一、柯萨奇-腺病毒受体在外周血不同类型白细胞的表达（论文文献综述）
沈阳坤[1]（2020）在《HSV-1溶瘤病毒用于肿瘤精准治疗及肿瘤耐受机制的研究》文中指出溶瘤病毒疗法（Oncolytic virus therapy,OVT）作为一种前景广阔的肿瘤治疗手段,具有安全、高效和副作用低的特点,已经成为肿瘤治疗研究中的热点。其中,I型单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus type 1,HSV-1）作为研究最为广泛的一类溶瘤病毒,已有几十种候选药物处于临床前或临床研究阶段。然而,多年的临床试验表明,单一的溶瘤病毒疗法只有有限的治疗效果,且具体机制尚不明确。宿主中的一些蛋白质对病毒的侵染、繁殖以及传染至关重要,被称为病毒的宿主依赖因子（Host Dependency Factor,HDF）。已有证据表明,细胞和动物水平HDF的缺陷,会导致病毒的感染失败。然而尽管目前已有针对HSV-1复制周期及HSV-1的免疫机制等方面的深入研究,但对病毒与宿主间的相互作用的理解,特别是涉及病毒感染和裂解复制的细胞质蛋白的作用仍然所知甚少。此外,肿瘤患者体内的HDF突变是否影响HSV-1类溶瘤病毒的治疗尚未见系统研究。本论文研究的目的是探讨HSV-1病毒HDF突变在溶瘤病毒精准治疗中的作用及肿瘤耐受的机制。方法:（1）利用CRISPR/Cas9技术制备ICP34.5基因缺失的HSV-1溶瘤病毒HSV-1-ΔICP34.5、HSV-1病毒受体Nectin1基因缺失的小鼠结肠癌MC38细胞MC38Nectin1-/-和表达NEO-2/15的HSV-1溶瘤病毒HSV-1-NEO-2/15。（2）制备小鼠B16黑色素瘤模型和小鼠MC38结肠肿瘤模型,利用HSV-1-ΔICP34.5溶瘤病毒治疗并评估治疗效果。（3）制备小鼠MC38结肠肿瘤模型,利用HSV-1-ΔICP34.5和HSV-1-NEO-2/15溶瘤病毒治疗并评估治疗效果。（4）利用人类CRISPR全基因组敲除文库结合高通量测序技术筛选HSV-1病毒的HDF。（5）通过统计学、基因富集分析、KEGG通路分析、PANTHER GO分析和基因重叠分析等方法确定HSV-1病毒HDF的候选基因。（6）利用CRISPR/Cas9技术制备Nectin1、ENTPD1、HCFC1R1、EXT1、EXT2、EXTL3、Tm9sf3和B3GALT6等基因的敲除细胞并通过病毒感染、台盼蓝法、细胞计数法、q PCR和Western Blotting检测HDF缺失对病毒感染的影响。（7）通过HSV-1病毒的膜结合实验评估HSV-1病毒的HDF缺失后病毒和宿主细胞的结合能力。（8）通过共聚焦显微镜追踪HSV-1病毒进入细胞的过程。（9）利用TCGA数据库分析临床肿瘤患者体内HSV-1病毒HDF的突变频率。结果:（1）HSV-1-ΔICP34.5溶瘤病毒治疗对小鼠MC38结肠癌治疗效果显着,然而对B16黑色素瘤未见明显效果。接着,我们利用HSV-1-ΔICP34.5溶瘤病毒治疗HSV-1病毒受体Nectin1基因缺失的小鼠结肠癌,结果显示,和对照组相比,Nectin1基因缺失的小鼠肿瘤体积未见明显缩小,证实溶瘤病毒对小鼠MC38-ΔNectin1结肠肿瘤的治疗无效。（2）本研究中,利用CRISPR基因编辑技术,我们成功制备HSV-1-NEO-2/15新型溶瘤病毒。通过对小鼠MC38结肠肿瘤的治疗,我们的研究结果表明,NEO-2/15不仅可以和HSV-1溶瘤病毒同时使用,并且NEO-2/15的整合能够显着增强溶瘤病毒的治疗效果。（3）利用人类CRISPR全基因组敲除文库结合高通量测序技术,结合统计学、基因富集分析、KEGG通路分析、PANTHER GO分析和基因重叠分析等分析方法,我们最终得到了31个HSV-1病毒的候选HDF基因。通个基因敲除验证,我们已经证实细胞水平敲除Nectin1、ENTPD1、HCFC1R1、EXT1、EXT2、EXTL3、Tm9sf3和B3GALT6可以显着增强细胞抵抗HSV-1病毒感染的能力。此外,KEGG分析结果表明EXT1、EXT2、EXTL3和B3GALT6等基因在硫酸乙酰肝素合成通路中扮演重要作用。基因敲除结果表明这些基因的突变不仅能够显着降低HSV-1病毒对宿主的感染水平,而且还能降低病毒与宿主细胞的结合能力。ENTPD1基因的缺失只影响HSV-1病毒进入宿主细胞,并不影响病毒与细胞膜的结合。（4）根据TCGA数据库提供的肿瘤患者基因信息,大部分基因在至少一种肿瘤中存在突变,且部分基因的突变频率高达5%以上,意味着HSV-1溶瘤病毒对这些肿瘤可能得不到很好的治疗效果,暗示HDF的精准检测在溶瘤病毒治疗前的必要性。结论:本研究中,基于HDF突变引起的溶瘤病毒感染失败的现象,我们首次提出溶瘤病毒抵抗（Oncolytic virus resistance）的概念,即当患者体内发生溶瘤病毒HDF的突变,溶瘤病毒的治疗效果就会消失;或者治疗前期溶瘤病毒对肿瘤的效果显着,但是随着肿瘤细胞增殖过程中异质性分化的更加明显,部分肿瘤细胞的HSV-1宿主依赖因子的表达水平降低或者发生基因突变,导致HSV-1病毒的感染减少或者失败,最终影响溶瘤病毒的治疗效果。基于此概念,寻找新的肿瘤治疗药物并用于溶瘤病毒的联合治疗是该治疗领域的一个重要研究方向。因此,我们构建了一种新型HSV-1类溶瘤病毒HSV-1-NEO-2/15,能显着增强肿瘤的治疗效果。此外,利用CRISPR全基因组敲除文库筛选出多个HSV-1的HDF,并深入探讨了部分基因的功能。近年来国内溶瘤病毒治疗的临床研究越来越多,而专门针对溶瘤病毒的精准医疗检测尚未见报道。本研究证实了根据HSV-1病毒HDF的突变与否可以判断患者能否获益于溶瘤病毒的治疗,以减少不当治疗带来的病情延误和资源浪费。未来,通过对这些蛋白的深入研究,将为开发HSV-1类溶瘤病毒耐药检测试剂盒以及为肿瘤患者制定个性化治疗方案提供研究依据。同时依据这些靶点,可以开发出新的抗HSV-1病毒药物,为溶瘤病毒治疗后因病毒残留带来的潜在感染风险提供新的解决方案,把溶瘤病毒治疗的副作用降到最低。
王子璇[2]（2020）在《TRAIL修饰溶瘤腺病毒靶向治疗急性髓系白血病的研究》文中研究表明急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）是一种异质性的血液系统恶性肿瘤,对人类的健康构成了严重的威胁。目前,AML的临床治疗仍旧是以放化疗、骨髓移植为主。尽管治疗手段在逐渐进步,但AML患者的整体存活率仍旧很低。对于一线化疗药物产生耐药反应是导致治疗失败的最主要原因,因此继续寻求新的治疗方式是当前AML治疗的首要任务。随着生命科学和医学研究的深入发展,溶瘤病毒（Oncolytic virus）成为目前治疗恶性肿瘤的一个重要发展方向。然而,由于靶向性较弱和感染效率不足,利用溶瘤病毒治疗白血病等血液系统恶性肿瘤目前仍然受到限制。溶瘤腺病毒是恶性肿瘤溶瘤病毒疗法研究中应用最为广泛的病毒类型之一。然而,受给药方式（目前主要通过瘤内给药）的限制,溶瘤腺病毒治疗血液恶性肿瘤的研究较少。在课题组的前期研究中,我们利用亮氨酸拉链异二聚体系统,通过对腺病毒衣壳蛋白进行结构改造修饰,成功构建了一种靶向型溶瘤腺病毒载体（rAd5pz-zTRAIL-RFP-SΔ24E1a,A4）。该载体可以通过静脉给药对乳腺癌小鼠模型产生较好的治疗效果。因此,本论文希望通过对载体进行优化,进一步考察其应用于AML治疗的潜力。溶瘤腺病毒A4可以表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）,且能够利用亮氨酸拉链（zipper）连接于病毒表面,从而靶向肿瘤细胞并增强肿瘤杀伤能力。因此,论文首先检测了AML细胞系和原代细胞表面腺病毒受体和TRAIL受体的表达水平。结果显示:在永生型AML细胞系THP-1和MV4-11均表达较高水平的死亡受体DR4、DR5,但假死亡受体（DcR1和DcR2）表达水平较低,并且两株细胞均表达较低水平的腺病毒受体（CAR,整合素αvβ3和整合素αvβ5）。而在所检测的19例AML患者来源的原代细胞中,有50%以上的样本表达中等水平的DR4、DR5。这一结果对经过我们改造的重组溶瘤腺病毒载体的应用奠定了基础。前期研究发现,尽管A4病毒的衣壳表面通过zipper修饰有TRAIL,但病毒衣壳修饰的TRAIL量小于理论值。所以,为了进一步提升A4的肿瘤靶向能力,我们首先构建了C端融合亮氨酸拉链zipper E·E34单链的截短型TRAIL的融合蛋白z-sTRAIL的原核表达质粒pET-28a-z-sTRAIL,并在大肠杆菌内成功表达并纯化出z-sTRAIL蛋白。在验证了z-sTRAIL的基本生物学活性后,将z-sTRAIL蛋白与腺病毒衣壳pIX修饰有zipper R·R34单链的病毒进行体外共孵育,经过CsCl密度梯度离心的方法对其进行纯化。通过对其进行dot blot和ELISA检测后证实,经过体外优化可以得到比A4病毒衣壳TRAIL修饰量多出一倍的重组溶瘤腺病毒载体,优化后的载体命名为zA4。通过对THP-1和MV4-11细胞进行感染分析,我们发现zA4对AML细胞的感染能力明显优于A4和衣壳未经修饰的A3病毒。并且通过THP-1与病毒的结合与内在化实验进一步证明了病毒载体表面修饰的TRAIL蛋白越多,越有利于增强病毒载体对THP-1细胞的结合能力。随后通过体外的抑瘤效果评价我们可以发现,以不同MOI病毒（A3、A4和zA4）分别感染THP-1和MV4-11细胞,三种溶瘤腺病毒均可以诱导剂量依赖的AML细胞毒性。并且对人正常淋巴T细胞H9无明显杀伤。并且以相同方法对19例AML患者的原代细胞样本进行相同的细胞毒性分析,结果表明三种溶瘤腺病毒均可以对原代AML细胞造成明显杀伤,并且杀伤能力随着病毒衣壳TRAIL蛋白修饰量的增加而增强。之后,使用THP-1细胞在Balb/c裸鼠中进行了体内抑瘤效果评价。我们成功建立了皮下荷瘤模型和静脉荷瘤模型两种AML模型。在两种模型中,三种病毒均有较明显的肿瘤靶向效果和抑制肿瘤效果,并且zA4显示出最佳的肿瘤靶向能力和效果最明显肿瘤细胞杀伤能力。由于发现溶瘤病毒在部分TRAIL受体表达较低的原代AML细胞中活性并不理想,因此为了进一步提升重组溶瘤腺病毒zA4在TRAIL死亡受体相对低表达的肿瘤细胞系中的杀伤能力,我们针对TRAIL活性进行了化药筛选。研究结果表明,人参皂苷Rh2能够提升肿瘤细胞的死亡受体表达,从而增强TRAIL引起的细胞凋亡活性。并且发现在同时应用低剂量的Rh2与低剂量的sTRAIL联合后,可以降低sTRAIL的半数抑制浓度IC50,二者之间存在着较强的协同作用。之后我们分别使用永生化AML细胞系THP-1与原代AML细胞分别进行了Rh2联合zA4的体外抑瘤效果评价,发现Rh2在这两类AML细胞中均能够显着增强zA4的肿瘤杀伤能力。最后,我们利用静脉荷瘤模型对这种联合疗法进行了体内评价验证。实验结果表明,这种联合治疗的方式可以有效地抑制肿瘤细胞的增殖及肝浸润现象,并且有效地延长了小鼠的生存期。综上所述,在本论文的研究中,我们通过对前期获得的靶向型溶瘤腺病毒进行优化,获得了具有更多TRAIL蛋白修饰的溶瘤腺病毒载体zA4。然后利用AML细胞系和原代AML细胞在体外细胞水平验证了zA4具有较好的抗肿瘤活性,并在裸鼠荷瘤模型中通过静脉注射的方式进行治疗性评价,证实优化后的zA4具有更强的肿瘤靶向能力及更强的抑瘤效果。此外,Rh2与zA4的联合应用增强了zA4对原代AML细胞和移植型AML裸鼠模型的靶向治疗效果。本研究提供了将溶瘤腺病毒载体应用于治疗包括AML在内的血液系统恶性肿瘤中的可行性。
