一、绵羊β-乳球蛋白基因5′端及上游调控序列的PCR扩增的方法学研究（论文文献综述）
崔趁趁[1]（2015）在《TALEN介导的β-乳球蛋白基因敲除奶山羊的生产》文中指出β-乳球蛋白（β-lactoglobulin,BLG）是羊乳中引起婴幼儿乳过敏症的主要过敏原之一。目前多采用生物化学方法对β-乳球蛋白进行加工处理以降低其致敏性,但并不能从根本上解决其致敏问题。靶向基因编辑技术和转基因动物技术的发展为从根本上彻底消除乳汁中的β-乳球蛋白提供了可能。研究表明,TALEN介导的基因打靶可以在生物基因组特定位点进行精确的基因插入或删除。本研究通过构建以山羊BLG基因第一外显子为靶位点的TALENs表达载体及基因打靶载体,在山羊胎儿成纤维细胞中利用TALEN介导的基因打靶技术对BLG基因进行敲除,利用体细胞克隆技术生产BLG基因单敲除奶山羊;并通过在山羊体细胞中进行连续的基因打靶获得BLG基因双敲除奶山羊。研究内容如下:1.靶向山羊BLG基因TALENs表达载体的构建使用“TAL Effector-Nucleotide Targeter”筛选TALENs靶位点,利用单元组装法构建TALEN表达载体,构建双荧光报告载体,将TALEN表达载体与报告载体共同转染HEK293细胞验证其生物活性。结果显示:以山羊BLG基因第一外显子序列为靶位点,利用单元组装法构建TALEN表达载体p TSBE1-R和p TRBE1-L,构建双荧光报告载体p RFP-BE1-GFP,双荧光报告系统检测结果表明单元组装法构建的TALENs表达载体可特异性识别并切割其对应靶位点。2.山羊BLG基因打靶载体的构建以西农莎能奶山羊基因组DNA为模板分别克隆不同大小的同源臂序列,分别构建3个靶向BLG基因的置换型基因敲除载体p BLG-neo、p BLG-neo-M和p BLG-puro。结果显示:以ploxpⅡ为骨架载体构建的p BLG-neo和p BLG-neo-M均含有新霉素抗性筛选标记,其中p BLG-neo的5’和3’同源臂大小分别为1.1 kb和5.3 kb;p BLG-neo-M的5’和3’同源臂大小分别为1.1 kb和1.3 kb。p BLG-puro含有绿色荧光蛋白和嘌呤霉素抗性基因作为双阳性筛选标记,其5’和3’同源臂大小均为1.0 kb。3.山羊胎儿成纤维细胞中BLG基因打靶效率的检测将TALEN表达载体的质粒DNA或以其为模板体外转录制备的m RNAs电穿孔法转染山羊胎儿成纤维细胞（goat fetal fibroblasts,GFFs）,使用有限稀释法获取单细胞克隆,经PCR、测序鉴定检测TALENs介导的非同源末端连接修复引起的BLG基因修饰效率;将基因打靶载体p BLG-neo和p BLG-neo-M分别转染GFFs,经药物筛选后,使用PCR鉴定检测自然发生的同源重组介导的基因打靶效率;将TALENs的DNA或m RNAs与p BLG-neo或p BLG-neo-M共转GFFs,经药物筛选后,使用PCR鉴定检测TALEN介导的基因打靶效率。结果显示:将TALENs电转染GFFs,有限稀释法获得303个单细胞克隆,经PCR、测序鉴定,并未发现BLG基因修饰突变体。仅转染基因打靶载体至GFFs,共获得G418抗性克隆1005个,经过PCR鉴定未发现基因打靶细胞。将TALENs与不同的打靶载体共转GFFs,经药物筛选和PCR鉴定,均获得了打靶载体中PGK-neo片段定点整合至山羊BLG基因座的细胞克隆;另外发现,必须同时进行5’端和3’端的PCR鉴定才能保证基因打靶鉴定的准确性经过两轮5’端和3’端的PCR鉴定,TALENs DNA与p BLG-neo-M共转GFFs获得的598个G418抗性克隆中,有94个发生了基因打靶,效率为13.6%;TALENs m RNA与p BLG-neo-M共转GFFs获得的459个G418抗性克隆,有49个发生了基因打靶,效率为10.7%。另外发现,将TALENs质粒DNA转染GFFs,会发生TALENs表达载体在山羊基因组中的随机整合。4.体细胞核移植生产BLG基因单敲除山羊以TALEN m RNAs介导的基因打靶细胞为核供体细胞进行核移植和胚胎移植生产克隆羊,并对出生后代进行PCR、测序及Southern blot鉴定。结果显示:以BLG基因单敲除细胞为核供体共构建克隆胚胎1128枚,出生并存活克隆羊7只,经PCR、Southern blot鉴定,其均为BLG基因单敲除山羊;经测序比对鉴定,BLG基因第一外显子信号肽序列后的20 bp序列被删除,置换为打靶载体p BLG-neo中1935 bp的外源基因。5.BLG基因双敲除山羊的生产取BLG基因单敲除（BLG+/-）山羊耳组织分离得到BLG+/-成体成纤维细胞,以p BLG-puro为打靶载体,在BLG+/-细胞中进行TALEN介导的二次基因打靶,经过嘌呤霉素筛选与PCR鉴定,检测对BLG的另一等位基因的敲除效率;以TALENs m RNA介导的BLG基因双敲除（BLG-/-）细胞作为核供体进行核移植及胚胎移植生产克隆羊,并对出生后代进行PCR、测序及Southern blot鉴定。结果显示:将TALENs质粒DNA与打靶载体p BLG-puro共转BLG+/-细胞,共获得嘌呤霉素抗性克隆667个,经5’端和3’端PCR鉴定后,打靶阳性克隆为39个（5.85%）;将TALENs m RNA与打靶载体p BLG-puro共转BLG+/-细胞,共获得嘌呤霉素抗性克隆647个,经5’端和3’端PCR鉴定后,打靶阳性克隆为33个（5.10%）;对PCR鉴定阳性的克隆进行Southern blot鉴定,所有克隆均显示为BLG基因双等位基因发生打靶。共构建克隆胚805个,获得克隆山羊3只,经PCR、Southern blot鉴定,其均为BLG基因双敲除山羊。综上所述,本研究建立了利用TALEN介导的基因打靶在动物体细胞中进行基因敲除的技术体系,并通过体细胞克隆分别获得BLG基因单敲除奶山羊7只,BLG基因双敲除奶山羊3只,为β-乳球蛋白敲除奶山羊的新品种培育提供了材料,为研究β-乳球蛋白功能以及以BLG基因座作为靶位点研制乳腺生物反应器奠定基础。
李静心[2]（2013）在《以β-乳球蛋白为靶基因的锌指核酸酶构建与筛选体系的探索》文中指出β-乳球蛋白是反刍动物乳清蛋白中含量最高的组分,目前已有多种外源蛋白通过β-乳球蛋白基因调控序列指导在乳腺中实现了特异性高效表达,同时它也是一种主要致敏原。锌指核酸酶（Zinc Finger Nuclease, ZFN）技术是一种高效、特异、适用性广泛的基因组靶向修饰技术,目前已成功应用于多种细胞和生物的基因敲除和定点重组。运用ZFN敲除β-乳球蛋白基因、同时将外源基因同源重组到β-乳球蛋白基因调控序列下游,理论上不仅可以消除羊乳的过敏原,还可以实现外源基因的高效表达。要达到这一目标,高效、特异的ZFN的设计与筛选是关键步骤,而灵敏、稳定的筛选体系十分重要。本研究构建了以红色荧光蛋白为标记基因的ZFN通用表达载体,并以β-乳球蛋白为靶基因设计、构建了6对ZFN,对ZFN的不同筛选方法进行探索。发现荧光标记ZFN筛选体系稳定、灵敏度高,可作为ZFN的真核筛选体系,ZFNpRVNFw-728可以有效切割靶基因序列,为实现β-乳球蛋白基因的高效敲除和外源基因在此位点的高效定点整合奠定了基础。具体内容如下：第一、ZFN通用表达载体的构建构建了真核表达载体N13AX·pTARGET和PsvRed·CMV。载体NI3AX·pTARGET以SV40启动子下的绿色荧光蛋白基因和Neo基因作为标记基因,载体PsvRed·CMV以SV40启动子下的红色荧光蛋白基因作为标记基因,两载体均可通过CMV启动子用于真核表达。转染两个载体至奶山羊胎儿成纤维细胞可观察到标记基因的正常表达,表明载体构建成功。在真核表达载体PsvRed·CMV的CMV启动子下游插入NLS和Fokl构建了含野生型Fokl的ZFN通用表达载体PRVNF和含优化后密码子Fokl的ZFN通用表达载体PRVNFw,为锌指核酸酶的构建和表达奠定了基础。第二、以山羊β-乳球蛋白为靶基因的ZFN载体构建与表达以山羊β-乳球蛋白为靶基因设计三对锌指蛋白并合成其DNA序列,将其插入本试验构建的两个ZFN通用表达载体PRVNF和PRVNFw中构建六对ZFN。将构建好的ZFN转入奶山羊胎儿成纤维细胞后在mRNA水平上检测到ZFN的表达。第三、ZFN筛选体系的探索本试验对三种ZFN筛选体系进行探索。①对荧光标记ZFN筛选体系进行了探索。将ZFN靶序列插入到pEGFP-N1载体绿色荧光蛋白基因序列（去除起始密码子）5’端,构建三个荧光标记的ZFN筛选载体,转染该载体至Hela细胞中不能发出绿色荧光,用G418筛选两周后转入ZFN,有效的ZFN可使细胞产生DSB, NHEJ途径修复DSB会使细胞有1/3的概率发出绿色荧光。