一、分月扇舟蛾颗粒体病毒的形态和限制性内切酶图谱分析（论文文献综述）
梁振普,吴慧,张小霞,张亲,王彩平,刘雅静,张俊庆,桑思瑶[1]（2017）在《ClanGV的PIF0与其他经口感染因子间的互作研究》文中提出本文旨在通过酵母双杂交技术研究杨扇舟蛾颗粒体病毒（ClanGV）的经口感染因子PIF0和其他经口感染因子PIF1PIF6之间的互作关系。首先根据ClanGV的基因组序列信息,利用在线软件TMHMM Server v.2.0对PIF0PIF6进行跨膜区分析,确定需要扩增的片段。然后以诱饵载体pGBKT7和捕获载体pGADT为出发载体,构建了PIF0的重组诱饵载体（B0）和PIF1PIF6的重组捕获载体（A1A6）。自激活实验证明,重组诱饵载体B0没有自激活特性,可以进一步开展蛋白的互作研究。酵母双杂交结果证明,PIF0作为诱饵载体时,可以与PIF3和PIF5的重组捕获载体发生蛋白相互作用,与PIF1、PIF2、PIF4和PIF6都没有互作现象。本研究结果将有助于揭示PIF0在ClanGV经口感染过程中的功能,并可为阐明ClanGV的经口感染机制以及开发新型病毒杀虫剂和增效剂奠定基础。
吴正伟[2]（2015）在《苹果蠹蛾颗粒体病毒对新疆强日照环境的适应性机理及苹果蠹蛾的生物防治》文中指出苹果蠹蛾颗粒体病毒（Cydia pomonella granulovirus,Cp GV）具有对宿主特异性强、致病力高,对非靶标生物安全等特点,在苹果蠹蛾的生物防治中具有重要地位。病毒在环境中易受紫外线辐射失活,而在我国西北强日照干旱环境下可以分离到Cp GV,说明其具有一套适应外界极端环境的机制。对本土苹果蠹蛾颗粒体病毒Cp GV-ZY适应新疆强日照环境机理的研究,不仅能够丰富微生物对极端环境适应机制研究内容,也对进一步筛选在干旱、强光照地区具有强毒力的病毒株系,以及研发针对干旱地区的微生物农药提供基础理论。为了扩繁病毒及为后期实验提供稳定的虫源,进行了苹果蠹蛾的田间采集与室内饲养,并通过与田间种群的比较评价了苹果蠹蛾室内种群的质量。通过对Cp GV颗粒体蛋白基因granulin的克隆和RT-q PCR技术建立了该病毒微量检测方法,并以此对病毒在特异性宿主苹果蠹蛾及非特异性宿主梨小食心虫体内的增殖动态进行了比较。为了验证病毒颗粒体大小与紫外耐受性的关系,进行了室内UVB辐射模型的搭建,并与之和强日照环境下的病毒活性衰减动态做了比较,测试了温度因素对病毒的失活效应;通过电镜技术对不同来源的两株病毒颗粒体进行了形态测量和比较,进一步通过颗粒体裂解实验比较了颗粒体裂解前后病毒对UVB辐射的耐受性差异。通过限制性内切酶酶切分析获得了本土毒株特征性酶切片段。转录组分析获得两株病毒差异表达基因,并进行相对定量进行差异表达基因验证;通过对两株病毒增殖动态及granulin基因相对表达量的比较研究以期获得本土毒株在大颗粒体形成中所用的策略。最后,在该虫的生物防治研究中,探究了两种氧化物对病毒的防紫外保护作用,以及生物源杀虫活性物斑蝥素对该虫的毒力、防效、酶活作用等。主要研究结果结论如下:1.苹果蠹蛾室内种群质量评价及Cp GV在宿主体内增殖动态与田间种群相比,目前室内连续饲养的苹果蠹蛾种群存在幼虫存活率下降、幼虫期延长的情况。但所测的各参数均与其他人工饲养种群情况相符。表明我们的饲养方法虽然能维持该虫的连续饲养,但仍需进一步改进。基于granulin基因的绝对定量PCR,建立了检测范围在1041011拷贝数/μL的病毒定量检测方法。通过与非特异性宿主梨小食心虫的比较,发现Cp GV在苹果蠹蛾体内复制迅速,在喂毒3d后即进入增殖平台期并引起宿主大量死亡,而病毒对梨小食心虫的LC50和LC90值要分别比苹果蠹蛾高1000倍和73000倍。Cp GV在宿主内增殖动态的研究可为病毒与宿主的互作奠定基础并为本土病毒在今后的开发和应用提供了数据支持。2.Cp GV颗粒体大小与其紫外耐受性关系室内UVB辐射模型表明辐射3.75h可使病毒活性减半,2h 60℃及以上温度或40℃4h及更长时间处理均对病毒活性造成显着影响,而2h的日光辐射环境下使病毒失活的主要因素为紫外线;酸碱溶液对颗粒体的裂解实验表明,弱碱ph9条件下,颗粒体偏大的ZY毒株其裂解程度明显低于M毒株;进一步通过UVB辐射实验,表明单独弱碱处理后病毒活性无明显变化,而增加UVB辐射处理后,两株病毒活性均下降,但只有M毒株活性下降显着（72%）;进而表明M毒株紫外耐受性弱于ZY毒株,且随颗粒体的裂解其紫外耐受性下降更明显。从而证实了病毒颗粒体大小与紫外耐受性有关,随着颗粒体的减小其耐受性降低。通过对granulin基因的相对定量实验,结果表明ZY毒株很快进入高表达,但在进入平台期后M毒株表达量增长迅速;两株病毒在增殖动态方面无显着差异,死亡虫体内ZY毒株较M毒株颗粒体产量略高,但差异不显着。该实验表明ZY毒株不是通过减少最终病毒产量而实现颗粒体的增大。3.病毒基因组限制性内切酶图谱分析本土病毒Cp GV-ZY在基因组水平与M毒株存在一定的差异,即在Sal I和Eco RI酶切片段中分别多出一条亚克分子带（7.5kbp,14.7kbp）。在于其他毒株比较后,推测Cp GV-ZY可能存在该两种酶酶切位点的突变,可作为其鉴别特征。4.两株病毒在宿主中肠内转录组差异分析喂毒两株病毒后对宿主中肠进行了转录组分析,数据显示在喂毒后24h病毒在宿主中肠组织转录水平尚处于较低水平（2.69%2.85%）。以M毒株为参照,对差异基因的表达量分析表明,只有orf20和orf91显着上调。其中orf20为颗粒体病毒所特有的基因,但其功能在后续的GO注释和KEGG注释中均为找到,这可能需要进一步做功能研究。orf91与编码ODV-E25的基因同源,属于病毒晚期表达基因,且为病毒核心基因,位于BV和ODV囊膜上,推测其在病毒系统侵染中具有重要作用。而半定量分析表明M毒株在宿主体内2d后的增殖中该基因处于高表达,这与平台期时M毒株拷贝数反而增高相符。由于本次实验只选取了一个时间点进行转录组测序,因此对于全面揭示病毒在宿主体内基因的差异表达还不够详尽。对于差异表达不明显的基因还可以继续关注。5.苹果蠹蛾颗粒体病毒紫外线保护剂应用基于前期的紫外线辐射模型,室内测试了两种氧化物Zn O和Ti O2添加后,幼虫死亡率比对照组分别提高55.8%和46.5%,结合田间的日照处理实验表明,Zn O（15mg/m L）和Ti O2（10mg/m L）可以显着提高Cp GV光稳定性。该研究为实现病毒农药田间持效性的提高提供可能。6.斑蝥素对苹果蠹蛾的毒性及生化特性斑蝥素是一种结构独特的昆虫防御性物质,本研究表明其对于苹果蠹蛾具有胃毒活性（LC50=0.057 mg/m L）和触杀活性（LC50=0.125 mg/m L）,并且具有田间防治效果。低剂量饲喂下能导致幼虫体重增量减小,解毒酶GST活性显着提高、Car E和MFO显着下降而ACh E下降不显着。其作为一种有效的杀虫活性物质很有潜力在有机农业中用于苹果蠹蛾的生物防治。综上所述,本研究完成了苹果蠹蛾室内种群的饲养及评价,Cp GV在宿主体内增殖动态;从病毒形态角度证实Cp GV颗粒体大小与其紫外线耐受性直接相关,并且本土病毒Cp GV-ZY在形成大型颗粒体时并未减少最终病毒产量;限制性内切酶图谱分析表明本土病毒基因组存在两个酶切位点的突变,同时转录组分析发现有两个差异表达基因明显上调,但该突变位点及差异表达基因是否与病毒的环境适应性直接有关还需进一步研究。另外,在苹果蠹蛾的生物防治方面,完成了针对Cp GV的紫外线保护剂研究并证实动物源斑蝥素可用于该虫的防治。