瞿静[3]（2020）在《肺癌靶向性丝素/ING4-IL-24双基因共表达腺病毒复合物》文中研究表明肺癌是威胁人类健康的重大疾病之一。恶性肿瘤的基因疗法因具有针对性强、毒副作用小、疗效好等优势而备受关注。生长抑制因子4（ING4）和白细胞介素-24（IL-24）基因能分别从细胞内、外两条途径抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡。腺病毒作为基因传递载体能够高效地传递和表达目的基因,但因存在免疫原性风险、高滴度时的细胞毒性、对固有受体细胞的趋向性等不足,限制了其在临床的广泛应用。柞蚕丝素蛋白具有优异的生物相容性和低免疫原性,并且包含的大量极性氨基酸残基赋予其丰富的化学反应活性和修饰位点。为了进一步提高腺病毒作为ING4-IL-24双基因传递载体的感染效率,以减少其有效使用滴度,降低其毒副作用,同时为了保护腺病毒免受腺病毒血清抗体的中和,本课题研制一种新型的肺癌靶向性的阳离子化柞蚕丝素/ING4-IL-24双基因共表达腺病毒复合物。通过体外实验和动物实验,研究该复合物对肺癌细胞的靶向感染作用、抑制生长作用、促进凋亡作用,以及对正常组织细胞的毒性。以期使用较低滴度的腺病毒,达到有效的抑制肺癌效果,避免使用高滴度腺病毒的潜在毒副作用。为实现这一目标,本文采用低分子量聚乙烯亚胺对柞蚕丝素蛋白进行阳离子化改性,并在丝素蛋白的侧链接枝肺癌细胞特异性寡肽C9（CSNIDARAC）,用此肺癌细胞靶向的阳离子化柞蚕丝素包被ING4-IL-24双基因共表达腺病毒,获得肺癌靶向性丝素/ING4-IL-24双基因共表达复合物。体外研究复合物对肺癌细胞H460的靶向作用、感染效率、抑制增殖和诱导凋亡作用,体内研究复合物对小鼠H460肺癌移植瘤的生长抑制作用及抑癌机制,同时通过体外、体内实验,分析和评价复合物对正常细胞脐静脉内皮细胞HUVEC和正常组织的毒副作用。首先,构建ING4-IL-24双基因共表达腺病毒载体。将ING4-IL-24双基因共表达转移质粒与腺病毒骨架质粒同源重组后感染人胚肾细胞QBI-293A,多次扩增后获得ING4-IL-24双基因共表达腺病毒（Ad）。Western blotting和ELISA测试结果表明,腺病毒能介导外源性的ING4和IL-24基因在人胚肾细胞QBI-293A细胞中表达。其次,在碳二亚胺的介导下,使低分子量聚乙烯亚胺（PEI）的氨基与柞蚕丝素蛋白（ASF）的羧基偶联后生成酰胺键,获得阳离子化柞蚕丝素蛋白（CASF）。当参加反应的PEI占柞蚕丝素的质量百分比为4%时,改性后柞蚕丝素蛋白的表面Zeta电位达到+12.03 mV,接枝效率约为86.34%。接着,以3-（2-吡啶二硫）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯作为交联剂,将肺癌细胞特异性寡肽C9以二硫键的形式接枝到阳离子化柞蚕丝素蛋白的侧链,制得肺癌细胞靶向性柞蚕丝素蛋白（CASF-C9）,实验结果表明,CASF-C9的表面Zeta电位较CASF有所下降。为了初步评价CASF-C9装载基因的能力及其生物学效应,先用CASF-C9包装质粒DNA（pDNA）,制备不同质量比的CASF-C9/pDNA复合物。实验结果显示,CASF-C9与pDNA质量比为64/2、128/2、256/2时,能够完全包裹住质粒DNA。CASF-C9/pDNA复合物转染肺癌细胞H460后表达绿色荧光的细胞数量和转染效率显着高于对照组CASF/pDNA复合物,并且接枝寡肽C9的量越高,表达荧光的细胞数量和基因转染效率越高,CASF-C9/pDNA复合物对H460细胞增殖的抑制作用也更显着。在此基础上,用CASF-C9依靠静电吸附作用包被腺病毒载体,制备肺癌靶向性丝素/ING4-IL-24双基因共表达腺病毒复合物CASF-C9/Ad。从形貌、表面Zeta电位和粒径分布的检测结果可知,复合物呈球形或类球形颗粒,其表面Zeta电位和粒径均随着包覆于腺病毒表面的CASF-C9浓度的增加而增大。对CASF-C9进行异硫氰酸荧光素标记,研究短肽C9对肺癌细胞H460的靶向识别作用。激光共聚焦显微镜观察和分析结果表明,接枝短肽C9的CASF-C9及复合物CASF-C9/Ad均能特异性识别并粘附至肺癌细胞H460的表面,提示复合物CASF-C9/Ad具有肺癌细胞靶向性,具有以较低滴度的复合物达到有效感染肺癌细胞的潜力。进一步,用CASF-C9/Ad复合物体外分别感染肺癌细胞H460和脐静脉内皮细胞HUVEC,检测荧光表达和感染效率。研究结果表明,H460细胞和HUVEC细胞感染复合物CASF-C9/Ad后的荧光表达强度和感染效率均显着高于对照组裸Ad。H460细胞感染复合物CASF-C9/Ad后的生长受到了明显的抑制,细胞存活率显着低于对照组裸Ad和CASF/Ad复合物。复合物CASF-C9/Ad中的目的基因ING4和IL-24均能在肺癌细胞H460中有效表达并诱导细胞凋亡。感染复合物CASF-C9/Ad的H460细胞凋亡率显着高于对照组裸Ad和CASF/Ad复合物。而与H460细胞完全不同,HUVEC细胞感染CASF-C9/Ad复合物后,其细胞形态和细胞增殖活力均未受到明显的影响。证明CASF-C9/Ad复合物对肺癌细胞具有明显的靶向性和抑制增殖、促进凋亡效应,而对正常细胞无明显毒性。最后,用ING4-IL-24双基因共表达CASF-C9/Ad复合物体内治疗小鼠H460肺癌移植瘤。肺癌移植瘤的体积变化、肿瘤重量、抑瘤率的检测结果证明,CASF-C9/Ad能显着抑制肺癌移植瘤的生长,抑瘤率显着高于对照组裸Ad和CASF/Ad复合物。经复合物CASF-C9/Ad治疗后的肿瘤组织出现大片坏死灶,肿瘤细胞崩解、胞核染色消失,肿瘤细胞发生肿胀,呈空泡化结构,细胞膜出现连续性破坏。经复合物CASF-C9/Ad治疗后的肿瘤组织坏死程度较对照组裸Ad和CASF/Ad复合物更显着。双基因共表达复合物CASF-C9/Ad能够将目的基因ING4和IL-24高效递送至肺癌细胞,通过下调Ki 67、Bcl-2的表达抑制肺癌细胞增殖;通过上调C Caspase-3、Bax的表达促进肺癌细胞凋亡;通过下调VEGF、CD31的表达阻断肿瘤血管新生,多途径实现对小鼠H460肺癌移植瘤的抑瘤效应。本文将肺癌细胞特异性的寡肽CSNIDARAC接枝到柞蚕丝素蛋白侧链,构建能靶向识别和感染肺癌细胞的阳离子化柞蚕丝素蛋白/ING4-IL-24双基因共表达腺病毒复合物CASF-C9/Ad。该复合物不仅能靶向、高效地将目的基因递送至肺癌细胞,减少腺病毒的有效使用滴度;也能屏蔽腺病毒与宿主的直接作用,保护腺病毒免受血清抗体的中和,降低腺病毒的免疫原性风险;同时对正常细胞无明显毒性。动物实验证明,复合物CASF-C9/Ad通过抑制肺癌细胞增殖、促进肺癌细胞凋亡、阻断肿瘤血管新生等多种途径实现抑瘤效应。
刘青青[4]（2020）在《儿童暴发性心肌炎长链非编码RNA表达谱及其功能分析》文中研究指明研究背景心肌炎（Myocarditis）是一种由多种病因引起的心肌局灶性或弥漫性炎性病变,其特征为心肌坏死及变性、间质炎性细胞浸润。轻者可无明显症状,重者可引起心律失常、心力衰竭、心源性休克,甚至死亡,部分患者可发展成为扩张型心肌病。急性暴发性心肌炎（acute fulminant myocarditis,AFM）指临床表现为骤然起病伴严重血流动力学障碍的急性心肌炎。AFM是心肌炎最为严重以及特殊的类型,其主要特点为具有前驱感染史,临床症状显着且迅速恶化,需要正性肌力药物、机械通气或机械循环辅助装置提供血流动力学支持。目前认为AFM的发病机制主要包括病毒直接损伤和免疫损伤,然而AFM发病的分子机制尚不清楚。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）指一类位于细胞核或细胞质内长度大于200个核苷酸,不参与或很少参与蛋白编码功能,具有多种生物功能的功能性RNA分子。lncRNA可在转录、转录后修饰、蛋白翻译、蛋白修饰以及表观遗传等多个水平上进行分子调控。近年来,越来越多的文献报道,lncRNA在心律失常、心力衰竭以及动脉粥样硬化等心血管疾病中具有的差异表达及一定的分子功能。然而,lncRNA与心肌炎的关系仍有待研究,其在心肌炎中的临床意义暂未见报道。目的探讨lncRNA和mRNA在AFM患儿与健康儿童外周血白细胞中的差异表达,并筛选AFM特异性的lncRNA,以期发现新的AFM生物标志物,同时为AFM的发病机制研究提供基础线索。方法本研究共收集15例AFM患儿以及15例正常儿童的外周血白细胞,其中临床症状典型的3例实验组以及3例对照组采用深圳中科普瑞生物技术有限公司的SinohumanceRNA array V3.0芯片分析差异表达的lncRNA以及mRNA。然后将差异表达的lncRNA和mRNA进行生物信息分析,包括GO和KEGG passway富集分析、lncRNA与miRNA吸附预测、lncRNA的cis/trans靶基因预测、lncRNA-mRNA共表达网络。之后,5例实验组以及5例对照组（包括芯片检测的3例实验组以及3例对照组）进一步采用qRT-PCR法验证芯片数据准确性。最后,15例实验组以及15例对照组（包括上述5例实验组以及5例对照组）采用qRT-PCR法验证NONHSAT253897.1的表达量。结果1.AFM患儿与正常儿童外周血白细胞的芯片数据比较,以差异倍数≥2或≤0.5倍以及P值<0.05作为有差异表达的lncRNA和mRNA截断标准,共有3101个差异表达的lncRNA,其中有1645个lncRNA表达上调,1456个lncRNA表达下调。另外,共有2170个差异表达的mRNA,其中有733个mRNA表达上调,1437个mRNA表达下调。