一、心脏发育的基因调控（论文文献综述）
王光斌[1]（2021）在《复杂心脏疾病相关的miRNA调控网络与模块识别研究》文中研究指明研究表明,心血管疾病是心血管系统基因失调导致的结果,而微小RNA（micro RNA,简称miRNA）在其疾病发生、发展过程中扮演着重要角色。miRNA识别复杂心脏疾病相关的重要生物标记物和生物特征有助于理解复杂心脏疾病的发生和发展机制,能够为疾病的诊断、治疗和预后提供帮助。本文主要选取瓣膜性心脏病合并房颤（Valvular Heart Disease with Atrial Fibrillation,AF-VHD）、肥厚型心肌疾病（Hypertrophic Cardiomyopathy,HCM）和法洛氏四联症（Tetralogy of Fallot,TOF）三类复杂心脏疾病作为研究对象,基于微阵列表达谱数据识别miRNA关联的调控网络和模块,从分子水平上研究复杂心脏疾病的生物特征,为理解其发病机制提供参考。本文主要研究内容包括:（1）基于差异共表达网络识别的miRNAs组合在AF-VHD中的潜在作用研究。首先从miRNA转录表达数据中筛选差异表达miRNAs;然后基于差异表达miRNAs,计算皮尔逊相关系数,设定阈值从而构建AF-VHD和对照组的miRNA共表达网络;通过比对两个网络的连接关系识别AF-VHD与对照组之间的差异miRNA共表达网络,从中识别AF-VHD特异性miRNAs及其组合模式。这种识别AF-VHD特异性miRNAs及其组合的方法既考虑了病例-对照组间差异,又考虑了组内差异,可以更加充分揭示上下文特异性的相互作用,滤除分子间非特异性的相互作用。最后,采用富集分析推断AF-VHD特异性miRNA组合的功能及其介导的信号通路,揭示它们在AF-VHD发生与发展中的作用。研究结果表明,47个miRNAs在AF-VHD与VHD之间差异表达,结合与AF-VHD相关的169个差异表达基因,验证32个差异表达的miRNAs被识别为AF-VHD特异性miRNAs,构建5个miRNA组合。通过实时荧光定量PCR验证AF-VHD特异性miRNAs的差异表达性和可靠性。另外,对组合中的miRNA,融合Target Scan、miRcode和Pic Tar三个数据库预测共同的靶向基因。基因富集结果表明,5个miRNA组合介导了12条信号通路。这些结果表明,miRNA组合介导的信号通路与AF-VHD的发生与发展密切相关,为理解AF-VHD发展机制提供了参考。（2）HCM疾病相关miRNA海绵互作网络识别研究。提出了一种从异质数据中识别circ RNA相关miRNA海绵互作网络的技术框架（circ Sponge）。利用circ Sponge框架,基于HCM关联的circ RNA与m RNA表达谱,和miRNA靶向公共数据库确立miRNA-m RNA和miRNA-circ RNA调控关系;再结合正向相关算法（Positive Correlation,PC）算法构建miRNA海绵互作网络（包含circ RNAcirc RNA、m RNA-m RNA和circ RNA-m RNA三种相互作用关系）。采用该技术框架,共识别出562个circ RNAs和179个m RNAs差异表达。构建的miRNA海绵互作网络包含249个circ RNAs和121个m RNAs所组成的8,146个miRNA海绵互作对（circ RNA-circ RNA、m RNA-m RNA和circ RNA-m RNA关系对分别是6,794、436和916对）。利用已有研究证据分析上述结果可知,miRNA海绵互作网络中涉及到的circ RNAs和m RNAs与HCM的发生发展存在关联,为研究miRNA海绵在HCM疾病中的作用提供了参考。（3）TOF相关的miRNAs调控网络和调控模块识别研究。提出了一个名为miRReg的框架来研究miRNA调控机制。miRReg被用来挖掘miRNA直接和间接调控网络,并在miRNA调控网络基础上,进一步识别miRNA直接和间接调控模块。从TOF关联的miRNA和m RNA表达谱中,miRReg识别了1565个miRNAm RNA调控关系对,266个miRNA海绵互作关系对,12个miRNA-m RNA调控模块和6个miRNA海绵模块。功能分析表明,4个miRNA-m RNA调控模块和3个miRNA海绵模块与TOF疾病显着相关。这说明miRReg识别的miRNA直接或间接调控网络和模块与TOF疾病存在关联,为理解TOF疾病的分子机制提供了新思路和新方法。本文考虑了miRNA-miRNA的协同作用,分析了miRNA组合在VHD和AFVHD的网络水平变化。另外,考虑了miRNA-circ RNA和miRNA-m RNA调控关系,并在HCM中建立了复杂的circ RNA关联miRNA海绵互作网络。进而,分别探讨了miRNA直接和间接调控网络与模块与TOF关联性。总之,本文研究工作为探索复杂心脏疾病中miRNA关联的调控机制提供了新视角。
窦嘉佳[2]（2020）在《ATAC测序鉴定牦牛基因组非编码保守元件》文中研究表明非编码保守元件（conserved non-coding elements,CNEs）是指在基因组中不编码蛋白质、也不编码rRNA或tRNA,但是在进化过程中极为保守的非编码序列。CNEs普遍存在于基因组中,多聚集在发育相关基因附近,在基因组中扮演着多种调控元件角色,直接或间接参与基因表达调控,影响物种的发育、表型和适应性进化。牦牛作为青藏高原特有畜种,对青藏高原的极端环境具有极强的适应能力。近来多组学研究已经从不同层面对牦牛的高原适应机制进行了研究,鉴定到一批与高原适应性相关的基因,但是相关的调控元件及其调控机制仍然缺乏系统研究。本论文通过比较基因组学鉴定牦牛基因组CNEs,并对牦牛心脏组织进行ATAC测序揭示全基因组中具有调控活性的序列,最后综合鉴定在牦牛基因组中与高原适应性相关的保守调控元件,为理解牦牛高原适应机制提供新的候选元件和新视角。首先,基于比较基因组学的方法对牛科的黄牛、欧洲野牛、北美野牛、瘤牛、大额牛、水牛、牦牛七个物种基因组序列进行多重比对,基于PhastCons软件,鉴定了3,653个具有调控功能的候选非编码保守元件,对这些CNEs附近的基因进行GO富集分析,发现有富集在出芽式血管生成、胚胎心血管发育以及血管内皮生长因子等与高原适应相关的通路上;进一步对这些CNEs相关基因进行功能注释,发现有33个与高原适应性相关,包括已被报道的与缺氧诱导途径相关基因ARNT、与血管内皮生成相关基因ANGPTL4、VAV3以及与心脏调节相关基因CAMK2D。这些CNEs可能参与调控以上基因的表达调控,从而在牦牛适应高原极端环境中发挥重要作用。其次,使用ATAC-seq技术对三个牦牛心脏组织进行了全基因组染色质开放区测序,共产生28G的原始数据,平均产出216,178,322条原始reads。进行质控和比对之后,在三个样本中共获得具有调控活性的332,265个peak,其中超过60%的peak落在基因间区,超过20%的peak落在内含子区域,表明数据质量较高且鉴定出的染色质开放区域具有功能性。最后,通过整合比较基因组鉴定的非编码保守元件和ATAC-seq的分析结果,共获得具有调控功能的252个CNEs。这些CNEs不仅是牦牛基因组中最保守的序列,而且有心脏ATAC数据的支持,因而可能具有重要的功能。对这些CNE附近的基因进行富集分析,发现主要与氧活性反应、单加氧酶活性调节、一氧化氮合酶活性调节、心脏收缩调节、以及血管紧张素受体活性等功能相关,表明这部分CNEs极有可能作为重要功能元件在牦牛适应高原环境中参与靶基因的调控表达。本研究通过比较基因组学手段系统地鉴定了牦牛基因组CNEs,借助ATAC测序技术构建了牦牛心脏全基因组染色质开放图谱,并鉴定出牦牛在适应高原极端环境中具有调控功能的CNEs。本研究从调控元件角度探究高原适应性调控机制,不仅为高原适应性调控元件的研究提供了新的遗传数据,并为理解牦牛高原适应机制提供了新的见解。
曹美玲[3]（2020）在《TBX1基因下游心脏发育相关差异表达基因筛选及功能研究》文中进行了进一步梳理研究背景和目的:先天性心脏病（congenital heart disease,CHD）是新生儿常见的重大出生缺陷,是导致围产儿死亡和儿童死亡的主要原因。研究证实,CHD主要由于胚胎时期遗传与环境因素共同作用引起,其中遗传因素具有重要作用。心脏发育相关基因及信号通路与CHD关系的机制仍不明确。心脏发育过程为多基因共同调控的极复杂的生物学过程。研究表明转录因子可通过直接或间接调控靶基因的表达,而影响心肌细胞的迁移、增殖及分化,从而参与心脏发育及CHD的发生。TBX1基因是T-box基因家族成员之一,在胚胎发育早期表达,与心脏发育密切相关,是CHD的致病基因之一。目前,对TBX1基因的研究多集中于TBX1基因编码区的核苷酸变异或基因缺失和重复,而关于TBX1基因表达异常调控的研究较少。本课题组前期研究发现TBX1基因T350M多态性与法洛氏四联症（TOF）具有明显的相关性,可能是TOF的遗传易感基因。课题组首次发现CHD患者心肌组织中ACTC1基因表达水平降低,该异常可诱导胚胎发育时期心肌细胞过度凋亡,从而导致人类CHD的发生。课题组进一步研究发现ACTC1上游调控序列中存在HOXA3转录因子结合位点,转录因子HOXA3与TBX1相互作用参与心脏发育,与CHD的发生密切相关。胚胎早期发育过程中,凋亡相关的心肌细胞缺失是导致CHD发生的关键因素之一,与心肌细胞凋亡相关的基因调控异常可能是影响CHD发生的原因之一,其确切机制亟待研究。TBX3基因参与胚胎早期多器官发育,研究表明,TBX3基因可抑制细胞周期调节蛋白P21表达,从而发挥调控细胞周期、抑制细胞凋亡、促进增殖的作用。P21基因为周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDK）家族的抑制剂,在调节细胞周期和细胞增殖过程中发挥关键作用,而其在心肌细胞中的作用尚未见报道。因此,有必要深入探讨TBX1基因下游心脏发育相关的差异表达基因,以及TBX3基因是否作为TBX1基因下游信号分子通过P21基因调控心肌细胞生物学功能。进一步阐明TBX1基因参与心脏发育信号通路的分子机制,有助于探索新的先天性心脏病产前诊断靶点,并为先天性心脏病靶向治疗提供新的理论依据。