将本试验构建的六对ZFN转入含相应靶序列的Hela细胞中,pRVNFw-728组可观察到绿色荧光,表明pRVNFw-728可以切割靶序列,更重要的是,证明该方法灵敏度较高,可用于ZFN的真核筛选。为了进一步提高检测的灵敏度,本试验构建了双荧光标记载体BLG-REG,该载体先将BLG编码区与红色荧光蛋白序列（含终止子）同框融合,再融合到pEGFP-N1载体绿色荧光蛋白序列（去除起始密码子）5’端,且使两个荧光标记基因处于不同ORF中。该载体转染至胎儿成纤维细胞中能发出红色荧光而不能发出绿色荧光,将有效的ZFN转染至含该载体的细胞株中,非同源末端连接途径修复DSB可使细胞有1/3的概率发出绿色荧光而不发出红色荧光,1/3的概率既不发出绿色荧光也不发出红色荧光。②对酵母单杂交方法用于ZFN筛选进行了探索。构建了3个酵母单杂交Bait载体和6个酵母单杂交表达载体,同时对双载体转化酵母菌条件进行了优化,在每种质粒用量200ng、10μL Carrier DNA、100μL感受态细胞和70μL DMSO条件下转染效率最高,达到6500cfu/μg DNA,为本试验后续进行酵母单杂交验证ZFN作用效果打下基础。③对PCR结合聚丙烯酰胺凝胶电泳法用于ZFN筛选进行了探索。根据NHEJ途径修复DSB会造成碱基数变化的原理在ZFN靶位点上下游各100bp处设计引物,以转染ZFN96h的细胞DNA做模板,PCR扩增产物20%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。发现该方法灵敏度较低,不适合检测ZFN在成纤维细胞中的效果。
胡林勇[3]（2012）在《靶向山羊β-乳球蛋白基因的基因打靶研究》文中研究说明制备“乳腺生物反应器”生产药用蛋白或生产“人源化”羊奶或牛奶是近年来转基因研究的热点。基因打靶技术不仅可以实现对基因组中特定基因的敲除，从根本上阻断目的基因的表达；而且可以将外源目的基因定位整合到基因组的特定位点，借助细胞内源性调控序列指导外源目的基因高效表达，从而有效降低随机整合带来的位置效应的影响。α-乳白蛋白（α-lactalbumin，ALA）是人乳中主要的乳清蛋白，富含色氨酸、赖氨酸及半胱氨酸等必需氨基酸，近年的研究发现其在预防新生儿胃肠道感染等方面有重要作用。而作为山羊乳中主要的乳清蛋白，β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，BLG）在人乳中并不存在，因而可能和牛乳中BLG一样是引起婴幼儿乳过敏症的一种重要的过敏原。因此，本研究通过基因打靶的手段，将BLG基因敲除或用hALA基因置换BLG基因CDS区，以期为生产“人源化”山羊乳奠定基础。1.以人血液基因组DNA为模板，通过PCR成功克隆获得人乳白蛋白（hALA）基因；构建了hALA基因的真核表达载体，将其转染到293T细胞中作为人乳腺上皮细胞的替代细胞，通过RT-PCR的方法成功克隆得到hALA cDNA。这一方法为克隆组织材料难以采集的cDNA提供了一种有效的备选方案。2.克隆了山羊BLG基因3个不同长度的5’端调控序列片段，并分别插入到荧光报告载体pAdTrack-RFP中，构建了重组腺病毒载体：pAd-B51RFP、pAd-B52RFP和pAd-B53RFP，以这3个片段为调控序列来启动mRFP基因的表达。将包装得到的重组腺病毒分别感染山羊乳腺上皮细胞，用倒置荧光显微镜检测mRFP表达。结果表明3个片段均能够启动mRFP的表达，其中B51和B52启动mRFP的表达水平高于B53。3.构建了4个靶向山羊BLG基因的打靶载体pBAT、pBATGFP、pBATM和pBAcT。其中pBATGFP含有neo和GFP两个阳性筛选标记基因，其他3个均只含有neo一个阳性筛选标记基因；pBATM的两个同源臂长度较pBAT短； pBAcT与pBATM载体的差异在于前者的目的基因为hALA cDNA。经酶切和测序鉴定，4个载体序列组装正确。以pBATM为代表，用其中的表达元件BLG基因5’调控序列、目的基因hALA和3’端调控序列置换pAdTrack-RFP中的mRFP和polyA，构建重组腺病毒载体。将包装得到的重组腺病毒感染山羊乳腺上皮细胞，用促乳素、EGF、胰岛素等进行诱导，取培养上清进行Western杂交检测，结果表明hALA能够在BLG基因调控序列指导下表达。4.将构建的4个打靶载体及本实验室保存的旨在敲除山羊BLG基因的打靶载体pBLG2T线性化后分别转染山羊胎儿成纤维细胞，用G418和GCV进行药物筛选。结果发现从pBATGFP组筛选到的胎儿成纤维细胞中GFP表达量非常微弱，不能实现剔除野生型细胞污染的目的。在pBAT和pBLG2T两组中分别筛选鉴定得到2株（B412F1和B7732F6）和3株（T229F2，T1041F1，T7963F6）打靶细胞。5.以5株打靶阳性细胞作为核供体进行体细胞核移植，将早期卵裂基因打靶克隆胚胎移植到同期发情的受体山羊输卵管，45d左右妊娠率达到了44.4%。妊娠足月顺产获得3只克隆山羊胎儿。经PCR及Southern杂交检测，其中有一只为BLG基因敲除山羊胎儿，另有一只为hALA定位整合的基因打靶阳性山羊。
袁天杰[4]（2009）在《sfat-1基因乳腺特异性表达载体的构建及转基因细胞的获得》文中提出膳食结构中ω-6不饱和脂肪酸与ω-3不饱和脂肪酸的比例过高,尤其是ω-3不饱和脂肪酸的缺乏将导致许多现代流行病的发生。哺乳动物自身不能合成ω-3脂肪酸,只能长期从食物中摄取,而ω-3脂肪酸的来源十分有限,不足以满足人们的大量需求,因此急需寻找安全且丰富的不饱和脂肪酸来源。fat-1基因编码一种ω-3不饱和脂肪酸脱氢酶,能够将ω-6转化成ω-3多不饱和脂肪酸,提高食物中ω-3不饱和脂肪酸的含量,为改善人们的膳食结构提供新的途径。本试验克隆了牛β-乳球蛋白基因的两段5’调控序列,长1450bp的BLG1和长1575bp的BLG2。利用BLAST软件对测序结果进行同源性分析及计算机软件分析,表明BLG1和BLG2可以做为启动子调控序列构建乳腺特异性表达元件。以pCDNA3.1（+）为骨架载体,采用本实验室已有经密码子优化了的线虫基因sfat-1,构建sfat-1基因乳腺特异性表达载体pCB1F1E和pCB2F1E,长度分别为8976bp和9101bp。经内切酶NotⅠ酶切鉴定,pCB1F1E酶切后出现两条带,大片段长5329bp,小片段长3647bp。pCB2F1E酶切后大片段长5454bp,小片段长3647bp。两个对照组载体pCB1E、pCB2E,长度分别为7823bp和7948bp。经NotⅠ酶切检测,pCB1E酶切后大片段长4176bp,小片段长3647bp。pCB2E酶切后大片段长4301bp,小片段长3647bp。与正向连接设计结果均一致,表明四个载体构建正确。建立了中国荷斯坦奶牛8079胎儿成纤维细胞系,利用阳离子脂质体法,将上述四个载体对该细胞系进行转染,蓝色激发光下观察转染细胞发绿色荧光,经500μg/mL的G148抗性筛选,高压筛选14天后改用250μg/mL的G148维持培养,获得稳定表达的转基因阳性细胞株各1株。经PCR鉴定,证明sfat-1基因已整合进入细胞基因组内,表明该细胞可以作为供体细胞进行核移植。作为阶段性成果,本试验获得的转基因阳性细胞可以做为供体进行体细胞核移植,得到整合sfat-1基因的克隆胚胎,为研究转基因克隆牛奠定了基础。构建的对照载体可以做为乳腺通用表达载体,为实验室进一步利用体细胞核移植技术制作乳腺生物反应器做基础性工作。
施庚寿[5]（2008）在《mWAP-hLTF杂合基因座载体的构建及其在转基因小鼠乳腺中表达的研究》文中研究表明人乳铁蛋白（LTF）富含于人母乳初乳中,具有广谱抗菌、调节体内铁平衡、促进细胞生长等广泛生理作用。由于来源的问题,因而生产的成本很高,价格昂贵。利用动物乳腺生物反应器来生产不仅维持生产的成本低,而且产量高,能够进行翻译后修饰、正确折叠。但位置效应的影响是其主要技术瓶颈之一。细菌人工染色体（BAC）上完整的乳蛋白基因座,包含位点独立性表达所需的全部元件,作为转基因载体就有可能克服外源基因整合时位置效应的影响。本研究构建了小鼠乳清酸蛋白（mWAP）完整调控序列与人乳铁蛋白（hLTF ）基因组序列连在一起的杂合基因座,利用mWAP基因完整调控序列指导hLTF基因组序列在转基因小鼠乳腺内高效表达。我们以pBR322载体为骨架,插入预先无痕连接在一起的6个同源臂,构建成能连续进行三次gap-repair的基因抓捕载体。然后在大肠杆菌内,利用λ噬菌体Red同源重组系统介导的同源重组方法,分三步连续地从含mWAP基因座的BAC和含hLTF基因座的BAC上亚克隆了8Kb的mWAP基因3’端完整侧冀序列,29Kb的hLTF基因组序列和12Kb的mWAP基因5’端完整侧冀序列,并使它们自动无痕地连接成一个全长约49Kb的mWAP-hLTF杂合基因座。经过PCR扩增、限制性内切酶消化和序列测定验证,我们构建的这个杂合基因座,达到了原来mWAP基因座中mWAP基因组编码序列从起始密码子（ATG）到终止密码子（TGA）被hLTF基因组序列精确置换的目的。然后,将构建好的mWAP-hLTF杂合基因座乳腺表达载体通过受精卵原核显微注射的方法制备转基因小鼠,获得了5个乳汁中高效稳定表达重组人LTF的转基因小鼠系,表达量最低为16.0mg/ml,最高为19.6mg/ml,平均为18.1mg/ml。由此建立了连续Gap-repair构建杂合基因座乳腺表达大载体的技术,并证明这种杂合基因座大载体在转基因小鼠乳腺中的表达能够克服位置效应的影响,达到位点独立性的稳定高效表达。这将为以后大动物乳腺生物反应器商业化生产人LTF奠定了坚实的基础,也为乳腺生物反应器高效表达大载体的的研究提供了一种全新思路和方法。