2.GO富集分析提示差异表达的lncRNA在生物过程中主要参与椎体神经元形成、分化,补体激活的负调控,RNA聚合酶Ⅲ启动子转录的正调控,Th17细胞分化,Ⅰ型干扰素的生物合成过程,多细胞生物生长的负调控,甲状腺激素代谢过程,MHC Ⅱ类生物合成过程,抗原受体介导的信号通路的正调控信号通路,Th2细胞分化,前脑神经元形成,Th细胞分化,IL-6产生的负调控,器官生长的积极调控,耐受诱导的调节,B细胞凋亡过程的调控,胸腺T细胞分化的调控,干扰素α的产生,Th1型免疫反应等生物学过程。3.KEGG passway富集分析发现,差异表达的lncRNA在免疫系统以及信号转导通路中主要参与造血细胞谱,T细胞受体信号通路,补体凝血级联,Notch信号通路,抗原递呈,ErbB信号通路,Toll样受体信号通路,NK细胞介导的细胞毒性,Jak-STAT信号通路,FcyR介导的吞噬作用,钙离子信号通路,白细胞跨内皮迁移,MAPK信号通路,磷脂酰肌醇信号系统,FcRI信号通路等生物学过程。4.将差异表达的lncRNA进行cis/trans靶基因预测,研究其是否可以通过AFM相关的信号通路参与基因调控。结果证明lncRNA在T细胞受体信号通路以及Jak-STAT信号通路中可能作为转录因子参与转录水平调控。5.LncRNA-mRNA在T细胞受体信号通路以及Jak-STAT信号通路中的共表达网络提示 IL21R、IL23R、AKT3、CD3E、STAT4、LAT、CCND2、CD247、NFATC2、LCK、ITK、CDK4、CD8B、CD3D、PLCG、IL12RB1、IL10RB、IL10、IL4R、SOS2等mRNA在AFM中发挥重要作用。6.LncRNA与microRNA吸附预测NONHSAT254241.1 和NONHSAT150563.1可能与hsa-miR-3653-5P作用,进一步负向调控mRNA CDK4的表达;lncRNA NR031607.1 和 NONHSAT197107.1 可能与 has-miR-370-3P 作用,进一步负向调控mRNACD3D的表达。7.qRT-PCR验证结果示NONHSAT253897.1、NONOHSAT177112.1、IL10 以及SOS2均为表达上调且与芯片表达呈正相关;NONHSAT256669.1、NR126169.1以及NONHSAT232454.1均为表达下调且与芯片结果呈正相关。然而,NONHSAT234238.1与芯片结果表达呈负相关。以上qRT-PCR结果均具有统计学意义,p<0.05。此外,进一步扩大样本至15例实验组以及15例对照组验证NONHSAT253897.1,实验组以及对照组中NONHSAT253897.1的相对表达量提示NONHSAT253897.1在实验组中呈稳定高表达。结论1.lncRNA和mRNA参与暴发性心肌炎的发生和发展。2.NONHSAT253897.1可能是诊断暴发性心肌炎的潜在生物标志物。
付扬喜[5]（2019）在《3、7型腺病毒纤毛蛋白差异对其致病力的影响机制研究》文中认为第一部分重庆地区急性呼吸道感染住院患儿腺病毒感染流行病学研究和临床特征分析目的:腺病毒（Ad V）是引起6月-2岁婴幼儿重症肺炎的病毒病原体,目前已报道有70种血清型,前期研究显示不同血清型Ad V引起疾病的严重程度不同。本研究拟通过回顾性分析2009-2015年急性呼吸道感染住院患儿Ad V感染情况,探讨重庆地区Ad V流行病学特征,以及不同血清型Ad V的临床特征。方法:1.收集2009年6月至2015年5月期间因急性呼吸道感染（Acute Respiratory Tract Infection,ARTI）在重庆医科大学附属儿童医院呼吸科病房住院且确诊为Ad V感染患儿的鼻咽抽吸物（Nasopharyngeal aspirates,NAPs）,共计4982份。2.提取NAPs中病毒脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid,DNA）,使用聚合酶联反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）扩增腺病毒DNA后分别行六邻体（hexon）、纤毛蛋白（fiber）基因测序,结果与Gen Bank中的序列BLAST比对分型。3.回顾性分析Ad V导致急性呼吸道感染住院患儿临床特征,分析比较3、7型腺病毒所致疾病严重度差异。结果:1.连续6年重庆地区腺病毒检出率为5.8%（289/4982）。2.主要的流行血清型为3型腺病毒（43.9%,127/289）和7型腺病毒（45.3%,131/289）;3.腺病毒终年流行,高发季节在夏、冬季。4.腺病毒感染以男性和5岁以下儿童多见。5.7型腺病毒较3型腺病毒引起了更严重的疾病。结论:3、7型腺病毒是引起重庆地区急性呼吸道感染住院患儿最主要的血清型,7型腺病毒感染患儿较3型腺病毒感染病情更重。第二部分3、7型腺病毒纤毛蛋白差异对其致病力影响目的:本研究第一部分结果提示7型腺病毒的致病性比3型腺病毒更强,课题组前期研究发现3、7型腺病毒序列差异主要在纤毛蛋白上,提示纤毛蛋白差异可能参与了3、7型腺病毒的致病力不同,有关这方面的研究尚未见相关文献报道。因此本部分拟进一步探讨3、7型腺病毒纤毛蛋白差异是否影响其致病力。方法:1.使用临床株3型腺病毒（CQ5291）、7型腺病毒（CQ4411）分别感染A549、16HBE和293细胞48小时（hour,h）后收取细胞悬液,通过定量聚合酶联反应（Quantitative polymerase chain reaction,QPCR）定量病毒的拷贝数;3型腺病毒、7型腺病毒以及3、7型腺病毒重组Ad3/H7株（human adenovirus type 3 packaged by type 7 hexon,Ad3/H7）感染A549细胞后0、4、8、12、24、36、48、60、72、96h收集细胞悬液,通过TCID50测定上述时间点的病毒滴度;3型腺病毒与7型腺病毒以1:1混合感染A549细胞后0、2、8、12、24、36、48、72h收取细胞悬液,通过Q-PCR定量病毒拷贝数。2.3、7型腺病毒以及重组腺病毒Ad3/H7株分别以MOI为250、25vp/cell感染A549细胞后2、4、24、36、48及60h加入CCK-8溶液作用30min,波长450nm读取吸光值,计算细胞毒性结果。3.体外用纯化的3型腺病毒、7型腺病毒以及重组腺病毒Ad3/H7株与正常健康人血清孵育以检测补体C3a产物。4.BALB/c小鼠鼻内接种3型腺病毒、7型腺病毒以及重组腺病毒Ad3/H7株建立腺病毒下呼吸道感染动物模型,每天监测小鼠体重变化,分别在感染后第3、5、7天收集标本。观察腺病毒感染后肺组织匀浆是否出现致细胞病变（Cytopathic effect,CPE）。Q-PCR检测肺组织病毒载量。瑞氏染色后行支气管肺泡灌洗液（Bronchoalvo larlavage fluid,BALF）中炎症细胞及其分类计数。苏木素-伊红染色（hematoxylin and eosin,HE）后行肺组织病理评分;酶联免疫吸附（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）试剂盒检测BALF中的细胞因子。结果:1.病毒定量结果显示7型腺病毒拷贝数显着高于3型腺病毒（p<0.05）;腺病毒生长曲线提示7型腺病毒在感染后24、36、60和72h病毒拷贝数明显高于3型腺病毒和重组腺病毒Ad3/H7株（p<0.05）;3型腺病毒与7型腺病毒共培养结果提示在感染后12、24、36、48、72h,HAd V-7病毒复制明显高于HAd V-3（p<0.05）。2.细胞毒性结果显示以低MOI感染A549细胞后,各时间点的细胞活性均无明显差异;以高MOI感染A549细胞后,在感染后2、4h,3型腺病毒细胞活性比7型腺病毒、重组腺病毒Ad3/H7株细胞活性分别高26.5、42.6%和33、37.7%（P<0.05,P<0.01）。3.腺病毒激活补体实验结果表明C3a产物增加在2分钟时7型腺病毒与重组腺病毒Ad3/H7株、3型腺病毒有统计学意义。4.肺组织匀浆感染A549细胞后出现了较为明显的CPE。3天时肺组织中7型腺病毒拷贝数明显高于3型腺病毒（p<0.05）。腺病毒感染BALB/c小鼠后引起的炎症细胞类型以巨噬细胞和淋巴细胞为主;肺组织病理损伤以7型腺病毒感染最重,病理评分7型腺病毒较重组腺病毒Ad3/H7株和3型腺病毒升高（p<0.05）;。BALF中细胞因子TNF-a,IL-1β,IL-6和IFN-γ均有升高,以IL-1β升高最为显着,7天最为明显,7型腺病毒较重组腺病毒Ad3/H7株和3型腺病毒升高明显（p<0.05）。结论:7型腺病毒致病性强于3型腺病毒、重组腺病毒Ad3/H7株,提示不同血清型Ad V纤毛蛋白差异可能导致Ad V致病力的差异。第三部分3、7型腺病毒纤毛蛋白与其受体CD46、DSG-2结合介导其致病性差异的机制研究目的:第二部分研究结果表明3型腺病毒与7型腺病毒具有不同的纤毛蛋白,故具有不同的致病能力,但不同纤毛蛋白导致临床病情轻重不同的具体机制尚不清楚。目前研究已经证实B种腺病毒纤毛蛋白与其受体CD46、DSG-2结合触发了感染,因此本部分探讨是否3型腺病毒与7型腺病毒的纤毛蛋白与受体CD46、DSG-2结合导致了其后病情发展的不同。方法:1.收集3型腺病毒、7型腺病毒、重组腺病毒Ad3/H7株感染A549细胞后0.5、2小时的细胞爬片,通过激光共聚焦显微镜检测病毒与受体结合表达以及水平。2.采用体外转染CD46 si RNA、DSG-2 si RNA,通过Q-PCR法进行转染后3、7型腺病毒定量以及ELISA方法检测转染后IL-8产物。结果:1.激光共聚焦显微镜观察在腺病毒感染的早期,随着时间的延长,7型腺病毒与其受体CD46、DSG-2进入细胞内荧光明显多于3型腺病毒和重组腺病毒Ad3/H7株。2.Q-PCR检测结果表明,分别在使用CD46 si RNA后2、6、12以及24h,3型腺病毒拷贝数分别下降了5.8×104、7.9×104、16.6×104以及34.2×104;7型腺病毒拷贝数分别降低了15.2×107、19.6×107、24.8×107以及43.9×107;3型腺病毒与7型腺病毒拷贝数降低幅度为75.3%vs 65.8%;72.5%vs 69.3%;82.2%vs 67.6%;88.1%vs 74.2%;分别在DSG-2 si RNA后2、6、12以及24h,3型腺病毒拷贝数分别降低了6.7×104、6.6×104、12.1×104以及21.4×104;7型腺病毒拷贝数分别降低了4.5×107、13.4×107、21.7×107以及33.7×107;3型腺病毒与7型腺病毒拷贝数降低幅度为88.2%vs56.3%;75.9%vs 77.9%;86.4%vs 78.1%;87.7%vs 73.6%;在使用CD46si RNA后6、24h,3型腺病毒诱导的IL-8的分泌量（pg/ml）分别减少了98.8、187.5,7型腺病毒诱导的IL-8的分泌量（pg/ml）分别减少了144.4、366.6,3型腺病毒与7型腺病毒诱导的IL-8的分泌减少幅度分别为75.6%vs 73.7%;82.1%vs 84.3%;在使用DSG-2 si RNA后6、24h,3型腺病毒诱导的IL-8的分泌量（pg/ml）分别减少了69.9、136.5,7型腺病毒诱导的IL-8的分泌量（pg/ml）分别减少了105.2、186.1,3型腺病毒与7型腺病毒诱导的IL-8的分泌减少幅度分别为76.2%vs 77.9%;83.0%vs 83.3%;比较干扰前后7型腺病毒和3型腺病毒IL-8的产物下降量及减少幅度均无统计学差异。结论:病毒与受体结合免疫荧光以及受体基因沉默实验提示不同血清型腺病毒的纤毛蛋白与其受体CD46、DSG-2结合导致了不同严重程度疾病的潜在机制,这些研究结果为理解不同腺病毒的毒力差异及为将来研制基于纤毛蛋白抗原表位的疫苗及抗腺病毒药物提供了重要的理论依据。
