2.4 经照射小鼠共移植后CFU-MK的生成 |
| 6.2.5 经照射小鼠共移植后外周血、骨髓中人源CD45细胞含量 |
| 6.2.6 经照射小鼠共移植后骨髓人源CD45细胞中巨核系细胞的含量 |
| 6.2.7 经照射小鼠共移植后骨髓、外周血、肝脏、脾脏中人特异的Alu序列的表达 |
| 6.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间主要的研究成果 |
（7）人巨细胞病毒体外感染巨核系细胞的实验研究（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 1.脐血标本和病毒来源: |
| 2.主要试剂: |
| 3.人脐血CD+34细胞磁性分选 (MACS磁珠分离系统) : |
| 4.HCMV感染巨核系细胞: |
| 5.流式细胞仪分析: |
| 6.聚合酶链反应 (PCR) 检测感染的巨核系细胞中HCMV |
| 7.统计学处理: |
| 结果 |
| 1.CD+34细胞的磁性分选: |
| 2.HCMV对巨核系细胞体外扩增的影响: |
| 3.PCR检测HCMV即刻早期蛋白 (IE) DNA: |
| 4.HCMV体外感染巨核系细胞: |
| 讨论 |
（8）巨细胞病毒感染对淋巴系祖细胞增殖的影响及其干预措施（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
（9）VCAM-1基因修饰人脐血源基质细胞移植重建造血微环境功能（论文提纲范文）
| 中英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 VCAM-1 基因修饰人脐血源基质细胞移植重建造血微环境功能 |
| 前言 |
| 第一部分 人脐血源基质细胞的发现和鉴定 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 照片 |
| 第二部分 VCAM-1 和EGFP 双基因共表达重组腺病毒的构建、鉴定及转染人脐血源基质细胞的实验研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 照片 |
| 第三部分 VCAM-1 修饰人脐血源基质细胞贴壁层对造血支持作用的体外研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 照片 |
| 第四部分 VCAM-1 基因修饰的人脐血源基质细胞移植重建造血微环境功能 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 照片 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述 人脐血造血微环境细胞的研究 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间已发表论文、撰写专着及获科研基金资助情况 |
（10）人类巨细胞病毒感染对脐血粒单系祖细胞增殖过程中HOXA5，HOXB6基因表达的影响（论文提纲范文）
| 1 人类巨细胞病毒感染对脐血粒单系祖细胞增殖过程中HOXA5，HOXB6基因表达的影响 |
| 1.1 中文摘要 |
| 1.2 英文摘要 |
| 1.3 前言 |
| 1.4 材料与方法 |
| 1.5 结果 |
| 1.6 讨论 |
| 1.7 结论 |
| 1.8 参考文献 |
| 1.9 英汉缩略词对照表 |
| 2 致谢 |
| 3 Hox基因及其在造血干／祖细胞增殖分化中的作用(综述) |
| 泸州医学院硕士研究生学位论文独创性声明 |
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四、人巨细胞病毒对人脐血巨核系祖细胞生长的影响及作用机制研究（论文参考文献）
- [1]Ⅰ 脐带血巨核系祖细胞注射液有效性临床试验研究 Ⅱ 人造血转录因子GATA-1的功能初探[D]. 南雪. 中国人民解放军军事医学科学院, 2013(02)
- [2]人脐血基质细胞联合移植促进造血细胞归巢植入及支持造血重建的实验研究[D]. 刘颖. 第三军医大学, 2011(12)
- [3]人巨细胞病毒感染对脐血红系祖细胞发育过程中Hoxb2,Hoxb4基因表达的影响[J]. 黄媚贤,刘文君,郭渠莲,陈军红,施翰. 中国组织工程研究与临床康复, 2010(45)
- [4]人脐血源基质细胞促进巨核细胞增殖作用及机制探讨[D]. 高蕾. 第三军医大学, 2008(03)
- [5]人巨细胞病毒对巨核细胞生长的影响及其反义寡核苷酸的抗病毒活性[J]. 姚军霞,刘莉,刘仲萍,黄士昂. 华中科技大学学报(医学版), 2007(03)
- [6]rAAV介导TPO基因修饰的骨髓MSCs对巨核系造血生成的作用研究[D]. 周小莹. 中南大学, 2007(02)
- [7]人巨细胞病毒体外感染巨核系细胞的实验研究[J]. 姚军霞,刘筱萍,宋善俊. 临床内科杂志, 2006(10)
- [8]巨细胞病毒感染对淋巴系祖细胞增殖的影响及其干预措施[J]. 李宏颖,刘文君,郭渠莲,邓正华,林江. 实用儿科临床杂志, 2006(10)
- [9]VCAM-1基因修饰人脐血源基质细胞移植重建造血微环境功能[D]. 张曦. 第三军医大学, 2006(11)
- [10]人类巨细胞病毒感染对脐血粒单系祖细胞增殖过程中HOXA5，HOXB6基因表达的影响[D]. 陈艾. 泸州医学院, 2006(09)
标签：巨核细胞论文; 细胞分化论文; 细胞增殖论文; 骨髓增生异常综合征论文; 骨髓细胞论文;