张亲[3]（2015）在《ClanGV口服感染因子（PIFs）间的分子互作研究》文中认为杆状病毒具有两种不同形态、不同功能的病毒粒子形态:出芽型的病毒粒子（Budded virus,BV）和包涵体来源的病毒粒子（Occlusion derived virus,ODV）。早期的研究证实,ODV被宿主吞食后,以膜融合方式侵入中肠上皮细胞,推测是因为ODV的表面存在一类发挥膜融合功能的蛋白。目前研究证实昆虫病毒入侵中肠上皮细胞与口服感染因子（per os infectivity factor,PIF）有关,这些蛋白的缺失或突变将导致病毒口服感染能力的缺失。目前为止已经确定有七个杆状病毒家族的核心蛋白与口服感染密切相关,分别为:PIF0、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4、PIF5、PIF6,已有的研究证明在NPV中,这些蛋白是通过互作形成一个复合体的形式在ODV感染中肠上皮细胞的阶段发挥作用的。作为杆状病毒的主要成员之一,由于缺乏相应的细胞系,GV的分子生物学研究（包括PIF的鉴定、互作及功能研究）远远滞后于NPV。开展GV的分子生物学研究有助于全面了解杆状病毒的侵染机制,从而使其更好的服务于人类的生产。本论文以隶属于GV家族的杨扇舟蛾颗粒体病毒（Clostera anachoreta granulovirus,Clan GV）为研究对象,利用酵母双杂交系统开展了GV来源的口服感染因子PIFs间的互作研究。本论文在进行两个目标蛋白互作研究时,采用双向互作方法,即将两个互作蛋白分别作为诱饵载体和捕获载体来研究二者的互作关系。为了验证每个PIF是否会通过自身间的互作形成二聚体或多聚体呈现在病毒上,本研究还开展了每个PIF同时作为捕获载体和诱饵载体的互作研究。具体包括:一、首先,以缺失跨膜区序列的pif0-pif6的基因片段为模板设计引物,PCR扩增目标片段,然后通过体外重组分别构建这7个目标基因片段的酵母诱饵载体和捕获载体（PGADT7-PIF0-6和PGBKT7-PIF0-6）。二、对上述构建成功的各个诱饵载体进行自激活验证,结果证明除了PGBKT7-PIF5有自激活现象,其它基因均无。因此在研究PIF5与其它PIFs互作时,只开展了PIF5作为捕获载体的情况下该蛋白与其它PIFs的互作关系。三、将携带有不同目标片段的重组诱饵载体和捕获载体（PGADT7-PIF0-6和PGBKT7-PIF0-6）分别共转化酵母菌AH109,然后利用缺陷型培养基:SD/Trp-Leu和SD/Trp-Leu-His-Ade进行筛选培养,缺陷型培养基SD/Trp-Leu用来验证共转化效率,若有蛋白的相互作用则能够在缺陷型培养基SD/Trp-Leu-His-Ade生长。为了进一步验证该结果,我们对在SD/Trp-Leu-His-Ade上生长的阳性菌落又进行了PCR和X-α-gal显色验证。结果证明,通过酵母双杂交实验证明PIF1PIF4蛋白之间两两双向互作,并且PIF1PIF4都可以与自身互作形成二聚体。单向互作关系存在于:PGBKT7-PIF0+PGADT7-PIF3,PGBKT7-PIF0+PGADT7-PIF5,PGBKT7-PIF6+PGADT7-PIF3,PGBKT7-PIF6+PGADT7-PIF4,PGADT7-PIF5+PGBKT7-PIF1,PGADT7-PIF5+PGBKT7-PIF3,PGADT7-PIF5+PGBKT7-PIF4。综上,我们推测GV的PIF1PIF4可能形成一个稳定的口服感染相关的核心蛋白复合体,并且各自在复合体中可能以二聚体或多聚体的形式存在。论文结果使得我们对GV PIFs所形成的蛋白复合体有了一个初步的了解,为进一步研究PIFs介导的GV ODV的中肠水平感染机制奠定了坚实的基础。
吴立华,靳亮,王金昌,王洪秀[4]（2014）在《美国白蛾核型多角体病毒的研究进展》文中提出美国白蛾（Hyphantria cunea（Drury））属鳞翅目（Lepidoptera）灯蛾科（Arctiidae）,是一种重要的国际性检疫害虫,从1979年入侵以来,对我国林业和园林绿化造成重大危害。美国白蛾核型多角体病毒（Hyphantria cunea Nucleopolyhedrovirus,HcNPV）生物杀虫剂能有效控制寄主美国白蛾种群的数量,在生物防治中起到了重要的控害作用,具有重要的经济、生态和环保价值,应用前景十分广阔。从侵染特点、致病性、流行病毒学、基因组特点及应用前景等方面综述了美国白蛾核型多角体病毒的研究进展。
梁振普[5]（2013）在《两种舟蛾颗粒体病毒的基因组与蛋白质组学研究》文中提出杨树是世界上许多国家普遍种植的树种,也是我国经济林、防护林和绿化林的主要树种。近年来,由于大面积种植和树种单一等原因,以杨扇舟蛾（Clostera anachoreta Denis et Schiffermiiller,1775）和分月扇舟蛾（Clostera anastomosis Linnaeus,1758）为主的食叶害虫的危害连年发生。杨扇舟蛾颗粒体病毒（Clostera anachoreta D. granulovirus, ClanGV）和分月扇舟蛾颗粒体病毒（Clostera anastomosis L. granulovirus, CaLGV）分别是杨扇舟蛾和分月扇舟蛾的病毒性病原。前期感染性实验证明,二者可能具有较近的亲缘关系。病毒杀虫剂具有不杀伤天敌、对人畜安全、不污染环境、可在自然界传播等优点。但是,杀虫速度慢、寄主过于单一的特点却限制了它的大规模推广。为了在基因组水平上对病毒进行改造,需要深入了解病毒的遗传背景、侵染与复制机制、基因的结构和功能。基于这些原因,本课题对ClanGV和CaLGV的全基因组进行了测定、分析和比较,对ClanGV的结构蛋白质组进行了解析和研究。（一）杨扇舟蛾颗粒体病毒（ClanGV）的全基因组测序与分析虫体克隆法分离了单一基因型ClanGV,生物测定结果说明该病毒对杨扇舟蛾具有较高的致死作用。测定了ClanGV的全基因组,其大小为101,487 bp, C+G含量为44.4%。它预计编码123个开放阅读框（ORF）,这些编码序列占了全基因组序列的93%。在此123个ORF中,119个在已经报道的杆状病毒基因中有同源子,2个ORF仅仅在已测序的NPV中存在,2个ORF是ClanGV的Unique ORF。杆状病毒研究通常设定两个ORF之间的基因重叠必须不大于25个氨基酸,但是发现全长只有210bp的Clan118（lef10）与Clan119（vp1054）有104bp的基因重叠,与文献报道一致。在ClanGV和12个已经测序的GV之间,有82-103个同源ORF。ClanGV和其它GV之间同源ORF的平均同源性为55.5%到43.1%。"Gene parity plot"分析结果表明,ClanGV基因组与CpGV、 AdorGV、CrleGV、PiraGV、PhopGV和ChocGV的基因组显示了很好的共线性；与其它GV相比较,ClanGV的ORF20-ORF39区域是反向的。ClanGV基因组中具有p6.9的同源ORF（Clan71）,Clan71与其他GV的同源性为43%（HearGV）至72%（PiraGV）.与ChocGV一样,ClanGV缺少XecnGV ORF26的同源子。在ClanGV中,发现了17个杆状病毒结构蛋白的同源ORF、2个抗细胞凋亡基因（P35 and IAP）,还有16个DNA复制与转录相关的基因（ie-1、dnapol、helicase、lef-1、lef-2、lef-3、lef-4、lef-5、lef-6、lef-8、lef-9、lef-10、 lef-11、39k、p47和vlf-1）。ClanGV的基因组在富含AT的基因间区域含有4个hr,它们缺少回文序列核心,仅含有若干直接重复。在ClanGV中,64个ORF拥有TATA box; Ie-1是一个已知的极早期基因,然而ClanGV的ie-1没有检测到已知的启动子序列；68个ORF拥有晚期启动子,其中的42个同时具有早期启动子；22个ClanGV的ORF拥有enhancer-like序列单元。基于杆状病毒29个核心序列的进化分析表明,ClanGV和hopGV、AdorGV、CpGV、CrleGV、PiraGV、ChocGV具有更近的亲缘关系。（二）CaLGV和ClanGV的比较基因组学研究CaLGV基因组包含101,818bp, G+C含量为46.7%。它的基因组大小和G+C含量与ClanGV的（101,487bp和44.4%）非常接近。CaLGV基因组的整个核苷酸序列与ClanGV具有90%的同源性。在CaLGV基因组中共鉴定了123个ORF,编码序列占了全基因组序列的93.4%。与ClanGV一样,CaL118 （lef-10）和CaL119 （vp1054）之间的重叠为104bp,但是这两个基因在其它病毒中已经得到验证。