一、改良法培养鼠腹膜间皮细胞（论文文献综述）
李栋[1]（2016）在《人脐带间充质干细胞移植对大鼠腹膜纤维化的修复作用及机制研究》文中指出目的随着经济的发展和人们生活方式的改变,我国慢性肾脏病（CKD）的发病率呈逐年上升趋势,CKD大多起病隐匿,且目前尚缺乏早期诊断和治疗方法,部分患者将进展至终末期肾脏疾病（ESRD）。腹膜透析（PD）是ESRD的主要替代治疗方法之一。然而,腹膜长期暴露于非生理性的腹膜透析液会造成腹膜间皮细胞（PMCs）层损伤、脱落、表型改变、新血管生成增加、细胞外基质沉积和炎细胞浸润,最终导致腹膜纤维化（PF）。PF迄今仍然是一个世界性的难题,尚缺乏有效的防治对策,治疗上主要以预防为主,是导致ESRD患者被迫中断长期腹膜透析的最主要因素,制约了腹膜透析的应用和发展。因此,如何延缓、阻断PF进程,已成为本研究领域的一个亟待解决的重要问题。间充质干细胞（MSCs）来源于发育早期的中胚层和外胚层,属于多能干细胞,在特定的诱导条件下,可修复器官的损伤及治疗器官纤维化。本实验室旨在建立稳定的、标准化的人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）体外培养方法,并且在能够保证hUC-MSCs长期培养的基础上,用于PF的修复研究并对修复机制进行探讨,为hUC-MSCs治疗PD相关PF奠定理论基础,为干细胞在肾脏病领域的应用开拓积累经验。对象与方法取新鲜脐带组织,以组织贴块法对脐带中的hUC-MSCs进行分离、培养、传代,并诱导其向脂肪细胞及成骨细胞分化,以流式细胞仪鉴定所分离的细胞为hUC-MSCs。以甲基乙二醛（MGO）加入2.5%腹膜透析液配置成20mmol/L的混合液,按照10ml/天连续2周腹腔注射上述混合液复制大鼠PF模型。以2×106个hUC-MSCs沿大鼠尾静脉缓慢一次性推入,对PF进行干预。2周后,进行腹膜功能评价,收集腹膜组织进行HE、天狼星红染色,免疫组化观察BMP-7、TGF-β1、E-cadherin、α-SMA、Snail1蛋白在腹膜组织的表达变化。对大鼠腹膜间皮细胞（RPMCs）进行原代培养、鉴定,以2.5 ng/ml TGF-β1处理间皮细胞,并用hUC-MSCs及hUC-MSCs条件培养基（h UC-MSCs-CM）进行干预,Western Blot方法检测E-cadherin、α-SMA、pSmad2的蛋白表达变化,探讨TGF-β1/Smad2通路在hUC-MSCs修复PF过程中所起的作用。结果本实验以组织贴块法成功分离、培养了hUC-MSCs。流式细胞仪检测细胞表面标志物CD105、CD90高表达,分别为98.32%和99.19%,鉴定为hUC-MSCs。MGO对Wistar大鼠腹腔注射两周后,免疫组化分析显示,腹膜组织Snail1、TGF-β1、α-SMA表达明显上调,BMP-7、E-cadherin表达明显下调,经尾静脉注射hUC-MSCs的大鼠,Snail1、TGF-β1、α-SMA表达明显下调,BMP-7、E-cadherin表达明显上调。以TGF-β1刺激RPMCs后,发现α-SMA、pSmad2的蛋白表达明显上调,E-cadherin明显下调,hUC-MSCs及hUC-MSCs-CM进行干预后,α-SMA、pSmad2的蛋白表达明显下调,E-cadherin明显上调。结论我们利用组织贴块法自正常产妇脐带中成功分离出了hUC-MSCs。hUC-MSCs可以抑制MGO诱导的大鼠PF的发生,此作用可能是通过下调BMP-7,改善腹膜组织PMCs的上皮间充质转分化（EMT）实现的。体外实验,hUC-MSCs及hUC-MSCs-CM可以有效抑制TGF-β1诱导的RPMCs的EMT,此作用是hUC-MSCs通过旁分泌机制抑制RPMCs TGF-β1/Smad2信号通路活性实现的。
魏丹[2]（2013）在《Ad-HGF转染大鼠脑膜间皮细胞的效率与细胞活性研究》文中研究表明背景脑膜具有调节神经干／祖细胞（Neural stem/progenitor cell, NSPC）发育、分化与皮质神经再生的重要作用,其可诱导皮层NSPC激活反应和产生神经元,继而转为血管周细胞随微血管深入皮层,对胚胎发育及成年脑损伤后修复具有重要意义。肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor, HGF）为一独立的促血管生成因子,越来越多的研究显示其具有神经营养、促神经发生、血管发生、轴突发生、减少瘢痕形成以及促脑室管膜下区（Subventricular zone, SVZ）神经干细胞增殖、分化作用。