颜克鹏[6]（2018）在《固有IL-17A在CVB3诱导的病毒性胰腺炎发病中的作用及机制》文中提出目的:急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）是多病因引起的血清淀粉酶、脂肪酶显着升高为特征的胰腺炎症损伤疾病。AP由胆石病、高血脂、酗酒、感染、遗传因素等诱导,发病机制和临床治疗策略均不十分清楚。可引起胰腺炎的病毒包括:流行性腮腺炎病毒、柯萨奇病毒、肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、轮状病毒等。柯萨奇病毒中的B3、B4型均可引起胰腺炎,B3型柯萨奇病毒（Coxsackievirus B Type 3,CVB3）感染诱导的病毒性心肌炎研究较为深入广泛,而CVB3诱导的急性胰腺炎的发病机制缺乏研究。CVB3为小核糖病毒科无衣壳正链RNA病毒。经粪口途径感染心脏、胰腺、脑、肝脏等,导致心肌炎、胰腺炎、病毒性脑炎、肝炎等。CVB3诱导急性病毒性心肌炎的机制主要由急性期（0-3天）病毒大量复制直接损伤心肌和心脏局部浸润免疫细胞炎症效应损伤所介导。病毒感染早期心脏局部,固有免疫激活介导的炎症细胞因子、趋化因子分泌及多种免疫细胞（主要为巨噬细胞和T细胞）的浸润,是急性病毒性心肌炎的主要致病细胞;心肌局部M1型巨噬细胞浸润介导的炎症损伤（TNF-α和IL-1β）和后期心脏局部过度的Th1/Th17免疫炎症损伤（IFN-γ和IL-17A）,是介导病毒性心肌炎的主要免疫效应机制:NK和γδT细胞等也发挥了重要的早期促炎和调控功能。很多研究证实CVB3感染早期心脏局部上调的IL-17A及IL-17-IL-17RA通路应答在心肌炎和心肌纤维化进程中发挥关键致病作用。胰腺是CVB3感染肠道入血后的首要器官,且胰腺CVB3的复制水平高于心脏,提示CVB3感染的致死首先来自于急性胰腺损伤,其次来自于急性心肌炎。然而迄今,CVB3感染诱导的急性胰腺炎的免疫发病机制未见详尽报道。我们的小鼠预试验发现:1)CVB3在胰腺组织的复制最高,心脏、肝脏次之;第3天的胰腺组织大量坏死主要来自于病毒复制;2)相对于病毒性心肌炎显着的免疫炎症浸润,CVB3感染后的胰腺坏死程度高于免疫浸润损伤;3)急性心肌炎和急性胰腺炎的共同特征是发现感染早期IL-17A的显着上调;IL-17A敲除小鼠感染CVB3后病毒性心肌炎显着减轻、小鼠生存率提高,提示IL-17A及其通路也可能在急性胰腺炎发病中发挥关键作用。IL-17A及IL-17A/IL-17RA通路是已知的感染性和自身免疫性组织炎症损伤的关键核心机制。IL-17A通路所介导的中性粒细胞组织浸润、Th17应答极化及其炎症效应,是其介导组织损伤的主要机制。IL-17A的来源主要有固有免疫细胞（ILC3、γδT、中性粒细胞）、T细胞（Th17）和组织细胞等。我们的预实验发现:病毒感染早期（3天）诱导了胰腺内γδT细胞上调浸润;同时该群细胞分泌较高水平的IL-17A。CVB3感染心肌细胞早期,γδT细胞是分泌IL-17A的主要细胞且促进急性心肌炎的发展。提示γδT细胞主导的IL-17A通路在CVB3诱导的胰腺炎中发挥重要作用。基于以上,我们提出了科学假设:CVB3感染胰腺早期的innate IL-17A可能在病毒性胰腺炎发病中发挥重要促炎作用,γδT是CVB3感染早期胰腺IL-17A的重要分泌细胞,并促进Th17分化及炎症损伤效应。本研究在CVB3感染C57BL/6小鼠诱导的急性胰腺炎模型中,明确胰腺早期IL-17A的分泌动力学;流式细胞术明确innate IL-17A的来源细胞及分泌IL-17A的γδT亚群;通过IL-17A-/-小鼠、TCRδ-/-小鼠、中和单抗和转输试验明确γδT17在CVB3病毒性胰腺炎中的作用;并探讨了 IL-23响应的γδT17促进胰腺Th17炎症效应的可能机制。本研究旨在创新性阐明γδT17及其IL-17A通路在CVB3急性胰腺炎发病中的作用和机制。研究方法:1.C57BL/6小鼠急性CVB3胰腺炎模型的建立:以2000 TCID50剂量CVB3腹腔注射小鼠,7天小鼠死亡率约为30%-60%,体重减轻率为25%,第三天胰腺病毒载量约106 PFU/g。第3～7天可见胰腺腺泡细胞坏死崩解及炎症细胞浸润。2.组织HE染色鉴定心肌炎、胰腺炎病理:胰腺组织经过多聚甲醛固定、脱水、包埋、制备5μm石蜡切片,H&E染色。3.组织病毒滴度测定:胰腺组织20mg,0.5ml PBS匀浆重悬,离心取上清,按1 0-1—1 0-10梯度稀释待用。Hela细胞按80%密度铺96孔板,胰腺匀浆30μl组织样本稀释液加至细胞表面,8复孔,37℃培养1小时,PBS洗三遍,加2%FBS DMEM培养,连续5天观察细胞病变情况。以细胞皱缩、折光性变差、飘起等大于50%视为病变孔。计算组织病毒TCID50/g,乘0.7换算PFU/g。4.胰腺、脾脏、外周血淋巴细胞分离与流式细胞术鉴定:小鼠胰腺组织以胶原酶IV和DNA酶Ⅰ消化,经75%-40%不连续Percoll密度梯度离心分离单个核免疫细胞:脾脏、外周血细胞经去除红细胞和过滤获得单个核细胞。T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、yδT细胞表型分别为CD45+CD3+、CD45+CD11b+Ly6G+Ly6C+、CD45+CD11b+F4/80+、CD45+CD11b+Ly6C+和CD45+CD3+TCRδ+。5.IL-17A+细胞的胞内染色鉴定:单个核淋巴细胞首先经PMA和离子霉素刺激5小时,而后加入Golgi阻断剂作用1小时,收集洗涤后先经表面标志单抗CD4、CD8、TCRδ+、CD11b、Ly6G染色;经固定和穿膜后,再以荧光标记anti-IL-17A、IFNγ、IL-4染色,流式测定。6.中和单抗清除试验:在病毒感染-1和+3天,分别通过尾静脉注射120μg anti-Vγ4单抗,逐天经外周血检测清除效率。7.体外培养和激活Vγ4细胞:Vy4 mAb抗体包板4℃过夜,取单个脾细胞,以anti-CD28（1μg/ml）,rmIL-2（2ng/ml）培养基重悬,培养48h后,换rmIL-2（2ng/ml）的新鲜培养基培养;培养第3-4天始有活化γδT细胞出现,调整细胞浓度为0.7-1 ×106/ml。每1.5天更换培养基至第6天。Vγ4γδT细胞得率约2×107/脾。8.体外转输Vγ4细胞试验:WT和TCRδ KO小鼠,在CVB3感染-1和+3天分别通过尾静脉注射106新鲜培养Vγ4细胞,检测输注效率。9.外源注射重组IL-23试验:小鼠尾腹腔注射重组rIL-23（4μg）,1天后注射CVB3,观察小鼠发病情况。10.Elisa检测外周血及组织匀浆液细胞因子水平:胰腺组织30mg匀浆,1ml PBS（含有PMSF）重悬,离心取上清。依照eBioscience细胞因子检测试剂盒检测IFNy,IL-1β,IL-6,TNF-α,IL-17A 等蛋白含量。11.脂肪酶活性测定:外周血血清样本、空白（双蒸水）,标准品分别与试剂混合均匀,37℃孵育100秒,570nm检测吸光度,根据公式计算样本脂肪酶活力。12.统计学分析:数据采用均数±标准差表示;两组间比较以t-检验;多组间比较以 one-way ANOVA 和 Bonferroni multiple comparison test 分析;生存曲线以Log-rank test 比较;以Graphpad Prism 5统计软件进行分析。结果:1、CVB3感染C57BL/6小鼠诱导了急性病毒性胰腺炎以2000 TCID50的CVB3经腹腔感染C57BL/6雄性小鼠,感染7天体重下降率20%,死亡率为30～60%。第7天小鼠胰腺石蜡切片H&E染色显示:感染小鼠胰腺呈大量胰腺腺胞细胞坏死和炎性细胞浸润,脂肪酶水平明显升高,提示已成功建立了急性AP小鼠模型。2、CVB3急性胰腺炎小鼠胰腺IL-17A水平在感染早期显着升高且IL-17A显着促进了胰腺炎发病程度以ELISA、WB、IHC、IF法检测小鼠胰腺IL-17A水平,发现:CVB3感染后胰腺IL-17A水平显着增高,且在感染第3天达高峰。为证实IL-17A在急性胰腺炎发病中的作用,以CVB3感染IL-17A-/-小鼠,发现:与WT小鼠相比,感染7天IL-17A-/-小鼠体重减轻显着降低,生存率明显提高;病毒滴度无明显变化;胰腺炎性细胞浸润和组织坏死明显改善;胰腺TNF-α等促炎细胞因子水平显着降低;提示IL-17A在急性病毒性胰腺炎发病中发挥关键的促炎作用。3、γδT细胞是CVB3感染早期期胰腺固有IL-17A的主要分泌细胞之一且主要为Vγ4 γδT亚群为明确感染早期胰腺增高的IL-17A的细胞来源,以流式检测CVB3感染小鼠0、3、7天小鼠胰腺浸润免疫细胞。发现:CVB3感染第3天可见胰腺γδT细胞比例显着增高,而CD4+Th细胞比例无明显变化。γδT细胞第3天浸润达高峰（2.2%,104/胰腺）,显着高于未感染组（0.8%,103/胰腺）;而CD4+Th细胞浸润于第7天达高峰（30%,106/胰腺）。胞内染色鉴定感染早期胰腺IL-17A+细胞类型,发现:感染3天,胰腺CD3+T细胞系分泌IL-17A的主要细胞。