研究方法:第一部分:采用TBX1 siRNA转染大鼠胚胎心肌细胞H9C2细胞,利用高通量基因芯片技术,筛选TBX1基因下游心脏发育相关的差异表达基因,进行GO富集分析和KEGG数据库Pathway富集分析;Real-time PCR和ELISA方法验证TBX3基因在CHD心肌组织中的mRNA和蛋白表达情况。第二部分:建立TBX3基因沉默和过表达H9C2细胞,Real-time PCR和Western blot检测TBX3基因mRNA和蛋白表达;采用CCK-8和Ki67免疫荧光染色检测细胞活性;流式细胞术检测细胞周期分布,Western blot检测周期蛋白CyclinA,CyclinB1,CyclinD1表达;利用Hoechst33342染色和Annexin V/PI双重染色法检测细胞凋亡,Western blot检测凋亡相关蛋白cleaved PARP、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2表达;Jc-1法检测线粒体膜电位、试剂盒法检测线粒体ATPase活性和ROS含量;采用Real-time PCR和Western blot检测P21基因mRNA和蛋白表达,ChIP实验验证TBX3基因对P21的调控作用。最后,通过同时敲减TBX3基因和P21基因,检测P21基因对TBX3基因沉默诱导的P21基因表达和细胞增殖的影响。结果:第一部分:1.TBX1基因下游差异表达的基因995个,其中上调基因240个,下调基因755个。2.GO富集分析显示,上调差异表达基因富集度较高的生物学过程主要为:糖酵解过程、胆固醇合成、碳水化合物磷酸化、细胞迁移和脂质磷酸化等。与心脏相关的生物学过程包括:心脏瓣膜发育和心脏形态发生,相关的差异基因包括:Tgfb2、Sox9、Tab1。下调差异表达基因富集度较高的生物学过程主要为:细胞分化、染色体分离、有丝分裂细胞周期和对病毒的反应等。与心脏相关的生物学过程包括:心脏形态发生、胚胎心管形成、胚胎心导管左/右模式形成、心率调节以及心脏发育等,相关的差异基因包括:TBX3、Cited2、Tead2、Pln、Casq2、Dmd、Ift122、Kcne2、Dchs1、Nrp2、Gli2。3.KEGG数据库Pathway富集分析表明,差异基因中具有统计学意义的信号通路主要有:细胞周期、胞质DNA传感通路、减数分裂等。4.在CHD心肌组织标本中TBX3基因mRNA和蛋白表达水平着降低。第二部分:1.敲减TBX3基因明显抑制H9C2细胞增殖活性和Ki67蛋白表达;过表达TBX3基因作用相反。2.敲减TBX3基因显着增加G1期H9C2细胞数,减少S期H9C2细胞数,抑制Cyclin D1,Cyclin A和Cyclin B1表达;过表达TBX3基因可以增强细胞周期蛋白表达,对细胞周期分布无显着影响。3、TBX3基因沉默H9C2细胞表现出典型的凋亡形态特征,包括核碎裂和染色质浓缩,凋亡细胞百分比明显增加,cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、cleaved PARP、Bax表达上调、Bcl-2表达下调;过表达TBX3基因对细胞的凋亡状态无显着影响。4.敲减TBX3基因可显着下调H9C2细胞线粒膜电位和ATPase活性,增加ROS含量,并且增加胞质中细胞色素C含量,降低线粒体中细胞色素C含量。5.TBX3基因沉默使H9C2细胞中P21基因mRNA和蛋白表达水平显着升高,且TBX3蛋白与P21基因DNA存在靶向结合。6.同时敲减TBX3基因和P21基因使H9C2细胞中P21蛋白表达显着降低,并可明显恢复TBX3基因沉默诱导的H9C2细胞增殖能力的下降。结论:1.TBX1基因下游上调差异基因可能与生物合成和磷酸化反应等有关,下调差异表达基因可能与细胞分化、细胞周期和对某些生化物质的反应等有关;与心脏相关的生物学过程包括:心脏形态发生、胚胎心管左右模式形成、心脏左/右不对称发育、心率调节和心脏发育等。2.TBX3基因是TBX1基因下游心脏发育相关的基因。3.TBX3基因表达下调与CHD的发生相关。4.TBX3基因沉默抑制H9C2细胞增殖,使细胞周期阻滞于G1期。5.TBX3基因沉默诱导H9C2细胞线粒体功能障碍,促进细胞凋亡。6.P21基因是TBX3基因的下游靶基因。7.TBX3基因表达下调通过靶向调控P21基因的表达而抑制H9C2细胞增殖。
孙文强[4]（2019）在《Akirin基因调控鸭成肌细胞增殖与分化的作用研究》文中提出Akirin基因家族在骨骼肌发育上具有重要作用。该基因家族有两个成员,Akirin1和Akirin2,研究报道鸟类基因组仅含有一个成员Akirin2。为研究鸟类Akirin2基因的功能,在鸭成肌细胞中过表达Akirin2基因、异源表达鼠Akirin1基因后,结合荧光定量、免疫荧光、蛋白印迹以及流式细胞术等手段,研究了Akirin2基因在鸭成肌细胞中的作用。主要研究结果如下:（1）将鼠Akirin1与Akirin2基因分别与多个鸟类基因组比对分析,仅在鸟类基因组中发现一个Akirin同源基因。该同源基因与鼠Akirin2基因有着80%以上的同源性,而与鼠Akirin1基因仅有41%45%的同源性。进化树结果显示,所选鸟类Akirin同源基因与其他物种Akirin2聚为一类。结构功能域分析结果显示,所选鸟类Akirin结构域与其他物种Akirin2高度相似。（2）通过低浓度马血清成功将鸭成肌细胞进行诱导分化。成功构建鸭Akirin2基因真核表达载体并将其转染至鸭成肌细胞后,生肌调控因子（MRFs）、肌细胞增强因子2（MEF2s）基因家族各成员的表达量、细胞周期的退出与细胞周期相关调控因子（Cyclin D家族与p21）的表达,以及肌管数目均无显着变化,表明过表达鸭Akirin2基因不能够影响成肌细胞分化。（3）过表达鸭Akirin2基因后,成肌细胞增殖活性显着提高。细胞周期相关调控因子（Cyclin D家族）的表达无显着变化,但胞内蛋白合成因子（S6K）的表达量显着升高。培养基添加mTOR特异性抑制剂雷帕霉素后,Akirin2基因对成肌细胞增殖活性以及胞内蛋白合成因子（S6K）的正向调控作用受到了阻断,表明鸭Akirin2能够通过mTOR/S6K通路调控成肌细胞增殖。（4）生物信息预测及双荧光素报告载体证实miR-365能够靶向结合Akirin2基因3’UTR区域。过表达miR-365后,胞内蛋白合成相关因子（mTOR、S6K）表达量显着降低,鸭成肌细胞增殖活性以及BrdU阳性细胞数目显着降低,进一步表明Akirin2基因能通过影响胞内蛋白合成相因子（mTOR、S6K）的表达调控成肌细胞的增殖。（5）异源表达Akirin1基因于鸭成肌细胞后,生肌调控因子MRF4以及肌细胞增强因子MEF2B的表达量均显着升高,同时,p38MAPK以及PI3K/Akt信号通路相关因子的表达量也显着升高。但培养基添加p38MAPK特异性抑制剂SB203580后,p-p38α和MRF4基因表达量显着降低,表明Akirin1可能通过p38MAPK信号通路介导调控成肌细胞分化。此外,培养基添加PI3K特异性抑制剂LY294002后,p-Akt和MEF2B基因表达量也显着降低,表明Akirin1也可能通过PI3K/Akt信号通路介导调控成肌细胞分化。综上,所选鸟类基因组中仅含有Akirin2的同源序列。鸭Akirin2基因与成肌细胞分化过程无关,但能够调控成肌细胞增殖,其作用可能是通过mTOR/S6K通路介导实现的。异源表达鼠Akirin1基因能诱导鸭成肌细胞分化,可能由PI3K/Akt以及p38MAPK信号通路介导。本研究明确了鸭Akirin2基因在成肌细胞增殖中的作用,为鸟类Akirin基因功能研究奠定了基础。
郭会萍[5]（2019）在《斑马鱼性腺和心脏可塑性再生的表观遗传调节机制研究》文中进行了进一步梳理干细胞和已分化细胞都具有细胞可塑性,即能够在一定条件下可逆地去分化或转分化形成多谱系的细胞。这种环境引导的细胞可塑性是组织内环境稳定、再生和性逆转的基础。表观遗传调控如DNA甲基化,miRNA,组蛋白修饰和染色质重塑等在细胞可塑性方面扮演者重要的角色。斑马鱼作为再生能力很强的模式动物,其性腺,心脏,尾鳍等组织再生过程中伴随着芽基形成和重建。本课题主要以斑马鱼的性腺和心脏为例分别研究miRNA和组蛋白修饰在斑马鱼性腺和心脏可塑性再生的分子机制。1.miRNA在斑马鱼性腺细胞可塑性的调控机制实验室前期研究通过对5个月斑马鱼成熟的性腺进行了miRNA和mRNA深度测序分析,筛选到许多性别相关的差异表达miRNA和GPCR基因。本课题结合显微注射和定量PCR分析进一步筛选出四个特异的miRNAs:miR430a,miR218a,miR734,miR141。为了探索特异的miRNAs和Sox9基因之间的相互关系,我们将特异的miRNAs注射到斑马鱼的性腺中,发现注射miR430a能提高精巢中Sox9a基因的表达,而注射miR218a能提高卵巢中Sox9b的表达。过表达Sox9a和Sox9b能够提高精巢和卵巢miR430a前体和miR218a前体的表达。同时发现敲降Sox9a和Sox9b能够分别降低精巢中miR430a前体的表达和卵巢中miR218a前体的表达。以上结果提示miR430a-Sox9a通路偏向调控精巢的发育,而miR218a-Sox9b通路偏向卵巢的发育。为了研究上述调控通路对精巢发育和卵泡生成的影响,我们在新近成熟斑马鱼性腺内分别注射特异miRNA和Sox9混合物。结果发现Sox9a-miR430a混合物能够提高染色体浓缩细胞和未分化的精原细胞的比例;而Sox9b-miR218a混合物能够诱导卵泡新生,降低精巢中染色体浓缩细胞和精子细胞的比例。当miRNA-Sox9混合物注射到2两年龄斑马鱼性腺内,发现Sox9a-miR430a能够明显的提高染色体浓缩细胞和未分化的精原细胞的比例,而Sox9b-miR218a能够诱导卵泡新生。我们又将miRNASox9混合物注射到vasa-GFP转基因青鳉鱼的性腺内,发现miR430a-Sox9a能够提高精巢中荧光报告信号,而miR218a-Sox9b能够增强卵巢中荧光报告信号。这些结果表明miR430a-Sox9a协同调节精巢的发育,而miR218a-Sox9b能够促进卵泡的更新。