我们进行Ad-HGF转染大鼠脑膜间皮细胞（rat meningeal mesothelial cells, RMMCs）的效率与细胞活性研究,期望为明确脑膜间皮细胞和HGF基因两者联合是否具有促血管新生和神经保护的双效作用提供实验基础,从而进一步为临床经蛛网膜下腔应用Ad-HGF治疗老年性缺血性脑血管病提供实验基础和理论依据。目的体外原代培养SD大鼠脑膜间皮细胞并鉴定,用Ad5-EGFP、Ad-HGF转染RMMCs,测定重组腺病毒转染细胞的最佳MOI值,观察转染后细胞上清液中HGF的表达及HGF对RMMCs增殖和迁移能力的影响。方法无菌条件下取出生1-2d SD大鼠的脑膜,采用机械吹打、轻消化法结合组织块培养法原代培养大鼠脑膜间皮细胞,传3代后,通过倒置相差显微镜观察细胞形态,普通光学显微镜观察细胞角蛋白、细胞波形蛋白、第Ⅷ因子相关抗原、抗CD45白细胞共同抗原的免疫细胞化学染色,以及荧光显微镜观察细胞角蛋白的细胞间接免疫荧光染色等三方面进行细胞鉴定：Ad5-EGFP转染脑膜间皮细胞,通过荧光显微镜观察法和流式细胞仪检测法确定重组腺病毒转染细胞的最佳MOI值；通过ELISA法检测Ad-HGF转染细胞的培养上清液中HGF的表达情况；通过MTT法检测HGF对细胞增殖能力的影响；通过细胞划痕实验和Transwells法检测HGF对细胞迁移能力的影响。结果1.倒置相差显微镜下观察RMMCs,细胞呈现梭形、多角形,96h后细胞呈现拉网状生长,7d后细胞呈现典型“铺路石”样外观,细胞大小、形状较为均一,融合度达80%以上。2.细胞角蛋白CK19和波形蛋白Vimentin的免疫细胞化学染色均为（+）,胞浆着色呈棕褐色,细胞第Ⅷ因子相关抗原和抗CD45白细胞共同抗原染色均呈（-）,一抗加入PBS设置阴性对照；细胞角蛋白CK19间接免疫荧光染色为（+）,胞浆呈现绿色荧光。3.Ad5-EGFP转染RMMCs48h后,细胞呈现绿色荧光,随着MOI值的增加,绿色荧光蛋白的表达逐渐增强,MOI=200时表达最强烈,随着病毒MOI值的进一步提高,贴壁细胞成片漂浮、死亡,出现严重的细胞毒性反应；用流式细胞仪检测转染效率,MOI=0时转染效率为0.52%,MOI=25时转染效率为67.37%,MOI=50时转染效率为77.83%,MOI=100时转染效率为89.52%,MOI=200时转染效率为96.21%。4.不同MOI值的Ad-HGF转染RMMCs后48h,随着MOI值的增加,上清液中HGF的表达逐渐增加,HGF的表达量呈一定浓度依赖性,差异有显着性（F=407.851,P<0.001）,当MOI=200时HGF表达量最高,可达97.275±3.035ng/mL;实验组与对照组相比,差异有显着性（t25=4.411,t50=25.263,t100=39.022,t200=56.625,P均<0.05）。5.Ad-HGF以MOI=200转染RMMCs后连续收集培养上清,显示HGF的表达量呈一定时间依赖性,差异有显着性（F=384.063,P<0.001）,HGF可在短期内高效表达,48h达高峰,峰值为104.275±2.356ng/mL,随着时间的延长,HGF表达量开始下降,第10d下降明显,随后维持在一个相对稳定的水平：实验组与对照组相比,差异有显着性（t2=82.359,t4=138.945,t6=51.572,t8=38.118,t10=22.682,t12=54.835,t14=8.590,P均<0.01）。6.随着培养液中Ad-HGF转染上清体积百分数的增加,细胞的OD值逐渐增加,这种促细胞增殖能力呈一定浓度依赖性,差异有显着性（F=285.946,P<0.001）；实验组与对照组相比,差异有显着性（t25=6.629,t50=9.993,t75=18.236,h00=29.109,P均<0.01）。7.划痕实验后于MOI=100的Ad-HGF培养上清中培养48h后,细胞受损边缘带见少数散在的迁移出来的RMMCs;Transwells细胞迁移实验见PVPE膜上大量被结晶紫染色的RMMCs;随机选取400倍视野下细胞迁移的数量进行比较,实验组与对照组相比,差异有显着性（t=34.135,P<0.001）。结论1.采用机械吹打、轻消化法结合组织块培养法可以成功获得纯度>96%的大鼠脑膜间皮细胞。2.重组腺病毒可以高效转染大鼠脑膜间皮细胞,其转染细胞的最佳MOI值为200。3.转染后HGF基因可以在大鼠脑膜间皮细胞中有效表达,HGF具有促进大鼠脑膜间皮细胞增殖和迁移的作用。
