一、应用RT—PCRIS技术检测大肠肿瘤石蜡标本三区组织中P~(53)mRNA（论文文献综述）
戴芳[1]（2021）在《CMTM6表达促进肺癌增殖侵袭及机制研究》文中进行了进一步梳理[目的]肺癌是世界上发病率和死亡率最高,增长最快的恶性肿瘤之一,是全球男性和女性癌症死亡的主要原因。肺癌病理类型包括非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC）,超过85%的病例为非小细胞肺癌。非小细胞肺癌具有遗传和细胞异质性。虽然在肺癌的诊断和治疗上取得了长足的进步,但是NSCLC的总体治愈率和生存率仍然很低,尤其是在转移性疾病中。肺癌发生和转移的具体分子机制目前还不完全清楚。肺癌的发生和侵袭是一个复杂而动态的过程,涉及肿瘤组织的内在遗传异常及其与免疫系统的相互作用。鉴于此,深入研究肺癌的发生、发展和转移的机制,对开发有效的治疗措施、提高肺癌的生存率具有重要的临床价值和社会效益。近年来发现,CMTM6 基因（chemokine-like MARVEL transmembrane domain containing family member 6）与肿瘤免疫逃逸有关。此基因又名趋化素样因子超家族6。该基因位于3号染色体短臂2区2带3亚带,其编码的蛋白质产物具有四次跨膜蛋白超家族（TM4SF）和MARVEL结构域,因此与多种肿瘤密切相关。研究显示CMTM6和PD-L1共同定位于肿瘤细胞表面,呈正相关,CMTM6通过稳定肿瘤细胞表面PD-L1分子,从而使T细胞抑制,使肿瘤细胞逃脱T细胞杀伤。然而CMTM6和PD-L1的表达不完全呈正相关,表明CMTM6不只与PD-L1相关,可能还有其它的重要分子和CMTM6相互作用共同影响肿瘤预后。同时其它研究显示CMTM6在多种肿瘤组织中表达,与肿瘤预后不良有非常密切的关系。但在原发肺肿瘤中表达及与预后的关系尚未清楚,且CMTM6在肺癌发生发展中的功能及分子机制亦知之甚少。同时,CMTM6作为一种新的生物标志物,对其功能的研究还远远不够。为此本课题拟检测CMTM6在非小细胞肺癌中的表达情况,分析其表达与相关临床病理参数之间的关系;通过体内外实验,研究肺癌发生、发展和转移过程中的作用;探究CMTM6调节肺癌细胞增殖和侵袭的机制。[方法]1.利用免疫组织化学检测石蜡标本非小细胞肺癌组织、正常肺组织中CMTM6的表达,并分析CMTM6的表达与肿瘤分化、分期、转移和临床预后等相关临床病理参数的关系;2.建立干扰CMTM6的稳转肺癌细胞株,通过体外MTT实验,平板克隆形成实验,流式细胞检测凋亡检测肿瘤细胞的增殖能力;通过划痕实验检测肿瘤细胞的迁移能力;Transwell实验检测肿瘤细胞的侵袭能力。3.体内实验:用干扰CMTM6的稳转肺癌细胞株建立裸鼠皮下肺癌移植瘤模型,检测CMTM6在裸鼠体内对肺癌细胞增殖的影响;检测裸鼠心、肝、脾、肺、肾、大脑、大肠、小肠有无肿瘤侵袭。4.利用转录组测序筛选CMTM6差异表达基因,通过对敲低CMTM6的肺癌细胞和对照组肺癌细胞mRNA基因表达量的统计,找出差异表达基因;对差异基因进行GO功能富集和KEGG信号通路富集;构建蛋白质互作网络并用cytoscape软件进行了可视化,提取和CMTM6相互作用的核心基因;构建了差异基因-信号通路网络,提取主要作用信号通路的相关蛋白。5.差异表达基因验证:通过流式细胞术检测干扰CMTM6肺癌细胞周期分布;通过western blot检测干扰CMTM6后细胞周期相关蛋白P53,P21,P27,Cyclin A,Cyclin D,Cyclin E,CDK2,CDK4 和 ERK,pERK,AKT,pAKT 的表达情况。[结 果]一、CMTM6在肺癌组织中的表达1.免疫组化结果显示CMTM6阳性表达主要定位于细胞膜和细胞质,呈棕褐色或棕黄色。2.肺癌组织CMTM6蛋白表达水平（161.04±86.60）高于邻近正常肺组织（71.20±45.10）（P<0.05）。3.CMTM6表达与肿瘤T分期、肿瘤组织学类型和肿瘤浸润淋巴细胞相关（P<0.05）,与患者年龄、性别、肿瘤分化程度、淋巴结浸润无关。4.Kaplan-Meier生存分析结果显示,CMTM6高表达患者的5年总体生存期明显短于低表达患者（P<0.01）。二、CMTM6促进肺癌细胞增殖和迁移、侵袭能力1.体外实验:MTT结果显示,CMTM6干扰的稳转肺癌株生长速度显着慢于对照组（P<0.01）。平板克隆形成实验显示,CMTM6干扰的稳转肺癌株克隆形成的数量显着少于对照组（P<0.05）。流式细胞术检测凋亡结果显示,CMTM6干扰稳转肺癌株凋亡率高于对照组（P<0.05）。划痕实验结果显示,CMTM6干扰的稳转肺癌株细胞迁移的速度明显减慢（P<0.05）。Transwell实验结果显示,CMTM6干扰稳转肺癌株侵袭细胞的数量明显少于对照组（P<0.05）。2.体内实验:裸鼠皮下成瘤实验表明,与对照组相比,CMTM6干扰的稳转肺癌株肿瘤生长速度较慢,肿瘤体积较小（P<0.05）。免疫组化结果显示,CMTM6干扰组的Ki-67阳性率（39.6%）显着低于对照组（76.4%）（P<0.05）。裸鼠心、肝、脾、肺、肾、大脑、大肠、小肠HE检测未见转移瘤。三、CMTM6调节肺癌细胞增殖和侵袭的机制1.转录组测序得到CMTM6差异表达基因4993个,上调基因2466个,下调基因2527个。2.对这些基因进行GO功能富集和KEGG信号通路富集,发现CMTM6差异表达基因在生物学过程主要富集在有丝分裂细胞周期相变,DNA复制和染色体分离。细胞组成主要富集在染色体,着丝粒区,染色体区和着丝粒。分子功能主要集中在作用于DNA的催化活性,核孔结构组成和微管蛋白结合。3.KEGG信号通路主要富集在DNA复制,细胞周期和碱基切除修复。4.蛋白质互作网络提取与CMTM6相互作用的核心基因10个,分别为UBC,TP53,PRDM10,HSP90AA1,TSPO,UBB,CDK1,TOP2A,CAD,CDK2。5.差异基因-信号通路网络得到主要作用信号通路的相关蛋白。作用P53信号通路的主要由TP53,CDK1,CDK2,CCND1,CCND3等。作用于细胞周期信号通路的主要有TP53,CDK1,CDK2,CDK6,CCNB1等。作用于DNA复制信号通路的主要有MCM2,MCM5,MCM7,POLE2,LIG1等。6.CMTM6差异表达的基因主要富集在细胞周期。7.流式细胞仪检测细胞周期结果显示,干扰CMTM6则使细胞周期阻滞于G0/G1期,细胞不能进入G2/M期,抑制细胞增殖。8.western blot 检测细胞周期相关蛋白 P53,P21,P27,CyclinA,CyclinD,Cyclin E,CDK2,CDK4的表达,干扰CMTM6可以通过激活P53,进一步诱导P27基因的表达,从而抑制Cyclin A的活性,将细胞周期阻滞在G0/G1期。9.western blot 检测 ERK,pERK,AKT,pAKT 蛋白表达,结果显示 CMTM6干扰稳转肺癌株下调了 pERK的表达,抑制ERK的磷酸化,但对AKT没有影响。[结 论]1.非小细胞肺癌组织中CMTM6表达水平显着上调,CMTM6表达与肿瘤T分期、肿瘤组织学类型和肿瘤浸润淋巴细胞相关。2.CMTM6表达与肺癌预后呈负相关。3.干扰CMTM6抑制肺癌细胞的增殖、侵袭迁移能力。4.CMTM6促进肺癌细胞的增殖、侵袭迁移能力,其调控机制可能与P53介导细胞周期阻滞有关。CMTM6通过MAPK/ERK信号通路介导肺癌细胞的增殖和迁移。5.CMTM6可作为评估NSCLC预后的独立危险因素,为临床制定个体化NSCLC治疗方案提供依据。
刘雅雯[2]（2021）在《TRIM37通过调控Wnt/β-catenin信号通路促进宫颈癌细胞增殖和侵袭》文中认为研究背景及目的:宫颈癌（cervical cancer）位居女性恶性生殖系统肿瘤首位,严重地危害着女性的健康。约50%的患者初诊时即为晚期,尽管近年来,放射治疗、靶向及免疫治疗已经取得了较大的进步,但有效率仍未得到明显的提高,且有50%的晚期宫颈癌患者会出现复发及转移,使生存率大大降低。因此,深入探讨宫颈癌细胞侵袭的分子机制,积极寻找到与宫颈癌细胞侵袭转移相关的主要基因靶点对提高宫颈癌患者的疗效及预后意义重大。TRIM蛋白家族参与了多种生理及病理过程,包括细胞增殖、自噬天然免疫、炎症和肿瘤的发生。研究已证实TRIM37在胰腺癌、肝癌、乳腺癌及肠癌的发生、发展过程中起着促癌作用,但其在宫颈癌中的生物学功能及其作用机制尚未阐明。在肿瘤发生发展的过程中,Wnt/β-catenin信号通路能够产生重要影响,如细胞增殖、侵袭转移、上皮-间质转化和肿瘤干细胞的特性。TRIM37与Wnt/β-catenin通路是否存在关联?TRIM37能否通过调控Wnt/β-catenin通路发挥生物学功能?明确该信号通路在宫颈癌中异常激活的机制,不仅有助于进一步了解宫颈癌细胞的增殖及恶性进程的机制,同时也能为临床疾病的治疗提供新的思路。本研究目的拟分析TRIM37与宫颈癌患者生存预后的关系;探讨宫颈癌中TRIM37的表达情况及生物学功能;明确TRIM37与Wnt/β-catenin信号通路下游核心成分间的关系,为宫颈癌的诊治和预后判断提供新的分子靶标。第一部分TRIM37在宫颈癌组织中的表达及临床意义目的:分析宫颈癌组织中TRIM37的表达水平,研究其与宫颈癌患者的临床病理因素之间存在的关联,及其对预后的影响。方法:应用Western blot法检测8对新鲜的宫颈癌组织及癌旁组织中TRIM37的表达水平;免疫组化检测131例宫颈癌石蜡标本中TRIM37的表达情况,应用卡方检验分析TRIM37的表达与临床病理因素间的相关性,通过随访患者生存,进一步分析可能影响患者生存的预后因素。结果:相较于宫颈癌旁组织,宫颈癌组织中的TRIM37表达水平相对较高。卡方检验结果提示:TRIM37的表达与肿瘤直径（P=0.005）;淋巴结转移（P=0.001）及FIGO分期（P=0.000）相关。Log-rank结果提示:TRIM37表达高的宫颈癌患者,总生存时间（OS）明显劣于表达低的患者（40个月VS.70个月;P=0.001）。COX回归分析显示:FIGO分期晚、淋巴结转移、TRIM37高表达均是导致患者生存预后差的相关因素。结论:TRIM37在宫颈癌组织中的表达明显高于癌旁组织,且TRIM37高表达是宫颈癌患者生存的预后不良因素。第二部分TRIM37在宫颈癌发生发展中的生物学功能目的:检测TRIM37在宫颈癌四株细胞系中的表达情况,明确其在宫颈癌中发挥的生物学功能及是否能促使宫颈癌细胞发生EMT。方法:采取RT-PCR、Westem-blot法检测宫颈癌细胞中TRIM37的mRNA和蛋白表达水平。通过CCK-8及平板克隆实验,对宫颈癌细胞的实际增殖能力进行检测;通过开展transwell细胞侵袭实验了解细胞侵袭能力,并使用划痕实验分析细胞的迁移能力;借助于Western blot及免疫荧光法了解EMT过程中的标记蛋白的变化情况。结果:过表达TRIM37后,Hela及SIHA宫颈癌细胞增殖、侵袭、迁移能力均增强,干扰TRIM37后,Hela及SIHA细胞增殖、侵袭、迁移能力减弱。Western blot及免疫荧光结果提示:干扰TRIM37后,Vimentin表达水平显着降低,而E-cadherin水平显着升高,然而过表达TRIM37后可获得相反的生物学功能效应。结论:TRIM37可促进宫颈癌细胞的增殖、侵袭及迁移。干扰TRIM37后可抑制宫颈癌细胞的迁移、侵袭能力;TRIM37还可促进宫颈癌细胞发生EMT。第三部分TRIM37在宫颈癌中对Wnt/β-catenin信号通路的调控研究目的:研究宫颈癌中TRIM37的表达对Wnt/β-catenin信号通路中核心成分的表达的影响,探索TRIM37促进宫颈癌发生发展的潜在机制。方法:采用Western-blot、RT-PCR检测裸鼠移植瘤中相应指标的变化;应用Western blot检测转染TRIM37 sh RNA对宫颈癌细胞Wnt/β-catenin信号通路中核心成员蛋白的表达水平的影响;RT-PCR检测转染TRIM37 sh RNA对宫颈癌细胞Wnt/β-catenin信号通路核心成员mRNA表达水平的影响。结果:在TRIM37干扰组的瘤体组织中,Wnt/β-catenin通路中的核心成份β-catenin及cyclin D1的蛋白表达下调;与转染scramble sh RNA的Hela及SIHA宫颈癌细胞相比,转染TRIM37 sh RNA的Hela及SIHA宫颈癌细胞中TRIM37、c-Myc、β-catenin及cyclin D1蛋白水平均明显下调;同样在转染TRIM37 PLASMID的Hela及SIHA宫颈癌细胞中TRIM37、c-Myc、β-catenin及cyclin D1蛋白的表达水平明显升高。结论:TRIM37的表达变化可影响Wnt/β-catenin信号通路下游核心成员的表达水平,且TRIM37可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制肿瘤的生长。