在123个ORF中,64个与颗粒体蛋白基因相同,59个与颗粒体蛋白方向相反。CaLGV的123个ORF并不和ClanGV的123个ORF一一同源。有119个CaLGV的ORF在ClanGV中具有同源子,它们的转录方向和组织方式相同。在这119个同源ORF中,75个具有不低于90%的同源性,31个具有80～89%的同源性,两对最低的同源性为53%（CaL18和Clan18）和56%（CaL35和Clan34）.在许多杆状病毒中都存在的bro基因,CaLGV和ClanGV中均没有发现。相对于ClanGV,在CaLGV中共发现7834处核苷酸替换（6048处转换和1786处颠换）和1857处插入/缺失。CaLGV和ClanGV蛋白编码区的平均核苷酸置换率是8.33%。从CaLGV基因组的26,309bp到34,650bp之间的区域,是最大的序列差异区,仅仅有84%的核苷酸序列同源性。ClanGV的全基因组包括4个hr,然而CaLGV仅仅具有1个hr。这个hr与ClanGV的hr4处于完全相同的位置。ClanGV的hr包括3个直向重复,然而CaLGV的hr仅仅有2个直向重复,二者都缺少回文序列序列。CaLGV包含4个Unique基因,ClanGV有2个Unique基因。有8对基因仅仅在CaLGV和ClanGV中存在,而在其它的杆状病毒中没有同源子。CaLGV的基因组含有33个重叠区域,包括8对3’端相对基因、12对5’端相对基因和13对转录方向相同基因。ClanGV具有36个基因重叠区域,其基因重叠特征与CalGV的明显不同。有9个ClanGV的基因重叠在CaLGV中并不存在。CaLGV和ClanGV的基因间序列分别占全基因组的6.6%和7%。在CaLGV的90个基因间序列中,有35个与ClanGV的不同。系统发育分析表明,CaLGV和ClanGV被分派到了GV中的同一个亚分枝上。目前,仅仅有3个GV含有P35（ChocGV, CaLGV和ClanGV）。CaLGV和ClanGV的P35具有86%的氨基酸同源性。"DQMDG"结构域是P35被caspase切割的位点,但是在CaLGV和ClanGV P35的相应位置却是84TVCDG88。（三）杨扇舟蛾颗粒体病毒（ClanGV） ODV的蛋白质组学研究分别从具有包涵体的病毒和去除包涵体的ODV病毒粒子中分离总蛋白。利用LC-MS/MS共鉴定出74种蛋白质,是目前用质谱技术鉴定出最多ODV蛋白的杆状病毒。在这些蛋白中,70种鉴定出了2个或多于2个的肽段,只有4种蛋白（Clan45、Clan79、ALK-EXO和FGF-3）被鉴定出一个肽段。本研究中鉴定的ClanGV ODV蛋白总数占该病毒整个基因组ORF数目的60.2%,远远高于ChchNPV等其它杆状病毒。74个蛋白中的大部分成员集中分布于基因组的个两区域：一个是位于ORF7-ORF24之间的15个蛋白形成的蛋白簇（除去ORF10、ORF16和ORF21）,另一个是位于ORF63-ORF91之间的24个蛋白形成的蛋白簇（除去ORF67、ORF75、ORF77、ORF80和ORF85）。这两个蛋白簇所包含的蛋白的数量分别占整个结构蛋白的20%和32%。将本研究结果和已鉴定的其它5种杆状病毒进行了比较。结果显示,有11个蛋白在已研究的杆状病毒中都被鉴定为ODV的蛋白：P49、PIF-2、P74、P6.9、P33、VP39、ODV-E27、VP91、vlf-1、GP41、 VP1054; 13个蛋白在已研究的杆状病毒中都被鉴定为ODV、BV或ODV/BV蛋白：P49、PIF-2、 ODV-EC43、P74、P6.9、38K、P33、VP39、ODV-E27、VP91、vlf-1、GP41和VP1054；12个蛋白只在GV的ODV中被鉴定：pep1、Clan22、Clan27、pep/p10、pep-2、Clan69、Clan83、Clan84、Clan90、 Clan94、Clan116和fgf-3。21种蛋白是本研究新鉴定的蛋白,它们是Clan17、Clan18、Clan20、P13、 Clan32、Clan37、Clan39、Clan42、P35、P47、P38.7、Clan63、Clan64、DBP、LEF-5、Clan79、TLP-20、 Clan93、Clan108、LEF-8和Clan117。这些新鉴定的蛋白大部分是功能未知蛋白,其中Clan42、Clan79和Clan93是ClanGV特有的ORF。没有鉴定到ODV-E66,在ClanGV基因组序列中也没有该蛋白的同源物。与ChchNPV一样,没有没有鉴定出DNA聚合酶（DNA polymerase）和解旋酶（Helicase）,但它们在AcMNPV、HearSNPV和PiraGV中都被鉴定为ODV蛋白。为了利用Westernblot技术对这些蛋白进行进一步的验证,随机克隆了其中7个蛋白（ORF1629、 P49、ODV-E56、P13、SOD、P47和P40）的基因,目前3个蛋白（ORF1629、P49和SOD）已经得到表达和纯化。
陈川[6]（2010）在《油桐尺蠖核型多角体病毒（BusuNPV）分离株比较及微量检测方法的研究》文中研究表明本论文对油桐尺蠖核型多角体病毒（Buzura suppressatia nucleopolydrovirus,BusuNPV）的不同毒株分别通过生物测定,了解不同毒株的毒力大小;制作超薄切片,在扫描电镜下观察不同毒株的外部形态特征,在透射电镜下观察其病毒粒子的分布状况;病毒基因组酶切分析病毒核酸的变化。根据油桐尺蠖核型多角体病毒（BusuNPV）的多角体囊膜蛋白基因（pep）、lef-2基因设计特异性引物,成功建立了BusuNPV的PCR检测技术体系。研究内容与结果如下:（1）对BusuNPV各分离株进行毒力测定,未见明显差别。LF、SF、WF的LC50分别为4.39×104、6.65×104、1.02×105PIB/ml;LT50分别为5.59、5.69、5.17d。观察扫描电镜、透射电镜照片,发现各分离株均为单粒包埋核型多角体病毒,多角体直径为0.85-1.50um,病毒粒子大小为0.195-0.246 um×0.054-0.072 um,各毒株间未见显着差别。（2）选择5种常见内切酶对BusuNPV全基因组序列进行酶解,除EcoRⅠ外其它内切酶酶解条带均较少,分子量大,不易进行分离株比较。其中EcoRⅠ消化的DNA片段约为12条,分子量小于15kb,分离株之间未见差别。双酶酶解BusuNPV全基因组序列时,DNA充分被消化,条带较多,适宜分离株之间比较。但是观察双酶切图谱,各分离株的酶切条带数目、大小不存在差别。（3）通过基因比对,分别确定了BusuNPV的两个特异性片段pep基因和lef-2基因,并根据两段基因设计出两对特异性引物BPF、BLA,建立以PCR技术为基础的快速检测BusuNPV的方法。（4）建立的BusuNPV的PCR检测技术,不仅能短时间内成功的从卵和蛹内检测到BusuNPV,而且其灵敏度可达到1 fg·ml -1DNA。经过模板多样性研究,用多角体悬液也可直接作为模板进行PCR试验检测BusuNPV。（5）本实验所建立的BusuNPV PCR快速检测技术,检测的特异性强、灵敏度高、操作简单易行,且应用效果非常好,可以用来研究病毒在虫体内的增殖规律及检测林间油桐尺蠖的带毒情况。