马姝琛,严海东,庄守纲,兰洋,张瑞青,王奕[3]（2012）在《大鼠腹膜间皮细胞的分离培养方法》文中指出目的建立简便有效的大鼠腹膜间皮细胞（passage of rat peritoneal mesothelial cells,RPMC）的体外培养方法。方法采用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化大鼠大网膜及脾胃韧带,细胞悬液进行离心培养,沉淀重悬后进行培养。通过形态学、免疫荧光、免疫组化法鉴定细胞。结果分离培养的细胞在光镜下呈铺路鹅卵石状,免疫荧光鉴定显示细胞角蛋白阳性,免疫组化鉴定显示波形蛋白抗原阳性,第Ⅷ因子、白细胞CD45抗原阴性,证实培养的细胞为RPMC。结论胰蛋白酶消化法是一种简便而实用的分离RPMC的方法。
李孟慧[4]（2012）在《腹膜间皮细胞及转化生长因子在子宫内膜异位症粘连中作用研究》文中指出盆腹腔粘连是子宫内膜异位症（以下简称内异症）最常见的表现之一,是造成内异症患者疼痛、不孕等的常见原因,也是造成手术困难和手术风险升高的重要原因。内异症造成粘连的主要特点包括：1粘连发生率高：80%以上的初治患者存在不同程度的盆腔粘连,而复发性内异症,粘连的机会几乎100%；2粘连程度重：内异症造成的粘连多为致密性的粘连,往往导致盆腔各个器官组织解剖结构不清,手术风险增大；3粘连造成的盆腔解剖变异,可以造成严重的后果如疼痛,不育和包裹性积液；4术后粘连再形成发生率高,使得再次手术的风险进一步增大。内异症粘连形成机制目前尚不明确。因此,研究内异症粘连的发生及其相关因素,对进一步理解内异症的发生机制以及寻求有效的预防粘连的方法将有积极的意义。腹膜由表面的单层间皮细胞及其下的结缔组织构成。正常的腹膜修复过程是：当腹膜受到创伤时,表面的间皮细胞坏死脱落,暴露出结缔组织；局部的炎症反应和血液凝集释放的趋化因子,将损伤部位周围的正常间皮细胞和间皮母细胞新生的间皮细胞,吸引到受损伤的部位,从而在受损伤的腹膜表面形成多个间皮细胞岛；在纤溶作用的促进下,这些间皮细胞进一步分裂、增殖并覆盖受损伤的腹膜表面,完成间皮化,形成新的腹膜。因此,腹膜的损伤愈合包括炎症、凝血、血管化、纤维化、细胞外基质沉积、上皮化和创面挛缩等多个步骤,而周围间皮细胞的增殖对于腹膜修复具有重要作用。上述过程的失衡就会导致损伤修复的障碍,并导致粘连的形成。腹膜间皮细胞、腹腔液及其中多种类型的细胞、细胞因子等构成的腹腔微环境对内异症病灶发生、发展及疾病相关的临床症状具有一定的作用。目前诸多相关研究亦证实了内异症患者腹腔微环境的改变,且认为盆腔内异症发病机制不仅涉及到随经血逆流进入盆腹腔的子宫内膜碎片及其特性的变化,而且还涉及到盆腹腔微环境中的细胞及细胞因子对异位内膜细胞生长产生的相关作用。腹膜间皮细胞在腹膜损伤、修复及粘连形成机制中的具有重要作用。腹膜间皮细胞,对维持腹膜结构完整性及维持腹膜局部纤溶活性起到重要作用,任何因素对腹膜的刺激,引起腹膜间皮细胞的改变均可能导致腹膜粘连的形成。转化生长因子-β（TGF-β）作为一类多功能的细胞因子,具有调节细胞生长分化等多种作用,且与多种纤维病变的发生、发展有关。腹腔液中巨噬细胞、子宫内膜基质细胞等均可产生、分泌TGF-β。哺乳动物的TGF-D有3型,即TGF-β1,TGF-p2,TGF-p3,三者功能相似且互相依赖,其中TGF-β1被认为是参与纤维化形成的主要细胞因子,能够促进细胞外基质中各种成分如胶原蛋白、纤维连接蛋白等合成的增多及促进新生血管的形成。TGF-β1经过活化后与其特异性的细胞表面受体结合,通过胞内信号途径的逐级磷酸化过程启动多种Smad成分,参与组织的纤维化形成。TGF-β1亦是一种强效的炎性趋化因子和免疫抑制物,具有调节细胞生长、诱导及刺激人单核细胞及巨噬细胞趋化,是纤维形成和新生血管形成的诱导物；能够显着抑制T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞功能,具有显着的免疫调节功能,在组织修复过程中是一种重要的细胞调节因子。Oosterlynck等发现内异症患者腹腔液NK细胞活性降低,而腹腔液中TGF-β1水平升高,认为内异症患者腹腔液NK细胞活性降低与TGF-β1活性升高有关,这亦提示TGF-β1与内异症的发生、发展具有一定相关性。近年来我院郎景和教授总负责的课题组对在位内膜在内异症发病机制中的作用进行了系统的研究,取得了一些重大突破：系统的论证了内异症在位内膜在粘附、侵袭、血管形成、致炎性反应等多方面与正常子宫内膜相比,具有诸如超微结构、基因、表达产物和机能状态的差异。因此我们认为内异症患者返流至盆腔的子宫内膜细胞对腹膜间皮细胞产生影响,使得腹膜结构发生异常而影响腹膜正常修复机制,导致腹膜粘连形成。