胡博[3]（2021）在《长链非编码RNA CYTOR通过调节miR-125b-5p/KIAA1522轴影响肝细胞癌增殖、凋亡和细胞周期的机制研究》文中认为背景:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一种原发性肝脏恶性肿瘤,在世界范围内发病率高、治疗效果欠佳。随着靶向治疗药物如索拉非尼、伦伐替尼,以及免疫治疗药物如免疫检查点抑制剂的出现,其预后得到一定的改善,但5年生存率仍旧不高。竞争性内源性RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）揭示了RNA间相互作用的新机制,即以长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）为主的非编码RNA通过竞争性共享微小RNA（microRNA,miRNA）来调节mRNA（messenger RNA,信使RNA）的表达,这种调节机制在癌症的发病机理中扮演了重要的角色。但是,ceRNA在HCC中的功能作用及调节机制仍未被完全解释,新的ceRNA调控轴亟待探究。lncRNA CYTOR是一种已被证实在多种肿瘤中发挥促进细胞增殖、迁移等作用的非编码基因,并可作为多种miRNA的内源性海绵。然而,lncRNACYTOR作为ceRNA在HCC发生、发展中的作用及调控网络目前仍不十分清楚。因此,本研究以lncRNACYTOR为起点,探索ceRNA调节机制在HCC中的应用。材料与方法:通过检索癌症基因组图谱数据库（The Cancer Genome Atlas,TCGA）,获得人类HCC的lncRNA、mRNA和miRNA数据集表达数据和相应临床信息。下载基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus database,GEO）数据库中GSE62232和GSE84402的HCC相关RNA数据用于后续验证。借助在线数据分析工具,分析lncRNA CYTOR在多种肿瘤类型及HCC相关数据集中的表达情况。借助R语言分析lncRNA CYTOR在TCGA数据库中HCC肿瘤组织及癌旁正常肝组织中的差异表达情况,以及其表达水平与TCGA数据库HCC患者总生存期（overall survival,OS）之间的关系。分析lncRNA CYTOR与常用临床病理参数,如性别、年龄、肿瘤分级、临床分期和T、N、M分期之间的关联性,并进一步整合这些参数,通过单因素及多因素Cox回归分析探究lncRNA CYTOR独立预测患者预后的能力。之后,识别TCGA数据库HCC样品中差异表达的miRNA,同时使用ENCORI软件（starbase3.0）预测目标lncRNA的靶向的miRNA,选择差异分析中表达下调的miRNA与预测的miRNA做交集后得出候选miRNA。同理,基于TCGA数据库分析HCC样品中差异表达的mRNA,并基于ENCORI软件使用6个数据库（PITA、miRNAmap、DIANA-microT、miRanda、PicTar 和 TargetScan）预测候选 miRNA 靶向的mRNA,选择差异分析中表达上调的mRNA与预测的mRNA做交集后得出候选的mRNA。使用基因集富分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）来识别与所筛选出的mRNA高表达相关的基因集和通路途径,探索其潜在的功能。结果:lncRNACYTOR在多种癌症的肿瘤组织（如结肠癌、肾透明细胞癌、膀胱尿路上皮癌等）及多个HCC相关数据集中（如GSE54236、GSE64041、GSE36376等）相较于癌旁组织表达上调。在TCGA数据库中,与癌旁正常组织相比,HCC组织中的lncRNACYTOR表达水平显着增高（P<0.001）;且高表达患者组的OS较低表达患者组显着缩短（P<0.001）。临床病理参数关联性分析显示,lncRNACYTOR的表达水平与病理分级（Grade）显着相关,且G2与G1（P<0.01）、G3与G2（P<0.05）、G3与G1（P<0.001）和G4与G1（P<0.05）之间存在显着性差异;该基因在临床Ⅱ期（StageⅡ）的表达水平较临床Ⅰ期（StageⅠ）显着上调（P<0.001）,在T2期及T4期的表达水平较T1期显着上调（P<0.001;P<0.05）。独立预后分析表明lncRNA可独立于上述临床参数来预测HCC患者的预后（P<0.05）。ENCORI软件分析得出miR-125b-5p可作为lncRNA CYTOR的靶向miRNA,后续6个数据库综合分析得出KIAA1522及PODXL可作为miR-125b-5p的候选靶向mRNA。对二者进行差异分析、生存分析及与miR-125b-5p的相关分析后,选择KIAA1522作为目标靶向mRNA。相较于癌旁组织,KIAA1522在GSE62232和GSE84402的HCC组织中表达显着上调（P<0.001）。GSEA富集分析结果表明,cell cycle信号通路、adherens junction信号通路、Notch信号通路、mTOR信号通路、Wnt信号通路、MAPK信号通路、VEGF信号通路、apoptosis信号通路和tight junction信号通路相关的基因集在高KIAA1522表达的表型中显着富集。结论:探究lncRNA的表达情况、生物学功能,构建新的lncRNA/miRNA/mRNA调控轴是研究HCC发病机制的有效手段。lncRNA在HCC组织中表达水平显着上调,与多种临床病理参数相关,且可作为HCC患者潜在的预后生物标志物。此外,lncRNA CYTOR可通过靶向miR-125b-5p进而调节KIAA1522的表达参与HCC的发生发展。背景:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一种由多种病因引起肿瘤,目前仍是人类最常见、最致命的恶性肿瘤之一。因此,寻找新的、临床上有效的HCC诊断及预后生物标志物至关重要。本实验的主要目的是基于第一部分生物信息学分析的结果,探索长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）CYTOR、微小RNA（microRNA,miRNA）miR-125b-5p 以及蛋白编码信使 RNA（messenger RNA,mRNA）KIAA1522的靶向调控作用及该调控轴在HCC发生、发展中的作用。材料与方法:通过脂质体将目的基因相关载体转染至正常肝细胞（HHL-5）及几种HCC细胞（SK-Hep-1、Hep3b和Huh-7）后,采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）检测 HCC 细胞中 lncRNA CYTOR、miR-125b-5p和KIAA1522的表达,并筛选实验细胞。免疫组化检测KIAA1522在HCC组织及癌旁正常组织中的表达情况。采用双荧光素酶报告基因检测试验证实lncRNA CYTOR、miR-125b-5p和KIAA1522间的调控关系。之后,利用CCK-8细胞增殖毒性检测试剂盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8）检测不同转染条件下HCC细胞的增殖情况,采用流式细胞仪分析转染后HCC细胞周期的变化,使用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidy l transferase mediated nick end labeling,TUNEL）观察转染后 HCC 细胞的凋亡情况;并通过蛋白免疫印迹实验（western blot,WB）分析检测细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡等相关蛋白的表达。结果:转染后,相较于HHL-5细胞,Hep3b细胞中上述基因的表达均是最为显着的,故选择Hep3b细胞进行下一步实验。双荧光素酶报告基因检测实验的结果显示miR-125b-5p mimic+CYTOR-wt 共转染组和miR-125b-5p mimic+KIAA1522-wt 共转染组Hep3b细胞的荧光素酶活性显着降低;lncRNA CYTOR可直接作用于miR-125b-5p,而miR-125b-5p可直接靶向KIAA1522。CCK-8实验结合WB检测结果显示敲低lncRNACYTOR抑制了 HCC细胞的增殖,并下调了 Ki-67和PCNA的蛋白表达;抑制miR-125b-5p或KIAA1522的过度表达则促进了细胞的增殖并上调了 Ki-67和PCNA的蛋白表达。流式细胞仪分析结合WB检测结果显示敲低lncRNA CYTOR 降低了 S期及G2/M期比值,下调了 cyclin D1及cyclin E等蛋白的表达而上调了 p21表达;抑制miR-125b-5p或KIAA1522的过度表达则升高了 S期及G2/M期比值,并上调了 cyclin D1等蛋白的表达并下调了 p21表达。TUNEL细胞凋亡检测结合WB检测提示敲低lncRNA CYTOR可促进Hep3b细胞凋亡,下调Bcl-2的表达同时上调 Bax 的表达及 cleaved caspase3/caspase 3、cleaved caspase9/caspase 9;而抑制miR-125b-5p或KIAA1522的过表达则抑制Hep3b细胞凋亡,上调Bcl-2的表达并下调 Bax 的表达及 cleaved caspase 3/caspase 3、cleaved caspase 9/caspase 9。结论:综上所述,HCC中过表达的lncRNA CYTOR可通过靶向抑制miR-125b-5p进而上调KIAA1522的表达水平,促进HCC细胞增殖、影响细胞周期并抑制细胞凋亡。本研究为肝细胞癌的发生机制注入了新的见解。
王世洋[4]（2021）在《RNF126通过介导p53泛素化降解影响结直肠癌进展的机制研究》文中提出研究背景:结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）因其高发病率及不良的预后而被人们所熟知。在全球,每年有近90万人死于结直肠癌,其病死率仅次于肺癌,乳腺癌和前列腺癌,位列第四名。在我国,结直肠癌的发病率和病死率在肿瘤人群中均位列前五名。多种分子信号通路的失调,可导致结直肠癌的发生并全力推动了结直肠癌的发展,这其中就包括癌基因同抑癌基因的功能失衡。泛素蛋白酶体系统是调节肿瘤信号通路的关键翻译后修饰之一。泛素化修饰是蛋白翻译后修饰中的一种,在许多细胞重要的生命活动中都需要泛素化修饰的参与并在其中发挥着不可替代的作用。泛素可以被泛素化活化酶E1激活,经过泛素化结合酶E2的传导作用,最后被泛素化连接酶E3识别并完成与特异性的蛋白质底物的共价结合。泛素连接酶E3可以招募底物并促进或直接催化泛素转移到目标物。泛素连接酶E3在很大程度上决定了泛素化反应的特异性。泛素连接酶E3的基因改变、表达异常或功能障碍可以导致人类癌症的发生和进展。事实上,相关抑癌分子的过度降解和致癌蛋白的降解障碍与肿瘤发生密切相关。结直肠癌的发病机制复杂、多样,涉及体细胞突变、基因异常融合、缺失或扩增以及表观遗传改变,可能导致结直肠癌中泛素化连接酶E3的异常表达或功能改变。大量研究表明,泛素化连接酶E3的功能缺陷参与了结直肠癌的分子病因和发病机制。异常表达的泛素化连接酶E3在结直肠癌中究竟起着促癌还是抑癌作用,这取决于泛素化的底物蛋白在结直肠癌中的作用。近年来,人们对于泛素化连接酶E3介导的泛素化修饰在结直肠癌发生和进展中的潜在作用方面的认识不断深入。TP53被认为是影响结直肠癌发生和发展的关键基因,TP53是结直肠癌中最常突变的基因之一。约40%-50%的结直肠癌存在TP53突变从而导致p53功能失活。p53作为转录因子也是抑癌蛋白,可以转录激活百余种的下游靶基因,促进靶基因表达。p53诱导表达的靶蛋白可以直接参与DNA的损伤修复过程,也可通过对细胞周期阻滞作用,为DNA损伤修复创造时机。事实上,p53主要是依靠其下游的靶蛋白p21来调控G1/S和G2/M细胞周期阻滞。虽然对于p53蛋白的调控可以发生于转录、翻译和蛋白修饰等多个阶段,但是p53的翻译后修饰对p53的调控作用最为重要,而p53的泛素化修饰是最重要也是研究最广泛的翻译后修饰。泛素化修饰可以抑制p53的功能活性并促进p53的核输出并介导其在细胞质中经蛋白酶体途径降解。多种泛素化连接酶E3可特异性识别p53,并将其作为泛素化底物。这其中最重要的泛素化连接酶E3是MDM2。除MDM2外,其他泛素E3连接酶如COP1、Pirh2和ARF-BP1被发现在特定环境下调控p53的泛素化和降解。RNF126（RING finger protein 126）作为一种新型的E3泛素连接酶,在一些实体肿瘤中起着致癌作用,但其在结直肠癌中的潜在作用却鲜有报道。因此,我们在本研究中探究了RNF126在结直肠癌的发展中的潜在作用及分子机制。第一部分:RNF126与p53在结直肠癌组织中的表达差异及与临床病理参数的相关性目的:观察RNF126在结直肠癌组织和癌旁组织中的表达情况。探究RNF126和p53在结直肠癌组织中的表达相关性。分析RNF126的高表达与结直肠癌患者的临床病理参数的关系。分析RNF126的高表达与结直肠癌患者的术后生存时间之间的关系。研究方法:首先利用免疫组化技术检测RNF126在147例结直肠癌及癌旁组织中的表达情况。同时检测p53在147例结直肠癌组织中的表达情况。通过相关性分析（seaprman test）探究RNF126和p53在结直肠癌组织中的表达相关性。随后通过免疫印迹法检测RNF126在24例结直肠癌及癌旁组织中的蛋白表达情况。通过实时定量PCR技术检测RNF126在24例结直肠癌及癌旁组织中的m RNA表达情况。最后,通过卡方检验,探究RNF126高表达与结直肠癌患者的临床病理参数的相关性。通过Kaplan-meier单因素分析,探究RNF126和p53的高表达对结直肠患者术后生存时间的影响。结果:免疫组化结果提示与癌旁组织相比,RNF126在结直肠癌组织中高表达（54.4%,80/147 VS 30.6%,45/147,P<0.01）。在结直肠癌标本中,突变型p53的高表达率为51%（75/147）。经相关性分析（seaprman test）提示在结直肠癌组织中RNF126高表达与p53的高表达没有相关性（r=0.114,p=0.166）。