王文欢[7]（2009）在《两种林业昆虫杆状病毒PCR快速检测技术及其应用的研究》文中研究表明林业昆虫病毒作为一种高效无害专一性强的杀虫剂,现在已经在森林保护中起到了很大的作用。但其在林业上的使用率还不够广泛,主要是因为病毒防治害虫时潜伏期较化学杀虫剂长,没有后者那么立竿见影的效果,使得使用者对病毒治虫有质疑。现今对昆虫病毒防治效果的研究还仅仅停留在对病毒的形态观测阶段,本实验旨在建立几种以昆虫病毒核酸为基础的检测技术,从而填补昆虫病毒检测在分子生物学方面的空白,同时应用这些技术检测在昆虫体内低水平存在的病毒,为昆虫病毒的垂直传播及防治效果监测提供微观的、确凿的分子生物学证据,进而论证应用昆虫病毒防治林业害虫的可行性,确保森林生态保持稳定。根据HcNPV pe38基因设计两对引物,利用PCR法检测HcNPV基因组DNA,分别扩增出长为994和614 bp的片段,经测序确定为HcNPV pe38基因片段。应用两对引物分别检测了美国白蛾病虫的总DNA和获得的病毒多角体,其检测最低量分别为1 fg病虫总DNA和34 OBs/mL。用不同浓度的病毒感染试虫后,不同时间取其血淋巴用PCR方法检测。结果表明,接毒量为3.53×109 OBs/mL时,36 h后可检出病毒DNA;接毒量为34 OBs/mL时,120 h后可检出。病毒可检出时间随接毒浓度的递减而延后。从秦皇岛地区施用过HcNPV的林地和未施用病毒防虫的林地采集美国白蛾野外幼虫,取其血淋巴做模板进行PCR扩增,结果十分明显,说明之前建立的方法完全可以应用于实践中,同时说明HcNPV对该地区的美国白蛾种群具有持续控制作用。根据ClanGV egt基因设计两对引物,利用PCR方法检测ClanGV基因组DNA,分别扩增出401和491bp的片段,经测序确定为ClanGV egt基因片段。应用两对引物检测ClanGV病毒悬液,亦可成功扩增出目的基因片段,说明这两对特异性较高,可以用其检测ClanGV的存在,从而为昆虫病毒的野外检测奠定基础。
段彦丽[8]（2008）在《美国白蛾NPV与Bt混合致病机理及其对寄主种群持续控制作用》文中研究说明美国白蛾核型多角体病毒（Hyphantria cunea Nucleopolyhedrovirus,HcNPV）生物杀虫剂能有效控制寄主美国白蛾种群的数量,在生物防治中起到了重要的控害作用,具有重要的经济、生态、环保价值,应用前景十分广阔。本文应用生物测定、组织病理切片、电镜技术、分子生物学、免疫组化等方法,初步研究HcNPV与Bt混合致病机理及其病毒对寄主种群中的持续控制作用,力争从多个角度揭示HcNPV与寄主的互作机理。主要研究内容和结果如下:混合感染试验表明,当两病原浓度接近LC50时,美国白蛾幼虫可表现出病毒或细菌的症状,并依次出现细菌和病毒两个发病高峰期。用各病原浓度接近LC50混合感染,与各单剂单独作用相比,可提前发病高峰期12-24h,表明病原混合作用可加强各病的致病力;当Bt浓度为10、25mg/L时对HcNPV的毒力有增效作用;而Bt浓度为5mg/L时,对HcNPV的毒力表现出减效作用;而HcNPV浓度为1.6×105、1.6×106、1.6×107 PIBs/mL时,对Bt的毒力均有增效作用。混合感染增效可使半数致死时间（LT50）缩短0.5-2.1d。说明病原混合感染寄主对其病原的致病性有明显影响,浓度配比是混合侵染提高效力的关键因素。4龄初幼虫接种后按不同时间取样,制成石蜡切片,进行H.E染色。观察了HcNPV、Bt和HcNPV+Bt混合侵染寄主所引起的中肠上皮细胞、脂肪体细胞、表皮细胞、精巢的病变过程。观察发现,病毒和细菌混合感染,6-48h中肠上皮细胞顶端肿胀呈囊泡状,细胞质积聚在顶部;72h-144h表现病毒病症,与病毒单独感染相比,出现病毒症状的时间略早,病变的程度也较严重,组织细胞降解的速度也明显加快,说明混合感染加重了病理变化,加速了幼虫死亡。对寄主的超微结构观察表明,Bt感染24h,中肠上皮细胞、杯状细胞出现病理变化,48h细胞质出现空泡,72h病变加重,上皮细胞大多从基底膜脱落。混合感染幼虫,感染24h,中肠上皮细胞出现病理变化,96h出现病毒粒子复制,而脂肪体24h无明显病理变化,48h出现病理变化,120h出现病毒粒子复制,至144h-168h中肠、脂肪体细胞核内病毒粒子大量复制,出现包埋病毒粒子多角体,尤其中肠细胞核内充满了多角体,细胞核胀大,几乎占满了整个细胞。HcNPV感染精巢组织细胞核在144h出现病毒发生基质,168h有病毒核衣壳形成。上述结果表明,病毒侵染中肠细胞比脂肪体细胞早24h,中肠在中后期出现带囊膜病毒粒子的复制,在晚期有大量的多角体在细胞核内形成,而在多数鳞翅目昆虫中,这种情况比较少见。同时在精巢细胞发现病毒发生基质,这些变化在美国白蛾寄主中还未见报道。免疫组化观察HcNPV在寄主组织中的定位情况,结果表明其经口感染寄主的病理时相:感染后48h,在中肠检测到个别阳性信号;72-96小时,在气管、脂肪体、表皮同时检测到病毒抗原,中肠的阳性信号也在增多;感染后120小时,气管上皮细胞、脂肪体和真皮细胞的细胞核肿大,阳性信号增强;感染后144小时,在脂肪体、气管、真皮的上皮组织中全部检测到阳性信号。上述结果说明,中肠细胞阳性信号出现的早,但数量增加缓慢,其它组织阳性信号出现的晚,但病毒增殖速度快;HcNPV+Bt混合感染阳性信号出现的时间早于病毒单独感染,说明混合感染增强了病毒在寄主体内的复制。肌肉组织中始终未见阳性信号,表明肌肉未被侵染。需要指出的是,在感染144h后,精巢的精囊细胞内检测到病毒抗原的阳性信号,表明病毒侵染了精巢组织。对染病寄主的血淋巴蛋白浓度和SDS-PAGE分析表明,HcNPV使寄主的血淋巴蛋白在染病后连续6d中,除在第72h、96h突然升高,明显高于对照外,其余时间血淋巴蛋白含量浓度均低于对照;三种蛋白（普通蛋白、糖蛋白、脂蛋白）电泳图谱与对照相比变化不明显,普通蛋白在第72h、96h的血淋巴蛋白,在中分子量区域出现相对含量上的变化及迁移位置的变动。糖蛋白、脂蛋白图谱变化相似。上述结果说明,HcNPV对寄主的血淋巴代谢有抑制作用,可能是病毒感染破坏了脂肪体组织,损坏了合成代谢蛋白质的功能,导致了血淋巴蛋白浓度的变化。用HcNPV感染美国白蛾幼虫后,对其亲代、子一代、子二代的幼虫致死率、蛹重、产卵量、卵孵化率及染病成虫繁殖对子代影响进行了生物测定和观察研究,结果表明,与对照比较,各项检测指标经生物统计,均表现出差异显着。说明HcNPV在寄主种群中能够传代,对种群的数量起到了一定控制作用。应用PCR检测染病寄主当代、次代卵总DNA,发现HcNPV的扩增产物,证明HcNPV在分子水平上可以垂直传播给子代。HcNPV在寄主中连续传代7次后,对第0、3、5、7代进行了生物活性测定、电镜观察、病毒粒子蛋白SDS-PAGE电泳、基因组DNA限制性内切酶酶解分析等研究,生物活性测定结果说明,各代病毒毒力没有明显差异。第7代病毒与原始感染病毒电镜观察,在多角体和病毒粒子形态方面未发现明显变化。各代病毒的结构多肽基本一致,有25-26条多肽,只是第3、7代病毒出现了一条新增条带,分子量约为42.0 kD。病毒核酸经BGⅡ,EcoRI,PST,PVUⅡ4种酶解,各代NDA的酶切位点、片段大小基本完全一致。说明,HcNPV经传代7次后,病毒核酸遗传稳定,病毒粒子多肽的变化只是病毒与寄主互作的适应性改变,并未改变其遗传特性。对HcNPV的5种分离株进行了比较研究,结果发现,其多角体、病毒粒子在形态方面没有明显差异;生物活性比较,其中一株LC50、LT50明显优于其它毒株;结构多肽电泳、病毒DNA酶切图谱存在一定差异。
李海霞[9]（2006）在《分月扇舟蛾颗粒体病毒病理、毒力及蛋白基因的研究》文中指出本文以分月扇舟蛾颗粒体病毒为研究对象，通过电镜观察、室内生物测定、石蜡切片等方法，系统研究了该病毒的超微结构、病毒毒力以及野外防治的效果；最后通过提取病毒的DNA，从基因组中扩增出颗粒体蛋白基因，对其核苷酸序列与蛋白质序列进行分析，预测蛋白质二级结构，为研究该基因在病毒感染中的作用提供依据。 本研究取得以下研究成果： （1）在分月扇舟蛾颗粒体病毒超微结构的试验中，通过扫描电镜和透射电镜观察到，病毒颗粒体形态呈椭圆形或卵圆形，有的呈现不规则形，形态平均大小为428.54×237.96nm；在透射电镜下显示病毒杆、内膜与囊膜构成病毒粒子，病毒粒子平均大小为223.44×58.51nm。 （2）分月扇舟蛾颗粒体病毒的室内生物测定试验结果表明，浓度对数和死亡几率值的回归直线方程为y=1.946+0.558x，LC50为2.97×105PIB·mL-1。1.58×105PIB·mL-1，1.58×106PIB·mL-1、1.58×107PIB·mL-1、1.58×108PIB·mL-1、1.58×109PIB·mL-1的半致死时间(LT50)分别为8.55d，6.89d，5.9d，4.65d，4.08d，随着浓度的增大，LT50逐渐缩短。 （3）通过对取食病毒不同时间的幼虫制作石蜡切片，在显微镜下观察发现，颗粒体病毒可在中肠细胞中形成，细胞核变大，使中肠细胞严重变形，但不侵染马氏管和围食膜。 （4）在颗粒体蛋白基因的研究中，利用PCR技术扩增得到498bp片段，测序后将所得序列与CacGV、PsGVA25-6、CpGVA11-2、AoGVS45、CmGVA11-1、HcGVA5-1的相应区段进行序列比较，其中与杨扇舟蛾颗粒体病毒（CacGV）蛋白基因的相似性最高；对该基因的蛋白质基本性质进行了分析，结果显示存在一个明显的疏水区，没有显着意义的跨膜区，同一氨基酸在使用不同的密码子上存在一定的偏向性；蛋白质的二级结构分析表明该基因分别由α螺旋（38.55％）、β折叠（18.07％）、β转角（10.24％）和无规卷曲（33.13％）组成，其中α螺旋占主要结构。 （5）应用浓度为1.83×107PIB·mL-1颗粒体病毒对分月扇舟蛾幼虫进行野外生物防治，结果表明，未套笼试验10d林间防治效果为49.13％，20d效果达到79.41％，套笼试验10d林间防治效果为48.48％，20d效果达到83.21％，说明颗粒体病毒作为生物杀虫剂对分月扇舟蛾有很好的防治效果。