通过Pmir-GFP荧光酶报告实验检验miR430a和miR218a与Gpr157,Grk5l,Grk4,Lgr4的靶向关系,结果显示miR430a靶向Lgr4,Grk5l,Grk4,而miR218a靶向Gpr157,Grk5l,Grk4。说明miRNA可能通过GPCR调节Sox9a和Sox9b的活性。免疫沉淀（IP）-质谱分析发现注射miR430a和miR218a能分别影响Sox9a和Sox9b蛋白的磷酸化和乙酰化修饰等,同时发现一些酶可能与Sox9a/Sox9b蛋白的磷酸化和乙酰化等修饰有关,包括PI3K,ROCK,PKC等。体内体外免疫印迹实验进一步验证混合注射miR430a/miR218a能分别Sox9a和Sox9b蛋白的条带大小。根据以上结果我们推测miRNA可能通过GPCR调节网络影响Sox9a/Sox9b蛋白的翻译后修饰。实验发现注射Sox9a能够提高精巢中p-PKC的表达水平,而共注射miR430a-Sox9a混合物能够同时提高p-PKC/p-Akt的活性。在卵巢中,Sox9b能够提高p-PKCc的活性,但是共注射miR218a能抑制p-PKC和p-Akt的活性。更惊奇发现敲降精巢中lgr4,grk5l,grk4能够很明显的降低p-PKC,p-Akt的磷酸化水平。然而在卵巢中敲降gpr157,grk5l,grk4能够促进p-PKC的表达降低P-Akt的表达。同时免疫组化更加清晰的发现共注射Sox9a和miR430a能够提高精巢中p-PKC和p-Akt的表达,而miR218a和Sox9b能够抑制p-PKC和p-Akt蛋白的表达。2.组蛋白修饰对斑马鱼心脏再生过程中细胞可塑性的影响我们前期实验显示斑马鱼心尖剪切后心脏再生过程包括炎性增生、血管重建和肌肉再生,分别以α-acta2,flk1和pax3a基因表达为代表。本实验首先利用染色体免疫共沉淀高通量测序分析结合转录组测序分析鉴定了斑马鱼心脏再生过程中57个基因的组蛋白H3K9ac修饰水平和转录水平同步增高。同时发现与心血管生成,细胞外基质,细胞骨架,细胞分化等关键基因Flk1,α-acta2,pax3a及其周围相邻基因在斑马鱼心脏再生过程中乙酰化水平明显升高,甲基化水平显着降低。显微注射H3K9ac和H3K9me3修饰抑制剂,发现抑制组蛋白H3K9ac影响斑马鱼心脏再生过程胶原组织的形成,同时也抑制血管芽基和芽基组织的形成。斑马鱼心脏再生过程中H3K9me3修饰受到抑制后,有详细结果显示胶原生产过度生成,芽基组织的形成受到抑制。同时体外抑制斑马鱼胚胎成纤维细胞（Pac2）细胞组蛋白H3K9ac和H3K9me3修饰会影响成纤维细胞的细胞骨架。总之,我们的研究发现miR430a/mirR218a能够分别通过调节GPCR,调控p-PKC/p-Akt的活性,从而提高Sox9a和Sox9b的活性。其中miR430a-Sox9a协同调节精巢的发育,而miR218a-Sox9b能够促进卵泡的更新。同时我们发现组蛋白H3K9ac和H3K9me3修饰反向调节α-acta2,flk1和pax3a的表达,影响斑马鱼心脏再生过程中芽基组织的生成和芽基细胞的可塑性改变。研究miRNA和组蛋白修饰调控斑马鱼组织再生过程中可塑性的分子机制可为再生医学提供新的思路。
郭舒瑜[6]（2018）在《转录因子GATA4调控神经嵴细胞进而影响相关衍生组织发育的机制研究》文中认为为了研究转录因子GATA4在神经嵴及其衍生组织发育过程中的具体作用机制,本课题使用了条件性敲基因小鼠Wnt1-Cre;Gata4fl/fl,以达到在神经嵴细胞中特异性敲除GATA4的目的。利用免疫组织化学染色的方法,观察GATA4在小鼠颅颌面组织时空表达情况:在胚胎14.5天（embryonic day 14.5,E14.5）、出生后1天（postnatal day 1,P1）、出生后14天（postnatal day 14,P14）,GATA4在小鼠下颌骨、腭部、牙齿的各个发育阶段都有高表达。表型分析发现,Wnt1-Cre;Gata4fl/fl小鼠体型明显减小。骨架染色结果显示,Wnt1-Cre;Gata4fl/fl小鼠颅缝闭合不全、下颌骨发育不足后缩畸形。影像学（micro-CT）、免疫荧光染色、组织化学染色结果表明:Wnt1-Cre;Gata4fl/fl的小鼠下颌骨、腭骨、额骨呈现出显着的骨矿化程度降低;牙根发育异常,短根畸形;冯库萨（Von kossa）、总胶原（total collagen）染色,collagenⅠ免疫荧光染色结果提示,敲基因鼠的骨量显着降低;H&E染色结果显示,神经嵴细胞特异性敲除GATA4后,小鼠表现出室间隔缺损（ventricular septal defect,VSD）、心脏代偿性肥大的表型。本课题进一步研究神经嵴细胞特异性敲除GATA4后所影响的神经嵴发育具体时期。结果如下:在迁徙期时,对E9.5天WT及Wnt1-Cre;Gata4fl/fl的小鼠进行SOX9的整胚免疫荧光染色,标记神经嵴细胞及第一咽弓（pharyngeal arch 1,pa1）,两组小鼠第一咽弓在大小和形态上没有显着性差异;选取E10.5天的胎鼠进行PHH3（phosphohistone H3,PHH3）,TUNEL（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling,TUNEL）的免疫荧光染色,对细胞的增殖、凋亡进行统计分析,结果无显着性差异,提示GATA4特异性敲除后没有影响神经嵴的迁徙期。对于神经嵴发育的分化时期,选择E14.5天的小鼠对其下颌组织进行增殖、凋亡的分析,发现敲基因组小鼠增殖的细胞数目显着降低,而细胞凋亡没有受到影响。综上所述,GATA4对小鼠神经嵴分化时期的细胞增殖起到促进的作用,同时也参与了颅颌面部相关衍生物发育过程的调控。体外实验部分,通过培养小鼠神经嵴细胞,转染小发卡RNA（small hairpin RNA,shRNA）敲低GATA4的表达,进行细胞学的研究。细胞增殖（cell counting kit-8,CCK-8）及流式凋亡实验表明,敲低GATA4后影响了神经嵴细胞的增殖,但细胞凋亡没有受到影响。划痕实验中,敲低组细胞迁徙能力明显降低。对神经嵴细胞进行成骨方向的矿化诱导,在矿化14天之后发现,GATA4敲低组钙结节生成数目显着降低,提示成骨矿化能力受到影响。提取E10.5天小鼠第一咽弓组织mRNA进行qRT-PCR检测,本研究选择了9个与神经嵴发育相关的基因发现:Wnt1-Cre;Gata4fl/fl组中,Sox9、Snail2、Ets1、Msx1、AP-2、Twist的表达显着降低,而Nestin、Pax3、HNK-1的表达没有改变。上述结果提示GATA4对神经嵴发育过程中的相关功能具有重要的调控作用。机制探究部分,本实验通过同位素标记相对和绝对定量技术（isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ）筛选GATA4在神经嵴细胞中潜在的下游靶基因。在所检测的1888个蛋白中,在GATA4敲低后有43个蛋白表达上调,19个蛋白表达显着下调,BARX1是其中下调的蛋白之一。鉴于BARX1在咽弓中高表达,且对磨牙、软骨、下颌骨发育均有重要调控作用,因此本实验选择BARX1继续研究。为了验证iTRAQ的结果,实验通过qRT-PCR、蛋白质印迹法（Western blot）实验证实,神经嵴细胞敲低GATA4后,Barx1表达随之下调。实验预测了转录因子GATA4与Barx1的启动子区域可能存在的两个结合位点。通过双荧光素酶报告基因实验、凝胶迁移率实验（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）及染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation assay,ChIP）实验进行结合位点的验证。结果表明:在双荧光素酶报告基因实验中,过表达GATA4之后,两个结合位点的荧光活性均增强,把结合位点突变之后,荧光值显着降低;EMSA结果显示,在第一个预测的结合位点实验中,能够观察到GATA4-Barx1复合体所形成的滞后条带,第二个结合位点未能检测出结合;ChIP结果显示,以GATA4抗体免疫沉淀的DNA片段为模板,PCR扩增获得Barx1基因启动子区的片段,能实现转录因子GATA4与Barx1启动子DNA序列结合。表明Barx1是转录因子GATA4的直接下游靶基因。为了验证转录因子GATA4确实是通过调控Barx1来影响神经嵴相关衍生物的发育,本实验使用了斑马鱼动物模型进行功能实验分析。通过注射反义吗啉代寡聚核苷酸（morpholino,MO）在斑马鱼体内敲低gata4的表达,对照组（control）注射标准化MO作为参照。通过qRT-PCR实验确定,注射gata4 MO能够在斑马鱼体内有效敲低其表达。在斑马鱼受精后72小时（hours post fertilization,hpf）后,gata4 MO组斑马鱼表现出体型减小、下颌骨发育畸形,彩虹色素生成减少、心包水肿等表型;在96 hpf时进行阿尔新蓝染色,gata4 MO组斑马鱼第一对软骨状咽弓（下颌弓）长度减小呈现出严重的后缩畸形。上述结果提示,gata4对维持神经嵴衍生物的正常发育至关重要,gata4可能通过调控barx1来影响神经嵴的发育。为验证上述假说,本研究通过原位杂交实验在24 hpf时,对control组和gata4MO组进行barx1的整胚原位杂交。结果发现:敲低gata4后,斑马鱼第一咽弓处barx1的表达明显下降,qRT-PCR也证实了上述结果。为了分析gata4是否通过调控barx1的表达进而参与了神经嵴发育过程的调控,本研究共注射gata4 MO与barx1的mRNA,以达到敲低gata4后过表达barx1的目的。结果显示:拯救组（rescue）斑马鱼下颌骨的长度、虹膜色素生成等表型均得到部分的有效恢复。综上所述,本研究通过借助两个动物模型证实Barx1作为GATA4的直接下游靶基因,参与了GATA4对神经嵴发育过程的调控。实验揭示了两者在神经嵴发育过程的重要作用,对于理解相关生物学过程具有重要的理论意义,为预防和治疗人类发育相关的疾病提供了理论和实验依据。