林慧[6]（2008）在《稳定整合人乳铁蛋白cDNA山羊胎儿成纤维细胞的制备》文中认为本研究从奶牛血液中提取基因组DNA,以其为模板,通过Long and Acute PCR扩增β-酪蛋白5′端约长6.5 kb和4.5 kb的两段序列。凝胶回收纯化后,分别将其连在pMD18-T载体上,组成质粒pGBC6.5和pGBC4.5。经测序分析,其与GenBank中登录的山羊β-酪蛋白全基因序列基本相同。通过设计特异性引物在GBC6.5,GBC4.5的5′、3′端分别加上BspE I和Sal I酶切位点。pGBC6.5和pGBC4.5的PCR产物经BspE I和Sal I双酶切后,回收纯化,分别克隆入pEGFP-C1载体,构建出中间载体pEGFP-4.5和pEGFP-6.5。以pBL为模板,扩增人乳铁蛋白基因cDNA （hLF cDNA）,同时在其5′端加上Sal I酶切位点,在3′端加上Bam HI酶切位点。hLF cDNA的PCR产物经Sal I、Bam HI双酶切后,回收纯化,克隆至pEGFP-4.5和pEGFP-6.5。最终构建p6.5hLF-EGFP和p4.5hLF-EGFP乳腺特异性表达载体。经酶切,序列测定及PCR鉴定,表明载体成功构建。载体的特点是:①调控序列GBC4.5为山羊β-酪蛋白启动子和增强子区域长约4.5 kb的5′端侧翼序列;GBC6.5为包括第一外显子、第一内含子和部分第二外显子以及5′端侧翼区共约6.5 kb的DNA序列。②设计引物时加终止密码子TAA,防止β-酪蛋白与EGFP基因形成融合蛋白,以及保护碱基,保证较好的酶切效果。③载体含有EGFP基因和抗性基因neo,用于对转染细胞的筛选。通过脂质体介导转染山羊胎儿成纤维细胞,经G418抗性筛选34周后得到阳性细胞p6.5hLF-EGFP-FFC和p4.5hLF-EGFP-FFC;p6.5hLF-EGFP-FFC和p4.5hLF-EGFP-FFC经多重PCR鉴定、EGFP表达检测以及染色体核型分析后,得到稳定整合有hLFcDNA且位于染色质开放区的具有正常核型的山羊胎儿成纤维细胞系p6.5hLF-EGFP-FFC和p4.5hLF-EGFP-FFC,为制备人乳铁蛋白的转基因山羊乳腺生物反应器提高核移植供体细胞。
王鹏雁,蒋建军,陈创夫,李彦芳[7]（2008）在《新疆绵羊β-乳球蛋白（BLG）5′端调控区的克隆与序列测定》文中认为用聚合酶链式反应（PCR）技术,从新疆绵羊全血中扩增了β-乳球蛋白5′端调控区890bp的片段。通过T4DNA连接酶将其连接于质粒载体pGEM-T上,转化至受体菌DH5α中。提取质粒经PCR扩增、酶切鉴定,证明重组质粒pT-BLG中含有β-乳球蛋白5′端调控区基因片段。经核苷酸序列测定,克隆的片段与发表的基因序列高度一致。
成勇[8]（2007）在《乳蛋白与CMV复合启动子驱动hLF cDNA乳腺特异性表达》文中研究表明由于高质量生物药品和医学诊断的需求,转基因动物乳腺生物反应器的研究已经成为生物工程领域研究的热点之一;成为高效、高质量生产昂贵生物活性蛋白的有效途径之一。应用乳腺生物反应器生产人的重组蛋白较其他的生物学制备系统有产品活性高、成本低的优点,因而某些人的重组蛋白更适宜用乳腺生物反应器来生产。外源基因在转基因动物乳腺中特异性表达是转基因动物乳腺生物反应器的根本目的。有许多生物活性蛋白基因在乳蛋白调控序列的指导下已经在转基因动物乳腺中表达,其中应用较多的调控元件有:牛αs1-酪蛋白（bovineαs1-casein）、山羊β-酪蛋白（β-casein）、绵羊β-乳球蛋白（BLG）、小鼠的乳清酸蛋白（WAP）等。尽管已有应用这些调控序列实现乳腺特异性表达成功的事例,但大多数实验研究中,乳腺特异性表达的成功率低、乳汁中的表达水平低。已经发现某些非乳蛋白调控元件对乳腺特异性表达有明显的作用,如绝缘子、染色质开启子、增强子、核基质附着区和内含子等,其中起到重要作用的是转录和翻译调控因子。近年来,尽管乳蛋白启动子及其它表达调控元件已广泛应用于乳腺特异性表达,但相对低的表达水平和不稳定表达案例也较多。人巨细胞病毒（CMV）启动/增强子是广泛用于真核细胞表达的调控元件,早期的研究证明有提高转录水平的作用,但未见报道用于激活乳腺特异性表达。本研究应用人巨细胞病毒启动/增强子（Pcmv）与乳蛋白调控元件构建复合启动/增强子和人乳铁蛋白cDNA组成乳腺特异性表达载体。为了鉴定复合启动/增强子对转基因动物乳腺特异性表达水平的作用,我们构建了单一乳蛋白启动子与乳蛋白/Pcmv复合启动子两种不同类型的乳腺特异性表达载体。应用山羊β-酪蛋白、山羊β-乳球蛋白、αs1-牛酪蛋白为乳蛋白调控序列为乳蛋白调控序列;鸡β-珠蛋白（β-globin,隔离元件）、CMV启动/增强子和SV40polyA为非乳蛋白启动/增强子。以不同的乳蛋白调控序列与启动/增强子组合构建乳腺特异性表达复合启动/增强子（chimeric promoter/enhancer）,单一的酪蛋白启动子作为对照,与人乳铁蛋白cDNA组成乳腺特异性表达载体。共构建了7个乳腺特异性表达载体（BnF95,pBnCL14,pBnLC2G,pgCN/LF/g,pgCNCG/LF25,pbCN/LF,pbCNCS/LF36）,其中4个为复合启动/增强子型载体,另3个为单一乳蛋白启动子型载体。BnF95、pBnCL14和pBnLC2G载体用于转染山羊乳腺上皮细胞（goat mammary epithetical cells,GMECs）;pgCNCG/LF25和pbCNCS/LF36为复合启动/增强子型,其中pgCN/LF/g和pbCN/LF为单一酪蛋白启动子作为对照,用于制备转基因小鼠。泌乳山羊乳腺组织经Ⅰ型胶原酶消化分离乳腺上皮细胞,DMEM/F12培养液（10%FCS）传代培养,获得的乳腺上皮细胞最多可培养25代以上。采用分步胰酶消化法去除上皮细胞中所含的成纤维细胞,从而乳腺上皮细胞得到纯化。通过电转染法将含NEOτ标记基因的BnF95、pBnCL14和pBnLC2G外源基因导入23个山羊乳腺上皮细胞系,经G418筛选三周后,得到有抗性的转染细胞株,挑取单克隆细胞株进行增殖培养。共获得242株转染外源基因的细胞,有118株转染pBnCL14,82株转染BnF95,42株转染pBnLC2G基因构件。有3株转染pBnCL14基因的细胞进行nestedPCR整合检测,结果均为外源基因整合阳性。初步认为经G418抗性培养后获得细胞为整合细胞。对抗性培养阳性的细胞株应用催乳素进行诱导表达,收集48和72小时的诱导细胞培养液进行ELISA检测,其中有30株细胞的诱导液中检测出重组人乳铁蛋白,有4株转染pBnCL14基因细胞的表达水平达到10-50mg·L-1;另有22株细胞（9株/BnF95,7株/pBnLC2G）表达水平低于10 mg·L-1。通过G418筛选和诱导表达和ELISA检测验证具有表达功能的乳腺上皮将用于山羊体细胞克隆的供核细胞。pgCN/LF/g,pgCNCG/LF25,pbCN/LF,pbCNCS/LF36四个构件应用胚胎显微注射的方法制备转基因小鼠。应用PCR初步筛选整合小鼠,获得14只原代转基因小鼠,PCR产物序列分析显示转基因小鼠PCR检测产物与模板的同源率为99.95%～99.75,在PCR正常正确率范围以上。原代鼠与C57或ICR正常鼠交配,在出生的后代鼠中检出37只F1代转基因小鼠。获得的转基因母鼠用ELISA检测乳汁中重组人乳铁蛋白,并繁殖传代,获得F1、F2代转基因小鼠。复合启动/增强子构件指导人乳铁蛋白cDNA在原代转基因小鼠乳腺中重组人乳铁蛋白（rhLF）表达水平(2～8.1g·L-1)明显高于单一酪蛋白启动子构件(0～12mg·L-1),约10000倍。