免疫印迹法和实时定量PCR提示RNF126在结直肠癌组织中的蛋白和m RNA表达均明显高于癌旁组织中的表达。对于结直肠患者的临床病理参数的分析（卡方检验）提示RNF126的高表达与CRC患者肿瘤大小（P=0.021）,T分期（P=0.030）,淋巴结转移（P=0.006）和TNM分期（P=0.001）呈正相关。RNF126表达在147例结直肠癌患者的Kaplan-meier单因素分析提示RNF126高表达的结直肠癌患者术后生存时间更短,差异具有统计学意义（p=0.003）。结论:1、RNF126在结直肠癌组织中的蛋白和m RNA表达均明显高于癌旁组织中的表达。2、RNF126的高表达与结直肠癌患者的肿瘤的大小,局部浸润深度,淋巴结转移以及TNM分期等多个临床病理参数呈显着正相关。3、RNF126的高表达与结直肠癌病人的不良预后密切相关。4、RNF126和突变型p53在结直肠癌组织中的表达无相关性。第二部分:RNF126、p53和p21在结直肠癌细胞中的表达相关性及分子机制目的:探究RNF126和p53-p21在CRC细胞中的表达相关性及分子机制研究方法:利用细胞瞬时转染技术,构建RNF126的过表达和沉默细胞系。通过免疫印迹法和免疫共沉淀技术检测RNF126和p53-p21的相互作用,联合蛋白酶体抑制剂MG132,探讨RNF126是否介导p53的泛素化调控。结果:通过免疫印迹法验证RNF126过表达和沉默的瞬转细胞系构建成功。免疫印迹实验提示在表达突变型p53的colo-205和SW620结直肠癌细胞系中,RNF126沉默并不能改变突变型p53及p21的表达水平。但在表达野生型p53的结直肠癌细胞HCT116和HCT-8中,沉默RNF126可以上调p53和p21的表达,但抑制了p Rb的表达。这一过程可以通过p53的共沉默所逆转。反之,RNF126过表达可以下调p53和p21的表达,但上调了p Rb的表达,这一过程可通过经典的蛋白酶体抑制剂MG132所逆转。通过实时定量PCR检测可发现,在RNF126沉默或过表达的细胞中,上述靶基因的m RNA水平没有变化,提示RNF126对p53-p21的调控发生在转录后水平。免疫共沉淀实验提示无论是以p53为沉淀蛋白还是以RNF126作为沉淀蛋白,RNF126和p53,p21均能形成共沉淀。进一步以p53为沉淀,检测p53的泛素化水平,沉默RNF126明显减弱p53的泛素化蛋白水平,提示p53的泛素化降解减弱,相应的,p53表达增高。而过表达RNF126明显提高了p53的泛素化,提示p53的泛素化降解增强,相应的p53表达降低。结论:1、RNF126不能调控突变型p53的蛋白表达;2、RNF126对p53-p21表达调控发生在转录后水平。可以通过泛素化降解途径调控野生型p53的表达,进而调控下游p21和p Rb的表达。第三部分:RNF126对结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭及化疗药物敏感性的调控目的:在体外,探究RNF126对于结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭和化疗药物敏感性的调控作用。在体内,通过裸鼠皮下成瘤实验进一步验证RNF126对结直肠癌的作用。研究方法:通过transwell法来研究RNF126的沉默和过表达对于结直肠癌细胞的侵袭和迁移能力的影响。通过MTT法观察RNF126的沉默和过表达对细胞增殖的作用。通过流式细胞技术,检测RNF126的沉默或过表达对结直肠癌细胞的细胞周期的调控作用。再次通过MTT法观察RNF126的沉默和过表达对于结直肠癌细胞对化疗药物敏感性的调控作用。构建RNF126沉默的稳定转染细胞系,通过裸鼠成瘤实验观察RNF126在体内实验中对结直肠癌的作用。结果:沉默RNF126可抑制HCT116结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力,而共沉默p53可逆转上述结果。相反,过表达RNF126可以促进HCT-8细胞的增殖、迁移和侵袭能力,蛋白酶抑制剂MG132可以抑制RNF126过表达对细胞增殖、侵袭、迁移和侵袭的促进作用。此外,沉默RNF126可以降低结直肠癌细胞对化疗药物的耐药性,这一结果同样可以被p53沉默所逆转。相反,过表达RNF126可以增强结直肠癌细胞对化疗药物的耐药性,这一情况同样可以被MG132所逆转。在体内实验,裸鼠成瘤实验结果提示,与对照组相比沉默RNF126的实验组裸鼠移植瘤体积增长明显受到抑制。沉默RNF126的实验组裸鼠移植瘤重量明显小于对照组。结论:1、在表达野生型p53的结直肠癌细胞中,RNF126可以通过促进p53的泛素化降解,调控p21-p Rb通路活性,最终促进CRC的增殖、侵袭、迁移和耐药。2、体内实验提示沉默RNF126对结直肠癌存在抑制作用。
陈施翰[5]（2020）在《OATP1B3在肝细胞癌中的表达与预后相关性及生物学功能分析》文中认为背景和目的:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是肝癌中最常见的类型,发病率和死亡率极高。HCC本身是一个多步骤、多阶段发展的疾病,涉及到的调控机制错综复杂,大量基因的异常表达在HCC进展过程中发挥着重要作用。有机阴离子转运多肽1B3（organic anion transporter polypeptide 1B3,OATP1B3）是在正常肝组织上表达的一种膜转运蛋白,可转运激素、药物等内外源性物质。大量研究已报道OATP1B3在胰腺癌、结直肠癌、胆管癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌等多种恶性肿瘤中的异常表达可以作为患者预后的生物标志物,并参与部分肿瘤进展。在HCC中,OATP1B3的表达水平与肿瘤分化程度显着相关,提示OATP1B3差异表达可能与HCC进展有密切联系。因此,本研究将探讨OATP1B3在HCC中的表达与临床病理学因素和预后的相关性,及其对肝癌细胞生物学功能的影响和作用机制初步探讨。方法:1.查询TCGA数据库,利用Kaplan-Meier法分析OATP1B3 mRNA与302例HCC患者的无瘤生存率和总体生存率的相关性。免疫组织化学染色法检测131例HCC患者癌组织以及89例癌旁正常组织中OATP1B3的表达情况。qRT-PCR检测30对新鲜HCC癌与配对癌旁正常组织中OATP1B3 mRNA的表达水平。Western blot检测34对新鲜HCC癌与配对癌旁正常组织中OATP1B3蛋白表达水平。采集131例HCC患者的临床病理资料和随访信息。χ2检验分析OATP1B3表达与HCC患者临床病理参数的相关性。通过Kaplan-Meier法分析OATP1B3对HCC患者预后评估的价值。Cox比例风险模型分析影响HCC患者生存的独立预后因素。2.体外培养MHCC97-H、SMMC-7721、Huh7、Hep G2和L02细胞,qRT-PCR检测OATP1B3 mRNA在上述5株细胞中的表达情况。选择OATP1B3 mRNA表达水平较高的SMMC-7721细胞构建OATP1B3慢病毒干扰模型,对OATP1B3 mRNA表达水平较低的Huh7细胞构建OATP1B3质粒过表达模型,并通过qRT-PCR和Western blot技术对OATP1B3干扰和过表达效果进行验证。将构建好的SMMC-7721和Huh7细胞进行MTT和克隆形成实验观察OATP1B3对肝癌细胞增殖能力的影响。Transwell和细胞划痕实验观察OATP1B3对肝癌细胞侵袭与迁移能力的影响。利用流式细胞仪检测OATP1B3对肝癌细胞凋亡与周期的影响。3.构建OATP1B3稳定高表达的Hep G2细胞和稳定低表达的SMMC7721细胞。Western blot检测上述细胞中OATP1B3对上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关标志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表达和Wnt/β-catenin/c-Myc通路活化的影响。将构建的Hep G2和SMMC7721细胞注入裸鼠肝脏包膜下,建立裸鼠肝脏原位癌种植模型,35天后MRI下观察裸鼠肝脏肿瘤转移情况。记录各组裸鼠的存活时间,裸鼠死亡后,解剖并取下肝脏,行肝脏表面大体观察。最后,将裸鼠肝脏肿瘤组织切片,行HE染色并镜下观察。结果:1.根据TCGA数据库分析结果显示,OATP1B3 mRNA高表达的HCC患者总体生存率和无瘤生存率均显着高于低表达者（63.9%vs 26.6%,P=0.005;27.6%vs 13.0%,P=0.017）。免疫组织化学染色法检测结果显示,与癌旁正常组织（25.8%,23/89）相比,OATP1B3在HCC癌组织中表达显着下调（59.5%,78/131）（P<0.0001）。OATP1B3的表达水平与肿瘤大小、复发、肿瘤分化程度、TNM分期显着相关（P<0.05）,而与年龄、性别、肿瘤包膜、HBs Ag、肝硬化、肿瘤数目、血管侵袭、血清AFP水平无相关性。OATP1B3高表达的HCC患者总体生存率和无瘤生存率均显着高于低表达者（33.0%vs 12.9%,P=0.001;18.8%vs 5.3%,P<0.0001）。Cox比例风险模型分析结果显示OATP1B3、血管侵袭、TNM分期是影响HCC患者总体生存率的独立预后因素（P<0.05）;OATP1B3和TNM分期是影响HCC患者无瘤生存率的独立预后因素（P<0.05）。2.OATP1B3 mRNA在人永生化正常肝细胞L02细胞和肝癌细胞SMMC-7721、MHCC97-H、Huh7、Hep G2细胞中的表达量依次降低。成功构建并转染OATP1B3干扰的SMMC-7721细胞模型和OATP1B3过表达的Huh7细胞模型。MTT和克隆形成实验结果表明,上调OATP1B3可抑制肝癌细胞增殖和克隆形成率,下调OATP1B3可促进肝癌细胞增殖和克隆形成率,并呈时间依赖性。Transwell迁移和侵袭实验结果表明,上调OATP1B3可抑制肝癌细胞的迁移和侵袭,下调OATP1B3可促进肝癌细胞的迁移和侵袭。划痕实验结果显示,上调OATP1B3可降低肝癌细胞迁移运动能力,下调OATP1B3可促进肝癌细胞的迁移运动能力。细胞凋亡结果显示,上调OATP1B3可促进肝癌细胞凋亡,下调OATP1B3可抑制肝癌细胞凋亡。细胞周期结果显示,上调OATP1B3可缩短肝癌细胞S期,下调OATP1B3可延长肝癌细胞S期。3.利用慢病毒构建并成功转染Hep G2和SMMC-7721细胞,分别建立OATP1B3稳定过表达和干扰细胞模型。上调OATP1B3表达后,上皮相关标志物E-cadherin表达增加,间质相关标志物Vimentin、N-cadherin以及下游蛋白β-catenin和c-Myc表达降低。下调OATP1B3表达后,上皮相关标志物E-cadherin表达降低,间质相关标志物Vimentin和N-cadherin以及下游蛋白β-catenin和c-Myc表达增加。裸鼠MRI检查和生存时间统计结果显示,上调OATP1B3表达后,肿瘤侵袭转移能力被抑制,裸鼠肝内转移灶数量较少,生存时间较长;下调OATP1B3表达后,肿瘤侵袭转移能力增强,裸鼠肝内转移灶较多,生存时间较短。最后,各组肿瘤组织病理学切片,HE染色可见大量癌巢。结论:1.OATP1B3在HCC中表达下调,其表达水平与患者肿瘤大小、复发、肿瘤分化程度和TNM分期显着相关,再结合TCGA数据库的分析结果,提示OATP1B3可作为HCC患者预后判断的肿瘤生物标志物。2.OATP1B3可抑制肝癌细胞增殖、侵袭与转移,促进细胞凋亡,缩短细胞S期比例。3.OATP1B3可能是通过Wnt/β-catenin/c-Myc通路抑制肝癌细胞的EMT过程。在裸鼠体内,OATP1B3可抑制肝脏原位种植瘤的侵袭与转移。综上,OATP1B3可能通过多种途径在HCC中发挥抑癌作用,并可作为HCC患者预后判断的潜在肿瘤生物标志物。