颜尔聪[7]（2017）在《果蝇TSMR1对心脏发育基因启动子活性的影响》文中研究表明TSMR1是本实验室克隆的人类心脏发育的候选基因,其功能研究目前还没有相关的研究报道。本实验室的前期研究成结果显示,在果蝇胚胎发育过程中,TSMR1影响果蝇胚胎心脏的发育过程。为了研究TSMR1调控心脏发育的作用机制,本文探讨TSMR1是否对心脏发育基因的启动子起调控作用。本文提取了野生型成虫果蝇的DNA,设计引物克隆果蝇心脏发育相关基因（Eve,Zfh-1,Odd,Prc,Svp,Smox）,将扩增的基因片段通过一步克隆法连接至p GL3-basic荧光素酶报告载体,构建成p GL3-Eve,p GL3-Zfh1,p GL3-Odd,p GL3-Prc,p GL3-Svp和p GL3-Smox质粒,电泳测序鉴定。将这些质粒与PCMV-myc-TSMR1共转染至HEK293细胞,同时单转启动子报告质粒、p GL3-basic和PCMV-myc质粒。以p RL-TK作为内参,建立双荧光素酶报告系统。对荧光素酶报告基因检测系统分析心脏发育相关基因的启动子活性,并用独立样本t检验方法进行统计分析。结果表明:TSMR1基因能够增强心脏发育相关基因启动子的转录活性。为了进一步研究TSMR1是否通过结合在基因的启动子区域起转录调控作用,确定核心启动子区域,将心脏发育基因Svp、Prc、Smox和Zfh1的启动子区域进行分段分析,分别分为5-6段片段大约长为500bp的启动子片段。通过PCR扩增反应,将扩增片段通过一步克隆法连接至p GL3-basic荧光素酶报告载体,构建成荧光素酶报告质粒。同样利用荧光素酶报告系统检测启动子活性。结果表明:Svp核心启动子区域为-465—+40bp;Prc核心启动子区域为-1426—-900bp;Smox核心启动子区域为-1205—-646bp;Zfh1核心启动子区域为-2646—-2127bp。综上所述,本文证明果蝇TSMR1影响心脏发育基因启动子的活性,并鉴定出其影响心脏发育基因的核心启动子区域。该结果为进一步研究TSMR1在果蝇心脏发育过程中的调控机制奠定了基础。
华旭[8]（2015）在《MicroRNA介导的组织特异性基因调控网络研究》文中认为MicroRNA（miRNA）是一类小的（～22nt）非编码RNA,在转录后水平上通过结合在靶基因的mRNA序列上来负调节基因的表达。MicroRNA于20世纪末被发现,近十年来一直是生命科学领域的研究热点。现有的研究揭示miRNA几乎参与所有重要的生物过程,比如发育,分化,凋亡,细胞增殖和致癌发生。其作用方式具有多靶点的特性,且在不同组织中呈现出显着的表达差异,这表明miRNA在构成基因调控网络的复杂性以及形成网络的组织特异性方面具有重要地位。本文对此问题进行了系统研究,通过开发新的计算方法,预测并分析了 miRNA转录起始位点（TSS）在不同细胞系中的特异性,从而深入认识miRNA的转录调控特性;基于本文确定的miRNA TSS数据,我们进一步在各种细胞系中预测得到较为可靠的转录因子（TF）对miRNA的调控关系;同时也对另一类长非编码RNA（lncRNA）进行了调控关系预测;利用迄今所知的大量miRNA和编码基因的信息数据,我们对多种组织中的基因表达谱、转录调控和转录后调控的关系进行整合,构建出完整的组织特异的基因调控网络。通过分析基因调控网络,本文试图从系统层面上认识miRNA在调控网络中的功能、作用模式以及在形成组织特异性网络中的作用。本研究具体分为三部分:1.细胞特异的miRNA转录起始位点（TSS）的识别。一般的,miRNA基因首先在细胞核里被RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ转录成miRNA初级转录本（pri-miRNAs）。然后 RNase Ⅲ型酶 Drosha 会将 pri-miRNA 加工成 miRNA前体（pre-miRNA）,接着pre-miRNA会被转运到细胞质中并在Dicer的帮助下变成miRNA成熟体。MiRNA的转录过程与蛋白质编码基因基本一样,但是pri-miRNA在转录后会很快失去5’帽的保护。因此,miRNA基因的全长转录本非常难以捕获,从而难以精确定位miRNA的转录起始位点（TSS）。我们设计了一个算法流程来预测miRNA的转录起始位点（TSS）,该流程整合了组蛋白H3K4三甲基化修饰（H3K4me3）和DNase Ⅰ超敏感位点（DHSs）的数据,并结合了物种保守信息和序列特征。在每个细胞系中,距每个pre-miRNA最近的H3K4me3区域被认为可能包含了 miRNA的TSS。该流程对来源于ENCODE项目的54个细胞系进行分析,成功预测了 610个基因内的（intragenic）miRNA的TSSs和765个基因间区的（intergenic）miRNA的TSSs。在这些细胞系中,我们一共找到了2468 个 intragenic miRNAs 的可变 TSSs 和 4748 个 intergenic miRNAs 的可变 TSSs。以文献中的实验数据作对照,我们的方法显示出比其他方法更好的性能。值得注意的是,在预测的miRNATSS位点处,细胞核内的CAGE信号要明显高于细胞质内的CAGE信号,这一现象支持了现有的miRNA产生的模型。对miRNA TSS细胞特异性的研究表明,对于在多个细胞系中具有活化TSS的miRNAs,intergenic miRNAs比intragenic miRNAs倾向于使用更多的可变TSS。因此,当intergenic miRNA的表达不具有细胞特异性时,依然可以通过特异的启动子被调控。本章的研究结果可以促进对miRNA组织特异性表达的理解,并且可以作为在不同细胞系中构建精确调控网络的基础。2.非编码RNA相关调控关系的预测。除了 miRNA以外,另一类长度大于200bp的非编码RNA（lncRNA）被越来越多的发现。据报道,四分之三的人类基因组可以被适当地转录,除了已知的2万多个蛋白质编码RNA,大约占人类基因组的2%,其它转录本都是非编码RNA。这些基因组上的非编码部分,在正常的发育和生理过程中,以及疾病过程中都可能具有重要的功能。本部分中,我们预测了包括miRNA和lncRNA的非编码RNA的调控关系。首先,我们整合了不同预测工具和实验数据中的结果,得到了较可靠的miRNA对其靶基因的调控关系。其次,基于上一部分中预测的miRNA TSS,我们根据miRNA启动子上保守性的分布,系统地预测了 TF-miRNA的调控关系。特别地,我们利用细胞特异的miRNA启动子数据研究了两个心脏细胞系,发现了一些心脏特异的miRNA启动子。在hsa-mir-21的心脏特异的启动子上我们找到了调控它的上游TF,通过对南京大学博士学位论文 中文摘要这些TF的功能富集,我们发现富集的功能与已报道的hsa-mir-21在心脏中的功能一致。最后,我们比较了不同类型lncRNA和miRNA的启动子的保守性,发现尽管lncRNA启动子的保守性程度明显低于miRNA,但是大多数类型的lncRNA启动子在TSS附近具有和miRNA相似的峰形。因此,我们用相似的方法预测了 TF-lncRNA的调控关系,以助于揭示lncRNA参与的基因调控机理。3.组织特异的基因调控网络的分析。人类细胞在形态上和功能上都呈现丰富的多样性,不同细胞的各自独特的调控关系导致了多样的基因表达谱,进而导致不同细胞类型之间的巨大差异。我们构建了 8个人类组织（脑,睾丸,卵巢,肝脏,脾脏,心脏,肾脏和前列腺）的调控网络,网络中包括TF,miRNA和非转录因子靶基因（non-TF）之间的调控关系。基于8个组织的基因调控网络,我们从三个水平上研究了它们的设计规则:节点的局部性质（比如度）,网络模体（motif）和网络模体的整合。结果表明,组织网络中具有高入度和高出度的入中心节点和出中心节点。我们还发现,网络中的motif大多数是前馈回路,并且miRNA倾向于出现在组织特异的motif中。特别地,基于模体实例（motifinstance）,我们发现了在不同组织中公有的领结型框架,它将研究的8个组织特异性的调控网络（TRN）分类为对称性网络,输入型网络和输出型网络。当研究不同细胞功能的特异性需求时,领结型框架可以作为今后理解调控系统结构的模型。将该工作中motif数据进行整理,我们还尝试构建了一个组织特异的网络motif数据库（TiMoD）,希望能为实验生物学、系统生物学等提供数据和相关信息。综上所述,本文以miRNA为主要研究对象,利用网络分析的方法从系统层面上研究miRNA在基因调控网络中的作用。首先,本文大规模预测了 miRNA转录起始位点并系统研究了其细胞特异性规律,发现对于在多个细胞系中具有活化TSS的miRNA,intergenic miRNAs 比 intragenic miRNAs倾向于使用更多的可变TSSs。其次,通过整合不同的预测工具和本工作中预测的miRNA TSS,我们获得了较为可靠的miRNA相关的调控关系。最后,通过整合TF和miRNA相关的调控关系,本文构建了组织特异的基因调控网络。通过分析不同组织调控网络中motif的特点,本文发现miRNA倾向于出现在组织特异的motif中,并偏向性地占据了网络领结型结构的输入层,这表明miRNA对形成调控网络的组织特异性起重要作用。本文的研究结果将对miRNA的组织特异性,miRNA的转录调控过程,miRNA介导的基因调控网络及网络motif等方面的研究起到广泛且重要的作用。
张慧,陆祖宏[9]（2011）在《小鼠心脏发育相关基因调控网络的生物信息学分析》文中认为Nkx2.5,Mef2c,Gata4/5/6,Tbx5和Hand1等基因作为脊椎动物心脏发育相关基因调控网络的核心基因,对脊椎动物的心脏发育起核心调控作用。本研究主要通过对小鼠心脏发育相关核心基因的生物信息学分析,研究Nkx2.5,Mef2c,Gata4,Gata6,Tbx5和Hand1等核心转录因子之间的相互调控关系,得到小鼠心脏发育的核心基因调控网络（GRNs）。与文献中总结的小鼠的GRNs作比较,发现Nkx2.5在小鼠心脏发育基因调控网络中的核心地位没有改变,并且Nkx2.5在网络中主要扮演了调控者的角色,它直接调控很多转录因子。Gata4是另一个主要起调控者作用的转录因子。另外小鼠的Mef2c和Hand1处于被多个转录因子调控的地位。变化比较大的是Tbx5所涉及的调控网络,主要有两点:Nkx2.5对Tbx5的表达有没有调控作用以及Tbx5对自身的表达有没有调控作用。研究表明生物信息学分析对具体实验研究有一定方向性指导意义。