那么内异症和非内异症患者腹膜间皮细胞之间有何功能差异、TGF-β1对腹膜间皮细胞有何作用、雌孕激素对TGF-β1有何影响、TGF-β1中和性抗体的应用能否对异位症病灶的发生、发展及粘连形成有作用,针对以上一系列问题进行以下临床基础研究。研究目的1.探讨内异症患者腹膜间皮细胞与正常腹膜间皮细胞差异。2.探讨TGF-β1对腹膜间皮细胞生长活性及细胞周期影响。3.探讨雌、孕激素对体外培养腹膜间皮细胞TGF-β1、smad3/7表达的影响。4.探讨盆腹腔内异症裸鼠模型中TGF-β1抗体对裸鼠腹腔内异症病灶及粘连形成的影响。研究方法1.体外培养腹膜间皮细胞,并行细胞免疫组化及流式细胞鉴定分析。2.MTT法检测TGF-β1对腹膜间皮细胞生长活性影响：相同浓度TGF-β1、不同作用时间对于腹膜间皮细胞生长活性的影响；不同浓度TGF-β1、同一作用时间对于腹膜间皮细胞生长活性的影响。3.流式细胞技术检测TGF-β1对腹膜间皮细胞周期影响：相同浓度TGF-β1、不同作用时间对于腹膜间皮细胞周期的影响；相同作用时间、不同浓度TGF-β1对于腹膜间皮细胞周期的影响。4.采用细胞免疫组化法、Real time-PCR、Western blot检测雌、孕激素对体外培养腹膜间皮细胞TGF-β1及Smad3、7表达的影响。5.建立盆腹腔内异症裸鼠模型；以TGF-β1抗体作用于内异症裸鼠模型,观察裸鼠内异症病灶及粘连形成情况。结果1.采用侧盆壁肉眼观察正常腹膜组织,体外成功分离、培养内异症腹膜间皮细胞,而正常腹膜间皮细胞不易体外培养；低浓度胰酶、短时消化是获得良好均一性腹膜间皮细胞的适宜处理条件2.TGF-β1对腹膜间皮细胞生长活性具有抑制作用,并表现出浓度依赖性。TGF-β1浓度≤2.5ng/ml时,TGF-β1降低腹膜间皮细胞的活性。TGF-β1>2.5ng/ml时,TGF-β1降低腹膜间皮细胞生长活性的作用逐渐减弱。3.TGF-β1对腹膜间皮细胞的增殖具有抑制作用,并表现出浓度依赖性。TGF-β1浓度至2.5ng/ml时,TGF-β1抑制抑制腹膜间皮细胞增殖作用。TGF-β1>2.5ng/ml时,TGF-β1抑制腹膜间皮细胞增殖的作用逐渐减弱。4.不同浓度雌激素促进腹膜间皮细胞TGF-β1和Smad3、Smad7的表达,具有浓度依赖性。5.不同浓度孕激素能抑制正常腹膜间皮细胞TGF-β1表达,促进内异症组腹膜间皮细胞TGF-β1的表达6.成功建立子宫内膜异位症裸鼠模型；TGF-β1抗体作用于内异症裸鼠模型可以降低裸鼠内异症病灶发生率；但没有明显减轻病灶处粘连形成程度。结论1.对于肉眼观察正常腹膜组织的腹膜间皮细胞,内异症组较对照组体外培养更容易,提示内异症腹膜间皮细胞对体外环境适应性增强。2.TGF-β1抑制腹膜间皮细胞生长活性及细胞周期,提示内异症腹腔环境中的细胞因子对腹膜间皮细胞产生影响,引起腹膜间皮细胞的功能异常,可能是粘连形成中的一个重要的环节。3.不同浓度雌孕激素影响TGF-β/Smad相关蛋白表达,雌激素对腹膜间皮细胞TGF-β1和Smad3、Smad7的表达具有一定的促进作用,而孕激素能够降低正常腹膜间皮细胞TGF-β1的表达,对内异症腹膜间皮细胞TGF-β1的表达具有促进作用,提示激素在内异症粘连形成可能起到重要作用。4.TGF-β1抗体可以降低内异症粘连的发生率；但对病灶粘连程度的减轻没有明显作用,提示TGF-β1可能是内异症粘连形成的早期阶段的启动环节,TGF-β1抗体通过阻断TGF-β1对腹膜间皮细胞活性以及增殖的抑制作用从而可以降低粘连的发生,TGF-β1可能成为在预防内异症粘连中具有临床治疗前景的干预靶点,值得进一步深入研究。
周循,凌光辉,邹莎琳,段绍斌,肖力,孙林,刘伏友[5]（2010）在《腹膜透析流出液中人腹膜间皮细胞的培养及转分化特征》文中提出目的建立从腹膜透析（PD）流出液中分离、培养人腹膜间皮细胞（HPMC）的方法,并检测上皮黏附连接蛋白E-cadherin、紧密连接蛋白claudin-1及间充质细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达水平。方法从25例持续不卧床腹膜透析（CAPD）患者PD流出液中分离HPMC,并在体外进行原代培养。根据开始透析的时间分为新开管组（10例）和透析半年以上组（15例）。采用倒置相差显微镜、免疫组织化学染色和扫描电镜对培养的细胞进行鉴定;采用实时定量PCR检测细胞E-cadherin、claudin-1及α-SMAmRNA表达。结果 22例患者（新开管组10例,半年以上组12例）PD流出液分离的细胞在体外培养成活,经鉴定均具有HPMC的特征。实时定量PCR结果显示,半年以上组较新开管组分离的HPMC细胞E-cadherin、claudin-1 mRNA表达降低,α-SMA mRNA表达增高（P<0.05）,提示出现了间充质细胞转分化（EMT）。结论该研究成功建立了PD流出液分离培养原代HPMC的方法,并证实长期PD患者HPMC存在EMT倾向。该研究的发现为进一步研究腹膜纤维化（PF）和超滤衰竭（UFF）提供了新的方法与实验依据。