郝书弘[6]（2020）在《结直肠癌患者KRAS、NRAS、BRAF基因突变与关键基因表达的相关性及circGLG1/miR-622/KRAS轴的分子作用机制》文中指出背景:结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一。在我国CRC的发病率呈逐渐上升趋势。结直肠癌的病因和发病机制十分复杂,涉及基因组、转录组、蛋白质组学及表观遗传学等多种因素的异常改变。利用现代分子生物学技术,对结直肠癌分子发病机制的更深入研究,对本病的早期诊断及个体化治疗至关重要。作为表皮生长因子受体（epidermal growth fatctor receptor,EGFR）信号通路的关键分子,KRAS、NRAS和BRAF基因突变已被证实在结直肠癌的发生、发展过程中起到重要作用,且对结直肠癌患者的靶向治疗具有重要的指导价值。然而,目前研究大多集中在KRAS、NRAS和BRAF的突变频率及其预后价值上,但对于这些基因突变与患者临床病理学特征及其他基因表达的关系仍缺乏了解。因此,分析上述基因突变和结直肠癌患者临床病理学参数及其他基因表达的内在联系对于更加精准的指导个体化治疗具有重要意义。环状RNA（circular RNA,circRNA）是新发现的一类共价闭合环状非编码RNA。CircRNA以其闭合成环,高度稳定,特异性强,易于检测等特点,逐渐成为恶性肿瘤领域的研究热点,且有望成为肿瘤诊断和评估预后最有潜力的分子标记物。KRAS基因作为结直肠癌中最关键的驱动基因,除了基因突变外KRAS基因是否通过其它方式参与结直肠癌的发生发展,在结直肠癌中,KRAS基因的表达水平如何,其表达还受到哪些非编码RNA,尤其是circRNA的分子调控,目前尚无相关报道。目的:本研究拟通过扩增阻碍突变系统PCR（amplification-refractory mutation system polymerase chain reaction,ARMS-PCR）的方法检测结直肠癌组织中KRAS、NRAS和BRAF的常见突变位点,同时,采用免疫组化的方法检测8个结直肠癌关键基因在蛋白水平的表达情况。通过多种统计学方法,探讨KRAS、NRAS和BRAF基因突变与结直肠癌患者临床病理学特征及关键基因表达的内在联系,旨在为更精准的指导结直肠癌的靶向治疗提供依据。此外,本研究在KRAS、NRAS、BRAF突变的基础之上,选取重要靶点,以KRAS表达调控为切入点,利用生物信息分析的方法筛选出结直肠癌发病过程中的关键circRNA/miRNA/KRAS调控轴,并在分子水平、蛋白水平、细胞功能水平对其进行验证。旨在转录后调控层面进一步完善KRAS基因在结直肠癌中的作用及机制,为结直肠癌患者的诊断、治疗提供新的生物标志物和分子靶点。方法:1.收集我院手术切除CRC组织216例。通过ARMS-PCR方法检测216例CRC组织中KRAS、NRAS和BRAF的常见突变位点。通过χ2检验、Mann-Whitney秩和检验、独立样本t检验等统计学方法分析上述基因突变与患者性别、年龄、肿瘤部位、TNM分期、浸润深度、有无淋巴结转移、病理类型、分化程度等临床指标的相关性。2.采用免疫组化的方法检测了P53、EGFR、CDX2、PMS2、MLH1、MSH6、MSH2和Ki67等8个CRC关键基因在蛋白水平的表达情况。通过χ2检验、Mann-Whitney秩和检验、多重对应分析探讨了上述基因表达与KRAS、NRAS和BRAF突变的相关性。3.收集我院手术切除的CRC组织及癌旁组织40对。通过实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time-polymerase chain reaction,qRT-PCR）方法检测40对肿瘤组织及癌旁组织KRAS表达水平。利用生物信息分析的方法筛选出结直肠癌增殖及侵袭相关的circRNA分子及KRAS基因潜在的上游调控miRNA分子,建立可能的circRNA/miRNA/KRAS调控轴。在40对CRC临床样本中检测上述调控轴中circRNA（circGLG1）及miRNA（miR-622）的表达水平,利用Pearson线性相关法分析其表达与KRAS表达的相关性。4.检测3株结肠癌细胞系（HCT8、HCT116、DLD1）和正常人肠上皮细胞系（NCM460）中circGLG1的表达水平。根据circGLG1序列设计siRNA及其对照,利用Lipofectamine 2000进行细胞转染。在DLD1细胞系中敲低circGLG1后:1)采用CCK-8、克隆形成实验检测细胞增殖活性;2)采用Transwell、划痕愈合实验检测细胞侵袭及迁移能力;3)检测miR-622表达变化,在mRNA水平和蛋白水平检测KRAS表达变化。在成功敲低circGLG1的基础上共转染miR-622 inhibitor,观察细胞增殖、侵袭、迁移能力及KRAS表达变化是否可以回复。5.根据circGLG1及KRAS序列与miR-622互补配对的区域,设计合成野生型及突变型双荧光素酶报告载体质粒,通过双荧光素酶报告实验进一步验证circGLG1与miR-622,miR-622与KRAS的靶向结合作用。结果:1.CRC患者中KRAS基因突变率为39.8%,其突变位点按概率高低依次为G12D（16.2%）、G12V（8.8%）、G13D（8.3%）、G12S（1.9%）、G12C（1.9%）、G12A（1.4%）、G12R（0.9%）、双位点突变（G12D+G12S）（0.5%）。NRAS的突变率为2.7%,其突变位点为G12D、G13D、Q61R各0.9%。BRAF V600E的突变率为1.4%。KRAS突变与性别有关,女性突变率高于男性（53.3%vs 32.6%,P=0.003）。NRAS、BRAF突变与性别无关。KRAS、NRAS、BRAF突变与患者年龄、TNM分期、浸润深度、有无淋巴结转移、组织病理类型、腺癌分化程度等均无显着相关性。2.免疫组化与KRAS、NRAS、BRAF基因突变结果分析显示,EGFR表达与NRAS突变有关,EGFR阳性表达者突变率高于弱阳性表达者及阴性表达者（5.3%vs 1.4%vs 0%,P=0.047）。PMS2、MLH1、MSH2表达与BRAF突变有关,PMS2阴性表达者BRAF突变率高于弱阳性表达者及阳性表达者（16.7%vs 0%vs 1%,P=0.010）。MLH1阴性表达者BRAF突变率高于弱阳性表达者及阳性表达者（16.7%vs 7.7%vs 0.5%,P=0.001）。MSH2阴性表达者BRAF突变率高于弱阳性表达者及阳性表达者（33.3%vs 0%vs 1.0%,P=0.005）。3.在40对CRC组织及癌旁组织中检测KRAS表达,结果显示,与癌旁组织相比,KRAS在CRC组织中的表达水平显着升高（P<0.001）。通过生物信息学分析的方法建立假设:circGLG1可能通过circGLG1/miR-622/KRAS轴调节结直肠癌增殖及侵袭。为了进一步验证上述假设,我们通过临床样本PCR发现,与癌旁组织相比,circGLG1在CRC组织中的表达明显上调（P<0.01）且与KRAS表达水平呈正相关（R2=0.586,P<0.001）。同时miR-622在CRC组织中的表达明显下调（P<0.01）且与KRAS表达水平呈负相关（R2=-0.339,P<0.05）。4.CircGLG1在肠癌细胞中的表达高于正常肠上皮细胞,其中DLD1细胞中circGLG1表达量最高（P<0.001）。成功设计了2条circGLG1 siRNA。在DLD1细胞系中敲低circGLG1后:1)CCK-8、克隆形成实验证实DLD1细胞增殖受到抑制;2)Transwell、划痕愈合实验证实DLD1细胞侵袭及迁移受到抑制;3)miR-622表达升高,KRAS在mRNA水平和蛋白水平表达均降低。在成功敲低circGLG1的基础上通过共转染miR-622 inhibitor下调DLD1细胞中miR-622表达后,circGLG1不能发挥其对细胞增殖、侵袭的调节作用。且miR-622 inhibitor可回复circGLG1对KRAS表达的调控作用。5.双荧光素酶报告实验结果显示,同时加入野生型重组质粒pEZX-MT06-Wt-circGLG1或pEZX-MT06-Wt-KRAS和miR-622 mimic后,DLD1细胞的荧光素酶活性显着减低,而突变型重组质粒与miR-622 mimic共转染时,荧光素酶活性无明显差异,这充分证明了miR-622与circGLG1和KRAS之间的可结合性。综上,本研究全面检测了216例结直肠癌患者中KRAS、NRAS、BRAF的突变分布并分析了其与患者临床病理参数及关键基因表达的相关性,首次发现EGFR表达与NRAS突变有关,证实了PMS2、MLH1、MSH2等错配修复基因表达缺失与BRAF突变有关。此外,我们证实了KRAS基因在结直肠癌及癌旁组织种存在差异表达,其非编码RNA调节机制之一为circGLG1可以通过circGLG1/miR-622/KRAS轴促进结直肠癌细胞的增殖及侵袭。我们的研究为进一步阐明结直肠癌分子机制提供了理论和实验依据,同时为结直肠癌的诊断及治疗提供了新的生物标志物及关键分子靶点。
林欣[7]（2020）在《miR-452-5p调控ERK/MAPK正反馈环路在结直肠癌进展中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理目的结直肠癌（colorectal cancer,CRC）为全球第三大恶性肿瘤,中晚期结直肠癌患者治疗效果不佳。因此深入研究结直肠癌发生发展的分子机制,有助于寻找其治疗靶点及改善患者预后。miRNA是小的单链非编码RNA,主要通过与3’非翻译区的互补序列结合而与mRNA相互作用,从而发挥基因负性调控的作用。miR-452-5p已被报道在多种肿瘤的发生发展中起重要作用,但其在结直肠癌中的研究较少。本研究旨在研究miR-452-5p在结直肠癌中的表达情况,探索miR-452-5p是否能够影响结直肠癌细胞的生物学功能及其发挥作用的具体分子机制。方法1.miR-452-5p在结直肠组织及细胞系中的表达验证1)公共数据库TCGA分析明确miR-452-5p在结直肠癌组织及正常肠上皮组织中的表达情况;2)qRT-PCR实验检测miR-452-5p在结直肠癌组织及配对正常组织、结直肠癌细胞系及正常肠上皮细胞系中的表达水平。2.miR-452-5p促进结直肠癌细胞恶性生物学行为1)体外增殖:将miR-452-5p mimics和inhibitors瞬时转染至结直肠癌细胞中,验证效率后进行CCK8实验及平板克隆实验;2)细胞周期:通过细胞周期实验验证miR-452-5p对结直肠癌细胞周期的影响;3)化疗抵抗:通过IC50、细胞凋亡实验及western Blot实验验证miR-452-5p对结直肠癌细胞凋亡以及对5-氟尿嘧啶化疗抵抗的影响;4)体内增殖:miR-452-5p过表达慢病毒感染结直肠癌细胞进行裸鼠皮下成瘤实验。3.miR-452-5p—PKN2/DUSP6—c-Jun 正反馈环路机制验证1)将测序结果中表达下调基因与预测靶基因数据库交集明确靶基因,并通过qRT-PCR、western Blot、双荧光素酶报告基因实验进行验证;2)通过western blot实验明确miR-452-5p对ERK/MAPK信号通路的作用;3)通过恢复实验（CCK8实验、平板克隆实验）验证PKN2/DUSP6轴参与miR-452-5p调控结直肠癌的过程。4)通过生物信息学分析预测、qRT-PCR及染色质免疫共沉淀实验证实了c-Jun对miR-452-5p的转录调控作用。结果1.与正常组织比较,结直肠癌组织中miR-452-5p的表达水平明显上调;并且在恶性程度较高的肿瘤细胞系HT29细胞中表达较高,在恶性程度较低的细胞系RKO、SW480中表达水平较低,且FHC中表达水平最低。2.miR-452-5p过表达后体外及体内增殖能力增强,且促进结直肠癌细胞G1/S期转化。3.miR-452-5p过表达的细胞5-氟尿嘧啶IC50值升高,凋亡率下降,5-氟尿嘧啶处理细胞后凋亡率趋势与之相同,提示miR-452-5p可以降低凋亡并且增强结直肠肿瘤细胞对5-氟尿嘧啶的化疗抵抗作用。4.miR-452-5p直接靶向PKN2、DUSP6,促进ERK/MAPK信号通路的异常激活。5.恢复性实验证明,PKN2、DUSP6过表达可抵消miR-452-5p对结直肠癌恶性生物学行为的促进作用。6.c-Jun对miR-452-5p的表达水平起转录调控作用。结论本研究证实miR-452-5p在结直肠癌中表达上调,过表达miR-452-5p可通过靶向PKN2/DUSP6轴来激活ERK/MAPK信号通路,miR-452-5p—PKN2/DUSP6—c-Jun正反馈环路机制促进结直肠癌的恶性生物学行为。
赵爽[8]（2020）在《JCV T抗原诱导消化系统肿瘤的病理特点和分子机理研究》文中认为目的:JC病毒（John Cunningham virus,JCV）是多瘤病毒家族成员之一（家族成员还包括SV40和BK病毒）,其基因组为环状双链DNA。JCV主要通过消化道和呼吸道进入人体,寄生在淋巴组织和泌尿系统中。当人体免疫力低下时,JCV大量复制并损伤神经系统,导致进展性多灶白质脑病（PML）,或整合到人体基因组参与肿瘤发生。JCV静脉和颅内注射可诱发动物星形细胞瘤、胶质母细胞瘤和神经母细胞瘤。在病毒自身启动子作用下JCV T抗原转基因动物可发生垂体腺瘤、恶性神经鞘瘤和髓母细胞瘤等。人体组织病理学检测结果表明,舌咽部鳞癌、食管癌、胃癌、结肠癌、肺癌和前列腺癌中JCV DNA阳性率或拷贝数高于对应正常组织。JCV T抗原可通过DpSGX（2-4）pS结合到蛋白酶体SCF中的β-Trcp 1/2蛋白,干扰泛素介导的β-catenin蛋白降解,同时还可与β-catenin结合提高其蛋白稳定性并诱导其入核,核β-catenin通过上调c-myc和Cyclin D1蛋白表达促进细胞S期演进。我们前期研究结果提示,JCV T抗原过表达可以使转基因鼠发生肺癌或晶状体肿瘤。本研究拟在人体、动物、细胞和分子水平揭示JCV T抗原诱导消化系统肿瘤的病理特点和分子机理,为JCV相关消化系统肿瘤防治提供科学实验依据。研究方法:1.原代培养小鼠晶状体肿瘤细胞,获得JCV T抗原高表达的细胞模型。稳定转染JCV T shRNA,qRT-PCR、Western blot和细胞免疫荧光检测JCV T抗原mRNA和蛋白表达;MTT和PI染色检测细胞增殖和周期;APC和PI双染检测细胞凋亡;划痕修复和Transwell检测细胞迁移和侵袭;免疫共沉淀、银染、飞行质谱和Western blot检测细胞相互作用蛋白;蛋白组学和Western blot分析T抗原表达降低后差异信号通路和蛋白。人肝癌、胰腺癌和小鼠胰腺癌细胞稳定转染pEGFP-N1-JCV T后,Western blot检测GFP和T抗原的表达;MTT检测细胞增殖和周期;APC和PI双染检测细胞凋亡;Transwell检测细胞迁移和侵袭。2.制备CAG-LacZ-T抗原loxp/loxp转基因鼠,与肝细胞特异工具鼠Alb-cre和胰腺特异工具鼠Pdx1-cre交配激活T抗原表达,鼠尾DNA PCR筛选Cre和T抗原双阳性转基因鼠,靶器官DNA PCR验证靶向LacZ的T抗原是否成功激活;CT和大体观察转基因鼠的脏器病变;HE染色观察组织病理学改变;免疫组化检测T抗原和肿瘤标志物表达;Western blot检测转基因鼠组织中相关蛋白表达。