王磊,侯玲玲,关伟军,马月辉[10]（2010）在《Islet1基因与心脏发育》文中进行了进一步梳理心脏发育及心脏疾病干细胞的治疗要求对心脏发育过程中的控制细胞增殖及分化的相关基因的作用机制进行深入了解.Islet1基因（Isl1基因）含有6个外显子和5个内含子,定位于人类5号染色体5q11.2.该基因在基因组内约占12kb,目前所知其最长可读框（ORF）至少由5个外显子组成,编码一个由384个氨基酸组成的转录因子蛋白.最近研究发现,不同的心脏细胞可能源于同一种多能心脏祖细胞—Isl1+细胞,心脏的这一发育模式与血液细胞的形成模式非常相像.另外有研究结果显示,Isl1是与心脏发育密切相关的转录因子之一,其表达随着心脏发育成熟而逐渐下调.虽然针对Isl1基因做了较多的研究工作,但是它表达调控的具体模式及发挥功能的详细作用机制目前仍未完全清楚,本文对最近几年Isl1基因的研究进展作一综述.
二、心脏发育的基因调控（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、心脏发育的基因调控（论文提纲范文）
（1）复杂心脏疾病相关的miRNA调控网络与模块识别研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究工作的背景与意义 |
| 1.2 研究工作的国内外研究现状 |
| 1.2.1 分子调控网络研究现状 |
| 1.2.2 三种复杂心脏疾病相关miRNA调控网络研究现状 |
| 1.3 本文主要研究内容与创新 |
| 1.4 本论文的结构安排 |
| 第二章 相关背景知识、计算技术以及数据库资源 |
| 2.1 本文关注的三种复杂心脏疾病 |
| 2.1.1 瓣膜性心脏病合并房颤 |
| 2.1.2 肥厚型心肌疾病 |
| 2.1.3 法洛氏四联症 |
| 2.2 miRNA调控机制 |
| 2.2.1 miRNA直接调控机制 |
| 2.2.2 miRNA间接调控机制 |
| 2.3 相关计算技术 |
| 2.3.1 差异表达基因识别算法 |
| 2.3.2 变量之间相关系数计算技术 |
| 2.3.3 竞争关系计算方法 |
| 2.3.4 相关聚类算法 |
| 2.4 相关数据库资源 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 基于差异共表达网络识别的miRNA组合在瓣膜性心脏病合并房颤中潜在作用研究 |
| 3.1 简介 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 研究对象与组织样本 |
| 3.2.2 miRNA表达谱数据 |
| 3.2.3 识别在AF-VHD与 VHD之间差异表达的miRNAs |
| 3.2.4 构建miRNA-miRNA共表达网络 |
| 3.2.5 识别AF-VHD特异性miRNAs |
| 3.2.6 功能富集分析 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 被识别的AF-VHD特异性miRNAs |
| 3.3.2 被构建的差异共表达网络和提取的miRNA组合 |
| 3.3.3 验证AF-VHD特异性miRNAs的差异表达 |
| 3.3.4 miRNA组合的生物特征 |
| 3.3.5 miRNA组合调控的信号通路及分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 AF-VHD相关的DE miRNAs比较 |
| 3.4.2 关于差异性共表达网络和AF-VHD特异性miRNAs |
| 3.4.3 局限性 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 肥厚型心肌疾病相关miRNA海绵互作网络识别研究 |
| 4.1 简介 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 HCM基因表达谱数据源 |
| 4.2.2 circ Sponge框架 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 识别的miRNA-m RNA和 miRNA-circ RNA调控网络 |
| 4.3.2 识别的miRNA海绵互作网络 |
| 4.3.3 miRNA海绵互作网络功能分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 circ RNA-circ RNA关联的miRNA海绵互作网络功能分析 |
| 4.4.2 circ Sponge海绵框架技术不足 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 法洛氏四联症相关的miRNA调控网络与模块识别研究 |
| 5.1 简介 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 TOF基因表达谱数据源 |
| 5.2.2 miRReg框架概述 |
| 5.3 实验结果与分析 |
| 5.3.1 识别的miRNA-m RNA调控网络和模块 |
| 5.3.2 识别的miRNA海绵互作网络和模块 |
| 5.3.3 miRNA-m RNA最大二分类模块与TOF的关联 |
| 5.3.4 miRNA海绵模块与TOF的关联 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间取得的成果 |
（2）ATAC测序鉴定牦牛基因组非编码保守元件（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 研究背景 |
| 1.1 牦牛 |
| 1.1.1 牦牛的分类和起源 |
| 1.1.2 牦牛对高原环境的适应性 |
| 1.1.3 牦牛高原适应性分子机制相关研究 |
| 1.2 非编码保守元件 |
| 1.2.1 非编码保守元件简介 |
| 1.2.2 非编码保守元件鉴定 |
| 1.2.3 非编码保守元件的特征和功能 |
| 1.2.4 非编码保守元件的来源 |
| 1.2.5 非编码保守元件研究现状 |
| 1.3 调控元件鉴定与ATAC-seq |
| 1.3.1 基因组中的调控元件检测 |
| 1.3.2 ATAC-seq研究策略 |
| 1.3.3 ATAC-seq研究现状 |
| 1.4 研究意义和科学问题 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 基因组数据集 |
| 2.2 牦牛基因组非编码保守元件识别 |
| 2.2.1 系统发育分析 |
| 2.2.2 PhastCons识别保守元件 |
| 2.2.3 牦牛非编码保守元件识别 |
| 2.3 非编码保守元件分析 |
| 2.3.1 基因组功能元件分布注释 |
| 2.3.2 motif分析 |
| 2.3.3 非编码保守元件相关基因 |
| 2.3.4 非编码保守元件相关基因功能注释 |
| 2.4 ATAC-seq与功能元件的评估 |
| 2.4.1 样本采集与处理 |
| 2.4.2 ATAC-seq实验流程 |
| 2.4.3 数据过滤与质量评估 |
| 2.4.4 序列比对 |
| 2.4.5 peak扫描 |
| 2.4.6 IDR分析 |
| 2.4.7 peak在基因功能元件上的分布 |
| 2.4.8 peak相关基因及功能注释 |
| 2.5 CNE与 ATAC-seq结果的整合分析 |
| 2.5.1 CNE和 peak整合分析 |
| 2.5.2 motif分析 |
| 2.5.3 overlap相关基因及GO分析 |
| 第三章 研究结果 |
| 3.1 牦牛基因组中的非编码保守元件分析 |
| 3.1.1 非编码保守元件结果统计 |
| 3.1.2 非编码保守元件在基因组中的分布 |
| 3.1.3 motif注释 |
| 3.1.4 非编码保守元件相关基因及GO分析 |
| 3.2 ATAC-seq分析 |
| 3.2.1 数据基本处理与质控 |
| 3.2.2 peak结果 |
| 3.2.3 IDR分析 |
| 3.2.4 peak在基因功能元件上的分布 |
| 3.2.5 peak相关基因富集分析 |
| 3.3 CNE与 ATAC-seq结果的整合分析 |
| 3.3.1 overlap整合结果 |
| 3.3.2 motif分析 |
| 3.3.3 overlap相关基因GO分析 |
| 第四章 讨论与展望 |
| 4.1 讨论 |
| 4.1.1 高原适应性相关的非编码保守元件 |
| 4.1.2 ATAC-seq鉴定牦牛基因组功能元件 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（3）TBX1基因下游心脏发育相关差异表达基因筛选及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :TBX1基因下游心脏发育相关差异表达基因的筛选与验证 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 组织标本 |
| 2.1.3 芯片 |
| 2.1.4 实验试剂 |
| 2.1.5 实验仪器 |
| 2.2 生物学信息分析软件 |
| 2.3 生物信息学数据库 |
| 2.3.1 Gene Ontology(GO)数据库 |
| 2.3.2 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)数据库 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 细胞培养 |
| 2.4.2 标本收集 |
| 2.4.3 细胞转染 |
| 2.4.4 提取细胞总RNA |
| 2.4.5 RNA反转录与c DNA合成 |
| 2.4.6 RT-PCR检测m RNA表达水平 |
| 2.4.7 芯片杂交及数据处理 |