比较CD3+T中CD4+T、CD8+T、γδT、NKT 细胞发现:感染第 3 天 CD8+T（0.08%）和 NK（0.02%）几乎不分泌IL-17A,而CD4+T（0.24%）和γδT（0.31%）是分泌IL-17A的主要细胞;30%以上的γδT细胞分泌IL-17A,而仅6%的CD4+T分泌IL-17A（p<0.05）,提示CVB3感染胰腺早期增高的IL-17A主要由γδT和CD4+T分泌,γδT分泌效率显着高于CD4+Th17。检测γδT细胞亚群发现:γδT亚群Vγ1和Vγ4浸润比例和绝对数相当;而第3天胰腺分泌IL-17A的γδT主要是Vγ4细胞亚群。4、CVB3感染TCRδ-/-小鼠诱导的急性胰腺炎显着减轻为证实γδT细胞在CVB3急性胰腺炎发病中的作用,以CVB3感染TCRδ-/-小鼠,发现:γδT细胞缺失后,小鼠CVB3胰腺炎发病显着降低,胰腺细胞坏死和炎症浸润显着减少;胰腺IL-17A、TNF-α和IL-6水平均显着降低;病毒载量无变化。提示γδT细胞在胰腺炎发病中发挥致病作用。5、以中和抗体清除Vγ4 γδT细胞显着减轻CVB3急性胰腺炎发病为证实CVB3感染胰腺早期分泌IL-17A的Vγ4 γδT细胞亚群的作用,以Vγ4中和抗体于-1、+3天尾静脉注射小鼠清除体内Vγ4细胞,0天感染CVB3。结果显示:Vγ4中和抗体清除90%以上外周血Vγ4 γδT;清除Vγ4γδT使CVB3感染小鼠诱导的急性胰腺腺泡细胞坏死和炎症浸润显着减少;胰腺IL-17A、TNF-α、IL-6和IFN-γ水平显着降低;提示Vγ4 γδT细胞在CVB3急性胰腺炎发病中发挥促炎作用。6、过继转输Vγ4 γδT细胞显着加重CVB3病毒性胰腺炎体外诱导培养正常和IL-17A-/-小鼠来源的Vy4 γδT细胞,以106细胞/只小鼠尾静脉回输TCRδ-/-小鼠,1天后感染CVB3,发现:向发病减轻的TCRδ-/-小鼠回输Vγ4 γδT可显着加重病毒性胰腺炎发病,而回输IL-17A-/-来源Vγ4 γδT,则急性胰腺炎发病显着减轻。提示Vγ4 γδT所分泌的IL-17A确实在CVB3感染诱导的急性胰腺炎发病中发挥关键促炎作用。7、IL-17A+Vγ4 γ8T细胞加重CVB3病毒性胰腺炎的机制与其促进中性粒细胞胰腺浸润、促进Th17炎症应答相关IL-17A-IL-17RA通路的效应之一是趋化中性粒细胞的器官浸润。流式检测发现:CVB3感染第3天诱导了胰腺中性粒细胞的大量浸润。而TCRδ-/-、IL-17A-/-小鼠及中和抗体清除了 Vγ4的感染小鼠胰腺中性粒细胞浸润比例和数目显着减少。清除Vγ4 γδT的小鼠外周血中性粒细胞被显着抑制90%,其向胰腺的浸润被显着抑制80%以上。提示胰腺早期浸润的IL-17A+Vγ4γδT细胞,显着促进中性粒细胞胰腺浸润并发挥促损伤功能。其次发现:清除Vγ4γδT小鼠脾脏及外周血的IFNγ+CD4+T（Th1）细胞比例及绝对数明显增加,而IL-17A+CD4+T（Th17）细胞的比例及绝对数明显减少;提示Vγ4 γδT细胞分泌的IL-17A通过抑制Th1应答、促进Th1 7炎症应答加剧病毒性胰腺炎。8、感染早期胰腺上调的IL-23激活浸润IL-23R+Vy4 γδT细胞向γδT17分化从而促进CVB3诱发的急性病毒性胰腺炎为明确感染早期激活胰腺γδT细胞的机制,发现:CVB3感染极早期（day1）胰腺显着上调IL-23表达,而γδT细胞组成型高表达IL-23R,为证实IL-23-IL-23R通路对胰腺早期浸润Vγ4 γδT细胞的激活,对WT、TCRδ-/-小鼠外源腹腔注射IL-23,1天后感染CVB3,发现显着加剧WT小鼠急性胰腺坏死及炎症浸润,而不改变TCRδ-/-小鼠胰腺病理;同时,rIL-23显着增高注射12小时后体内胰腺诱导的IL-17A+γδT（而非Th17）比例。提示CVB3感染早期上调的胰腺局部IL-23,经由IL-23R通路激活Vγ4 γδT细胞分泌IL-17A,从而促进病毒性胰腺炎病理。结论:1、CVB3感染C57BL/6小鼠第7天诱导了以胰腺腺泡细胞坏死、免疫浸润和血清胰酶增高为特征的急性病毒性胰腺炎。2、CVB3感染诱导小鼠胰腺早期（day1～3）上调表达IL-17A且其显着促进CVB3感染诱导的急性胰腺炎发病。3、感染早期胰腺分泌IL-17A的主要细胞为Vγ4γδT17和CD4+Th17细胞,但γδT17先于CD4+T浸润胰腺、且其分泌IL-17A的效率显着高于Th17。4、γδT细胞敲除小鼠经CVB3诱发的急性胰腺炎发病显着减轻。中和抗体清除Vγ4 γδT细胞后感染CVB3诱导的急性胰腺炎发病显着减轻。过继转输IL-17A+Vγ4 γδT显着加重CVB3诱导的急性胰腺炎;而转输IL-17A-/-来源的Vγ4 yδT细胞则使加重的胰腺炎显着减轻,提示Vγ4 γδT来源的固有IL-17A促进CVB3诱发的急性病毒性胰腺炎。5、IL-17A+Vγ4 γδT细胞加重CVB3病毒性胰腺炎的机制与其促进γδT17分泌的IL-17A对于嗜中性粒细胞胰腺浸润、促进Th17炎症应答相关。6、感染早期胰腺上调的IL-23经IL-23R通路激活浸润Vγ4 γδT细胞分泌IL-17A从而促进CVB3诱发的急性病毒性胰腺炎。
杨圆圆[7]（2018）在《E1A基因修饰的间充质干细胞介导的CD3-HAC阻断PD-1/PD-L1对转移性乳腺癌的免疫治疗研究》文中研究表明背景和目的:乳腺癌是影响全世界女性健康的头号杀手,据全国肿瘤登记中心统计,2015年全国乳腺癌发病病例约26.9万例,死亡病例约7.0万例。三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer,TNBC）是其中恶性程度最高的一个分型,预后极差,且极易发生脑部和内脏的转移。全球范围内每年有超过50万人死于乳腺癌转移,其中位生存期仅有2到3年。临床上对于TNBC的治疗手段以手术和化疗为主,但对于已发生转移的患者手术切除明显是不现实的,化疗药物也很难起到很好的效果,并常常伴有副作用。随着免疫治疗的迅速发展,CAR-T、TCR-T、肿瘤疫苗、双功能抗体、免疫检查点抑制剂等多种治疗方案应用于恶性肿瘤的治疗中,并取得了喜人的临床效果。其中又以PD-1/PD-L1通路阻断剂在实体瘤的疗效最为突出。对TNBC的肿瘤微环境研究表明,TNBC是一种高异质性和突变负荷的肿瘤类型,且有着较多的淋巴细胞浸润和PD-L1表达。这样的免疫微环境对于PD-1/PD-L1抑制剂发挥作用是非常有益的。随着临床适应症的扩展和患者范围的扩大,PD-1抗体的不良反应事件逐渐增多,且对部分患者临床响应率偏低也一直是饱受诟病的问题。瘤内局部给药有着避免PD-1抗体全身暴露、减少副作用、提高药物利用度、增强免疫反应的优势。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是一类来源广泛免疫原性低,具有多项分化潜能的成体干细胞。多项研究表明,MSCs可以有效地向肿瘤原位和微小转移灶归巢,这些特性使其成为基因治疗的理想载体。根据上述理论和研究基础,我们设计双特异性的融合蛋白CD3-HAC（HAC为文献中报道的具有高亲和能力的PD-1胞外区突变序列）,并以人端粒酶启动子（hTERTp）调控其表达,将其克隆到腺病毒载体中,利用E1A修饰的MSCs于肿瘤部位包装分泌腺病毒,并感染肿瘤细胞。继而在肿瘤原位激活T细胞,发挥免疫杀伤功能。方法:采用PCR、重叠PCR（overlap PCR）、酶切、连接等方法构建pAd-hTERT-CD3-HAC,pAd-hTERT-CD3scFv,pAd-hTERT-HAC 腺病毒表达载体,pcDNA3.1（+）-CD3-HAC,pcDNA3.1（+）-CD3scFv,pcDNA3.1（+）-HAC 真核表达载体,以及pAdTrack和pLentiR空载对照载体,并经测序验证其基因序列的正确性。将表达载体 pcDNA3.1（+）-CD3-HAC,pcDNA3.1（+）-CD3scFv,pcDNA3.1（+）-HAC 瞬时转染至293T细胞,收集培养上清并通过His标签亲和层析对产物进行纯化,通过Western blot检测培养上清及纯化后样品中目的蛋白的表达。通过WB、免疫荧光、流式分析,检测CD3-HAC蛋白的表达及其与靶细胞的结合。利用活细胞工作站监测PBMC与AdCD3-HAC感染的MDA-MB-231乳腺癌靶细胞之间经典相互作用,乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase,LDH）释放法定量检测PBMC对不同靶细胞的杀伤水平,流式检测淋巴细胞表面活化分子的表达,ELISA检测细胞因子的分泌,CellTrace Far Red检测淋巴细胞增殖等,从不同角度全面分析CD3-HAC蛋白的生物学功能。通过ELISA及细胞凋亡检测证实HAC对PD-1/PD-L1通路的阻断作用。联合低剂量5-FU,检测其对腺病毒感染的增敏及免疫杀伤的促进作用。使用Bio-Rad QX200数字微滴PCR系统检测不同时间点腺病毒在MSC.Adtrack.E1A胞内及上清的绝对拷贝数,绘制腺病毒复制时间曲线;采用细胞透射电镜证明腺病毒颗粒在MSC.Adtrack.E1A中的存在。建立MDA-MB-231乳腺癌转移小鼠模型,尾静脉注射MSC.AdLuc.E1A或MSC.AdLuc.LentiR.至荷瘤小鼠体内,IVIS成像系统观察其向肿瘤部位的归巢情况。尾静脉注射MSC.Adtrack.E1A或MSC.AdCD3-HAC.E1A,检测CD3-HAC蛋白对PBMC的体内激活作用。最后,利用MDA-MB-231乳腺癌肺转移小鼠模型评价MSC.AdCD3-HAC.E1 A治疗系统单独或联合低剂量5-FU对肿瘤生长的抑制作用,并绘制生存曲线。结果:成功构建 pAd-hTERT-CD3-HAC,pAd-hTERT-CD3scFv,pAd-hTERT-HAC,pcDNA3.1（+）-CD3-HAC,pcDNA3.1（+）-CD3scFv,pcDNA3.1（+）-HAC,pAdTrack及pLentiR载体,经测序证明其基因序列正确。免疫荧光及流式分析,结果表明CD3-HAC双特异性融合蛋白CD3-HAC表达于乳腺癌细胞,并成功结合于细胞表面。活细胞工作站监测PBMC与AdCD3-HAC感染的MDA-MB-231乳腺癌细胞之间的相互作用。LDH释放实验结果表明CD3-HAC能够特异性介导T细胞对PD-L1阳性细胞的杀伤。HAC功能蛋白可以阻断PD-1与PD-L1相互作用。联合低剂量5-FU可增敏腺病毒对靶细胞的感染,进而促进PBMC的细胞毒作用。腺病毒AdTrack及慢病毒LentiR.E1A共感染HUMSC后,腺病毒在MSCs中复制及包装,最终裂解MSCs并释放具有感染能力的完整腺病毒颗粒。成功建立MDA-MB-231肺转移小鼠模型,经基因修饰的MSCs在尾静脉注射24小时后即可归巢至肿瘤局部,然后能够产生新的病毒并感染肿瘤细胞,实现体内CD3-HAC融合蛋白介导T细胞对肿瘤细胞的杀伤。体内抑瘤实验证明,MSC.AdCD3-HAC.E1A+PBMC单独或5-FU联用组,小鼠的生存期明显延长。结论:本课题建立了由经过基因修饰的MSCs运载CD3-HAC双特异性融合蛋白的局部靶向治疗系统,并与5-FU联用增强抗肿瘤作用。在增强免疫应答的同时,避免了 PD-1/PD-L1免疫检查点阻断剂的副作用,为恶性转移肿瘤的治疗提供了新的思路。