王沛靓,吴晓平[6]（2010）在《人正常腹膜间皮细胞原代培养方法》文中研究表明目的探讨人正常腹膜间皮细胞原代培养方法。方法以胰酶和乙二胺四乙酸磁性搅拌分离人正常腹膜间皮细胞,倒置相差显微镜观察细胞形态结构和大体生长过程,Calretinin免疫荧光染色鉴定间皮细胞,初步观察传代细胞的贴壁生长情况。结果培养第4天细胞贴壁良好,第15天呈铺路石状、生长良好,1个月时细胞密集铺满皿壁;腹膜间皮细胞Calretinin表达都呈阳性;传代腹膜间皮细胞数量显着减少。结论磁性搅拌酶分离培养可得到数量多、纯度高的原代人正常腹膜间皮细胞,能够满足一般实验要求。
谢艺,崔华雷,王晓晔,董亮,杨宏[7]（2009）在《丹皮酚体外诱导间皮细胞增殖及分泌t-PA的研究》文中研究指明目的:探讨丹皮酚影响下离体间皮细胞的增殖及分泌组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）的情况。方法:取10只健康Wistar大鼠用于培养间皮细胞,将离体大鼠腹膜间皮细胞平均分为4组,分别加入细胞培养液RPMI-1640,RPMI-1640+TNF-α,RPMI-1640+丹皮酚,RPMI-1640+TNF-α+丹皮酚。测定各培养液中间皮细胞增殖情况及其分泌t-PA的量。结果:单独使用丹皮酚不影响间皮细胞的增殖和t-PA分泌的量（P>0.05）,单独使用TNF-α可以抑制间皮细胞进入增殖状态（P<0.05）,而并不影响t-PA的分泌（P>0.05）,加入丹皮酚的干预后间皮细胞的增殖率明显升高,并上调t-PA的分泌（P<0.05）。结论:TNF-α可以抑制间皮细胞增殖,丹皮酚对活化的间皮细胞增殖、分泌有上调作用,丹皮酚可能在一定程度上促进损伤的腹膜早期愈合。
魏丽红,韩素改,李彤[8]（2009）在《改良法体外培养大鼠脑膜间皮细胞》文中研究指明建立大鼠脑膜间皮细胞（rat meningeal mesothelial cells,RMMC）的体外原代培养模型。用机械吹打法和0.25%胰酶-0.01%EDTA轻消化法收集原代细胞,多次差速黏附处理及传代。传三代,分别进行倒置相差显微镜观察细胞大体结构、扫描电镜（SEM）观察细胞超微结构、苏木素伊红（HE）染色法观察细胞形态、细胞免疫荧光法及免疫细胞化学法鉴定细胞。结果显示:分离培养的原代细胞在倒置显微镜下为多边形,汇合时呈铺路石样排列;SEM下细胞表面可见大量密集的微绒毛;免疫荧光染色结果显示培养细胞呈细胞角蛋白抗原阳性;免疫细胞化学结果显示培养细胞呈细胞角蛋白和波形蛋白抗原阳性,第Ⅷ因子相关抗原阴性,培养细胞的纯度达96%以上。结论:本实验成功建立了RMMC培养模型,可为脑膜纤维化的形成机制研究提供理想的细胞模型。
李婷,江森[9]（2009）在《人腹膜间皮细胞的优化原代培养》文中认为
沈培[10]（2009）在《HepA-H肝癌细胞腹膜转移过程中间皮细胞和淋巴孔的形态学研究》文中研究指明研究背景:间皮细胞覆盖在浆膜腔及腔内脏器的表面,具有屏障、免疫、物质转运等功能。淋巴孔是毛细淋巴管在浆膜间皮细胞之间的微小开口,通过淋巴孔,浆膜腔与淋巴管系直接相通。淋巴孔具有物质吸收、免疫等功能。肿瘤腹膜转移一般经历细胞游离、粘附、侵袭、生长四个阶段。在肿瘤腹膜转移时,间皮细胞和淋巴孔形态会发生改变。研究目的:研究腹腔接种肿瘤细胞后,膈腹膜、肠系膜上的间皮细胞及淋巴孔在肿瘤腹膜转移过程中不同时期的变化,探讨间皮细胞及淋巴孔在肿瘤腹膜转移过程中发挥的作用。研究方法:小鼠腹腔接种HeA-H细胞后,每天记录体重增长状况,以确定收集腹水的时间点。接种后每两天取一次膈腹膜及肠系膜,扫描电镜观察腹腔接种肿瘤细胞后膈腹膜和肠系膜上间皮细胞及淋巴孔在不同时期的变化。扫描电镜观察用腹水连续处理后膈腹膜和肠系膜间皮细胞及淋巴孔的变化。以Boyden小室法研究HepA-H细胞侵袭能力。以ELISA法测定腹水中VEGF含量。肠系膜消化法培养间皮细胞,建立间皮细胞体外培养体系,为肿瘤转移过程中间皮细胞和淋巴孔的体外研究建立基础。研究结果:小鼠腹腔接种HepA-H肿瘤细胞后,体重较对照组有明显增长,第11天后体重增长减缓,第14天后出现死亡。研究发现肿瘤腹膜转移过程中间皮细胞发生明显肿胀,淋巴孔开放数目增加,孔中可见肿瘤细胞。腹水连续处理后,较之对照组,膈腹膜及肠系膜上淋巴孔开放明显增加,膈腹膜间皮细胞肿胀,绒毛增生,肠系膜间皮细胞边界出现明显微绒毛。Boyden小室测定HepA-H细胞侵袭能力为23.4±1.5%。腹水中VEGF含量为5.43±0.23ng/ml。从细胞形态及免疫荧光两方面的检测,确定肠系膜消化法培养之细胞为间皮细胞。结论:膈腹膜间皮细胞在HepA-H肝癌细胞腹膜转移过程中,细胞体肿胀,间皮细胞间隙增大,微绒毛增生,肿瘤细胞种植于间皮细胞之间。肠系膜间皮细胞形态变化不大,后期可见结节状肿瘤细胞。肿瘤细胞可通过淋巴孔传播。