在所有转基因小鼠的血清和唾液中未检测（ELISA）出重组人乳铁蛋白（rhLF）。研究表明,酪蛋白/Pcmv复合启动/增强子不仅可提高转基因小鼠乳腺特异性表达水平,而且具有良好的乳腺组织表达定位性。近年来,对基因表达调控机制提出了一些新的看法,认为几乎所有的哺乳动物基因表达是由多个环节调控的,其中包括了转录、转录后加工、核输出和定位、mRNA分子的成熟、翻译和稳定性等。生物信息学分析显示Pcmv含有多个uORF和CCAAT增强子结合位点。Lodhi等（2003）认为uORF能介导编码mRNA翻译的作用,而CCAAT序列是增强子结合蛋白结合的位点。有研究报道,CCAAT位点结合增强子结合蛋白也可介导功能基因的表达,这一过程可能意味着在5’-UTR顺式调控元件,包括复合启动子中乳蛋白和CMV启动子序列能激活人乳铁蛋白cDNA在培养的山羊乳腺上皮细胞和转基因小鼠乳腺中表达。本领域的研究报道显示,尽管已有一些利用长片段调控元件获得高表达的事例,但更多的低表达案例使开发那些构建方便、片段长度短小、表达效率和表达水平高的乳腺特异性表达载体显得十分迫切。本研究的结果不仅实现了cDNA功能基因的高水平、高效乳腺特异性表达,而且其载体的构建简单方便。到目前为止,尚未见有应用乳蛋白/Pcmv复合启动子激活cDNA功能基因实现乳腺特异性高效表达的报道。
李贵阳[9]（2007）在《增强子、绝缘子和β-乳球蛋白调控序列启动功能基因在山羊乳腺上皮细胞中表达的影响》文中进行了进一步梳理动物乳腺生物反应器是利用转基因技术,将乳腺特异性调控元件指导的外源功能基因,在乳腺组织中高效表达高产值的人类医用蛋白。通过哺乳动物乳腺生产重组蛋白,成本低,产量高,可持续生产,尤其是所表达的重组蛋白可进行翻译后加工修饰,具有天然蛋白的结构及活性等优点而成为当前国内外生物反应器研究的热点课题。该研究的关键是乳腺特异性高效表达载体的构建,包括乳腺特异性表达的调控元件及其能够提高外源基因表达的顺式作用因子的使用。构建好的乳腺特异性表达载体在制作转基因动物之前须进行构件有效性的验证,乳腺上皮细胞体外培养因具有操作简便、实验条件可人为控制和经人工激素诱导可表达蛋白、表达产物纯净、检测较简便且实验结果较稳定等优点无疑成为一种理想的实验材料。本研究就是基于以上原理而设计,旨在验证增强子和绝缘子等顺式作用因子对山羊β-乳球蛋白（BLG）基因调控序列指导的人乳铁蛋白基因（hLF）在山羊乳腺上皮细胞中表达的影响,从而筛选出高表达量的载体进一步做转基因动物研究。将山羊β-乳球蛋白基因调控序列,包括4.2kb的5`端和1.8 kb的3`端,人乳铁蛋白（hLF）cDNA,人巨细胞病毒增强子序列及SV40 polyA序列和新霉素抗性筛选基因（Neor ）、双拷贝的鸡β-珠蛋白绝缘子基因（Insulator）等上述基因元件体外重组构建成人乳铁蛋白乳腺特异性表达载体BLC14和BLCDI。采用胶原酶和透明质酸酶共同消化法从健康的泌乳期奶山羊乳腺组织中分离到原代乳腺细胞;采用胰蛋白酶消化和反复贴壁法在DMEM/F12培养液中培养2-3代,获得纯化的乳腺上皮细胞。通过电转染法将表达载体BLC14和BLCDI导入纯化乳腺上皮细胞中,经G418筛选10d左右,利用Neor基因筛选抗G418的细胞单克隆传代扩大培养,分别获得63株和41株。经PCR检测确认,分别有21株和13株细胞克隆整合有外源基因。对整合有外源基因的细胞株进行催乳素诱导表达,分别收集诱导后48h的细胞上清夜进行ELISA检测,结果分别有14株和8株能检测到人乳铁蛋白的表达。其中转染BLC14基因的细胞株表达量高,但表达不稳定;而转染BLCDI的细胞株表达量相对较低,但表达较稳定。研究结果表明,表达载体BLC14和BLCDI构建合理正确,山羊β-乳球蛋白调控元件可以指导hLF cDNA在乳腺上皮细胞中表达人乳铁蛋白,人巨细胞病毒增强子可以促进其高水平表达,而双拷贝的鸡β-珠蛋白绝缘子基因能够消除外源基因的“位置效应”,稳定其表达。
刘建忠,田为宇,周丽芳,敖敬[10]（2006）在《我国不同地域牦牛BLG基因部分核苷酸序列同源性分析》文中研究说明设计一对PCR引物,寡聚核苷酸序列的上游引物为5-′gCg,AAT,TCA,TCC,CAC,gTg,CCT,gC-3,′下游引物为5-′gAg,AAT,TCC,Tgg,ggA,ggg,ACC,TT-3′。经68℃退火及30轮循环的PCR程序后,分别克隆了来自我国甘肃、青海和云南地区牦牛β乳球蛋白基因的5′调控区1 447 bp的DNA片段。将该片段从琼脂糖凝胶中回收,克隆在pMD18-T Vector后进行序列测定。序列分析结果表明,甘肃牦牛与青海牦牛该序列的核苷酸同源性为98.13%,与云南牦牛该序列的核苷酸同源性为97.65%,青海牦牛与云南牦牛该基因片段的核苷酸序列同源性为99.45%。
二、绵羊β-乳球蛋白基因5′端及上游调控序列的PCR扩增的方法学研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、绵羊β-乳球蛋白基因5′端及上游调控序列的PCR扩增的方法学研究（论文提纲范文）
（1）TALEN介导的β-乳球蛋白基因敲除奶山羊的生产（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 文献综述 |
| 第一章 β-乳球蛋白研究进展 |
| 1.1 β-乳球蛋白结构 |
| 1.2 β-乳球蛋白的生物功能 |
| 1.3 β-乳球蛋白致敏性研究及其解决方法 |
| 1.3.1 β-乳球蛋白的致敏性 |
| 1.3.2 β-乳球蛋白的致敏性的降低与消除 |
| 第二章 人工核酸酶在家畜靶向基因组编辑研究中的应用 |
| 2.1 DNA双链断裂修复机制 |
| 2.1.1 非同源末端连接修复途径 |
| 2.1.2 同源重组修复途径 |
| 2.1.3 修复途径的选择调控 |
| 2.1.4 双链断裂修复时NHEJ和HR的合作 |
| 2.2 人工核酸内切酶 |
| 2.2.1 锌指核酸酶 |
| 2.2.2 类转录激活因子效应物核酸酶 |
| 2.2.3 CRISPR/Cas9 |
| 2.3 人工核酸酶介导的NHEJ修复在家畜靶向基因组编辑中的应用 |
| 2.4 人工核酸酶介导的HR修复在家畜靶向基因组编辑中的应用 |
| 试验研究 |
| 第三章 靶向山羊BLG基因的TALENs表达载体的构建 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 菌株、质粒和细胞株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 测试化验加工 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 单元组装法构建TALENs表达载体 |
| 3.2.2 TALENs的生物活性验证 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 以山羊BLG基因为靶位点的TALENs表达载体的构建 |
| 3.3.2 双荧光报告系统验证TALENs的生物活性 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 山羊BLG基因打靶载体的构建 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 血液样本 |
| 4.1.2 菌株和质粒 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 测试化验加工 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 山羊BLG基因打靶载体pBLG-neo-M的构建 |
| 4.2.2 山羊BLG基因打靶载体pBLG-neo的构建 |
| 4.2.3 山羊BLG基因打靶载体pBLG-puro的构建 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 基因打靶载体pBLG-neo和pBLG-neo-M的构建 |
| 4.3.2 基因打靶载体pBLG-puro的构建 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 山羊体细胞中TALEN介导的基因打靶效率检测 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 动物组织 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 测试化验加工 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 西农莎能奶山羊胎儿成纤维细胞的培养与性别鉴定 |