汪巍巍[8]（2018）在《阳离子化柞蚕丝素改性的hING4-IL-24双基因共表达腺病毒载体》文中研究指明肝癌是最常见的恶性肿瘤之一。随着生命科学的进步,肝癌的基因治疗已成为一种具有广阔临床应用前景的治疗手段。生长抑制因子4（ING4）及白细胞介素-24（IL-24）基因是抑肝癌细胞生长效果较明显的两种基因。腺病毒作为外源性基因载体具有感染率高的显着优势,但是直接使用腺病毒载体进行基因治疗具有引起不良反应的潜在风险,这限制了腺病毒载体的临床应用。为了降低腺病毒载体对正常细胞的毒性,并提高对肝癌细胞的诱导凋亡作用,一条途径是提高腺病毒载体对肝癌细胞的靶向性;另一条途径是用化学或物理的方法对腺病毒载体表面进行适当改性。精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸（RGD）修饰腺病毒载体,可提高载体对柯萨奇-腺病毒受体阴性细胞的感染效率。柞蚕丝素蛋白（ASF）具有良好的生物相容性和生物降解性,免疫原性低等特点,有可能用于对腺病毒载体进行改性,从而提高其对肝癌细胞的感染效率,降低对正常组织细胞毒性的天然高分子。本文首先构建了RGD修饰的hING4-IL-24双基因共表达腺病毒（Ad）载体,并进行鉴定。然后,用聚乙烯亚胺（PEI）改性带负电荷的柞蚕丝素蛋白,使柞蚕丝素蛋白表面带正电荷,制备阳离子化柞蚕丝素（CASF）。再用CASF包覆、改性表面带负电荷的双基因共表达腺病毒载体,构建CASF/Ad复合物。进一步,研究经RGD修饰并经CASF改性的双基因共表达腺病毒载体对人肝癌细胞SMMC-7721的感染效率、目的基因表达、抑制增殖和促进凋亡的作用,并研究其对人正常肝细胞L-02的毒性。首先,构建pAdTrack-CMV-hING4-poly A+promoter-IL-24双基因共表达重组转移载体。将构建正确的重组转移载体经Pme I酶切后与RGD-pAdEasy-1腺病毒骨架质粒在BJ5183大肠杆菌中同源重组,得到的同源重组质粒（RGD.pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-hING4-poly A+promoter-IL-24）经Pac I酶切后再用脂质体转染QBI-293-26细胞,经多轮感染和扩增后获得大量重组腺病毒载体。Western blotting和ELISA检测结果表明,新构建的腺病毒载体能介导外源性hING4和IL-24基因的表达。说明成功获得了RGD修饰的hING4和IL-24双基因共表达腺病毒载体。其次,用低分子量聚乙烯亚胺（PEI,1800Da）对柞蚕丝素蛋白进行阳离子化改性,得到CASF。Zeta电位分析结果表明,经PEI改性后,柞蚕丝素蛋白的表面Zeta电位值由负值转变为正值。改性后柞蚕丝素蛋白的O/C元素比减小,而N/C元素比增大。CD光谱分析显示改性后柞蚕丝素蛋白的分子构象发生了无规卷曲和/或α-螺旋结构向β-折叠结构的明显转变。进一步,用不同浓度的CASF包覆、改性腺病毒载体,构建CASF/Ad复合物。研究CASF/Ad复合物对SMMC-7721细胞和L-02细胞感染效率、细胞毒性及诱导SMMC-7721细胞凋亡效果的影响。体外感染实验结果表明,与裸Ad相比,CASF/Ad复合物（CASF浓度:50μg/m L）对两种细胞都有较高的感染效率。CASF/Ad复合物与L-02细胞体外共培养的CCK-8检测结果表明,其对正常肝细胞无明显毒性。CASF/Ad复合物感染SMMC-7721细胞后,Western blotting和ELISA检测结果表明,目的基因hING4和IL-24能够有效表达。流式细胞术测试SMMC-7721细胞早期凋亡结果表明,CASF/Ad复合物诱导SMMC-7721细胞的早期凋亡率为19.2±0.47%,显着高于裸Ad组（P<0.05）,用CASF改性的hING4-IL-24双基因共表达腺病毒载体对肝癌细胞具有显着的诱导凋亡效应。本文构建的经RGD修饰并经CASF改性的hING4-IL-24双基因共表达腺病毒载体,不仅能有效感染肝癌细胞,表达两种抑肝癌细胞生长基因,诱导肝癌细胞凋亡,且对正常肝细胞无明显毒性。为肝癌提供了一种新的基因治疗系统,具有开发应用于肝癌临床治疗的潜力。
温继梨[9]（2018）在《柯萨奇病毒B3对心肌微血管内皮细胞Fractalkine表达机制的研究》文中提出背景:通过对病毒性心肌炎（Viral Myocarditis,VMC）的致病机理研究得知病毒感染后可以诱导宿主产生免疫应答。自身免疫治疗成为当今治疗的一大热点。柯萨奇病毒B3（Coxsackieviruses B3,CVB3）是病毒性心肌炎的常见病因,CVB3致病首先要跨越心肌微血管内皮细胞这道屏障,才能感染到心肌细胞。作为抵御外界感染心肌细胞的最后一道防线,心肌微血管内皮细胞同时参与免疫调节与炎症反应,释放炎性因子来抵御外界病原的入侵。同时心肌微血管内皮细胞会通过改变内皮细胞内一系列功能基因的表达来实现各种内皮细胞的功能。而Fractalkine（FKN）就是其中之一。FKN同时发挥着使外周白细胞游走和粘附的作用。FKN发挥的粘附作用不需要其他分子的参与介导。FKN可以在多种细胞中表达,主要有内皮细胞,平滑肌细胞,巨噬细胞等。当有炎症信号刺激时,FKN在这些细胞中的表达会大大增加,发挥作用,特别是在各种疾病早期,FKN的表达对减轻炎症反应及延缓疾病进程方面很有意义。基于对病毒性心肌炎的免疫调节机制及寻找一种理想的自身免疫疗法的研究,FKN作为一种同时具有粘附作用的趋化因子成为大家研究的热点。而FKN的表达受到多种信号通路的调控,MAPK通路就是其中之一,然而在柯萨奇病毒感染的心肌微血管内皮细胞中的FKN表达,具体受MAPK通路中哪个途径调控,目前关于这个方面的研究较少,也是本次研究的重点。目的:对心肌微血管内皮细胞在体外感染柯萨奇病毒后,心肌微血管内皮细胞表达FKN变化的MAPK调节机制进行探讨。旨在研究病毒性心肌炎的发病机制及自身免疫调节机制。方法:第一部分:心肌微血管内皮细胞的培养及传代,应用免疫荧光法鉴定心肌微血管内皮细胞表面CD31特性性抗原测定,并鉴定纯度。心肌微血管内皮细胞进行CVB3干预,并在显微镜下观察其细胞形态变化。将病毒用病毒培养液进行10倍梯度的稀释,从10-110-8,分别干预细胞,并在显微镜下观察细胞病变情况,使用Reed-Muench法计算病毒的半数致死量（TCID50）。第二部分:利用第一部分得到的TCID50浓度的CVB3干预细胞。然后分别于感染0,20,40,60,80min收集细胞,进行总蛋白的提取。使用western blot检测FKN的表达情况及ERK1/2,JNK,P38的蛋白磷酸化情况。第三部分:选择第二部实验得到的变化的信号蛋白ERK1/2的特异性抑制剂U0126对ERK1/2通路进行抑制。首先通过CCK8法选择U0126的最佳浓度,然后将U0126加入TCID50的CVB3干预的细胞,分别于0,20,40,60,80min分别提取细胞总蛋白,进行ERK1/2磷酸化的检测及RSK90磷酸化的检测。对加入最佳浓度的U0126及TCID50的CVB3的细胞分别于0,20,40,60,80min提取的细胞总蛋白,用wester blot法检测FKN的表达情况。将病毒用病毒培养液进行10倍梯度的稀释,从10-1-10-8,分别加入同时含有最佳浓度的U0126和CVB3的细胞,并在显微镜下观察细胞病变情况,使用Reed-Muench法计算病毒此时的半数致死量（TCID50）。第四部分:选择脂质体质粒转染的方法对细胞的FKN表达进行抑制。质粒转染效率检测。分别从显微镜下观察,PCR法检测FKN在mRNA水平的表达,以及wester blot法检测FKN在蛋白水平的表达,对质粒转染结果进行检测。将筛选的阳性FKN-shRNA的细胞,进行TCID50浓度的CVB3干预,然后分别0,20,40,60,80min提取细胞总蛋白,wester blot法进行ERK1/2,JNK,P38,的蛋白磷酸化检测。将病毒用病毒培养液进行10倍梯度的稀释,从10-1-10-8,分别干预阳性FKN-shRNA的细胞,并在显微镜下观察细胞病变情况,使用Reed-Muench法计算病毒此时的半数致死量（TCID50）。结果:第一部分:心肌微血管内皮细胞经抗CD31因子相关抗原处理后荧光显微镜下可见心肌微血管内皮细胞胞浆呈绿色荧光,且纯度很高。在CVB3干预下细胞培养到4-6天时细胞已经出现病变,其在显微镜下主要可以见到细胞开始变圆、皱缩,最后漂浮在液体表面。细胞的半数感染量TCID50为6.825。第二部分:用终浓度为TCID50浓度的CVB3作用于心肌微血管内皮细胞并于0,20,40,60和80min收集细胞,结果表明磷酸化的ERK1/2随着时间的增加磷酸化情况也逐渐变高在40min条带开始明显,60min时最高,随后在80min时与60min基本差不多,JNK和P38的磷酸化条带在各个时间变化无差异。与此同时FKN的表达条带随着时间的增加条带逐渐变深在40min时最深,60min和80min较40min时无明显差异。第三部分:经检测U0126的最佳浓度是40ng/ml。用40ng/ml浓度的U0126同时加入TCID50浓度CVB3作用于心肌微血管内皮细胞后,分别在0,20,40,60,80min后提取细胞蛋白,进行ERK1/2磷酸化的检测及RSK90磷酸化的检测,检测结果ERK1/2通路被有效抑制。分别在0,20,40,60,80min后提取同时加入U0126及CVB的细胞总蛋白,结果表明在各个时间FKN的表达的条带颜色基本一致。此时CVB3对细胞的TCID50为7.48。第四部分:显微镜下观察阳性质粒组的细胞可见绿色荧光,24h转染率达到50%。PCR检测FKN在mRNA水平低表达,western blot检测FKN在蛋白水平低表达,成功将FKN-shRNA转染到心肌微血管内皮细胞中。阳性FKN-shRNA的细胞,在0,20,40,60,80min,ERK1/2,JNK,P38,的蛋白磷酸化条带均无变化。此时CVB3对细胞的TCID50为7.99。结论:心肌微血管内皮细胞被柯萨奇病毒感染后,FKN在心肌微血管内皮的表达可以降低CVB3对心肌微血管内皮细胞的感染性,其中FKN的表达受到MAPK信号传导通路中的ERK1/2通路的调节。这个发现为进一步研究病毒性心肌炎的免疫调节治疗方向提供了理论依据。