| 2.4.8 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 2.4.9 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 总RNA质检 |
| 3.2 TBX1 siRNA转染效率评价 |
| 3.3 芯片杂交及芯片质量评价 |
| 3.3.1 芯片杂交扫描 |
| 3.3.2 芯片原始数据提取 |
| 3.3.3 主成分分析(PCA) |
| 3.3.4 通过箱线图查看数据的分布状况 |
| 3.3.5 绘制散点图评估芯片数据集中趋势 |
| 3.4 芯片数据差异基因筛选 |
| 3.5 差异表达基因GO富集分析 |
| 3.5.1 上调差异表达基因的GO富集分析 |
| 3.5.2 下调差异表达基因的GO富集分析 |
| 3.6 差异表达基因KEGG数据库Pathway分析 |
| 3.7 TBX3基因在CHD心肌组织中表达情况 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 :TBX1通过TBX3/P21途径参与大鼠胚胎心肌细胞H9C2 细胞生物学功能调控的机制研究 |
| 5 前言 |
| 6 材料与方法 |
| 6.1 主要试剂和仪器 |
| 6.1.1 细胞系 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要配置试剂及配置方法 |
| 6.1.4 主要仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 细胞培养与转染 |
| 6.2.2 实时荧光定量PCR(Real-time PCR) |
| 6.2.3 CCK-8检测细胞活性 |
| 6.2.4 细胞周期检测 |
| 6.2.5 细胞凋亡检测 |
| 6.2.6 细胞免疫荧光染色 |
| 6.2.7 Hoechst33342 染色 |
| 6.2.8 线粒体膜电位实验 |
| 6.2.9 线粒体ROS检测实验 |
| 6.2.10 ATP_(ase)活性检测 |
| 6.2.11 染色质免疫共沉淀(ChIP)实验 |
| 6.2.12 蛋白质免疫印迹(Western blot) |
| 6.2.13 统计学分析 |
| 7 结果 |
| 7.1 沉默和过表达TBX3基因大鼠胚胎心肌细胞H9C2细胞系建立 |
| 7.1.1 沉默TBX3基因H9C2细胞系建立 |
| 7.1.2 过表达TBX3基因H9C2细胞系建立 |
| 7.2 TBX3沉默抑制H9C2细胞增殖 |
| 7.3 TBX3 沉默使H9C2 细胞细胞周期阻滞于G1期 |
| 7.4 TBX3沉默诱导H9C2细胞凋亡 |
| 7.5 TBX3沉默诱导H9C2细胞线粒体功能障碍 |
| 7.6 P21是TBX3的直接靶基因 |
| 7.7 TBX3基因负向调控P21对H9C2细胞增殖活性的影响 |
| 8 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）Akirin基因调控鸭成肌细胞增殖与分化的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 成肌细胞与生肌调控 |
| 1.1 成肌细胞的起源 |
| 1.2 成肌细胞的增殖与分化过程 |
| 1.3 调控成肌细胞增殖与分化的关键因子 |
| 1.3.1 生肌调控因子 |
| 1.3.1.1 生肌决定因子(MyoD) |
| 1.3.1.2 成肌因子5(Myf5) |
| 1.3.1.3 肌细胞生成素(MyoG) |
| 1.3.1.4 成肌调节因子4(MRF4) |
| 1.3.2 肌细胞増强因子2(Myocyte Enhacer Factors2,MEF2s) |
| 1.3.2.1 肌细胞増强因子2A(MEF2A) |
| 1.3.2.2 肌细胞増强因子2B(MEF2B) |
| 1.3.2.3 肌细胞増强因子2C(MEF2C) |
| 1.3.2.4 肌细胞増强因子2D(MEF2D) |
| 1.3.3 细胞周期调控因子 |
| 1.4 调控成肌细胞增殖与分化的信号通路 |
| 1.4.1 MAPK信号通路 |
| 1.4.2 PI3K/Akt信号通路 |
| 2 Akirin基因家族研究进展 |
| 2.1 发现与成员命名 |
| 2.2 基因组结构组成及分子进化 |
| 2.3 表达模式 |
| 2.4 主要功能 |
| 2.4.1 Akirin基因与骨骼肌发育 |
| 2.4.2 Akirin基因与先天性免疫 |
| 2.4.3 Akirin基因与肿瘤发生 |
| 3 鸟类Akirin2 基因研究进展 |
| 4 研究内容和目的意义及研究思路 |
| 4.1 研究内容和目的意义 |
| 4.2 技术路线 |
| 第二章 Akirin基因家族分子进化分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 所用网站 |
| 2.2 所用软件 |
| 2.3 系统进化树构建 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鸟类Akirin基因blast比对分析 |
| 3.2 Akirin基因家族系统进化分析 |
| 3.3 Akirin基因家族保守蛋白结构域分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 过表达Akirin2 对鸭成肌细胞分化的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验动物与试剂 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 药品和试剂 |
| 2.1.3 主要试验仪器 |
| 2.1.4 常用试剂配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 总RNA的提取及质量检测 |
| 2.2.2 cDNA的合成 |
| 2.2.3 鸭Akirin2 基因真核表达载体构建及酶切鉴定 |
| 2.2.4 鸭成肌细胞培养 |
| 2.2.5 鸭成肌细胞诱导分化 |
| 2.2.6 成肌细胞RNA的提取及反转录 |
| 2.2.7 实时荧光定量PCR |
| 2.2.8 Western Blot |
| 2.2.9 细胞周期测定 |
| 2.2.10 My HC免疫荧光染色 |
| 2.3 数据统计 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鸭成肌细胞分化过程中生肌调控因子表达模式 |
| 3.2 鸭pEGFP-N1-Akirin2 载体转染效率 |
| 3.3 过表达鸭Akirin2 基因对MRFs和 MEFs表达的影响 |
| 3.4 过表达鸭Akirin2 基因对成肌细胞细胞周期的影响 |
| 3.5 过表达鸭Akirin2 基因对My HC表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 过表达Akirin2 对鸭成肌细胞增殖的影响 |
| 1 前言 |
| 2 试验材料与方法 |
| 2.1 试验动物与试剂 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 药品和试剂 |
| 2.1.3 主要试验仪器 |
| 2.1.4 常用试剂配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 总RNA的提取及质量检测 |
| 2.2.2 cDNA的合成 |
| 2.2.3 鸭pEGFP-N1-Akirin2 载体的构建 |
| 2.2.4 鸭成肌细胞培养 |
| 2.2.5 pEGFP-N1-Akirin2 重组质粒转染以及雷帕霉素处理成肌细胞 |
| 2.2.6 成肌细胞RNA的提取及反转录 |
| 2.2.7 实时荧光定量PCR |
| 2.2.8 Western Blot |
| 2.2.9 CCK-8 细胞增殖活性检测 |
| 2.3 数据统计 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 过表达鸭Akirin2 对成肌细胞细胞活性的影响 |
| 3.2 过表达鸭Akirin2 对周期因子表达的影响 |
| 3.3 过表达鸭Akirin2 基因对蛋白代谢调控因子表达的影响 |
| 3.4 雷帕霉素对鸭Akirin2 基因调控胞内蛋白代谢相关因子表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 miR-365 介导Akirin2 表达对鸭成肌细胞增殖的影响 |
| 1 前言 |
| 2 试验材料与方法 |
| 2.1 试验动物与试剂 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 药品和试剂 |
| 2.1.3 主要试验仪器 |
| 2.1.4 常用试剂配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 总RNA的提取及质量检测 |
| 2.2.2 cDNA的合成 |
| 2.2.3 双荧光素酶报告载体及其突变载体的构建 |
| 2.2.4 鸭成肌细胞培养 |
| 2.2.5 实时荧光定量PCR |
| 2.2.6 Western Blot |
| 2.2.7 BrdU免疫荧光染色 |
| 2.3 数据统计 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 不同物种Akirin23’UTR区域保守性分析 |
| 3.2 鸭Akirin23’UTR的 microRNA预测及双荧光素酶报告载体构建 |
| 3.3 过表达miR-365 对鸭成肌细胞增殖活性的影响 |
| 3.4 过表达miR-365 对胞内蛋白代谢相关因子表达的影响 |
| 3.5 过表达miR-365 对周期蛋白相关调控因子表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第六章 异源表达Akirin1 影响鸭成肌细胞分化的分子机制 |