| 5.2.2 山羊胎儿成纤维细胞中TALEN介导的NHEJ引起的BLG基因修饰 |
| 5.2.3 山羊胎儿成纤维细胞中TALEN介导的山羊BLG基因打靶效率 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 山羊胎儿成纤维细胞的培养与性别鉴定 |
| 5.3.2 山羊胎儿成纤维细胞中山TALEN介导的NHEJ引起的BLG基因修饰检测 |
| 5.3.3 山羊胎儿成纤维细胞中TALENs介导的BLG基因打靶效率检测 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 体细胞核移植生产BLG基因单敲除奶山羊 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.1.1 实验动物 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 测试化验加工 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 体细胞核移植及胚胎移植 |
| 6.2.2 转基因山羊PCR和Southern鉴定 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 基因打靶细胞的体细胞核移植及效率检测 |
| 6.3.2 转基因山羊PCR和Southern鉴定 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章BLG基因双敲除奶山羊的生产 |
| 7.1 试验材料 |
| 7.1.1 实验动物 |
| 7.1.2 质粒和菌株 |
| 7.1.3 主要试剂 |
| 7.1.4 测试化验加工 |
| 7.2 试验方法 |
| 7.2.1 BLG基因单敲除成体成纤维细胞的培养 |
| 7.2.2 二次基因打靶效率的检测 |
| 7.2.3 BLG基因双敲除山羊的生产及鉴定 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 BLG基因单敲除成体成纤维细胞的培养 |
| 7.3.2 二次基因打靶效率的检测 |
| 7.3.3 BLG基因双敲除山羊的生产 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 结论 |
| 创新之处与进一步研究的课题 |
| 参考文献 |
| 附录 主要仪器 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）以β-乳球蛋白为靶基因的锌指核酸酶构建与筛选体系的探索（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语中英文对照 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 乳腺生物反应器和β-乳球蛋白 |
| 1. 动物乳腺生物反应器 |
| 1.1 动物乳腺生物反应器的优点 |
| 1.2 动物乳腺生物反应器的应用 |
| 2. β-乳球蛋白 |
| 2.1 β-乳球蛋白 |
| 2.2 β-乳球蛋白的致敏性 |
| 2.3 β-乳球蛋白的调控序列 |
| 参考文献 |
| 第二章 锌指核酸酶技术 |
| 1. 锌指核酸酶的结构及作用原理 |
| 1.1 锌指核酸酶的结构 |
| 1.2 锌指核酸酶作用原理 |
| 2. 锌指核酸酶的设计 |
| 2.1 MA方法 |
| 2.2 OPEN方法 |
| 2.3 CoDA方法 |
| 3. 锌指核酸酶的应用 |
| 参考文献 |
| 第二部分 试验部分 |
| 第三章 ZFN通用表达载体的构建 |
| 摘要 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 真核表达载体NI3AX·pTARGET的构建 |
| 1.4 载体NIPT·PSV的构建 |
| 1.5 载体PSVRed·CMV的构建 |
| 1.6 ZFN通用表达载体的构建 |
| 1.7 ZFN通用表达载体pRVNF和pRVNFw载体的构建 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 pTARGET真核表达片段的克隆及鉴定 |
| 2.2 真核表达载体NI3AX·pTARGET的鉴定 |
| 2.3 NI3AX·pTARGET载体真核表达能力的检测 |
| 2.4 载体NI3PT·PSV的鉴定 |
| 2.5 载体PSVRed·CMV的鉴定 |
| 2.6 载体PRVNF和pRVNFw的鉴定 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 以山羊β-乳球蛋白为靶基因的ZFN构建 |
| 摘要 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 Zinic Finger的设计 |
| 1.3 ZFN的载体构建 |
| 1.4 ZFN载体的真核表达验证 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 ZFN表达载体的鉴定 |
| 2.2 ZFN真核表达的验证 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 ZFN筛选体系的探索 |
| 摘要 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 荧光标记ZFN筛选体系的探索 |
| 1.4 酵母单杂交筛选体系的构建及探索 |
| 1.5 PCR+聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选体系的探索 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 荧光标记ZFN筛选体系的探索 |
| 2.2 酵母单杂交筛选体系的探索 |
| 2.3 PCR+聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选体系的探索 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 荧光标记ZFN筛选体系的探索 |
| 3.2 酵母单杂交筛选体系的探索 |
| 3.3 PCR+聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选体系的探索 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录 |
| 致谢 |
（3）靶向山羊β-乳球蛋白基因的基因打靶研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 综述部分 |
| 第一章 基因打靶技术在家畜新品种培育中的研究进展 |
| 1.1 基因打靶技术的原理 |
| 1.1.1 Holliday 模型 |
| 1.1.2 Meselson-Radding 模型 |
| 1.1.3 双链断裂模型 |
| 1.1.4 单链退火模型 |
| 1.2 基因打靶技术的分类 |
| 1.2.1 基因敲除 |
| 1.2.2 基因靶向整合 |
| 1.2.3 基因定点修饰 |
| 1.2.4 条件型基因打靶 |
| 1.2.5 RNA 干扰技术 |
| 1.3 基因打靶技术在家畜中的应用研究现状 |
| 1.4 影响基因打靶效率的因素 |
| 1.4.1 靶位点的选择 |
| 1.4.2 基因打靶载体 |
| 1.4.3 基因打靶受体细胞 |
| 1.4.4 细胞转染 |
| 1.4.5 阳性细胞的富集 |
| 1.4.6 体细胞核移植 |
| 1.5 提高打靶效率的策略 |
| 1.5.1 基因打靶载体方面 |
| 1.5.2 细胞方面 |
| 1.5.3 位点特异性重组酶 |
| 1.5.4 人工核酸酶 |
| 试验研究 |
| 第二章 人α-乳白蛋白基因及其 cDNA 的克隆 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 人α-乳白蛋白基因的克隆 |
| 2.1.5 细胞培养 |
| 2.1.6 替代细胞的制备 |