3.收集肝癌和胰腺癌组织及相应的正常组织的石蜡标本和冰冻组织,提取石蜡标本DNA,PCR和qPCR检测JCV T抗原DNA阳性率和拷贝数;提取新鲜组织蛋白,Western blot检测JCV T抗原蛋白的表达。利用石蜡标本制备组织芯片,免疫组化和原位PCR检测JC V T抗原DNA和蛋白。结果:第一部分:JC病毒T抗原对消化系统肿瘤细胞恶性表型的影响及分子机理1.稳定转染JCV T shRNA后,通过qRT-PCR、Western blot和细胞免疫荧光检测JCV T抗原mRNA和蛋白表达均降低（P<0.05）;2.JCV T抗原低表达,抑制细胞增殖,诱导细胞G2/M期阻滞和凋亡,降低细胞迁移、侵袭、糖酵解和有氧氧化能力（P<0.05）。3.JCV T抗原可与RPL19、β-catenin、β-Trcp、NF-κB和C/EBP相互结合,但不能与Rb结合。JCV T抗原主要影响蛋白质合成和降解、能量代谢和粘附信号通路（P<0.05）。下调JCV T抗原表达促进ING2、ING5、p21、p53、Bax和p-p38蛋白表达;抑制CyclinD1、survivin、p-mTOR、VEGF、NF-κB、Akt和Bcl-2蛋白表达。4.人肝癌、胰腺癌及小鼠胰腺癌细胞中JCV T抗原过表达促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,增强细胞迁移和侵袭能力（P<0.05）。第二部分:JCV T抗原诱发转基因鼠消化系统肿瘤的病理特点和分子机理1.鼠尾DNA PCR鉴定结果显示,cre和T抗原均为阳性;靶器官DNA PCR结果显示,LacZ被切除。2.CT发现转基因鼠肝脏肿胀,体积增大。大体发现转基因鼠的肝脏、肺、脾及腹腔均有白色结节。HE染色发现肝脏、肺脏、脾脏及腹腔结节均出现癌细胞;免疫组化显示肝脏、肺脏、脾脏及腹腔结节的癌细胞均有强阳性的T抗原表达;肝癌细胞中AFP、Hep-1、β-catenin和Ki-67蛋白高表达,CEA和CK19无着色。3.与野生型鼠相比,Alb-cre/T抗原转基因鼠的肝组织中T抗原、mTOR、p-m TOR、β-catenin、Rb、β-Trcp、NF-κB和survivin蛋白表达均显着升高,同时ING2、ING4、ING5和Bax蛋白表达降低。4.CT观测发现Pdx1-Cre/T抗原鼠腹腔出现钙化灶,大体发现转基因鼠胰腺肿瘤,同时还在胃和十二指肠内发现了白色肿物。HE染色发现胰腺、前胃、胃体、胃窦及十二指肠内均发生肿瘤;免疫组化显示,胰腺、前胃、胃体、胃窦及十二指肠的肿瘤细胞均有强阳性的T抗原表达。5.与野生型鼠相比,Pdx1-cre/T抗原转基因鼠的胰腺组织中T抗原、β-catenin、Rb、β-Trcp和survivin蛋白表达升高,同时ING2、ING4、ING5、Bax、p53和p21蛋白表达降低。第三部分:JCV T抗原与人肝癌和胰腺癌发生的关系1.PCR结果显示,肝癌及正常肝脏组织均有JCV T抗原DNA整合,肝癌组织的JCV T抗原DNA阳性率明显低于正常肝脏组织（79.0%vs 84.7%,P<0.05）;胰腺癌及正常胰腺组织均有JCV T抗原DNA整合,胰腺癌组织的JCV T抗原DNA阳性率明显低于正常胰腺组织（76.0%vs 92.3%,P<0.05）。2.肝癌及正常肝脏组织中JCV T抗原DNA拷贝数无显着差异（P>0.05）;胰腺癌及正常胰腺组织中JCV T抗原DNA拷贝数也无显着差异（P>0.05）。原位PCR结果显示,肝癌及正常肝细胞核中可以检测到JCV T抗原DNA;胰腺癌及正常胰腺细胞核中也可检测到JCV T抗原DNA。3.Western blot结果表明,肝癌组织中JCV T抗原蛋白的表达水平明显高于癌旁正常组织（P<0.05）;胰腺癌组织中JCV T抗原蛋白的表达水平明显高于癌旁正常组织（P<0.05）。免疫组化结果表明,肝癌组织中可以检测到JCV T抗原蛋白核着色,癌旁正常组织中JCV T抗原无着色;胰腺癌组织可以检测到JCV T抗原蛋白核着色,正常胰腺组织中JCV T抗原无着色。结论:1.JCV T抗原通过影响蛋白质合成及分解、WNT和NF-κB等信号传导通路,调节肿瘤细胞增殖、周期、凋亡、能量代谢、迁移和侵袭。JCV T抗原促进肝癌和胰腺癌细胞生物学表型恶性转变,在消化系统肿瘤恶性演进中可能发挥作用。2.JCV T抗原诱发转基因鼠消化系统肿瘤,为T抗原参与消化系统肿瘤发生提供了直接实验依据。JC病毒T抗原通过下调抑癌基因表达,激活WNT等信号通路促进消化系统肿瘤的发生。3.JC病毒通过嵌入到人肝和胰腺细胞基因组并表达T抗原参与肝癌和胰腺癌的发生。JCV T抗原在正常和癌组织中的差异表达,是由于癌细胞更有利于JCV T抗原的转录和翻译。
韩兴文[9]（2020）在《MOXD1基因在骨肉瘤增殖中作用及分子机制研究》文中指出目的:基于体外和体内实验,研究MOXD1基因在骨肉瘤增殖中的作用及可能的分子机制,为骨肉瘤的生物治疗提供新的思路及可能的分子靶标。方法:1、免疫组织化学法检测人骨肉瘤蜡块组织标本中MOXD1的表达情况。2、q-PCR检测三株常用的骨肉瘤细胞株,根据MOXD1在细胞株中表达丰度的高低,选择表达丰度最高的两株细胞（U2OS、MNNGHOS Cl#5）作为实验细胞。3、以MOXD1的基因序列为对应的模板,并设计RNA的相关序列,创建所需的载体,为后续的实验研究做准备。4、借助RNAi载体,从而对骨肉瘤细胞进行基因敲减处理,构建MOXD1基因低表达骨肉瘤细胞模型。5、qPCR检测在mRNA水平上MOXD1的敲减效率;Western blot检测MOXD1内源性蛋白的表达量,确定敲减靶点的有效性。6、细胞分组:（1）shCtrl组:正常的骨肉瘤细胞、加阴性对照病毒感染的骨肉瘤细胞组;（2）shMOXD1组:正常的骨肉瘤细胞、加MOXD1基因shRNA病毒感染的骨肉瘤细胞组。7、celigo细胞计数法、MTT法检测骨肉瘤细胞shCtrl组和shMOXD1组细胞增殖状况的差异。8、FACS细胞凋亡检测法检测骨肉瘤细胞shCtrl组和shMOXD1组细胞凋亡状况的差异。9、克隆形成实验检测骨肉瘤细胞shCtrl组和shMOXD1组细胞增殖能力的差异。10、选取20只裸鼠,随机分为两组,每组10只,并在裸鼠腋部皮下注射shCtrl组和shMOXD1组MNNGHOS Cl#5骨肉瘤细胞悬液进行体内骨肉瘤模型构建,并检测MOXD1敲减前后移植瘤生长状况的差异。11、选取shCtrl组和shMOXD1组的MNNGHOS Cl#5细胞,分别提取Total RNA,质控,利用基因芯片检测差异表达基因,q-PCR和Western blot检测相关基因的表达差异情况,对差异基因进行生物信息学分析并探究与MOXD1相关的细胞通路。结果:1、免疫组化检测显示,在人骨肉瘤标本中肿瘤组织内MOXD1的表达是明显增高的,在瘤旁和正常骨组织中出现了表达的下降甚至无表达。2、RNAi慢病毒载体转染骨肉瘤细胞后,与shCtrl组相比,shMOXD1组两株骨肉瘤细胞中MOXD1基因的mRNA水平的表达量均受到了抑制（P<0.05）,其中U2-OS细胞的敲减效率达到92.8%,MNNG/HOS Cl#5细胞的敲减效率为71.0%。3、与shCtrl组相比,shMOXD1组两株骨肉瘤细胞MOXD1的增值效率明显降低、发生凋亡的肿瘤细胞数量显着增多、骨肉瘤细胞形成的克隆形成数目减少（P<0.05）。4、在裸鼠体内成瘤实验中,与shCtrl组相比,shMOXD1组MNNGHOS Cl#5骨肉瘤细胞形成异体移植瘤的裸鼠数量和肿瘤重量明显减小、活体动物荧光成像的荧光表达量降低（P<0.05）。5、基因芯片分析发现,在shMOXD1组中,上调了285个基因,下调了331个基因。MOXD1调控包括EIF2、ERK5和RAN在内的细胞通路,其中对EIF2细胞通路的抑制最为显着。6、对与增殖及凋亡相关的37个基因进行q-PCR和Western blot检测发现在shMOXD1组中PDGFRA,FOXM1,CCND3和TNFAIP2表达降低,EGR1表达升高。其中CCND3和TNFAIP2的表达显着降低,EGR1的表达显着升高。7、选择和增殖相关的基因PCNA和cyclinD1以及和EIF2通路相关的基因（p-EIF2α、EIF2α、EIF4E、DDIT3和AKT1）进行Western blot验证,发现上述基因均出现低表达。结论:1、通过RNAi慢病毒载体转染骨肉瘤细胞,成功构建了MOXD1低表达细胞模型。2、MOXD1在人骨肉瘤石蜡标本中表达具有明显的肿瘤聚集现象,表达情况和患者性别、年龄、肿瘤发生部位无相关性,MOXD1的表达阳性率和肿瘤大小、Ennecking分期呈正相关,MOXD1在骨肉瘤的发生发展过程中发挥着重要的作用。3、利用骨肉瘤细胞株MNNGHOS Cl#5成功构建了骨肉瘤动物模型。抑制MOXD1可以有效的抑制骨肉瘤异体移植瘤的生长。4、敲减MOXD1基因可以显着抑制EIF2细胞通路,导致骨肉瘤细胞增殖降低、细胞凋亡增加。5、MOXD1基因在骨肉瘤中可能通过调节基因CCND3、TNFAIP2和EGR1的表达来发挥作用。6、首次发现MOXD1在骨肉瘤中发挥着癌基因的作用。它可能成为骨肉瘤治疗的潜在靶点。
金浩[10]（2019）在《Syt7在调控肝癌细胞增殖中的作用及机制研究》文中指出背景原发性肝癌是一种高度恶性肿瘤,肝细胞肝癌是其主要的类型,是全世界最常见恶性肿瘤之一。根据最新统计,全球每年新发肝癌病例达到60万,居所有恶性肿瘤的第五位,死亡率位居恶性肿瘤第三位。其临床特点是发现迟、进展迅速、预后差。目前中国肝癌的病例超过全世界半数以上,严重危害中国人的生命健康,成为中国医师棘手的病种。原发性肝癌的起病、进展是多种因素导致的长期、复杂的连续过程。其病因主要包括酒精、肝炎病毒感染等,这些病因最终通过复杂的多种基因突变导致肿瘤的发生。因此,力争发现在肝癌中有意义的基因是明确复杂致病的前提。突触结合蛋白（synaptptagmin,Syt）一类分泌囊泡的蛋白,山N端跨膜结构域和C端结合Ca2+的C2结构域（包括C2A和C2B）构成。Ca2+结合的突触结合蛋白亚型调节了神经元、神经内分泌细胞以及各种其他分泌细胞融合孔的扩大。突触结合蛋白7（Syt7）是Syt家族中的一员,其在肿瘤中的作用报道较少。已有研究发现,Syt家族在几种类型的肿瘤中表达异常,如Syt（未提是哪类Syt）在小细胞肺癌中表达升高,Sytl3在左侧结肠癌标本中的表达低于右侧结肠癌,Sytl在神经母细胞瘤细胞中高表达,而钙调素对甲状旁腺激素的抑制效应有助于甲状旁腺瘤中Sytl的表达缺失。延伸的Sytl（E-Sytl）的磷酸化参与了原癌基因肺癌融合激酶激活的侵袭通路。但关于Syt尤其是Syt7在肝癌中未见文献报道。目的（1）检测原发性肝癌患者肿瘤及癌旁组织中Syt7蛋白的表达情况,分析肿瘤组织中Syt7表达水平与患者临床病理资料的关系（2）检测不同的肝癌细胞系中Syt7 mRNA的表达情况方法（1）收集蚌埠医学院第一附属医院2013年9月至2018年2月期间行手术切除的原发性肝癌患者的石蜡标本,免疫组化检测肿瘤及癌旁组织中Syt7蛋白的表达情况（2）qRT-PCR检测不同的肝癌细胞系中Syt7 mRNA表达情况（3）分析肝癌组织Syt7蛋白的表达与患者临床、病理资料的关系（4）肿瘤及癌旁组织中Syt7蛋白阳性率的比较及Syt7蛋白阳性率与临床病理学参数的相关性分析均采用x 2检验的方法,通过Kaplan-Meier模型的log-rank检验及Cox回归模型分析影响总体生存率（overall survival,OS）及无瘤生存率（disease-free survival,DFS）的因素,认定P<0.05时具有显着性差异。结果（1）Syt7蛋白在肝癌患者肿瘤组织中的阳性表达率为64.00%（48/75）,在癌旁组织中阳性表达率为2.67%（2/75）,在肿瘤组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织,差异具有统计学意义（P<0.05）;（2）与Syt7阴性组相比,Syt7阳性组患者血清中AFP水平较高、肿瘤直径较大、肿瘤数目较多、血管侵犯的风险增加、TNM分期较晚、肿瘤分化程度较低,结果均具有显着性差异（P均<0.05）;（3）Cox单因素分析表明,术前肿瘤大小、血管侵犯、TNM分期、肿瘤分化程度、Child-Pugh分级及Syt7表达水平是影响肝癌患者术后OS的主要预后因素。多因素分析表明,术前肿瘤直径>5cm（HR=4.22,95%CI:1.44-12.39,P=0.009）、血管侵犯（HR=2.71,95%CI:1.15-6.40,P=0.023）、Child-Pugh B 级（HR=4.16,95%CI:1.54-11.25,P=0.005）及 Syt7 阳性（HR=2.84,95%CI:1.08-7.49,P=0.035）是术后OS的独立危险因素;（4）Cox单因素分析表明,术前AFP水平、肿瘤大小、血管侵犯、TNM分期、肿瘤分化程度、Child-Pugh分级及Syt7表达水平是影响肝癌患者术后DFS的主要预后因素。多因素分析表明,术前AFP≥200ng/ml（HR=2.37,95%CI:1.13-4.97,P=0.022）、肿瘤直径>5cm（HR=4.30,95%CI:1.43-12.95,P=0.010）、肿瘤具有血管侵犯（HR=2.57,95%CI:1.10-6.01,P=0.030）、Child-Pugh B 级（HR=4.65,95%CI:1.72-12.56,P=0.002）及 Syt7 阳性（HR=3.43,95%CI:1.26-9.29,P=0.016）是术后DFS的独立危险因素;（5）qRT-PCR结果显示,在肝癌细胞系Huh-7、Hep-3B中Syt7 mRNA表达水平较高,而在肝癌细胞系SMMC-7721、Hep G2、BEL-7402中表达水平较低。