二、改良法培养鼠腹膜间皮细胞（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、改良法培养鼠腹膜间皮细胞（论文提纲范文）
（1）人脐带间充质干细胞移植对大鼠腹膜纤维化的修复作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、人脐带间充质干细胞原代培养及鉴定 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 对象 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 hUC-MSCs的形态学观察 |
| 1.2.2 hUC-MSCs的成脂诱导分化 |
| 1.2.3 hUC-MSCs的成骨诱导分化 |
| 1.2.4 hUC-MSCs的染色体核型鉴定 |
| 1.2.5 hUC-MSCs的细胞表型检测 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、人脐带间充质干细胞移植对大鼠腹膜纤维化的修复作用 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 对象 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 hUC-MSCs对PF大鼠腹膜功能的影响 |
| 2.2.2 hUC-MSCs对大鼠腹膜形态学改变的影响 |
| 2.2.3 hUC-MSCs对PF大鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 大鼠腹膜纤维化模型的建立及hUC-MSCs的干预 |
| 2.3.2 hUC-MSCs对腹膜纤维化大鼠治疗未见免疫排斥反应 |
| 2.3.3 hUC-MSCs对腹膜纤维化大鼠抗纤维化的作用途径 |
| 2.4 小结 |
| 三、人脐带间充质干细胞移植对大鼠腹膜纤维化的修复机制 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 对象 |
| 3.1.1.1 实验动物 |
| 3.1.1.2 实验组织 |
| 3.1.1.3 实验细胞 |
| 3.1.1.4 主要试剂 |
| 3.1.1.5 主要仪器 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 免疫组化染色 |
| 3.1.2.2 免疫组化分析 |
| 3.1.2.3 hUC-MSCs的复苏、传代 |
| 3.1.2.4 原代RPMCs的分离、培养、传代、鉴定、分组 |
| 3.1.2.5 细胞总蛋白的提取 |
| 3.1.2.6 细胞总蛋白浓度的检测 |
| 3.1.2.7 Western Blot检测 |
| 3.1.2.8 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 大鼠腹膜组织BMP-7 的表达及半定量分析结果 |
| 3.2.2 大鼠腹膜组织TGF-β1 的表达及半定量分析结果 |
| 3.2.3 大鼠腹膜组织E-cadherin的表达及半定量分析结果 |
| 3.2.4 大鼠腹膜组织α-SMA的表达及半定量分析结果 |
| 3.2.5 大鼠腹膜组织Snail1的表达及半定量分析结果 |
| 3.2.6 RPMCs的鉴定 |
| 3.2.7 hUC-MSCs对RPMCs EMT的抑制作用 |
| 3.2.8 hUC-MSCs对RPMCs pSmad2的抑制作用 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 hUC-MSCs通过抑制EMT改善大鼠腹膜纤维化 |
| 3.3.2 hUC-MSCs通过抑制TGF-β1/Smad2通路改善RPMCs的EMT |
| 3.3.3 hUC-MSCs抑制TGF-β1/Smad2通路的可能机制 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附图 |