张小霞[10]（2005）在《ClanGV的分子生物学特性和棉铃虫PM的研究》文中提出本论文对杨扇舟蛾颗粒体病毒（Clostera anachoreta granulovirus,简称ClanGV）进行了形态学等基本特性研究,鉴定了颗粒体基因N-末端近10kb 的基因图谱,并对序列做了进化分析。同时以棉铃虫为研究对象,对鳞翅目昆虫中肠防御系统-围食膜进行了基本研究,主要研究内容如下: 论文第一章以综述的形式介绍了目前杆状病毒、颗粒体病毒以及昆虫围食膜研究现状。第二章中,我们对ClanGV 进行了增殖、病毒纯化、核酸提取、形态学研究、限制性内切酶及颗粒体病毒enhancin 同源基因分析。在论文第三章,利用Southern 杂交定位了颗粒体基因N-末端近10kb 的基因图谱。对定位的限制性片段进行了克隆和序列测定,并利用生物软件对测序结果进行了分析,以此确定ClanGV 在颗粒体病毒的分类定位,结果显示ClanGV和ClGV,CpGV,PoGV 以及AoGV 从基因水平看,亲缘关系较近。第四章中,对ClanGV 的颗粒体蛋白基因进行了克隆、测序及分析。并提取颗粒体蛋白,免疫家兔制备抗体。通过免疫杂交分析了与其他杆状病毒包涵体蛋白间的血清学关系,结果显示ClanGV 除了与分月扇舟蛾颗粒体病毒（CaLGV）的颗粒体蛋白有较强的杂交信号外,与棉铃虫核多角体病毒（HaNPV）多角体蛋白也有明显的杂交带出现,与甜菜夜蛾核多角体病毒（SeNPV）几乎没有血清学关系。论文第五章的主要研究内容是以棉铃虫为研究对象,对鳞翅目昆虫围食膜进行了形态学研究、染色观察,以及几丁质结合物质-刚果红对中肠围食膜的破坏作用研究。结果表明:棉铃虫的围食膜类似于Ⅰ型围食膜。幼虫摄取含大于1.0%刚果红的饲料2.5h后,只能形成易脆无弹性的围食膜碎片,并且通过恢复实验证明,刚果红对围食膜的破坏作用在较短时间内可以得到修复。1%刚果红能增强棉铃虫幼虫对HaNPV的敏感性。
二、分月扇舟蛾颗粒体病毒的形态和限制性内切酶图谱分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、分月扇舟蛾颗粒体病毒的形态和限制性内切酶图谱分析（论文提纲范文）
（1）ClanGV的PIF0与其他经口感染因子间的互作研究（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 1 菌株、质粒、病毒 |
| 2 主要试剂 |
| 3 PIF0序列同源性及进化分析 |
| 4 目的基因扩增 |
| 5 重组载体构建及鉴定 |
| 6 酵母双杂交验证PIF0和其它PIFs之间的互作 |
| 6.1 重组诱饵载体的自激活试验 |
| 6.2 重组捕获载体和重组诱饵载体共转化酵母菌AH109 |
| 6.3 发生蛋白互作的转化组的显色及PCR验证 |
| 结果 |
| 1 PIF0序列同源性及其进化树分析 |
| 2酵母重组载体的构建 |
| 3重组诱饵载体B0的自激活检测 |
| 4 PIF0与PIF1~PIF6之间的蛋白互作检测 |
| 讨论 |
（2）苹果蠹蛾颗粒体病毒对新疆强日照环境的适应性机理及苹果蠹蛾的生物防治（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 苹果蠹蛾简介 |
| 1.1.1 苹果蠹蛾分布 |
| 1.1.2 苹果蠹蛾生物学特性 |
| 1.2 苹果蠹蛾综合防治 |
| 1.3 生物源农药在苹果蠹蛾防治中的应用 |
| 1.3.1 动物源农药 |
| 1.3.2 植物源农药 |
| 1.3.3 微生物源农药 |
| 1.3.4 动物源生物化学农药 |
| 1.3.5 植物源生物化学农药 |
| 1.3.6 微生物源生物化学农药 |
| 1.4 苹果蠹蛾颗粒体病毒 |
| 1.4.1 CpGV的形态特征及分类地位 |
| 1.4.2 CpGV寄主范围及安全性评价 |
| 1.4.3 苹果蠹蛾颗粒体病毒病 |
| 1.4.4 CpGV的获取与传播 |
| 1.4.5 影响病毒稳定性的因素 |
| 1.4.6 CpGV的商业发展过程 |
| 1.4.7 CpGV分子及生化研究 |
| 1.4.8 CpGV抗性 |
| 1.4.9 抗性治理 |
| 1.5 研究设想 |
| 第二章 苹果蠹蛾室内种群质量评价及CpGV在宿主体内增殖动态 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 供试昆虫与病毒 |
| 2.1.2 主要试剂和材料 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 建立苹果蠹蛾室内种群 |
| 2.2.2 室内种群的质量评价 |
| 2.2.3 病毒扩繁、分离、纯化 |
| 2.2.4 病毒RT-qPCR检测及其在宿主内的复制时相 |
| 2.2.5 数据处理 |
| 2.3 结果分析 |
| 2.3.1 苹果蠹蛾室内种群参数的评价 |
| 2.3.2 CpGV在宿主体内的增殖动态 |
| 2.4 结论与讨论 |
| 第三章 CpGV颗粒体大小与病毒紫外耐受性关系 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 供试虫源和病毒 |
| 3.1.2 紫外线照射装置 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 病毒形态观察 |
| 3.2.2 两株病毒毒力测定 |
| 3.2.3 紫外光UVB辐射模型构建 |
| 3.2.4 病毒温度耐受性 |
| 3.2.5 病毒pH稳定性 |
| 3.2.6 颗粒体裂解后CpGV紫外耐受性比较 |
| 3.2.7 颗粒体蛋白的转录与颗粒体的增殖动态 |
| 3.2.8 数据处理 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 CpGV形态观察与比较 |
| 3.3.2 两株病毒毒力测定 |
| 3.3.3 紫外线UVB辐射模型构建 |
| 3.3.4 UVB辐射对病毒活力的影响 |
| 3.3.5 温度耐受性 |
| 3.3.6 病毒颗粒体裂解实验 |
| 3.3.7 病毒产生大颗粒体的策略探究 |
| 3.4 结论与讨论 |
| 第四章 病毒基因组限制性内切酶图谱分析 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 试虫、病毒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 病毒扩繁、分离、纯化 |
| 4.2.2 病毒基因组DNA提取 |
| 4.2.3 限制性内切酶酶切反应 |
| 4.3 结果分析 |
| 4.3.1 CpGV-ZY基因组限制性内切酶酶切分析 |
| 4.4 结论与讨论 |