| 2.1.7 hALA cDNA 的克隆 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 hALA 真核表达载体的构建 |
| 2.2.2 山羊耳组织成纤维细胞及 HEK293 细胞的培养 |
| 2.2.3 替代细胞的制备 |
| 2.2.4 hALA cDNA 的克隆 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 β-乳球蛋白基因启动子的克隆及功能验证 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 血样及细胞 |
| 3.1.2 菌株与质粒 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 双荧光腺病毒穿梭载体构建及功能验证 |
| 3.1.5 β-乳球蛋白基因调控序列的克隆 |
| 3.1.6 重组腺病毒载体的构建 |
| 3.1.7 重组腺病毒的包装及滴度测定 |
| 3.1.8 乳腺上皮细胞的培养 |
| 3.1.9 启动子功能验证 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 双荧光腺病毒穿梭载体的构建与功能验证 |
| 3.2.2 山羊 BLG 5’端调控序列的克隆与分析 |
| 3.2.3 BLG 重组腺病毒载体的构建 |
| 3.2.4 重组腺病毒的包装 |
| 3.2.5 上皮细胞的培养 |
| 3.2.6 BLG 基因 5’端调控序列功能验证 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 靶向山羊 -乳球蛋白基因座位的基因打靶载体的构建 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 血样 |
| 4.1.2 质粒及菌株材料 |
| 4.1.3 其他试剂 |
| 4.1.4 主要仪器设备 |
| 4.1.5 血液基因组提取 |
| 4.1.6 相关 DNA 片段的克隆 |
| 4.1.7 基因打靶载体 pBAT 的构建 |
| 4.1.8 双阳性筛选标记打靶载体的构建 |
| 4.1.9 基因打靶载体 pBATM 的构建 |
| 4.1.10 基因打靶载体 pBAcT 的构建 |
| 4.1.11 基因打靶载体中 loxp 生物活性的鉴定 |
| 4.1.12 打靶载体中目的基因表达鉴定 |
| 4.2 结果及分析 |
| 4.2.1 相关基因的克隆及鉴定 |
| 4.2.2 基因打靶载体 pBAT 的构建 |
| 4.2.3 双阳性打靶载体 pBATGFP 的构建 |
| 4.2.4 基因打靶载体 pBATM 的构建 |
| 4.2.5 基因打靶载体 pBAcT 的构建 |
| 4.2.6 基因打靶载体中 loxp 生物活性鉴定 |
| 4.2.7 基因打靶载体中目的基因表达验证 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 基因打靶细胞的筛选及鉴定 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试剂 |
| 5.1.2 主要设备和仪器 |
| 5.1.3 基因打靶质粒的准备 |
| 5.1.4 胎儿成纤维细胞的培养及生长特性分析 |
| 5.1.5 G418 最佳筛选浓度的确定 |
| 5.1.6 细胞转染参数优化 |
| 5.1.7 阳性细胞筛选 |
| 5.1.8 阳性克隆的鉴定 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 山羊胎儿成纤维细胞的培养 |
| 5.2.2 G418 最佳筛选浓度的确定 |
| 5.2.3 电转参数的优化 |
| 5.2.4 基因打靶细胞的筛选 |
| 5.2.5 阳性克隆的鉴定 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 体细胞核移植生产基因打靶山羊 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试剂 |
| 6.1.2 主要仪器设备 |
| 6.1.3 卵母细胞的成熟培养 |
| 6.1.4 成熟卵母细胞的去核 |
| 6.1.5 核移植、融合与激活 |
| 6.1.6 克隆囊胚的移植与妊娠检测 |
| 6.1.7 转基因山羊的 PCR 和 Southern 鉴定 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 卵母细胞体外成熟 |
| 6.2.2 基因打靶细胞的体细胞核移植 |
| 6.2.3 基因打靶克隆胚胎的移植 |
| 6.2.4 基因打靶山羊的鉴定 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 结论 |
| 本研究主要创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）sfat-1基因乳腺特异性表达载体的构建及转基因细胞的获得（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 FAT-1 基因及Ω-3 脂肪酸脱氢酶 |
| 1.1.1 不饱和脂肪酸 |
| 1.1.2 ω-3 不饱和脂肪酸脱氢酶 |
| 1.1.3 fat-1 基因的研究进展 |
| 1.2 哺乳动物乳腺生物反应器 |
| 1.2.1 转基因动物乳腺生物反应器的优势 |
| 1.2.2 乳腺特异性表达载体的构建 |
| 1.2.3 乳腺生物反应器的发展趋势 |
| 1.3 展望 |
| 第二章 SFAT-1 基因乳腺特异性表达载体的构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 仪器设备及试剂 |
| 2.1.3 牛β-乳球蛋白基因调控序列的克隆 |
| 2.1.4 sfat-1 基因乳腺特异性表达载体的构建 |
| 2.1.5 pCB1E 和pCB2E 载体的构建 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 牛β-乳球蛋白基因5'调控序列的克隆 |
| 2.2.2 sfat-1 基因乳腺特异性表达载体的构建 |
| 2.2.3 对照载体pCB1E 和pCB2E 的构建 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 中国荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞系建立及SFAT-1 基因转染 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 仪器设备及试剂 |
| 3.1.3 主要试剂的配制 |
| 3.1.4 中国荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞培养建系 |
| 3.1.5 中国荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞的体外培养生长特点测定 |
| 3.1.6 脂质体转染sfat-1 基因 |
| 3.1.7 转基因细胞sfat-1 基因的PCR 鉴定 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 中国荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞建系培养 |
| 3.2.2 中国荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞体外培养生长特点 |
| 3.2.3 转sfat-1 基因阳性细胞的获得 |
| 3.2.4 转基因细胞sfat-1 基因的PCR 鉴定 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）mWAP-hLTF杂合基因座载体的构建及其在转基因小鼠乳腺中表达的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 一.乳铁蛋白研究现状 |
| 二.人工染色体在乳腺生物反应器中的应用 |
| 三.Red 同源重组在构建杂合型基因座乳腺表达载体中的应用 |
| 参考文献 |