结论（1）原发性肝癌患者肿瘤标本中Syt7蛋白阳性率明显高于癌旁标本,Syt7表达水平与患者血清AFP水平、瘤体直径、肿瘤病灶数目、血管侵犯、TNM分期及肿瘤分化程度密切相关。（2）Syt7表达水平是影响肝癌患者术后OS及DFS的独立预后因素。（3）在肝癌细胞系Huh-7、Hep-3B中Syt7 mRNA表达水平较高,而在肝癌细胞系SMMC-7721、Hep G2、BEL-7402中表达水平较低背景原发性肝癌是肝胆系统最常见的恶性肿瘤之一,其病因多样,在西方国家以饮酒和丙肝病毒感染为主,而在中国以乙肝病毒感染多见。由于其起病隐匿,早期症状不明显,早期发现较为困难,进而导致根治性手术切除率低。因而,其综合治疗显得尤为重要,包括化疗,基因靶向治疗等。肝癌的生物学行为较差,预后欠佳,目前的治疗手段仍有限。研究表明,肝癌的起病、进展一定是多种基因参与的多步骤的复杂过程。近年来随着不断进步的分子生物学技术,使针对肝癌的基因治疗成为可能的研究方向。因而,研究在肝癌的增殖、克隆形成、侵袭及转移中起至关重要作用的基因,通过有目的裁剪、替换致病基因甚至修复表达异常的基因,可以进一步丰富肝癌的综合治疗手段。一些基因可能在肝癌细胞中表达异常,但是否对肝癌细胞增殖、克隆、周期变化、凋亡等细胞学及侵袭、转移等行为学方面有影响,以及如何影响,是研究的关键。神经系统释放神经递质和胰岛β细胞释放胰岛素所涉及的胞吐作用是生物体参与生命活动以及产生生化反应的重要组成部分。在这些生理生化过程中多种蛋白发挥了重要的作用。胞内各隔室间的蛋白转运受来自一个细胞器转运蛋白的介导并选择性地与另一个细胞器融合。囊泡的细胞器特异性转运需要调节囊泡转运、着位和融合的蛋白。根据 SNARE（soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein attachment protein receptor）假说:每一类囊泡包含一个 v-SNARE（vesicle SNARE）,并只能与一个t-SNARE（target SNARE）关联到合适的受体细胞膜。其中,Syt、突触小泡蛋白（synaptophysin）和 VAMP（vesicle-associated membrane protein）属于v-SNARE;而突触融合蛋白（syntaxin）和SNAP-25家族属于t-SNARE。SNARE蛋白参与了分泌通路中的每一步,但每个SNARE蛋白具有隔室特异性,并有助于着位和融合的特异性。在Syt家族中,Syt7作为Ca2+高亲和的感应器而发挥作用,参与了非神经细胞包括胰腺β细胞的胰岛素分泌颗粒、PC12细胞中大而致密中心的囊泡、溶酶体和大囊泡的胞吐作用中对融合孔动力学的调节。除了上述生理功能外,Syt7也参与了一些病理生理过程,如克氏锥虫侵袭细胞、帕金森病、肺纤维化等。此外有研究报道Syt7是Ca2+调节溶酶体囊泡分泌所必须的,可以通过调节囊泡分泌促进中性粒细胞的迁移。由此,我们提出疑问,Syt7是否可以影响肿瘤细胞的功能其内在机制又是如何呢?查阅文献尚未见Syt7影响肿瘤细胞功能尤其是肝癌细胞的报道。目的体外实验研究干扰Syt7对肝癌细胞系SMMC-7721,BEL-7404增殖的影响,体内实验验证干扰Syt7对肝癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用方法（1）以Syt7基因为模板,设计其RNA干扰序列,以构建Syt7基因的RNA干扰慢病毒载体;将含有Syt7基因RNA干扰序列的慢病毒进行肝癌细胞系SMMC-7721、BEL-7404感染实验,分为实验组（shSyt7组）和对照组（shCtrl组）;（2）qRT-PCR检测靶点干扰后肝癌细胞系SMMC-7721及BEL-7404中Syt7 mRNA水平,评价干扰效率;Western Blot检测靶点干扰Syt7后外源蛋白水平表达;（3）Celigo细胞计数检测细胞生长;（4）克隆实验检测慢病毒干扰后细胞成瘤能力;（5）PI-FACS检测细胞周期的变化;（6）MTT实验检测肝癌细胞增殖能力;（7）裸鼠成瘤实验检测干扰Syt7对移植瘤生长的影响;（8）采用SPSS 21.0统计学软件进行统计学分析,均值±标准差的形式表示所有计量资料,成组资料间的比较采用t检验。P<0.05表示差异具有显着性意义。结果（1）成功构建了 Syt7干扰慢病毒载体,建立了稳定干扰Syt7的细胞系;荧光观察显示感染细胞效率达到70%以上;（2）慢病毒感染后,SMMC-7721及BEL-7404中Syt7 mRNA的表达量受到明显抑制（P<0.05）,敲减效率分别为62.3%及52.3%。Western Blot显示慢病毒感染对Syt7基因的外源蛋白表达水平有显着的敲减作用;（3）通过Celigo分析仪连续检测5天,结果发现,实验组SMMC-7721及BEL-7404细胞的生长受到明显抑制,表明Syt7可明显促进肝癌细胞的生长;（4）克隆实验结果发现,实验组SMMC-7721及BEL-7404细胞的集落数目显着减少,提示Syt7明显地提高了肝癌细胞的克隆形成能力;（5）PI-FACS检测细胞周期的结果提示,实验组SMMC-7721细胞G1期的细胞数量明显减少,而处于G2/M期的细胞则无明显变化,此外,处于S期的细胞数量明显增多。实验组BEL-7404细胞处于G1期的细胞明显增多,处于S期的细胞无显着变化,处于G2/M期的细胞明显减少,结果提示干扰Syt7后可使细胞周期停滞。提示Syt7可明显影响肝癌细胞的周期分布;（6）通过MTT实验连续检测5天,结果发现,实验组SMMC-7721和BEL-7404细胞的增殖受到明显的抑制,提示Syt7明显提高了肝癌细胞的增殖能力;（7）干扰Syt7后裸鼠体内移植瘤的荧光强度显着降低,瘤体体积及重量均显着降低。结论（1）干扰目的基因Syt7可抑制肝癌细胞系SMMC-7721和BEL-7404的增殖。（2）干扰Syt7可以诱导肝癌细胞系SMMC-7721和BEL-7404的周期停滞。（3）干扰Syt7可以抑制肝癌细胞系SMMC-7721和BEL-7404的克隆形成。（4）干扰Syt7可以抑制裸鼠体内移植瘤的生长。背景肝癌的综合治疗手段多样,而根治性手术切除仍是其中的首选治疗手段。由于肝癌的不良生物学行为如多中心性、进展快、容易复发和转移的特点,导致总体治疗效果仍较差,生存率不高。外源性的环境污染、内源性的染色体改变、细胞内基因的变化等综合因素最终导致细胞的恶性转化及肿瘤的发生。因此,发现肝癌细胞和组织标本中异常表达,且进一步实验证明在肝癌中有功能的基因仍然是不够的。进一步探讨基因相关的信号转导通路,明确其在通路中角色,有助于明确肝癌的发病、进展机制,使在此基础上寻找到肝癌靶向治疗的靶点成为可能。关于肝癌中信号通路的研究较多,如Wnt/β-catenin信号通路、p38-MAPK通路、Hedgehog 信号通路、P13K-hkt、MAPK、SAPK/JNK、NF-κ B、上皮间质转化、细胞自噬相关通路、细胞凋亡相关死亡信号通路及线粒体通路等在肝癌中可能都起一定的研究。Syt7在肿瘤中的作用未见报道,前两部分研究表明Syt7在肝癌组织标本及肝癌细胞中高表达,且可以促进肝癌细胞增殖及肝癌进展,其在肝癌中所涉及的通路尚不清楚。此部分研究力争明确Syt7在肝癌中所参与的信号通路及其在通路中的角色,为探寻新的肝癌治疗靶点提供理论及实验基础。目的检测干扰目的基因Syt7后对肝癌细胞SMMC-7721信号通路中关键信号分子的影响方法（1）以Syt7基因为模板,设计其RNA干扰靶点,以构建Syt7基因的RNA干扰慢病毒载体;含有Syt7基因RNA干扰序列的慢病毒进行肝癌细胞SMMC-7721感染实验,分为实验组（shSyt7组）和对照组（shCtrl组）。（2）qRT-PCR检测干扰后SMMC-7721中Syt7 mRNA水平,评价干扰效率。（3）使用 Cell Signaling Technology（CST）公司的 PathScan（？）Stress and Apoptosis Signaling Antibody Array Kit,检测和比较实验组和对照组信号通路中关键分子的变化。（4）Western blot进一步验证Syt7干扰后肝癌细胞系SMMC-7721中相关基因外源性蛋白表达水平。（5）采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析,均值±标准差的形式表示所有计量资料,P<0.05表示差异具有显着性意义。结果（1）成功构建了 Syt7干扰慢病毒载体,建立了稳定干扰Syt7的细胞系;荧光观察,显示细胞感染效率达到70%以上;（2）实验组SMMC-7721细胞中Syt7 mRNA的表达量受到明显抑制（P<0.05）,敲减效率达到53.4%;（3）PathScan（?）Antibody Array Kit结果提示,与对照组相比,实验组信号通路中p53、Chk1蛋白的磷酸化水平显着上调;（4）Western blot进一步提示,实验组p53、Chk1基因的外源性蛋白表达明显上调。结论干扰Syt7基因可以通过激活Chk1-p53信号通路抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖和使细胞周期停滞于S期。
二、应用RT—PCRIS技术检测大肠肿瘤石蜡标本三区组织中P~(53)mRNA（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用RT—PCRIS技术检测大肠肿瘤石蜡标本三区组织中P~(53)mRNA（论文提纲范文）
（1）CMTM6表达促进肺癌增殖侵袭及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表(以字母顺序排列) |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 CMTM6在肺癌组织中的表达 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二章 敲低CMTM6对非小细胞肺癌生物学行为的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三章 CMTM6调节肺癌细胞增殖和侵袭的机制 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 含有MARVEL跨膜结构域的趋化素样因子6研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（2）TRIM37通过调控Wnt/β-catenin信号通路促进宫颈癌细胞增殖和侵袭（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 TRIM37在宫颈癌中的表达及临床意义 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 组织标本及入选标准 |
| 1.2 主要设备及材料 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 组织标本的处理和制片 |
| 2.2 免疫组化及染色 |
| 2.3 蛋白免疫印迹法实验 |
| 2.4 统计学方法 |
| 结果 |
| 1.TRIM37 在宫颈癌组织与癌旁正常组织中的表达差异 |
| 2.TRIM37 与宫颈癌临床病理特征间的关系 |
| 3.TRIM37 与宫颈癌患者生存预后的关系 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 TRIM37 促进宫颈癌增殖、侵袭及EMT |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 主要试剂及耗材 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 构建合成过表达TRIM37 的质粒 |
| 2.2 构建合成靶向TRIM37的sh RNA |
| 2.3 细胞复苏 |
| 2.4 细胞传代 |
| 2.5 细胞冻存 |
| 2.6 CCK-8 实验 |
| 2.7 Transwell细胞侵袭实验 |
| 2.8 细胞平板克隆形成实验 |
| 2.9 细胞划痕实验 |
| 2.10 免疫荧光实验 |
| 2.11 动物实验 |
| 2.12 实时荧光定量PCR |
| 2.13 统计分析 |
| 结果 |
| 1.TRIM37 在宫颈癌细胞系中的表达情况 |
| 2.转染效能检测 |
| 3.TRIM37 体外功能的验证 |
| 3.1 TRIM37 对宫颈癌细胞增殖能力的影响 |
| 3.2 TRIM37 对宫颈癌细胞侵袭能力的影响 |
| 3.3 TRIM37 对宫颈癌细胞迁移能力的影响 |
| 3.4 TRIM37 促进宫颈癌细胞上皮-间质转化(EMT) |
| 4.TRIM37 体内功能的验证 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 TRIM37对Wnt/β-catenin信号通路的调控 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 主要试剂及耗材 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养与细胞转染 |