| 第五章 两株病毒在宿主中肠内转录组差异分析 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 供试虫源和病毒 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 试虫准备及组织样品获取 |
| 5.2.2 总RNA提取，反转录cDNA模板 |
| 5.2.3 转录组测序样品制备 |
| 5.2.4 转录组测序分析 |
| 5.2.5 实时定量PCR引物合成 |
| 5.2.6 常规PCR扩增 |
| 5.2.7 实时定量PCR |
| 5.2.8 数据处理 |
| 5.3 结果分析 |
| 5.3.1 苹果蠹蛾中肠组织总RNA的提取及检测 |
| 5.3.2 病毒转录组数据分析 |
| 5.3.3 宿主转录组数据分析 |
| 5.3.4 病毒基因差异表达检测与分析 |
| 5.4 结论与讨论 |
| 第六章 苹果蠹蛾颗粒体病毒紫外保护剂应用 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.1.1 试虫 |
| 6.1.2 苹果蠹蛾颗粒体病毒及紫外线保护剂 |
| 6.1.3 照射装置 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 ZnO和TiO_2对幼虫存活及体重的影响 |
| 6.2.2 UVB照射实验 |
| 6.2.3 田间日照实验 |
| 6.2.4 数据处理 |
| 6.3 结果分析 |
| 6.3.1 CpGV毒力测定及UVB失活效应 |
| 6.3.2 喂食ZnO和TiO_2对幼虫的影响 |
| 6.3.3 ZnO和TiO_2对CpGV的保护作用 |
| 6.3.4 日光辐射实验 |
| 6.4 结论与讨论 |
| 第七章 斑蝥素对苹果蠹蛾的毒性及生化特性 |
| 7.1 试验材料 |
| 7.1.1 试虫 |
| 7.1.2 斑蝥素和对照农药 |
| 7.2 试验方法 |
| 7.2.1 斑蝥素对幼虫胃毒活性和对其体重影响 |
| 7.2.2 斑蝥素对初孵幼虫触杀活性 |
| 7.2.3 斑蝥素对成虫产卵影响及其杀卵活性 |
| 7.2.4 田间防效实验 |
| 7.2.5 酶活实验昆虫处理 |
| 7.2.6 酶源制备 |
| 7.2.7 酶活测定 |
| 7.2.8 数据处理 |
| 7.3 结果分析 |
| 7.3.1 斑蝥素胃毒活性和触杀活性 |
| 7.3.2 斑蝥素对幼虫体重的影响 |
| 7.3.3 斑蝥素杀卵效果 |
| 7.3.4 田间防效实验 |
| 7.3.5 解毒酶活性变化 |
| 7.4 结论与讨论 |
| 第八章 总结 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）ClanGV口服感染因子（PIFs）间的分子互作研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 杆状病毒简介及其应用 |
| 1.1.1 杆状病毒分类 |
| 1.1.2 杆状病毒的感染过程 |
| 1.1.3 杆状病毒应用及作为生物杀虫剂的优缺点 |
| 1.2 杆状病毒的分子生物学研究现状 |
| 1.2.1 杆状病毒的基因组研究 |
| 1.2.2 杆状病毒的蛋白质组研究 |
| 1.2.3 杆状病毒系统进化与基因组的分析技术 |
| 1.3 口服感染因子的研究进展 |
| 1.3.1 口服感染因子PIFs |
| 1.3.2 不同口服感染因子的特征与功能 |
| 1.3.2.1 口服感染因子P74(PIF0) |
| 1.3.2.2 口服感染因子PIF1 |
| 1.3.2.3 口服感染因子PIF2 |
| 1.3.2.4 口服感染因子PIF3 |
| 1.3.2.5 口服感染因子PIF4 |
| 1.3.2.6 口服感染因子PIF5 |
| 1.3.2.7 口服感染因子PIF6 |
| 1.3.3 口服感染因子复合物及其相关蛋白质 |
| 1.3.3.1 口服感染因子复合物 |
| 1.3.3.2 口服感染因子复合物相关的蛋白质 |
| 1.4 ClanGV的研究现状 |
| 1.5 酵母双杂交系统 |
| 1.6 研究内容和意义 |
| 2 引言 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株、质粒、病毒 |
| 3.1.2 酶及其它试剂 |
| 3.1.3 实验中自配溶液 |
| 3.1.4 耗材与仪器 |
| 3.1.5 引物合成和测序 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 病毒的提取 |
| 3.2.2 病毒基因组的提取 |
| 3.2.3 目的基因的扩增 |
| 3.2.3.1 目的基因pif的跨膜区分析 |
| 3.2.3.2 目的基因pif的引物设计 |
| 3.2.4 酵母PGADT7,PGBKT7重组载体的构建 |
| 3.2.4.1 PGADT7,PGBKT7质粒提取 |
| 3.2.4.2 PGADT7,PGBKT7质粒双酶切 |
| 3.2.4.3 pif基因连接到PGADT7,PGBKT7载体 |
| 3.2.4.4 连接体系转化大肠杆菌DH5α |
| 3.2.4.5 重组捕获载体和诱饵载体的鉴定 |
| 3.2.5 诱饵载体的自激活检验 |
| 3.2.6 酵母双杂交验证PIFs的互作 |
| 3.2.6.1 酵母感受态的制备 |
| 3.2.6.2 重组诱饵载体和重组捕获载体的共转化 |
| 3.2.6.3 蛋白互作的进一步验证 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 ClanGV病毒基因组的提取 |
| 4.2 pif基因的PCR扩增 |
| 4.3 重组载体的构建 |
| 4.4 重组诱饵载体的自激活检测 |
| 4.5 酵母双杂验证PIFs间的互作 |
| 4.5.1 营养缺陷筛选验证PIFs间的互作 |
| 4.5.2 X-α-gal显色验证 |
| 4.5.3 PCR验证 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
（4）美国白蛾核型多角体病毒的研究进展（论文提纲范文）
| 0引言 |
| 1美国白蛾核型多角体病毒的侵染特点 |
| 1.1感染HcNPV的美国白蛾幼虫的外部症状 |
| 1.2感染HcNPV的美国白蛾幼虫的组织病变过程 |
| 2美国白蛾核型多角体病毒的致病性研究 |
| 2.1HcNPV对寄主的毒力研究 |
| 2.2HcNPV对寄主的传播和交叉感染研究 |
| 2.3HcNPV制剂对美国白蛾防治研究 |
| 3美国白蛾核型多角体病毒的分子生物学研究 |
| 4美国白蛾核型多角体病毒杀虫剂的产业化发展 |
（5）两种舟蛾颗粒体病毒的基因组与蛋白质组学研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 1 杆状病毒分类 |
| 2 杆状病毒的形态与结构 |
| 3 杆状病毒的应用 |
| 4 杆状病毒的进化 |
| 5 杆状病毒的生活史 |
| 6 杆状病毒的基因组及基因 |
| 7 杆状病毒的蛋白质组 |
| 引言 |
| 第一部分 杨扇舟蛾颗粒体病毒(ClanGV)的全基因组测序与分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 单一基因型ClanGV的制备 |
| 3.2 ClanGV的LC50测定 |
| 3.3 ClanGV的全基因组序列分析 |
| 3.4 ClanGV基因组的成分 |
| 3.5 ClanGV与其它杆状病毒的ORF比较 |
| 3.6 ClanGV的Unique ORF |
| 3.7 结构蛋白基因 |
| 3.8 DNA复制和转录相关基因 |
| 3.9 抗细胞凋亡基因 |
| 3.10 辅助基因 |
| 3.11 基因间序列和重复区 |
| 3.12 启动子分析 |
| 3.13 系统发育分析 |
| 4 小结 |