| 综述 microRNA与腹膜纤维化 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）Ad-HGF转染大鼠脑膜间皮细胞的效率与细胞活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.5.1 大鼠脑膜间皮细胞的体外培养 |
| 1.5.2 大鼠脑膜间皮细胞的鉴定 |
| 1.5.3 Ad5-EGFP转染大鼠脑膜间皮细胞的最佳MOI值测定 |
| 1.5.4 酶联免疫吸附法(ELISA)对HGF的表达进行测定 |
| 1.5.5 噻唑兰(MTT)比色法对Ad-HGF转染后大鼠脑膜间皮细胞增殖能力的测定 |
| 1.5.6 Ad-HGF转染后大鼠脑膜间皮细胞迁移能力的测定 |
| 1.6 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 大鼠脑膜间皮细胞的体外培养 |
| 2.1.1 脑膜间皮细胞原代培养及倒置相差显微镜下细胞形态学观察 |
| 2.1.2 大鼠脑膜间皮细胞传代培养 |
| 2.2 大鼠脑膜间皮细胞的鉴定 |
| 2.2.1 倒置相差显微镜下观察细胞形态 |
| 2.2.2 免疫细胞化学染色法鉴定结果 |
| 2.2.3 细胞间接免疫荧光染色法鉴定结果 |
| 2.3 Ad5-EGFP转染大鼠脑膜间皮细胞最佳MOI值测定结果 |
| 2.3.1 荧光显微镜观察法测定结果 |
| 2.3.2 流式细胞仪检测法测定结果 |
| 2.4 酶联免疫吸附法对HGF表达的测定结果 |
| 2.4.1 标准曲线绘制 |
| 2.4.2 不同MOI值的Ad-HGF转染脑膜间皮细胞后48h上清液中HGF含量测定结果 |
| 2.4.3 Ad-HGF转染脑膜间皮细胞后不同时间点条件培养液中HGF含量测定结果 |
| 2.5 MTT比色法对Ad-HGF转染后脑膜间皮细胞增殖能力测定结果 |
| 2.6 Ad-HGF转染后大鼠脑膜间皮细胞迁移能力测定结果 |
| 2.6.1 细胞划痕实验结果 |
| 2.6.2 Transwells细胞迁移实验结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 脑膜间皮细胞的分离培养和扩增 |
| 3.1.1 脑膜间皮细胞的概念 |
| 3.1.2 脑膜在中枢神经系统促神经发育、分化和皮质神经再生的功能研究 |
| 3.1.3 大鼠脑膜间皮细胞的培养与鉴定 |
| 3.2 Ad-HGF转染脑膜间皮细胞的效率及对细胞增殖、迁移能力的影响 |
| 3.2.1 HGF的基本性状及生物学功能 |
| 3.2.2 基因转染载体的选择 |
| 3.2.3 本课题结果分析 |
| 4 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述：HGF基因治疗缺血性脑血管病的实验研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）腹膜间皮细胞及转化生长因子在子宫内膜异位症粘连中作用研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 腹膜间皮细胞体外培养的探索 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 TGF-β1对腹膜间皮细胞的作用 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 雌、孕激素对腹膜间皮细胞TGF-β1及其信号蛋白表达的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 子宫内膜异位症裸鼠模型中TGF-β1抗体对子宫内膜异位灶及粘连形成的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 参考文献 |
| 全文小结及展望 |
| 文献综述 子宫内膜异位症粘连形成的分子机制 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）腹膜透析流出液中人腹膜间皮细胞的培养及转分化特征（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 标本来源 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 HP MC的分离与培养 |