| 2.2 Western blot蛋白质免疫印迹法 |
| 2.3 实时荧光定量PCR |
| 2.4 统计分析 |
| 结果 |
| 1.切除移植瘤后Western-blot、RT-PCR检测相应指标的变化 |
| 2.Westernblot检测转染TRIM37siRNA对宫颈癌细胞Wnt/β-catenin信号通路核心成员蛋白表达水平的影响 |
| 3.RT-PCR检测转染TRIM37 siRNA对宫颈癌细胞Wnt/β-catenin信号通路核心成员mRNA表达水平的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 TRIM37 在恶性肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
（3）长链非编码RNA CYTOR通过调节miR-125b-5p/KIAA1522轴影响肝细胞癌增殖、凋亡和细胞周期的机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 第一部分: 应用生物信息学方法筛选新的肝细胞癌相关的lncRNA/miRNA/mRNA调控轴 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分: lncRNA CYTOR/miR-125b-5p/KIAA1522调控轴在肝细胞癌细胞系中的作用 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 非编码RNA在肝细胞癌发生与发展中的调节作用及临床应用(文献综述) |
| 第一章 引言 |
| 第二章 作为ceRNA的ncRNA及其它ncRNA在肝细胞癌发展中的可能作用及机制 |
| 第三章 ncRNA在HCC诊断及预后中的临床应用 |
| 第四章 结论、局限性和展望 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（4）RNF126通过介导p53泛素化降解影响结直肠癌进展的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:RNF126 与p53 在结直肠癌组织中的表达差异及与临床病例参数的相关性 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂抗体和耗材 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 免疫组化(Immunohistochemistry,IHC) |
| 2.3.2 免疫印迹(Western blot,WB) |
| 2.3.3 实时定量逆转录聚合酶链式反应(Quantitaive real-time polymerasechain reaction,q RT-PCR) |
| 2.3.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 RNF126 在结直肠癌组织中的表达差异以及RNF126与p53 在结直肠癌组织中的表达相关性 |
| 3.1.1 免疫组化检测RNF126 在结直肠癌组织中的差异表达 |
| 3.1.2 RNF126 与p53 在结直肠癌组织中的表达相关性 |
| 3.1.3 免疫印迹法和q RT-PCR检测RNF126 在结直肠癌中的差异表达 |
| 3.2 RNF126 的表达与临床病理参数和结直肠癌患者术后生存的相关性分析 |
| 3.2.1 RNF126 的表达与临床病理参数的相关性 |
| 3.2.2 RNF126 及p53 的表达与结直肠癌患者术后生存时间的关系 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:RNF126、p53 和p21 在结直肠癌细胞中的表达相关性及分子机制 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂和抗体 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 免疫印迹(Western blot,WB) |
| 2.3.3 实时定量逆转录聚合酶链式反应(Quantitaive real-time polymerasechain reaction,q RT-PCR) |
| 2.3.4 siRNA瞬转实验 |
| 2.3.5 免疫共沉淀 |
| 3 结果 |
| 3.1 RNF126 在不同的结直肠癌细胞系中的表达情况 |
| 3.2 RNF126、p53、p21和p Rb在 mt P53 结直肠癌细胞中的表达相关性 |
| 3.3 RNF126、p53、p21和p Rb在 wt P53 结直肠癌细胞中的表达相关性 |
| 3.4 通过 qRt-PCR 在 RNF126 沉默或过表达的结直肠癌细胞中检测 p53和 p21 的 mRNA 表达情况 |
| 3.5 免疫共沉淀验证RNF126、p53 和p21 的相关性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:RNF126对CRC细胞增殖、迁移、侵袭以及化疗药物敏感性的调控 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂和抗体 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 MTT实验-细胞增殖 |
| 2.3.2 MMT实验-细胞耐药 |
| 2.3.3 细胞侵袭和迁移实验 |
| 2.3.4 细胞周期实验 |
| 2.3.5 体内实验 |
| 3 结果 |
| 3.1 HCT116 结直肠癌细胞的迁移和侵袭实验 |
| 3.2 HCT-8 结直肠癌细胞的迁移和侵袭实验 |
| 3.3 RNF126 对于结直肠癌细胞增殖的作用 |
| 3.4 RNF126 对于结直肠癌细胞的细胞周期的作用 |
| 3.5 RNF126 对于结直肠癌细胞的细胞周期的作用 |
| 3.6 RNF126 对于结直肠癌细胞的化疗药敏感性的作用 |
| 3.7 体内实验验证RNF126 对裸鼠移植瘤的作用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 泛素化连接酶 E3 及其在结直肠癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（5）OATP1B3在肝细胞癌中的表达与预后相关性及生物学功能分析（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 OATP1B3在肝细胞癌中的表达与患者临床病理因素及预后的相关性研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 OATP1B3在肝癌细胞中的功能的初步研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 OATP1B3对裸鼠肝脏原位种植癌侵袭转移的影响 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 有机阴离子转运多肽在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 肝癌相关肿瘤标志物研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间研究成果 |
| 致谢 |
（6）结直肠癌患者KRAS、NRAS、BRAF基因突变与关键基因表达的相关性及circGLG1/miR-622/KRAS轴的分子作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略表 |
| 第1章 结直肠癌患者KRAS、NRAS、BRAF基因突变与关键基因表达的相关性 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料 |
| 1.2.1 实验试剂 |
| 1.2.2 实验仪器 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 研究对象 |
| 1.3.2 组织DNA提取 |
| 1.3.3 DNA浓度测定 |
| 1.3.4 KRAS、NRAS、BRAF检测位点及突变类型 |
| 1.3.5 ARMS-PCR反应 |
| 1.3.6 KRAS、NRAS、BRAF基因突变结果判定 |
| 1.3.7 免疫组织化学染色 |
| 1.3.8 免疫组化结果判定 |
| 1.3.9 统计学分析 |
| 1.4 结果 |
| 1.4.1 患者一般资料 |
| 1.4.2 KRAS突变分布及其与结直肠癌患者临床病理学特征分析 |
| 1.4.3 NRAS突变分布及其与结直肠癌患者临床病理学特征分析 |
| 1.4.4 BRAF突变情况及其与结直肠癌患者临床病理学特征分析 |
| 1.4.5 免疫组织化学染色结果 |
| 1.4.6 KRAS、NRAS、BRAF基因突变与免疫组化结果分析 |
| 1.4.7 KRAS、NRAS、BRAF基因突变与免疫组化结果的多重对应分析 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 结论 |
| 第2章 Circ GLG1/miR-622/KRAS轴在结直肠癌中的分子作用机制 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 细胞系 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 研究对象 |
| 2.3.2 细胞培养 |
| 2.3.3 RNA提取及浓度测定 |
| 2.3.4 m RNA及 circRNA qRT-PCR反应 |
| 2.3.5 MiRNA qRT-PCR反应 |
| 2.3.6 生物信息学分析方法 |
| 2.3.7 细胞功能学实验 |
| 2.3.8 Western blot实验 |
| 2.3.9 双荧光素酶报告实验 |
| 2.3.10 统计学分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 KRAS在结直肠癌组织中表达上调 |
| 2.4.2 生物信息学方法预测KRAS潜在的上游调控miRNA和circRNA分子 |
| 2.4.3 CircGLG1及miR-622 在临床样本中的表达水平 |
| 2.4.4 Circ GLG1 在结直肠癌细胞系中表达上调并促进结直肠癌细胞增殖及侵袭 |
| 2.4.5 CircGLG1 通过调控miR-622/KRAS轴促进结直肠癌细胞增殖及侵袭 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第3章 全文总结 |
| 3.1 结论 |
| 3.2 创新点 |
| 3.3 本论文的不足 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述1 RAS突变在肿瘤中的靶向治疗进展 |
| 1 RAS基因及蛋白的结构及功能 |
| 2 RAS基因及蛋白的直接靶向治疗 |
| 3 RAS蛋白下游信号通路靶向治疗进展 |
| 4 RAS突变的其他靶向治疗策略 |
| 5 总结 |
| 参考文献 |
| 综述2 环状RNA在结直肠癌中的研究进展 |
| 1 环状RNA的起源与特点 |
| 2 环状RNA的形成机制 |
| 3 环状RNA的功能 |
| 4 环状RNA在结直肠癌中的研究 |
| 5 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 博士研究生指导组成员和课题基金资助项目 |
| 致谢 |
（7）miR-452-5p调控ERK/MAPK正反馈环路在结直肠癌进展中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 miR-452-5p在结直肠癌组织及细胞中的表达 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料和试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 小结 |
| 第二章 miR-452-5p表达异常对结直肠癌细胞生物学行为的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 转录组测序初步探讨miR-452-5p促进结直肠癌恶性生物学行为的机制 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料及试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 miR-452-5p调控结直肠癌恶性生物学行为的分子机制研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料及试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 MIR-452与肿瘤研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（8）JCV T抗原诱导消化系统肿瘤的病理特点和分子机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 JCV T抗原对消化系统肿瘤细胞恶性表型的影响及分子机理 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象、试剂和仪器 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 细胞的原代培养及处理 |