| 第二部分 CaLGV和ClanGV的比较基因组学研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 CaLGV基因组的序列分析 |
| 3.2 CaLGV和ClanGV的ORF比较 |
| 3.3 同源重复区 |
| 3.4 Unique基因 |
| 3.5 重叠基因和基因间序列 |
| 3.6 系统发育分析 |
| 3.7 P35基因 |
| 4 小结 |
| 第三部分 杨扇舟蛾颗粒体病毒(ClanGV)ODV的蛋白质组学研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ClanGV ODV全蛋白的制备与检测 |
| 3.2 ClanGV ODV蛋白质组的鉴定 |
| 3.3 ClanGV和其它杆状病毒ODV蛋白质组的比较 |
| 3.4 原核表达载体的构建 |
| 3.5 目的蛋白的原核表达与纯化 |
| 4 小结 |
| 全文总结 |
| 讨论 |
| 本文创新点 |
| 英文摘要 |
| 参考文献 |
| 附录一 攻读博士学位期间发表的相关论文及获得的专利与成果 |
| 附录二 缩略词汇总 |
（6）油桐尺蠖核型多角体病毒（BusuNPV）分离株比较及微量检测方法的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.1.1 研究背景 |
| 1.1.2 研究目的与意义 |
| 1.1.3 项目来源与经费支持 |
| 1.2 国内外研究现状与评述 |
| 1.2.1 昆虫病毒学研究进展 |
| 1.2.2 试虫简介 |
| 1.2.3 供试病毒的研究进展 |
| 1.3 研究目标和主要研究内容 |
| 1.3.1 主要研究内容 |
| 1.3.2 研究目标 |
| 1.4 研究技术路线 |
| 第二章 油桐尺蠖核型多角体病毒（BusuNPV）不同分离株的比较研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 PCR 方法检测各株病毒 |
| 2.2.2 不同分离株生物活性的比较 |
| 2.2.3 不同分离株电镜观察结果 |
| 2.2.4 基因组限制性内切酶图谱比较 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 第三章 油桐尺蠖核型多角体病毒（BusuNPV）PCR 检测技术的研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 BusuNPV 基因组的PCR 扩增和引物特异性分析 |
| 3.2.2 PCR 检测BusuNPV 基因组DNA 敏感性的研究 |
| 3.2.3 油桐尺蠖核型多角体病毒PCR 检测技术的应用 |
| 3.2.4 PCR 检测技术模板的多样性研究 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第四章 结论与讨论 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 讨论 |
| 4.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 文中目的基因的序列 |
| 在读期间学术研究 |
| 致谢 |
（7）两种林业昆虫杆状病毒PCR快速检测技术及其应用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.1.1 研究背景 |
| 1.1.2 研究目的与意义 |
| 1.1.3 项目来源与经费支持 |
| 1.2 国内外研究现状与评述 |
| 1.2.1 杆状病毒简述 |
| 1.2.2 试虫简介 |
| 1.2.3 核酸检测简述 |
| 1.3 研究目标和主要研究内容 |
| 1.3.1 主要研究内容 |
| 1.3.2 研究目标 |
| 1.4 研究技术路线 |
| 第二章 美国白蛾核型多角体病毒PCR 快速检测方法的建立与验证 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 美国白蛾核型多角体病毒形态观察与鉴定 |
| 2.2.2 美国白蛾核型多角体病毒PCR 检测方法的建立 |
| 2.2.3 美国白蛾核型多角体病毒PCR 检测方法的验证 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 第三章 美国白蛾核型多角体病毒PCR 快速检测方法的应用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 美国白蛾野外幼虫典型网幕形态鉴定 |
| 3.2.2 人工模拟野外施毒检测 |
| 3.2.3 野外虫血淋巴检测 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第四章 杨扇舟蛾颗粒体病毒PCR 快速检测方法的建立 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 杨扇舟蛾人工饲养形态鉴定 |
| 4.2.2 杨扇舟蛾颗粒体病毒形态观察与鉴定 |
| 4.2.3 杨扇舟蛾颗粒体病毒PCR 快速检测技术的建立 |
| 4.2.4 杨扇舟蛾颗粒体病毒PCR 快速检测技术的验证 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 第五章 结论与讨论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 讨论 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 文中目的基因的序列 |
| 在读期间学术研究 |
| 致谢 |
（8）美国白蛾NPV与Bt混合致病机理及其对寄主种群持续控制作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.1.1 研究背景 |
| 1.1.2 研究目的和意义 |
| 1.1.3 项目来源与经费支持 |
| 1.2 国内外研究现状与评述 |
| 1.2.1 昆虫病毒学研究概况 |
| 1.2.2 杆状病毒的结构与功能 |
| 1.2.3 杆状病毒基因组 |
| 1.2.4 杆状病毒持续传播 |
| 1.2.5 核型多角体病毒的组织病理和生理生化 |
| 1.2.6 苏云金杆菌的研究进展 |
| 1.2.7 昆虫病原微生物混合感染的研究进展 |
| 1.2.8 免疫组组织化学在昆虫病毒研究中的应用 |
| 1.2.9 美国白蛾核型多角体病毒的研究概况 |
| 1.3 研究目标与内容 |
| 1.3.1 研究思路 |
| 1.3.2 研究目标 |
| 1.3.3 研究内容 |
| 1.4 研究技术路线 |
| 第二章 HcNPV+Bt 对美国白蛾的致病性 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 病原混合感染病征 |
| 2.3.2 混合感染对发病高峰期出现时间的影响 |
| 2.3.3 混合感染中病原的相互作用 |
| 2.3.4 Bt 和HcNPV 混合感染对病原毒力的影响 |
| 2.3.5 Bt 和HcNPV 混合感染对美国白蛾幼虫致死的速效性 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 2.4.1 讨论 |
| 2.4.2 小结 |
| 第三章 HcNPV+Bt 侵染美国白蛾的组织病理学研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 感染病征和症状 |
| 3.3.2 组织病理变化 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第四章 HcNPV+Bt 侵染美国白蛾的超微结构变化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 病征和病状 |