杨洋[10]（2018）在《Annexin A1调控的中性粒细胞心脏浸润在病毒性心肌炎发病中的作用及机制》文中认为目的:病毒性心肌炎（Virus myocarditis,VMC）是病毒感染机体诱导的淋巴细胞心脏浸润与心肌细胞损伤所导致的心脏收缩和传导功能受损疾病,约21%的急性VMC可发展成为致死性扩张性心肌病（dilated cardiomyopathy,DCM）和心衰,可引起10%的青少年急性心功能衰竭死亡。肠道病毒属B3型柯萨奇病毒（coxsackievirus B type 3,CVB3）仍被认为是最常见的VMC病因,是临床DCM和心脏移植患者中最常检出的病毒。迄今,VMC的致病机理不清,临床缺乏特异性检测及治疗药物,阐明VMC的发病机制和探索繁殖新靶点具有重要意义。CVB3属单股正链小RNA病毒,经粪口途径首先在胃肠道少量复制,而后经血液循环进一步感染心脏、胰腺等诱导病毒性心肌炎、胰腺炎等。CVB3感染的急性期,病毒复制在第3天达高峰,引起心肌细胞坏死和凋亡,心肌细胞、成纤维细胞、局部巨噬细胞等经Toll样受体（TLRs）等识别病毒来源分子模式（PAMPs）和损伤心肌细胞释放的损伤相关分子模式（DAMPs）,上调趋化因子表达趋引外周免疫细胞浸润,并激活局部固有免疫炎症,分泌IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α及干扰素（IFNs）等多种炎症因子,发挥抗病毒效应,同时启动抗原提呈。感染的亚急性期（7-14天）,心脏病毒载量降至低点,适应性细胞被激活并渐次浸润心脏,CD8+杀伤性T细胞和过度的Th1和Th17应答促进了急性心肌炎的发展;而自身免疫性抗体加剧心肌炎。CVB3感染慢性期（14天至数月）,病毒低剂量持续存在,心肌修复重建,调节性T细胞和M2巨噬细胞分泌TGF-β等促进心肌纤维化和心肌肥大。当前,认为病毒导致的早期心肌损伤与免疫细胞浸润介导的免疫损伤是VMC的主要致病机制。CVB3感染的极早期（03天）,心脏浸润的多种固有免疫细胞（NK、巨噬细胞、γδT）及其独特的炎症因子效应发挥了直接抗病毒效应和调节后续T细胞应答的重要前驱作用。我们的预实验发现,CVB3感染1天起,即诱导激活了外周血中性粒细胞扩增和向心脏组织的快速浸润,并在第3天达高峰,其动力学曲线显着早于单核巨噬细胞,其绝对数高于其他浸润免疫细胞,且其心脏浸润绝对数与急性心肌炎损伤成正相关,提示中性粒细胞可能在急性VMC发病早期扮演重要作用。中性粒是人外周血的优势监控细胞,具有分泌抗菌肽、细胞因子及产生反应活性氧（ROS）、形成胞外诱捕网（NET）、调节T细胞应答等多种功能,是抗细菌及真菌感染的早期重要效应细胞,在心肌梗塞等无菌性炎症疾病中则发挥早期浸润和损伤组织作用;而在肿瘤则发挥抑制免疫促肿瘤生长功能。然而,中性粒细胞在病毒感染中的作用不甚明确,呼吸道单纯疱疹病毒和流感病毒感染中肺泡支气管大量浸润的中性粒细胞不发挥显着功能。在CVB3感染早期,浸润心脏的中性粒细胞是否可能发挥抗病毒作用?或发挥损伤心肌组织、促进心肌炎作用?本实验室前期研究以中性粒细胞特异单抗anti-Ly6G清除外周中性粒细胞发现不影响CVB3复制与急性心肌炎。而这一现象不能反映心脏浸润中性粒细胞的功能。为寻求一种能调节中性粒细胞心脏浸润的试剂从而探究心脏浸润中性粒细胞在VMC中的作用,我们发现膜联蛋白A1（annexin A1,Anx A1）具有调节中性粒细胞组织迁移的功能。Anx A1,是糖皮质激素通路信使,优势表达于上皮细胞、血管内皮细胞和中性粒细胞,能调节细胞内体囊泡吞噬体与肌动蛋白微丝结合而调控细胞的血管黏附与跨血管迁移。Anx A1和其N端模拟肽Ac2-26,与血管内皮细胞表面甲酰化受体2（FPR2）作用,具有调控中性粒细胞与内皮细胞黏附和迁移、调控巨噬细胞极化、调控局部炎症应答的功能。综上,我们提出科学假设:CVB3感染早期诱导外周血中性粒细胞向心脏的快速和优势浸润,可能发挥促炎促心肌损伤、促炎的有害作用,外源注射膜联蛋白Anx A1模拟肽Ac2-26,预期通过干预感染早期的中性粒细胞血管黏附与心脏迁移而改变（减轻）病毒性心肌炎发生。进一步深入探讨心脏浸润中性粒细胞通过分泌ROS、经由NET凋亡结构的促心肌细胞损伤和促心肌炎的致病机制,为病毒性心肌炎的防治提供基于中性粒细胞干预的新切入点。研究方法:1.BALB/c小鼠病毒性心肌炎模型建立:以1000 TCID50剂量CVB3腹腔注射小鼠建立急性心肌炎模型,7天小鼠死亡率约20%,体重减轻率25%,心脏第3天病毒载量约105 PFU/g心肌。第7天可见心肌细胞坏死崩解及炎性细胞浸润。2.心肌炎和心肌纤维化免疫组化染色鉴定:心脏组织经过多聚甲醛固定、脱水、包埋、制成超薄切片,H&E染色显示心脏组织炎症。3.骨髓中性粒细胞提取纯化与中性粒细胞流式细胞术鉴定:自小鼠股骨和胫骨取骨髓,经Percoll密度梯度离心获得中性粒细胞,纯度达95%。表型为CD11b+Ly6G+或CD11b+Gr1high。经流式检测,均可见独立的CD11b+Ly6G+一群,健康未感染鼠外周血中性粒细胞比例约410%（占CD45+淋巴细胞）。4.中性粒细胞合成ROS鉴定:骨髓来源中性粒细胞用PMA或CVB3刺激,中加入ROS检测探针H2DCFDA,流式细胞术检测ROS检测探针荧光强度。5.中性粒细胞形成胞外诱捕网（NET）效应的鉴定:两种方法:1)双荧光染色:以PMA诱导骨髓来源中性粒细胞形成胞外诱捕网,瓜氨酸化组蛋白（Cit-H3）为标志,anti-Cit-H3抗体联合Alexa fluor 488-抗-兔荧光二抗标记Cit-H3,DAPI染核,激光共聚焦显微镜鉴定。2)Western blot检测瓜氨酸化组蛋白（Cit-H3）。6.Anx A1模拟肽Ac2-26小鼠注射试验:6-8周BALB/c雄鼠,Ac2-26通过腹腔注射小鼠（2.5 mg/kg/d）,day-1/day1/day3注射3次。7.外周血和心脏免疫细胞组成的流式鉴定:裂解外周血中红细胞获取外周血单核细胞;以40%-75%不连续Percoll密度梯度离心获取心脏组织单个核免疫细胞,5抗体染色鉴定髓系细胞组成:CD45、CD11b、Ly6C、Ly6G、F4/80。通过4抗体染色鉴定T细胞组成:CD45、CD3、CD4、CD8,流式细胞仪检测。8.心脏超声仪检测左心室收缩舒张功能:小鼠麻醉后,用小动物超声成像系统（Vevo 2100）测量左心室收缩末期内径和左心室舒张末期内径,获得左心室射血分数（EF%）、左心室短轴缩短率（FS%）的计算值。9.实时定量RT-PCR技术检测外周血和心脏中性趋化因子、炎症细胞因子表达。10.骨髓中性粒细胞与原代心肌细胞共孵育试验:提取骨髓来源中性粒细胞,体外经PMA或CVB3刺激4小时,诱导ROS及NET的形成,随后与乳鼠原代心肌细胞共培养4小时,流式细胞术检测心肌细胞凋亡、坏死情况。11.统计学分析:数据采用均数±标准差表示;以Graphpad Prism 5统计软件进行统计学分析;组间比较采用方差分析;P<0.05被认为存在统计学差异。结果:1、CVB3感染第3天小鼠心脏上调表达中性粒细胞趋化因子。实时定量PCR检测心脏组织中性粒相关趋化因子表达,结果显示,CVB3感染后,显着诱导了CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、IL-8的上调表达,且第3天达高峰。2、CVB3感染小鼠诱导的外周血中性粒细胞扩增与心脏的早期快速浸润。CVB3感染第0、3、7天,流式细胞术检测外周血和心脏组织单核淋细胞结果显示:未感染小鼠外周血中性粒细胞占CD45+淋巴细胞的8%,绝对数2╳105个/ml;心脏比例约4%,绝对数1╳104个/g心脏。CVB3感染3天,外周血和心脏中性粒细胞比例显着上升至65%和45%,达到高峰,随后比例下降,而绝对数均持续上升。感染第7天心脏中性粒细胞比例回落至15-28%,而其绝对数达到13╳104个/g心脏。中性粒细胞这一先升后降的动力学曲线与CVB3心脏复制曲线一致。同时发现Ly6Chigh单核细胞发生外周扩增和心脏浸润,但其比例和绝对数（心脏浸润单核细胞在0/3/7天分别为2%-12%-15%）显着低于中性粒细胞。提示CVB3感染诱导0-3天外周血中性粒迅速扩增和向心脏的快速优势浸润。3、CVB3体内外均激活中性粒细胞上调功能性分子MPO及ROS的表达。中性粒细胞合成分泌的特征性酶和功能性分子包括:髓过氧化物酶（MPO）和活性反应氧中间物（ROS）等,为研究CVB3感染对心脏浸润中性粒细胞的激活作用,首先免疫组化及Western blot检测CVB3感染心脏组织中MPO的变化,发现随CVB3感染0-7天,心脏组织MPO表达逐渐上调;Amplex法证实心脏组织中ROS水平持续升高。体外以CVB3刺激骨髓来源中性粒细胞发现ROS水平增高。提示CVB3感染激活中性粒细胞的心脏浸润并促使其上调表达功能性酶和ROS。4、CVB3感染上调心脏组织内源性膜联蛋白表达。在使用外源性膜联蛋白干预中性粒细胞迁移之前,我们检测了CVB3感染对内源性膜联蛋白的调节。免疫组化发现,未感染小鼠心脏几乎不表达膜联蛋白;CVB3感染07天,内源性膜联蛋白随感染不断上调表达。5、外源注射膜联蛋白模拟肽Ac2-26可减少病毒复制并治疗急性病毒性心肌炎。为干预CVB3感染后的中性粒细胞心脏迁移,采用膜联蛋白模拟肽Ac2-26注射方案:在感染-1、1、3、5天腹腔注射2.5mg/kg Ac2-26肽,0天注射CVB3,检测病毒复制与急性病毒性心肌炎的改变。结果显示:注射Ac2-26的小鼠经CVB3感染后,生存率显着提高、体重减轻率则相对下降,提示Ac2-26的治疗效果。感染7天心脏石蜡切片HE染色显示:Ac2-26组与未治疗组相比,心肌细胞坏死、炎性细胞浸润显着减少。Ac2-26显着减少心脏匀浆中促炎细胞因子IL-1β、IL-6表达水平。心超检测发现:Ac2-26能显着提高CVB3感染下降的心脏左室短轴缩短率及心脏射血分数,提示心脏舒张功能改善。Ac2-26能明显降低心脏病毒的载量及复制。提示外源注射Ac2-26能显着减少病毒复制、减轻CVB3诱导的急性病毒性心肌炎并改善心脏功能。6、外源注射膜联蛋白模拟肽Ac2-26减轻急性病毒性心肌炎的机制:与外周及心脏中性粒细胞浸润比例与绝对数显着减少密切相关。Anx A1调节免疫细胞的血管黏附与跨血管运动。