| 1 前言 |
| 2 试验材料与方法 |
| 2.1 试验动物与试剂 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 药品和试剂 |
| 2.1.3 主要试验仪器 |
| 2.1.4 常用试剂配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 总RNA的提取及质量检测 |
| 2.2.2 cDNA的合成 |
| 2.2.3 鼠pEGFP-N1-Akirin1 载体构建 |
| 2.2.4 鸭成肌细胞培养 |
| 2.2.5 鸭成肌细胞诱导分化 |
| 2.2.6 pEGFP-N1-Akirin1与LY294002或SB203580 处理成肌细胞 |
| 2.2.7 成肌细胞RNA的提取及反转录 |
| 2.2.8 实时荧光定量PCR |
| 2.2.9 Western Blot |
| 2.2.10 细胞周期测定 |
| 2.2.11 免疫荧光染色 |
| 2.3 数据统计 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 pEGFP-N1-Akirin1 载体转染效率检测 |
| 3.2 异源表达鼠Akirin1 基因对生肌调控因子表达的影响 |
| 3.3 异源表达鼠Akirin1 基因对p38MAPK信号通路相关因子表达的影响 |
| 3.4 SB203580 与鼠Akirin1 共处理对p38MAPK/MRF4 相关基因表达的影响 |
| 3.5 异源表达鼠Akirin1 基因对生肌调控因子增强子表达的影响 |
| 3.6 异源表达鼠Akirin1 基因对IGF-II/PI3K/Akt相关因子表达的影响 |
| 3.7 LY294002 与鼠Akirin1 共处理对IGF-II/PI3K/Akt相关基因表达的影响 |
| 3.8 异源表达鼠Akirin1 基因对成细胞周期相关因子表达的影响 |
| 3.9 LY294002 与鼠Akirin1 共处理对细胞周期相关因子表达的影响 |
| 3.10 异源表达鼠Akirin1 基因对成肌细胞肌管生成的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第七章 总结 |
| 1 主要结论 |
| 2 创新点 |
| 3 下一步需开展的工作 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）斑马鱼性腺和心脏可塑性再生的表观遗传调节机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1.1 表观遗传调控细胞可塑性的研究进展 |
| 1.2 斑马鱼性腺和心脏可塑性的再生机制 |
| 1.2.1 斑马鱼性腺可塑性的机制 |
| 1.2.2 斑马鱼心脏可塑性的再生机制 |
| 1.3 miRNA,组蛋白修饰调节性腺和心脏发育的研究进展 |
| 1.3.1 miRNA调节性别分化的研究进展 |
| 1.3.2 组蛋白修饰调节心脏发育的研究进展 |
| 1.4 研究的目的和意义 |
| 第二章 miRNA在斑马鱼性腺细胞可塑性调控机制的研究 |
| 第一节 显微注射特异的miRNA-Sox9 混合物能促进性腺的更新 |
| 2.1.1 实验用品 |
| 2.1.1.1 实验用鱼 |
| 2.1.1.2 实验试剂 |
| 2.1.1.3 仪器设备 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.2.1 荧光定量PCR |
| 2.1.2.2 体内显微注射 |
| 2.1.2.3 石蜡切片HE染色 |
| 2.1.2.4 细胞计数分析 |
| 2.1.2.5 冰冻切片 |
| 2.1.3 实验结果 |
| 2.1.3.1 检测预筛选miRNA在精卵巢内源性前体的表达 |
| 2.1.3.2 过表达、敲降 Sox9a/Sox9b 对 mi RNAs 前体表达量的影响 |
| 2.1.3.3 miRNA-Sox9 混合物对青春期斑马鱼性腺发育的影响 |
| 2.1.3.4 miRNA-Sox9 混合物对老年斑马鱼性腺发育的影响 |
| 2.1.3.5 miRNA-Sox9 混合物对老年vasa-GFP青鳉性腺发育的影响 |
| 2.1.4 讨论 |
| 第二节 miR430a/miR218a在预选GPCR基因的靶点验证 |
| 2.2.1 实验用品 |
| 2.2.1.1 实验用鱼 |
| 2.2.1.2 实验试剂 |
| 2.2.1.3 仪器设备 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.2.1 pMIR-GFP报告基因终载体克隆 |
| 2.2.2.2 细胞转染 |
| 2.2.2.3 细胞荧光量化分析 |
| 2.2.3 结果 |
| 2.2.3.1 预测特异的miRNA靶向GPCR的调控模式 |
| 2.2.3.2 pMIR-GFP报告重组载体的构建 |
| 2.2.3.3 验证miR218a/miR430a在 GPCR靶点 |
| 2.2.4 讨论 |
| 第三节 miR430a和 miR218a反向调节Sox9a/Sox9b蛋白的活性 |
| 2.3.1 实验用品 |
| 2.3.1.1 实验用鱼 |
| 2.3.1.2 实验试剂 |
| 2.3.1.3 仪器设备 |
| 2.3.2 实验方法 |
| 2.3.2.1 IP-质谱分析实验 |
| 2.3.2.2 体内外蛋白免疫印迹实验 |
| 2.3.2.3 WB验证信号通路相关激酶的表达水平实验 |
| 2.3.2.4 WB灰度分析 |
| 2.3.2.5 免疫组化实验 |
| 2.3.3 结果 |
| 2.3.3.1 miR430a/miR218a影响Sox9a/Sox9b的化学修饰 |
| 2.3.3.2 miR430a/miR218a影响体内体外Sox9a/Sox9b蛋白大小 |
| 2.3.3.3 miR430a/miR218a通过调节G蛋白信号通路相关激酶调控Sox9a/Sox9b的生物活性 |
| 2.3.4 讨论 |
| 小结 |
| 第三章 组蛋白修饰对斑马鱼心脏再生过程中细胞可塑性的影响 |
| 第一节 数据分析斑马鱼心脏再生过程中组蛋白修饰的变化与基因表达量的关系 |
| 3.1.1 实验用品 |
| 3.1.1.1 实验用鱼 |
| 3.1.1.2 实验试剂 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.2.1 染色体免疫共沉淀(chromatin immunopreciptation) |
| 3.1.2.2 荧光定量PCR |
| 3.1.2.3 转录组测序分析步骤 |
| 3.1.3 实验结果 |
| 3.1.3.1 组蛋白甲基化乙酰化修饰反向富集于与芽基组织相关基因启动子处 |
| 3.1.3.2 斑马鱼心脏再生过程中组蛋白修饰与表达量的相关性分析 |
| 3.1.3.3 分析斑马心脏再生过程中acta2,Flk1(kdrl),pax3a基因组蛋白修饰的变化 |
| 3.1.4 讨论 |
| 第二节 组蛋白修饰抑制剂对斑马鱼心脏再生的影响 |
| 3.2.1 实验用品 |
| 3.2.1.1 实验用鱼 |
| 3.2.1.2 实验试剂 |
| 3.2.1.3 实验器材 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.2.1 免疫组化实验 |
| 3.2.2.2 labtek体外验证组蛋白抑制剂对细胞骨架影响的实验 |
| 3.2.3 结果 |
| 3.2.3.1 组蛋白抑制剂对斑马鱼心脏再生的影响 |
| 3.2.3.2 体外实验验证组蛋白抑制剂对细胞骨架的影响 |
| 3.2.4 讨论 |
| 小结与展望 |
| 全文结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（6）转录因子GATA4调控神经嵴细胞进而影响相关衍生组织发育的机制研究（论文提纲范文）
| 缩写词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 第一部分 Wnt1-Cre;Gata4~(fl/fl)条件性敲基因小鼠表型分析 |
| 结果 |
| 1.GATA4在小鼠颅颌面部时空表达分析 |
| 2.神经嵴细胞条件性敲除GATA4后对小鼠骨组织发育及矿化的影响 |
| 3.神经嵴细胞条件性敲除GATA4后对小鼠牙齿发育的影响 |
| 4.神经嵴细胞条件性敲除GATA4后对小鼠心脏发育的影响 |
| 5.神经嵴细胞条件性敲除GATA4后对神经嵴细胞迁徙时期的影响 |
| 6.神经嵴细胞条件性敲除GATA4后对神经嵴分化时期的影响 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 GATA4调控神经嵴细胞的体外机制研究 |
| 结果 |
| 1.神经嵴细胞敲低GATA4后对细胞增殖凋亡的影响 |
| 2.神经嵴细胞敲低GATA4后对细胞迁徙分化的影响 |
| 3.神经嵴细胞敲除GATA4后对神经嵴相关基因表达的影响 |
| 4.神经嵴细胞敲低GATA4 后通过同位素标记相对和绝对定量技术来筛选GATA4 潜在下游靶基因 |
| 5.Barx1 是否为GATA4 的直接靶基因的实验研究 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 gata4 调控barx1 进而影响神经嵴发育的体内验证 |
| 结果 |
| 1.斑马鱼体内敲低gata4后对下颌弓及心脏发育的影响 |
| 2.斑马鱼体内敲低gata4后对彩虹色素生成的影响 |
| 3.斑马鱼体内敲低gata4 后对咽弓处barx1 表达的影响 |
| 4.barx1拯救实验对斑马鱼下颌弓及心脏发育的影响 |
| 5.barx1拯救实验对斑马鱼彩虹色素生成的影响 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 攻读学位期间获奖情况 |
| 致谢 |