| 4.3.2 细胞病理学变化 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 4.4.1 讨论 |
| 4.4.2 小结 |
| 第五章 HcNPV 侵染寄主免疫组化定位检测 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 免疫组化方法优化 |
| 5.3.2 特异性检验 |
| 5.3.3 病毒多角体的免疫组化检测 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 5.4.1 讨论 |
| 5.4.2 小结 |
| 第六章 HcNPV 对美国白蛾幼虫血淋巴的影响 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 材料 |
| 6.2.2 方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 血淋巴蛋白浓度的变化 |
| 6.3.2 血淋巴蛋白电泳结果 |
| 6.4 讨论与小结 |
| 6.4.1 讨论 |
| 6.4.2 小结 |
| 第七章 HcNPV 对寄主种群的持续控制作用 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料和方法 |
| 7.2.1 材料 |
| 7.2.2 方法 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 病毒对亲代寄主的影响 |
| 7.3.2 HcNPV 对子代寄主的影响 |
| 7.3.3 带毒寄主性别对子代的影响 |
| 7.3.4 HcNPV 经卵表的传播 |
| 7.3.5 不同处理对感病成虫所产卵的孵化、幼虫死亡的影响 |
| 7.3.6 病毒基因组DNA 电泳结果 |
| 7.3.7 病毒基因组DNA 的PCR 扩增 |
| 7.3.8 对美国白蛾卵的检测结果 |
| 7.4 讨论与小结 |
| 7.4.1 讨论 |
| 7.4.2 小结 |
| 第八章 HcNPV 在美国白蛾幼虫中连续传代的研究 |
| 8.1 引言 |
| 8.2 材料与方法 |
| 8.2.1 材料 |
| 8.2.2 方法 |
| 8.3 结果与分析 |
| 8.3.1 传代病毒致死浓度的比较 |
| 8.3.2 传代病毒的半数死亡时间的比较 |
| 8.3.3 病毒的电镜观察 |
| 8.3.4 病毒粒子结构多肽的比较 |
| 8.3.5 基因组酶切 |
| 8.4 讨论与小结 |
| 8.4.1 讨论 |
| 8.4.2 小结 |
| 第九章 HcNPV 不同分离株形态、毒力及基因组的比较研究 |
| 9.1 引言 |
| 9.2 材料与方法 |
| 9.2.1 材料 |
| 9.2.2 实验方法 |
| 9.3 结果与分析 |
| 9.3.1 不同分离株致死浓度的比较 |
| 9.3.2 不同分离株的半数死亡时间的比较 |
| 9.3.3 不同分离株多角体电镜观察结果 |
| 9.3.4 病毒粒子结构多肽的比较 |
| 9.3.5 基因组限制性内切酶图谱的比较 |
| 9.4 小结与讨论 |
| 9.4.1 讨论 |
| 9.4.2 小结 |
| 第十章 结论与讨论 |
| 10.1 结论 |
| 10.2 讨论 |
| 10.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 第三章彩图 |
| 附录Ⅱ 第四章电镜图版 |
| 附录Ⅲ 第五章彩图 |
| 在读期间学术研究 |
| 致谢 |
（9）分月扇舟蛾颗粒体病毒病理、毒力及蛋白基因的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 引言 |
| 1.1.1 研究背景 |
| 1.1.2 研究目的、意义 |
| 1.2 国内外技术现状发展趋向： |
| 1.2.1 分月扇舟蛾的研究概况 |
| 1.2.2 颗粒体病毒(GV)的研究进展 |
| 1.2.3 研究评述 |
| 1.3 研究目标和主要研究内容 |
| 1.3.1 研究目标 |
| 1.3.2 主要研究内容 |
| 1.4 研究技术路线 |
| 第二章 研究材料与方法 |
| 2.1 颗粒体病毒(GV)的超微结构观察 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.2 分月扇舟蛾颗粒体病毒的生物测定 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 试验方法 |
| 2.3 颗粒体病毒的组织病理观察 |
| 2.3.1 试验材料 |
| 2.3.2 试验方法 |
| 2.4 分月扇舟蛾颗粒体病毒蛋白基因的序列测定 |
| 2.4.1 试验材料 |
| 2.4.2 试验方法 |
| 2.5 分月扇舟蛾颗粒体病毒的野外生物防治 |
| 2.5.1 试验地概况 |
| 2.5.2 试验材料 |
| 2.5.3 试验方法 |
| 第三章 结果和分析 |
| 3.1 颗粒体病毒(GV)的超微结构 |
| 3.1.1 结果和分析 |
| 3.1.2 小结 |
| 3.2 分月扇舟蛾颗粒体病毒的生物测定 |
| 3.2.1 结果与分析 |
| 3.2.2 小结 |
| 3.3 颗粒体病毒的组织病理学 |
| 3.3.1 结果与分析 |
| 3.3.2 小结 |
| 3.4 分月扇舟蛾颗粒体病毒蛋白基因的序列测定 |
| 3.4.1 结果和分析 |
| 3.4.2 小结 |
| 3.5 分月扇舟蛾颗粒体病毒林间防治 |
| 3.5.1 结果和分析 |
| 3.5.2 小结 |
| 第四章 结论和讨论 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及参加的科研项目 |
（10）ClanGV的分子生物学特性和棉铃虫PM的研究（论文提纲范文）
| 第1章 引言 |
| 第2章 ClanGV 的基本特性研究 |
| 第3章 ClanGV granulin基因N端区域基因图谱的建立 |
| 第4章 ClanGV granulin基因的分析 |
| 第5 章 棉铃虫中肠围食膜(Peritrophic Membrane, PM)的基本研究 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 发表文章目录 |
| 致谢 |
| 附录 |
四、分月扇舟蛾颗粒体病毒的形态和限制性内切酶图谱分析（论文参考文献）
- [1]ClanGV的PIF0与其他经口感染因子间的互作研究[J]. 梁振普,吴慧,张小霞,张亲,王彩平,刘雅静,张俊庆,桑思瑶. 病毒学报, 2017(02)
- [2]苹果蠹蛾颗粒体病毒对新疆强日照环境的适应性机理及苹果蠹蛾的生物防治[D]. 吴正伟. 西北农林科技大学, 2015(01)
- [3]ClanGV口服感染因子（PIFs）间的分子互作研究[D]. 张亲. 河南农业大学, 2015(04)
- [4]美国白蛾核型多角体病毒的研究进展[J]. 吴立华,靳亮,王金昌,王洪秀. 江西科学, 2014(02)
- [5]两种舟蛾颗粒体病毒的基因组与蛋白质组学研究[D]. 梁振普. 河南农业大学, 2013(12)
- [6]油桐尺蠖核型多角体病毒（BusuNPV）分离株比较及微量检测方法的研究[D]. 陈川. 中国林业科学研究院, 2010(05)
- [7]两种林业昆虫杆状病毒PCR快速检测技术及其应用的研究[D]. 王文欢. 中国林业科学研究院, 2009(01)
- [8]美国白蛾NPV与Bt混合致病机理及其对寄主种群持续控制作用[D]. 段彦丽. 中国林业科学研究院, 2008(04)
- [9]分月扇舟蛾颗粒体病毒病理、毒力及蛋白基因的研究[D]. 李海霞. 中国林业科学研究院, 2006(12)
- [10]ClanGV的分子生物学特性和棉铃虫PM的研究[D]. 张小霞. 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）, 2005(01)