| 2.2.2 细胞的转染及筛选 |
| 2.2.3 MTT检测 |
| 2.2.4 细胞周期检测 |
| 2.2.5 细胞凋亡检测 |
| 2.2.6 细胞划痕修复实验 |
| 2.2.7 Tranwell |
| 2.2.8 细胞能量代谢检测 |
| 2.2.9 免疫荧光检测 |
| 2.2.10 细胞总蛋白提取 |
| 2.2.11 Western blot |
| 2.2.12 q RT-PCR |
| 2.2.13 免疫共沉淀 |
| 2.2.14 SDS-PAGE凝胶快速银染检测 |
| 2.2.15 蛋白质组学测序 |
| 3 结果 |
| 3.1 JCV T抗原对小鼠晶状体肿瘤细胞恶性表型的影响 |
| 3.1.1 细胞转染及鉴定 |
| 3.1.2 JCV T抗原对小鼠晶状体肿瘤细胞增殖活性的影响 |
| 3.1.3 JCV T抗原对小鼠晶状体肿瘤细胞周期的影响 |
| 3.1.4 JCV T抗原对小鼠晶状体肿瘤细胞凋亡的影响 |
| 3.1.5 JCV T抗原对小鼠晶状体肿瘤细胞迁移和侵袭的影响 |
| 3.1.6 JCV T抗原对小鼠晶状体肿瘤细胞能量代谢的影响 |
| 3.2 小鼠晶状体肿瘤细胞中JCV T抗原致癌的分子机制 |
| 3.2.1 JCV T抗原相互作用蛋白筛选 |
| 3.2.2 质谱分析JCV T抗原特异相互作用蛋白 |
| 3.2.3 免疫沉淀验证JCV T抗原的相互作用蛋白 |
| 3.2.4 JCV T抗原表达下调后的差异蛋白GO通路富集 |
| 3.2.5 蛋白组学测序分析下调JCV T抗原后的差异蛋白表达 |
| 3.2.6 免疫印迹验证下调JCV T抗原后差异蛋白表达 |
| 3.3 JCV T抗原对人肝癌细胞恶性表型的影响 |
| 3.3.1 细胞转染及鉴定 |
| 3.3.2 JCV T抗原对人肝癌细胞增殖活性的影响 |
| 3.3.3 JCV T抗原对人肝癌细胞凋亡的影响 |
| 3.3.4 JCV T抗原对人肝癌细胞迁移和侵袭的影响 |
| 3.4 JCV T抗原对人胰腺癌细胞恶性表型的影响 |
| 3.4.1 细胞转染及鉴定 |
| 3.4.2 JCV T抗原对人胰腺癌细胞增殖活性的影响 |
| 3.4.3 JCV T抗原对人胰腺癌细胞凋亡的影响 |
| 3.4.4 JCV T抗原对人胰腺癌细胞迁移和侵袭的影响 |
| 3.5 JCV T抗原对小鼠胰腺癌细胞恶性表型的影响 |
| 3.5.1 细胞转染及鉴定 |
| 3.5.2 JCV T抗原对小鼠胰腺癌细胞增殖活性的影响 |
| 3.5.3 JCV T抗原对小鼠胰腺癌细胞凋亡的影响 |
| 3.5.4 JCV T抗原对小鼠胰腺癌细胞迁移和侵袭的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 JCV T抗原诱发转基因鼠消化系统肿瘤的病理特点和分子机理 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验对象、主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 转基因鼠的构建 |
| 2.2.2 鼠尾DNA提取 |
| 2.2.3 PCR |
| 2.2.4 小动物CT |
| 2.2.5 组织包埋 |
| 2.2.6 HE染色 |
| 2.2.7 免疫组化 |
| 2.2.8 组织蛋白提取 |
| 2.2.9 Western Blot |
| 3 结果 |
| 3.1 转基因鼠的DNA鉴定 |
| 3.2 Alb-Cre/T抗原转基因鼠CT及大体改变 |
| 3.3 Alb-Cre/T抗原转基因鼠的组织病理学改变 |
| 3.4 Alb-Cre/T抗原转基因鼠肝癌组织肿瘤标志物检测 |
| 3.5 JCV T抗原诱导转基因鼠肝癌的分子基础 |
| 3.6 Pdx1-Cre/T抗原转基因鼠的CT及大体改变 |
| 3.7 Pdx1-Cre/T抗原转基因鼠的组织病理学改变 |
| 3.8 Pdx1-Cre/T抗原转基因鼠组织T抗原表达 |
| 3.9 JCV T抗原诱导转基因鼠胰腺癌的分子基础 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 JCV T抗原与人肝癌和胰腺癌发生的关系 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验对象、主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 石蜡组织提取DNA |
| 2.2.2 PCR |
| 2.2.3 qPCR |
| 2.2.5 原位PCR |
| 2.2.6 组织总蛋白的提取 |
| 2.2.7 Western blot |
| 2.2.8 免疫组化 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 人肝癌和胰腺癌组织中JCV T抗原DNA |
| 3.1.1 PCR检测肝癌和胰腺癌组织中JCV T抗原DNA |
| 3.1.2 q PCR检测肝癌和胰腺癌组织中JCV T抗原DNA |
| 3.1.3 原位PCR检测肝癌和胰腺癌组织中JCV T抗原DNA |
| 3.2 人肝癌和胰腺癌中JCV T抗原蛋白表达 |
| 3.2.1 免疫印迹检测肝癌组织中JCV T抗原蛋白表达 |
| 3.2.2 免疫印迹检测胰腺癌组织中JCV T抗原蛋白表达 |
| 3.2.3 免疫组化检测肝癌和胰腺癌组织中JCV T抗原表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）MOXD1基因在骨肉瘤增殖中作用及分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 骨肉瘤的流行病学现状 |
| 1.2 骨肉瘤的临床治疗现状 |
| 1.3 骨肉瘤的其他治疗方式进展 |
| 1.4 Monooxygenase DBH like1 的研究现状 |
| 第二章 MOXD1的表达与骨肉瘤患者临床病理参数相关性的研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 样本 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 判断标准 |
| 2.1.4 实验步骤 |
| 2.1.5 数据统计 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 基因MOXD1低表达骨肉瘤细胞株模型的构建 |
| 3.1 材料与方法: |
| 3.1.1 实验所用细胞和质粒 |
| 3.1.2 实验菌株 |
| 3.1.3 所需试剂和仪器 |
| 3.1.4 关于试剂的制备问题 |
| 3.1.5 RNA干扰靶点设计和双链DNA oligo制备 |
| 3.1.6 构建RNA干扰慢病毒载体 |
| 3.1.7 基因MOXD1 RNAi慢病毒包装 |
| 3.1.8 使用RT-PCR检测骨肉瘤细胞中MOXD1 的表达 |
| 3.1.9 慢病毒感染骨肉瘤细胞 |
| 3.1.10 qPCR检测MOXD1 mRNA敲减效率 |
| 3.1.11 Western Blot检测目的基因敲减后内源蛋白含量状态 |
| 3.1.12 数据统计 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 q-PCR检测骨肉瘤细胞中MOXD1 的表达情况 |
| 3.2.2 慢病毒感染骨肉瘤细胞(U2-OS、MNNG/HOS Cl#5)的荧光观察 |
| 3.2.3 MOXD1低表达细胞模型构建成功的检测 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 敲减基因MOXD1抑制骨肉瘤细胞增殖和异种移植瘤生长 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 实验所需细胞 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要实验材料和装置 |
| 4.1.4 全视野细胞分析仪细胞计数检测骨肉瘤细胞生长 |
| 4.1.5 细胞凋亡检测 |
| 4.1.6 骨肉细胞克隆形成检测 |
| 4.1.7 MTT检测骨肉瘤细胞活力 |
| 4.1.8 裸鼠皮下注射骨肉瘤细胞构建异种移植瘤模型、进行异种移植瘤裸鼠活体成像分析并观察瘤体生长情况。 |
| 4.1.9 数据统计 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 各组间细胞计数检测MOXD1敲减后细胞生长情况变化 |
| 4.2.2 FACS检测MOXD1 基因敲减后骨肉瘤细胞凋亡的变化 |
| 4.2.3 MOXD1基因敲减后骨肉瘤细胞增殖能力的变化 |
| 4.2.4 MTT检测MOXD1 基因敲减后细胞增殖的变化 |
| 4.2.5 MOXD1基因敲减后裸鼠异种移植瘤活体成像分析 |
| 4.2.6 MOXD1基因敲减后裸鼠异种移植瘤的生长变化 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 敲减基因MOXD1抑制骨肉瘤细胞增殖的机制研究 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 实验所需细胞 |
| 5.1.2 实验试剂和仪器 |
| 5.1.3RNAi慢病毒转染人骨肉瘤细胞MNNG/HOSCl#5 构建MOXD1 敲减模型 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1成功构建敲减MOXD1 人骨肉瘤细胞株MNNG/HOS Cl#5 模型,并验证了敲减有效性 |
| 5.2.2 基因芯片数据的质量评估 |
| 5.2.3 基因差异分析方案 |
| 5.2.4 显着性差异基因的生物信息分析 |
| 5.2.5 基于IPA的上游调控分析 |
| 5.2.6 基于IPA的疾病和功能分析 |
| 5.2.7 敲减基因MOXD1后调控因子互相作用 |
| 5.2.8 敲减基因MOXD1后下游基因的挑选及检测 |
| 5.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 缩略词对照表 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
（10）Syt7在调控肝癌细胞增殖中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 第一部分 Syt7原发性肝细胞肝癌组织标本和肝癌细胞中的表达及意义 |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Syt7在体内外实验中对肝癌增殖的影响 |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分 Syt7调控肝癌细胞增殖的机理研究 |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
四、应用RT—PCRIS技术检测大肠肿瘤石蜡标本三区组织中P~(53)mRNA（论文参考文献）
- [1]CMTM6表达促进肺癌增殖侵袭及机制研究[D]. 戴芳. 昆明医科大学, 2021(02)
- [2]TRIM37通过调控Wnt/β-catenin信号通路促进宫颈癌细胞增殖和侵袭[D]. 刘雅雯. 南昌大学, 2021(02)
- [3]长链非编码RNA CYTOR通过调节miR-125b-5p/KIAA1522轴影响肝细胞癌增殖、凋亡和细胞周期的机制研究[D]. 胡博. 北京协和医学院, 2021(02)
- [4]RNF126通过介导p53泛素化降解影响结直肠癌进展的机制研究[D]. 王世洋. 中国医科大学, 2021(02)
- [5]OATP1B3在肝细胞癌中的表达与预后相关性及生物学功能分析[D]. 陈施翰. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [6]结直肠癌患者KRAS、NRAS、BRAF基因突变与关键基因表达的相关性及circGLG1/miR-622/KRAS轴的分子作用机制[D]. 郝书弘. 吉林大学, 2020(08)
- [7]miR-452-5p调控ERK/MAPK正反馈环路在结直肠癌进展中的作用及机制研究[D]. 林欣. 南方医科大学, 2020
- [8]JCV T抗原诱导消化系统肿瘤的病理特点和分子机理研究[D]. 赵爽. 中国医科大学, 2020(01)
- [9]MOXD1基因在骨肉瘤增殖中作用及分子机制研究[D]. 韩兴文. 兰州大学, 2020(01)
- [10]Syt7在调控肝癌细胞增殖中的作用及机制研究[D]. 金浩. 山东大学, 2019(02)