| 第二章 三步连续‘Gap-repair’构建小鼠WAP－人LTF 杂合基因座 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 mWAP－hLTF 杂合基因座在转基因小鼠乳腺中表达的研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 致谢 |
| 附文献综述 |
（6）稳定整合人乳铁蛋白cDNA山羊胎儿成纤维细胞的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 激素诱导的奶蛋白基因表达信号转导通路 |
| 1.1 复合型应答元件 |
| 1.1.1 STAT5 |
| 1.1.2 C/EBPs 相关的激素和发育调控 |
| 1.1.3 C/EBPβ在乳腺发育过程中的表达 |
| 1.1.4 C/EBPδ |
| 1.1.5 NFI |
| 1.1.6 糖皮质激素（GR） |
| 1.1.7 负向调节因子：YYI 和Milk Box Region |
| 1.2 奶蛋白基因表达信号通路间的对话 |
| 1.2.1 转录因子在β酪蛋白基因启动子的模式分布 |
| 1.2.2 GR 和STAT5 间的协同作用 |
| 1.2.3 NF-γ和STAT5 间的拮抗作用 |
| 1.3 催乳素和糖皮质激素在β酪蛋白启动子的整合 |
| 1.3.1 关于β酪蛋白基因转录的特异性转录因子和染色质修饰子间的相互作用 |
| 1.3.2 基础转录装置与DNA 模板的结合以及β酪蛋白转录的抑制 |
| 1.4 结论 |
| 第二章 乳腺特异性表达载体的构建 |
| 2.1 乳腺特异性表达载体的启动子及其调控序列 |
| 2.1.1 乳清酸蛋白基因（WAP） |
| 2.1.2 β-乳球蛋白基因（β-lactoglobulin BLG） |
| 2.1.3 酪蛋白基因（casein gene） |
| 2.2 内含子对转基因动物表达效率的影响 |
| 2.2.1 位置效应对转基因动物表达效率的影响 |
| 2.2.2 目的基因 |
| 2.3 其它载体的研究 |
| 2.3.1 人工染色体 |
| 2.3.2 同源重组技术 |
| 2.4 小结与展望 |
| 2.5 乳腺生物反应器存在的问题 |
| 第二部分 试验部分 |
| 第三章 人乳铁蛋白基因克隆及载体构建 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 调控序列GBC4.5 与 GBC6.5 的扩增结果 |
| 3.2.2 pEGFP-6.5 BspE I 和Sal I 的双酶切及pEGFP-4.5 的Sal I 单酶切结果 |
| 3.2.3 从pBL 扩增长约2.3 kb 的人乳铁蛋白（hLF）cDNA |
| 3.2.4 p6.5hLF-EGFP 和 p4.5hLF-EGFP 的 Sal I/BamH I 双酶切结果 |
| 3.2.5 p6.5hLF-EGFP 和p4.5hLF-EGFP 载体检测结果 |
| 3.2.6 p6.5hLF-EGFP 和p4.5hLF-EGFP 载体示意图 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 山羊胎儿成纤维细胞培养体系的建立 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 山羊胎儿成纤维细胞转染质粒p6.5hLF-EGFP 和p4.5hLF-EGFP后报告基因EGFP 的表达 |
| 4.2.2 稳定转染hLFcDNA 山羊胎儿成纤维细胞基因组DNA 的多重PCR 鉴定结果 |
| 4.2.3 稳定整合hLFcDNA 阳性细胞的核型分析结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）新疆绵羊β-乳球蛋白（BLG）5′端调控区的克隆与序列测定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 绵羊全血基因组DNA的提取 |
| 1.2.2 BLG5′上游调控区的PCR扩增 |
| 1.2.3 BLG5′上游调控区克隆 |
| 1.2.4 BLG5′上游调控区核苷酸序列测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 BLG5′调控区的PCR扩增 |
| 2.2 目的片段的克隆 |
| 2.3 BLG5′调控区基因的核苷酸序列分析 |
| 3 讨论 |
（8）乳蛋白与CMV复合启动子驱动hLF cDNA乳腺特异性表达（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 转基因动物乳腺生物反应器研究进展 |
| 1.国外转基因动物乳腺生物反应器研究进展 |
| 2.国内乳腺生物反应器研究开发进展 |
| 第二章 乳腺生物反应器的分子遗传学基础 |
| 1.真核生物的表达调控 |
| 2.乳蛋白基因的表达调控 |
| 2.1 酪蛋白及其表达调控序列 |
| 2.2 β-乳球蛋白(BLG) |
| 2.3 乳清酸蛋白(WAP) |
| 第三章 乳腺特异性表达载体构建研究进展 |
| 1.启动子 |
| 2.5′和3′非翻译区 |
| 3.5'非转录区(5'UTR)中短阅读框架(uORF) |
| 4.增强子 |
| 5.基因座控制区与核基质黏附区及长片段调控序列的应用 |
| 6.转录后调控相关元件 |
| 7.翻译后修饰及功能基因选择 |
| 8.CMV启动/增强子 |
| 9.人乳铁蛋白的生物学功能 |
| 10.问题与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 乳腺特异性表达hLF cDNA基因载体的构建 |
| 第一章 乳蛋白调控元件、人乳铁蛋白cDNA和相关启动/增强子的分离和扩增 |
| 1.材料和试剂 |
| 1.1 仪器和器材 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 试验动物 |
| 1.4 部分质粒和引物序列及合成 |
| 2.方法 |
| 2.1 引物的处理 |
| 2.2 PCR反应混合物组成 |
| 2.3 PCR参数 |
| 2.4 PCR产物的克隆 |
| 2.4.1 PCR产物的纯化 |
| 2.4.2 PCR产物浓缩 |
| 2.4.3 浓缩的PCR产物与PGEM载体连接 |
| 2.4.4 连接产物转化DH5a感受态细胞 |
| 2.5 PCR产物克隆、转化、测序及同源性分析KSK |
| 2.6 限制性内切酶消化反应 |
| 2.6.1 单酶切反应 |
| 2.6.2 双酶切反应 |
| 2.7 DNA片段末端的补平 |
| 2.8 DNA片段的分离与回收 |
| 3.乳腺特异性表达调控元件和hLFcDNA的分离 |
| 3.1 牛as1-酪蛋白5'和3'端表达调控序列的分离和扩增 |
| 3.1.1 哺乳动物基因组DNA的提取 |
| 3.1.2 PCR扩增参数 |
| 3.1.3 PCR纯化,浓缩处理见2.4 |
| 3.1.4 PCR产物克隆 |
| 3.2 山羊β-乳球蛋白5'和3'调控序列的扩增与克隆 |
| 3.2.1 山羊β-乳球蛋白基因5'端和3'端调控区部分测序结果及同源性分析 |
| 3.3 山羊β-酪蛋白调控序列的应用 |
| 3.4 人乳铁蛋白cDNA的扩增和克隆 |
| 3.5 Neo基因的扩增和克隆 |
| 3.6 CMV启动/增强子的PCR扩增和克隆 |
| 3.6.1 PCR反应体系 |
| 3.6.2 PCR扩增参数(热启动法) |
| 3.6.3 PCR产物定量和克隆 |
| 第二章 人乳铁蛋白乳腺特异性表达载体构建 |
| 1.用山羊β-乳球蛋白调控元件构建乳腺特异性表达载体 |
| 1.1 BnF95载体的构建和结构 |
| 1.1.1 β-乳球蛋白3'端和Neo基因的连接: |
| 1.1.2 β乳球蛋白3'调控区和Neo基因与β乳球蛋白5'端调控区的连接 |
| 1.1.3 人乳铁蛋白基因和BN16的连接 |
| 1.2 pBnCL14载体的构建和结构 |
| 1.2.1 载体PCL的构建 |
| 1.2.2 pBnCL14载体的构建 |
| 1.3 pBnLC2G载体的构建和结构 |
| 2.牛as1-酪蛋白调控元件的乳腺特异性表达载体构建 |
| 2.1 pbCN/LF载体的构建和结构 |
| 2.2 pbCNCS/LF36载体的构建和结构 |
| 2.2.1 PCL质粒消除Not Ⅰ位点 |
| 3.以山羊β-酪蛋白基因调控序列为启动子构建hLF表达载体 |