（7）果蝇TSMR1对心脏发育基因启动子活性的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 果蝇是心脏发育研究的模式动物 |
| 1.2 果蝇心脏的发育特征 |
| 1.3 果蝇心脏发育的相关基因及信号途径 |
| 1.3.1 Eve基因和Zfh-1 基因 |
| 1.3.2 Odd基因 |
| 1.3.3 Svp基因 |
| 1.3.4 TGF-β途径以梯度依赖性调控细胞间相互作用 |
| 1.4 双荧光素酶报告系统 |
| 1.5 本课题的研究意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 酶类和试剂盒 |
| 2.1.2 菌株和质粒 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 缓冲液 |
| 2.1.5 使用仪器 |
| 2.1.6 生物信息学分析的常用软件与数据库 |
| 2.1.7 实验中所使用的果蝇品系 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 常用试剂及培养基配制 |
| 2.2.2 果蝇基因组DNA的制备 |
| 2.2.3 Zfh1、Svp、Eve、Prc、Smox、Odd基因的生物信息学分析 |
| 2.2.4 引物设计与合成 |
| 2.2.5 PCR扩增 |
| 2.2.6 PCR产物的纯化回收 |
| 2.2.7 Clon Express~(TM) Ⅱ同源重组(一步克隆法)实验 |
| 2.2.8 感受态细胞的制备(CaCl_2法) |
| 2.2.9 连接产物转化(热休克法) |
| 2.2.10 质粒的小量制备 |
| 2.2.11 阳性克隆的筛选与鉴定 |
| 2.2.12 荧光素酶报告系统分析 |
| 第三章 实验结果与讨论 |
| 3.1 心脏发育基因启动子报告质粒的构建 |
| 3.1.1 pGL3-Eve基因启动子报告质粒的构建 |
| 3.1.2 pGL3-Smox基因启动子报告质粒的构建 |
| 3.1.3 pGL3-Odd基因启动子报告质粒的构建 |
| 3.1.4 pGL3-Prc基因启动子报告质粒的构建 |
| 3.1.5 pGL3-Svp基因启动子报告质粒的构建 |
| 3.1.6 pGL3-Zfh1 基因启动子报告质粒的构建 |
| 3.2 果蝇TSMR1对心脏发育基因启动子转录活性研究 |
| 3.2.1 TSMR1 基因在HEK293 细胞中的表达情况 |
| 3.2.2 TSMR1对心脏发育基因启动子活性的影响 |
| 3.3 心脏发育基因启动子分段研究 |
| 3.3.1 Svp基因启动子分段研究 |
| 3.3.2 Prc基因启动子分段研究 |
| 3.3.3 Smox基因启动子分段研究 |
| 3.3.4 Zfh1基因启动子分段研究 |
| 第四章 其他工作 |
| 第五章 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（8）MicroRNA介导的组织特异性基因调控网络研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 论文的主要创新点 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 miRNA的介绍 |
| 1.1.1 miRNA的功能 |
| 1.1.2 miRNA靶基因的预测 |
| 1.2 miRNA的转录调控 |
| 1.2.1 miRNA的生成模型 |
| 1.2.2 miRNA的转录起始位点(TSS) |
| 1.3 miRNA参与的基因调控网络 |
| 1.3.1 网络的概念 |
| 1.3.2 网络的拓扑学性质 |
| 1.3.2.1 距离,平均路径长度和直径 |
| 1.3.2.2 六度分割理论 |
| 1.3.2.3 度分布 |
| 1.3.2.4 聚类系数 |
| 1.3.3 基因调控网络 |
| 1.3.3.1 传统的转录调控网络 |
| 1.3.3.2 miRNA参与的基因调控网络 |
| 1.4 网络模体(motif) |
| 1.4.1 网络motif的定义 |
| 1.4.2 转录调控网络中的motif |
| 1.4.3 miRNA参与的网络motif |
| 1.5 本文的研究内容 |
| 第二章 预测细胞特异性的miRNA转录起始位点 |
| 2.1 背景 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 人类基因组miRNA基因和Refseq注释基因 |
| 2.2.2 细胞特异性的H3K4me3组蛋白修饰数据 |
| 2.2.3 物种保守性得分 |
| 2.2.4 DNase Ⅰ超敏感位点 |
| 2.2.5 定位miRNA TSS |
| 2.2.6 收集参照数据 |
| 2.2.7 表达序列标签(EST)数据 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 细胞特异性地预测miRNA TSS流程图 |
| 2.3.2 评估预测的TSS |
| 2.3.2.1 与参照数据集比较 |
| 2.3.2.2 预测的pri-miRNAs和TSSs的存在证据 |
| 2.3.2.3 总的物种保守性特征 |
| 2.3.3 预测的TSS的统计 |
| 2.3.4 TSS距pre-miRNA的距离 |
| 2.3.5 长非编码RNA (lncRNA)和pri-miRNA |
| 2.3.6 表达的miRNA的TSS附近的CAGE片段 |
| 2.3.7 intergenic miRNA利用可变TSS实现细胞特异性的调控 |
| 2.4 总结和讨论 |
| 第三章 非编码RNA调控关系的预测 |
| 3.1 背景 |
| 3.2 miRNA对靶基因的调控关系的整合 |
| 3.3 TF对miRNA的调控关系的预测 |
| 3.3.1 系统地预测TF-miRNA调控关系 |
| 3.3.2 心脏细胞系中miRNA的转录调控 |
| 3.4 TF对lncRNA的调控关系的预测 |
| 3.5 总结和讨论 |
| 第四章 组织特异的基因调控网络的结构 |
| 4.1 背景 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 网络构建 |
| 4.2.2 入中心节点,出中心节点和特异度指数 |
| 4.2.3 中心节点的标准差(σ_(RF)) |
| 4.2.4 Motif搜索 |
| 4.2.5 公有的(CM)和特异的(TS) motif实例中基因的统计检验 |
| 4.2.5.1 分子组成 |
| 4.2.5.2 平均度 |
| 4.2.5.3 统计检验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 组织调控网络及其一般性质 |
| 4.3.2 度分布 |
| 4.3.3 中心节点倾向于被公有 |
| 4.3.4 中心节点的开关转换 |
| 4.3.5 基本的调控回路:共享的(CM)和组织特异的(TS)网络模体 |
| 4.3.6 网络motif的稳定性 |
| 4.3.7 CM-TS组合的领结型结构 |
| 4.3.8 领结型结构的模式 |
| 4.3.9 组织特异性基因调控网络motif数据库的构建 |
| 4.3.9.1 数据库设计 |
| 4.3.9.2 数据收集 |
| 4.3.9.3 数据库原型展示 |
| 4.4 总结和讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 科研成果 |
| 致谢 |
（9）小鼠心脏发育相关基因调控网络的生物信息学分析（论文提纲范文）
| 1 引 言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 相关基因序列 |
| 2.2 启动子区域分析工具 |
| 2.3 分析方法 |
| 3 分析结果 |
| 3.1 Nkx2.5 |
| 3.2 Mef2c Mef2c的基因序列在物种间具有很好的保守性, 其保守结构域具有高度的序列同源性 (见图2) 。在UCSC组数据库中找到小鼠Mef2c基因序列, 并提取其上游2000bp长度的序列作为Mef2c的启动子区域, 利用PromoterScan、CONSITE、Tfsitescan Service、TFSEARCH、Cister和JASPAR数据库进行转录因子结合位点的分析。预测的结果经过筛选之后得到小鼠Mef2c基因启动子区域的核心转录因子的结合位点, 见表1。可以看出在Mef2c启动子区域有转录因子Nkx2.5和Gata4的结合位点, 结合位点分别为六个和两个。 |
| 3.3 Hand1 |
| 3.4 Gata4, Gata6 |
| 3.5 Tbx5 |
| 4 讨论 |
四、心脏发育的基因调控（论文参考文献）
- [1]复杂心脏疾病相关的miRNA调控网络与模块识别研究[D]. 王光斌. 电子科技大学, 2021(01)
- [2]ATAC测序鉴定牦牛基因组非编码保守元件[D]. 窦嘉佳. 兰州大学, 2020(01)
- [3]TBX1基因下游心脏发育相关差异表达基因筛选及功能研究[D]. 曹美玲. 中国医科大学, 2020
- [4]Akirin基因调控鸭成肌细胞增殖与分化的作用研究[D]. 孙文强. 四川农业大学, 2019(07)
- [5]斑马鱼性腺和心脏可塑性再生的表观遗传调节机制研究[D]. 郭会萍. 上海海洋大学, 2019(06)
- [6]转录因子GATA4调控神经嵴细胞进而影响相关衍生组织发育的机制研究[D]. 郭舒瑜. 南京医科大学, 2018(01)
- [7]果蝇TSMR1对心脏发育基因启动子活性的影响[D]. 颜尔聪. 湖南师范大学, 2017(04)
- [8]MicroRNA介导的组织特异性基因调控网络研究[D]. 华旭. 南京大学, 2015(06)
- [9]小鼠心脏发育相关基因调控网络的生物信息学分析[J]. 张慧,陆祖宏. 生物医学工程研究, 2011(02)
- [10]Islet1基因与心脏发育[J]. 王磊,侯玲玲,关伟军,马月辉. 中国生物化学与分子生物学报, 2010(05)