| 1.4 HP MC的传代培养 |
| 1.5 HP MC的鉴定 |
| 1.5.1 免疫组织化学 |
| 1.5.2 扫描电镜 |
| 1.6 实时定量P CR (Re a ltime P CR) 检测E-ca d-herin、claudin-1及α-SMA m RNA的表达 |
| 1.6.1 细胞总R N A的提取与鉴定 |
| 1.6.2 c DN A合成 |
| 1.6.3 PCR扩增 |
| 1.7 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 P D流出液培养的HP MC的鉴定 |
| 2.2 不同透析时间患者P D流出液培养的HP MC形态学改变 |
| 2.3 实时定量P CR检测结果 |
| 3 讨论 |
（7）丹皮酚体外诱导间皮细胞增殖及分泌t-PA的研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与分组 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
（9）人腹膜间皮细胞的优化原代培养（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 资料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 间皮细胞原代培养 |
| 1.2.2 间皮细胞的鉴定 |
| 1.2.3 含不同组分的培养基对间皮细胞生长的研究 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结 果 |
| 2.1 间皮细胞生长情况 |
| 2.2 培养细胞鉴定结果 |
| 2.2.1 HE染色结果 |
| 2.2.2 超微结构 |
| 2.2.3 免疫组化的鉴定结果 |
| 2.3 不同成分的培养液对间皮细胞生长的影响 |
| 3 讨 论 |
| 3.1 间皮细胞在卵巢肿瘤侵袭转移研究中的意义 |
| 3.2 NH4Cl破碎红细胞法对传统培养方法的改良 |
| 3.3 间皮细胞培养基中辅助成份的优化筛选 |
（10）HepA-H肝癌细胞腹膜转移过程中间皮细胞和淋巴孔的形态学研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 研究材料 |
| 2.1.4 相关试剂配制 |
| 1.2 研究方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 HepA-H细胞培养及荷瘤小鼠体重曲线 |
| 3.2 小鼠腹腔巨噬细胞形态观察 |
| 3.3 HepA-H肝癌腹水瘤细胞腹膜转移过程中间皮细胞及淋巴孔形态学观察 |
| 3.4 腹水对间皮细胞和淋巴孔的影响 |
| 3.5 HepA-H侵袭能力检测 |
| 3.6 腹水中VEGF的测定 |
| 3.7 小鼠肠系膜间皮细胞体外培养及鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 作者简历 |
四、改良法培养鼠腹膜间皮细胞（论文参考文献）
- [1]人脐带间充质干细胞移植对大鼠腹膜纤维化的修复作用及机制研究[D]. 李栋. 天津医科大学, 2016(02)
- [2]Ad-HGF转染大鼠脑膜间皮细胞的效率与细胞活性研究[D]. 魏丹. 新乡医学院, 2013(06)
- [3]大鼠腹膜间皮细胞的分离培养方法[J]. 马姝琛,严海东,庄守纲,兰洋,张瑞青,王奕. 同济大学学报(医学版), 2012(06)
- [4]腹膜间皮细胞及转化生长因子在子宫内膜异位症粘连中作用研究[D]. 李孟慧. 北京协和医学院, 2012(12)
- [5]腹膜透析流出液中人腹膜间皮细胞的培养及转分化特征[J]. 周循,凌光辉,邹莎琳,段绍斌,肖力,孙林,刘伏友. 中国现代医学杂志, 2010(17)
- [6]人正常腹膜间皮细胞原代培养方法[J]. 王沛靓,吴晓平. 中国普外基础与临床杂志, 2010(01)
- [7]丹皮酚体外诱导间皮细胞增殖及分泌t-PA的研究[J]. 谢艺,崔华雷,王晓晔,董亮,杨宏. 天津医药, 2009(09)
- [8]改良法体外培养大鼠脑膜间皮细胞[J]. 魏丽红,韩素改,李彤. 神经解剖学杂志, 2009(04)
- [9]人腹膜间皮细胞的优化原代培养[J]. 李婷,江森. 现代妇产科进展, 2009(05)
- [10]HepA-H肝癌细胞腹膜转移过程中间皮细胞和淋巴孔的形态学研究[D]. 沈培. 浙江大学, 2009(10)