| 3.1 pgCN/LF/g载体的构建和结构 |
| 3.2 pgCNCG//LF25载体的构建和结构 |
| 3.2.1 CMV插入到山羊β-酪蛋白调控序列5'端和3'端之间: |
| 3.2.2 人乳铁蛋白基因同pBC1-Pcmv连接: |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 外源基因转染乳腺上皮细胞及诱导表达 |
| 第一章 山羊乳腺上皮细胞培养 |
| 1.山羊乳腺上皮细胞分离和培养 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 仪器、器械和器具 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 正常奶山羊的催乳 |
| 1.4.2 山羊乳腺上皮细胞的分离和培养 |
| 1.4.3 细胞冻存与解冻 |
| 2.结果分析 |
| 2.1 奶山羊乳腺上皮细胞与成纤维细胞的分离纯化培养 |
| 2.2 山羊乳腺上皮细胞生长观察 |
| 2.2.1 乳腺上皮细胞的生长和形态 |
| 2.2.2 山羊乳腺上皮细胞的贴壁与生长曲线 |
| 2.2.3 细胞解冻后的存活率 |
| 第二章 外源基因电转染山羊乳腺上皮细胞及转基因细胞株筛选 |
| 1.仪器和试剂 |
| 2.方法 |
| 2.1 乳腺特异性载体的准备 |
| 2.2 细胞对G418的耐受性实验 |
| 2.3 乳腺上皮细胞电转染外源基因 |
| 2.3.1 电转染条件的优化 |
| 2.3.2 BnF95、pBnCL14和pBnLC2G电转染奶山羊乳腺上皮细胞(GMECs) |
| 2.4 G418抗性培养及转基因细胞株的筛选 |
| 2.4.1 G418在培养液中的浓度确定 |
| 2.4.2 阳性克隆细胞株的挑选 |
| 2.4.3 PCR检测抗性细胞株外源基因整合 |
| 2.4.4 整合外源基因的细胞的诱导表达 |
| 2.4.5 诱导表达细胞株收集液ELISA检测 |
| 3.结果 |
| 3.1 细胞转染的电参数 |
| 3.2 转染细胞的筛选 |
| 3.2.1 G418的特性 |
| 3.2.2 G418筛选浓度的确定 |
| 2.2.3 转染细胞抗性培养 |
| 3.3.4 单克隆细胞的挑取 |
| 3.2.5 转染细胞外源基因PCR检测结果 |
| 3.3 获得的转基因细胞株 |
| 3.4 转基因细胞表达结果 |
| 4.讨论 |
| 4.1 细胞转染 |
| 4.2 转染细胞的筛选 |
| 4.3 抗性细胞株的PCR检测 |
| 4.4 表达率和表达水平 |
| 参考文献 |
| 第四部分 乳腺特异性表达载体在小鼠中表达特性检验 |
| 第一章 转基因小鼠的产生 |
| 1.材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试剂药品 |
| 1.3 实验动物 |
| 2.方法 |
| 2.1 显微注射DNA的准备 |
| 2.1.1 DNA的准备 |
| 2.1.2 小鼠超数排卵 |
| 2.1.3 取卵 |
| 2.1.4 原核显微注射 |
| 2.1.5 输卵管胚胎移植 |
| 2.2 转基因小鼠的整合检测 |
| 2.2.1 鼠尾基因组DNA提取 |
| 2.2.2 转基因小鼠PCR检测 |
| 3.结果 |
| 3.1 小鼠出生和转基因小鼠的筛选 |
| 3.2 转基因小鼠的传代 |
| 第二章 转基因小鼠乳表达特性分析 |
| 1.材料与试剂 |
| 2.方法 |
| 2.1 PCR检测阳性转基因小鼠的乳汁表达检测 |
| 2.1.1 乳汁收集及处理 |
| 2.1.2 小鼠乳清的提取 |
| 2.2 转基因小鼠乳清的酶联免疫(ELISA)检测 |
| 2.2.1 抗原包被 |
| 2.2.2 封闭 |
| 2.2.3 靶蛋白与一抗作用 |
| 2.2.4 加入酶标二抗 |
| 2.2.5 显色 |
| 2.2.6 结果判断 |
| 2.3 转基因小鼠乳清的的蛋白印迹(Western Blot)检测 |
| 2.3.1 转基因小鼠乳清的SDS-PAGE电泳 |
| 2.3.2 转基因小鼠乳汁蛋白的Western Blot检测 |
| 3.结果 |
| 3.1 转基因小鼠乳清的酶联免疫(ELISA)检测结果 |
| 3.2 转基因小鼠乳清western blot和ELISA检测结果 |
| 4.讨论 |
| 4.1 转基因小鼠出生率 |
| 4.2 表达水平和表达率 |
| 4.3 表达的定位性 |
| 4.4 转基因小鼠传代与表达 |
| 4.5 重组人乳铁蛋白的杂交电泳条带及分子量 |
| 参考文献 |
| 第五部分 分析讨论与结论 |
| 1.复合启动/增强子与基因表达调控网络 |
| 2.CMV启动/增强子的作用原理分析 |
| 3.复合启动/增强子hLF cDNA在乳腺上皮细胞中表达特性 |
| 4.人乳铁蛋白cDNA及基因组DNA与表达水平的关系 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）增强子、绝缘子和β-乳球蛋白调控序列启动功能基因在山羊乳腺上皮细胞中表达的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文及缩写符号 |
| 第一章 转基因动物乳腺生物反应器 |
| 1 转基因动物乳腺生物反应器原理 |
| 2 乳腺生物反应器的优势 |
| 3 乳腺生物反应器的应用及现状 |
| 4 转基因动物乳腺生物反应器模型的建立 |
| 4.1 乳腺特异性表达载体的构建及影响因素 |
| 4.2 转基因技术 |
| 4.3 提高外源基因表达效率的措施 |
| 5 乳腺特异性表达载体构建有效性的验证 |
| 5.1 乳腺暂态表达 |
| 5.2 制作转基因小鼠 |
| 5.3 乳腺细胞培养作为检测乳腺表达载体构建有效性的表达系统 |
| 第二章 山羊乳腺上皮细胞的培养 |
| 1 动物细胞培养的发展 |
| 2 乳腺细胞培养概况 |
| 第三章 山羊β-乳球蛋白（BLG）基因调控序列指导人乳铁蛋白cDNA 乳腺特异性表达载体的构建 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 山羊乳腺上皮细胞的培养及转染人乳铁蛋白基因细胞株的获得 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表的文章 |
（10）我国不同地域牦牛BLG基因部分核苷酸序列同源性分析（论文提纲范文）
| 1材料与方法 |
| 1.1实验材料 |
| 1.2方法 |
| 2结果与分析 |
| 2.1基因组DNA的提取 |
| 2.2靶基因序列的PCR扩增及重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.3青海、云南及甘肃牦牛乳球蛋白基因5′调区核苷酸序列的同源性比较 |
| 3讨论 |
| 4结论 |
四、绵羊β-乳球蛋白基因5′端及上游调控序列的PCR扩增的方法学研究（论文参考文献）
- [1]TALEN介导的β-乳球蛋白基因敲除奶山羊的生产[D]. 崔趁趁. 西北农林科技大学, 2015(01)
- [2]以β-乳球蛋白为靶基因的锌指核酸酶构建与筛选体系的探索[D]. 李静心. 南京农业大学, 2013(08)
- [3]靶向山羊β-乳球蛋白基因的基因打靶研究[D]. 胡林勇. 西北农林科技大学, 2012(06)
- [4]sfat-1基因乳腺特异性表达载体的构建及转基因细胞的获得[D]. 袁天杰. 中国农业科学院, 2009(10)
- [5]mWAP-hLTF杂合基因座载体的构建及其在转基因小鼠乳腺中表达的研究[D]. 施庚寿. 中国人民解放军军事医学科学院, 2008(11)
- [6]稳定整合人乳铁蛋白cDNA山羊胎儿成纤维细胞的制备[D]. 林慧. 西北农林科技大学, 2008(11)
- [7]新疆绵羊β-乳球蛋白（BLG）5′端调控区的克隆与序列测定[J]. 王鹏雁,蒋建军,陈创夫,李彦芳. 石河子大学学报(自然科学版), 2008(02)
- [8]乳蛋白与CMV复合启动子驱动hLF cDNA乳腺特异性表达[D]. 成勇. 南京农业大学, 2007(02)
- [9]增强子、绝缘子和β-乳球蛋白调控序列启动功能基因在山羊乳腺上皮细胞中表达的影响[D]. 李贵阳. 扬州大学, 2007(06)
- [10]我国不同地域牦牛BLG基因部分核苷酸序列同源性分析[J]. 刘建忠,田为宇,周丽芳,敖敬. 武汉科技大学学报(自然科学版), 2006(05)