为此分析了Ac2-26治疗第7天外周血和心脏中性粒细胞、单核细胞的比例与数目变化,发现:1)外周血中性粒细胞比例及绝对数显着减少:CVB3感染诱导外周血总CD11b+髓系细胞及其中的Ly6Chigh单核与Ly6G+Ly6C-中性粒细胞比例及绝对数显着上升,而Ac2-26显着降低CD11b+髓系细胞比例及绝对数。其中,外周血单核细胞比例及绝对数略有下降;而外周血中性粒细胞比例由90%降低至63%,其绝对数由1.4╳106/ml显着减少至0.4╳106/ml。2)心脏中性粒相关趋化因子表达显着降低:的表达变化。结果显示:膜联蛋白模拟肽Ac2-26注射后使CVB3上调的心脏CXCL1/2/3/5的表达显着降低。3)心脏中性粒细胞浸润比例与绝对数显着减少:Ac2-26注射后,心脏浸润总CD11b+髓系细胞比例和绝对数显着减少,其中心脏中性粒细胞比例略下降（45%至33%）,而绝对数由4╳104/g心脏显着降至1.2╳104/g心脏。免疫荧光检测心脏CD11b+Ly6G+细胞,同样证实Ac2-26能显着减少心脏内中性粒细胞浸润。同时,心脏浸润促炎单核细胞比例略下降,绝对数显着降低。提示外源注射Anx A1治疗急性心肌炎的机制与显着抑制CVB3诱导的外周中性粒心脏浸润密切相关。7、CVB3可体外激活骨髓来源中性粒细胞分泌ROS并促进原代心肌细胞凋亡。为阐明心脏浸润中性粒细胞促进心肌炎症损伤的机制,首先研究了中性粒细胞ROS分泌及其对心肌细胞效应。小鼠骨髓来源中性粒细胞在PMA和CVB3刺激后,ROS的产生显着上升;经与原代心肌细胞共孵育,可能促进心肌细胞凋亡。而Ac2-26能减少CVB3诱导中性粒ROS产生。8、PMA诱导中性粒NET效应可促心肌细胞凋亡而CVB3体外不能诱导经典NET形成。骨髓来源中性粒细胞以PMA刺激3hr,双荧光共聚焦显示PMA可诱导中性粒细胞内DNA等向胞外翻转和弥散;而Ac2-26能够显着抑制NET结构形成。将PMA诱导NET与原代心肌细胞共孵育发现促进心肌细胞凋亡,而NET抑制剂、MPO抑制剂和Ac2-26均可抑制PMA诱导中性粒NET的促心肌凋亡作用。初步试验发现CVB3体外刺激并不能诱导经典NET结构,推测诱导另一形式的不正常死亡（necroptosis）。9、NET抑制剂体内注射小鼠具有病毒性心肌炎的治疗作用。为证实CVB3感染诱导过度的中性粒死亡（NET）是其促炎致病机制。以中性粒细胞NET形成必需的PAD4抑制剂Cl-amidine,-1/1/3/5天注射小鼠,0天感染CVB3,发现可提高小鼠生存率。其余试验尚进行中。结论:1、CVB3感染BALB/c小鼠诱导了外周血中性粒细胞扩增和快速优势的心脏迁移浸润,中性粒细胞心脏浸润程度与心肌炎症损伤呈正比。2、CVB3感染诱导小鼠心脏上调表达膜联蛋白Annexin A1.3、外源注射膜联蛋白模拟肽Ac2-26可显着降低CVB3体内复制、减轻急性病毒性心肌炎。4、Anx A1减轻CVB3性心肌炎的机制与显着下调外周血中性粒细胞扩增、减少中性粒细胞心脏浸润、抑制中性粒细胞分泌ROS相关。5、CVB3体外激活中性粒细胞分泌大量ROS,其可能促进心肌细胞凋亡。6、体外PMA诱导的中性粒NET效应促心肌细胞凋亡;体内中性粒NET效应可增加小鼠对CVB3的易感性。
二、柯萨奇-腺病毒受体在外周血不同类型白细胞的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、柯萨奇-腺病毒受体在外周血不同类型白细胞的表达（论文提纲范文）
（1）HSV-1溶瘤病毒用于肿瘤精准治疗及肿瘤耐受机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 1 疱疹病毒概述 |
| 1.1 疱疹病毒的分类 |
| 1.2 单纯疱疹病毒 |
| 2 溶瘤病毒研究进展 |
| 2.1 溶瘤病毒的种类 |
| 3 CRISPR/Cas9 系统概述 |
| 3.1 CRISPR/Cas9 系统的分子机制 |
| 3.2 CRISPR/Cas9 系统在HSV-1 病毒基因改造中的应用 |
| 4 研究的目的和意义 |
| 第一章 HSV-1 溶瘤病毒治疗小鼠恶性肿瘤 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 仪器耗材 |
| 1.2.1 主要仪器 |
| 1.2.2 材料 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 细胞培养 |
| 1.3.2 细胞转染 |
| 1.3.3 HSV-1 病毒的扩增与保存 |
| 1.3.4 HSV-1 对细胞增殖影响的曲线制备 |
| 1.3.5 HSV-1 对细胞存活影响的曲线制备 |
| 1.3.6 利用CRISPR/Cas9 系统构建基因改造溶瘤病毒 |
| 1.3.7 图像分析和数据统计 |
| 1.4 结果 |
| 1.4.1 制备ICP34.5 缺失的HSV-1 溶瘤病毒 |
| 1.4.2 HSV-1-ΔICP34.5 病毒对小鼠黑色素瘤的治疗效果 |
| 1.4.3 多种细胞系对HSV-1-ΔICP34.5 病毒的敏感性分析 |
| 1.4.4 HSV-1-ΔICP34.5 病毒对小鼠结肠癌的治疗效果 |
| 1.4.5 Nectin1 缺失抵抗HSV-1-ΔICP34.5 病毒对小鼠结肠癌的治疗 |
| 1.4.6 HSV-1-NEO2/15 溶瘤病毒制备 |
| 1.4.7 HSV-1-NEO-2/15 溶瘤病毒对小鼠结肠癌的治疗效果 |
| 1.5 讨论 |
| 第二章 利用全基因组CRISPR-Cas9敲除文库进行HSV-1宿主依赖因子的筛选及富集 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 仪器耗材 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 材料 |
| 2.2.4 主要溶液的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 利用CRISPR/Cas9 系统构建基因敲除细胞 |
| 2.3.3 Western Blot验证敲除细胞株 |
| 2.3.4 细胞免疫荧光 |
| 2.3.5 慢病毒包装 |
| 2.3.6 细胞总RNA提取 |
| 2.3.7 cDNA的合成 |
| 2.3.8 cDNA的普通PCR反应 |
| 2.3.9 病毒结合实验 |
| 2.3.10 图像分析和数据统计 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 制备L929 全基因组细胞敲除文库 |
| 2.4.2 利用全基因组敲除库筛选抗HSV-1 的细胞 |
| 2.4.3 筛选后抗病毒细胞对HSV-1 病毒的敏感性分析 |
| 2.4.4 筛选过程中sg RNA以及其靶向基因的动力学变化 |
| 2.4.5 PANTHER GO富集度分析 |
| 2.4.6 富集HSV-1 病毒的宿主依赖因子 |
| 2.4.7 临床肿瘤患者体内HSV-1 病毒HDF的突变频率分析 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 HSV-1 宿主依赖因子候选基因的验证与分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 仪器耗材 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 利用CRISPR/Cas9 系统构建基因敲除细胞 |
| 3.3.2 利用PANTHER网站分析基因功能 |
| 3.3.3 利用KEGG网站分析目的基因通路关系 |
| 3.3.4 图像分析和数据统计 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 Nectin1和ENTPD1 基因缺失对病毒的抵抗 |
| 3.4.2 ENTPD1 基因是一个HSV-1 病毒新的宿主依赖因子 |
| 3.4.3 敲除ENTPD1对HSV-1 感染后病毒增殖的影响 |
| 3.4.4 ENTPD1 缺失抵抗HSV-1 感染不依赖I型干扰素通路 |
| 3.4.5 ENTPD1 缺失阻止HSV-1 病毒进入细胞,但不影响病毒和细胞膜结合 |
| 3.4.6 BGC-823 细胞缺失ENTPD1 基因抵抗HSV-1 感染 |
| 3.4.7 其他HSV-1 病毒HDF候选基因验证与分析 |
| 3.4.8 硫酸乙酰肝素合成途径对HSV-1 进入细胞至关重要 |
| 3.4.9 KEGG通路分析 |
| 3.4.10 确定硫酸乙酰肝素合成途径候选基因 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 附录 Ⅰ |
| 附录 Ⅱ |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）TRAIL修饰溶瘤腺病毒靶向治疗急性髓系白血病的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 急性髓系白血病治疗研究进展 |
| 1.1.1 急性髓系白血病 |
| 1.1.2 AML治疗现状 |
| 1.1.3 AML的新型疗法 |
| 1.2 溶瘤腺病毒与AML治疗 |
| 1.2.1 溶瘤病毒 |
| 1.2.2 溶瘤腺病毒 |
| 1.2.3 溶瘤腺病毒治疗AML的限制 |
| 1.3 溶瘤腺病毒的改造策略 |
| 1.3.1 溶瘤腺病毒的肿瘤靶向策略 |
| 1.3.2 基于pIX的靶向性改造 |
| 1.3.3 TRAIL修饰溶瘤腺病毒 |
| 1.4 立题依据与论文设计 |
| 1.4.1 立题依据 |
| 1.4.2 设计思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料、仪器设备与常用试剂 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 常用试剂及缓冲液配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒构建 |
| 2.2.2 蛋白表达及纯化 |
| 2.2.3 SDS-PAGE |
| 2.2.4 Western Blot |
| 2.2.5 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2.2.6 MTT法检测腺病毒诱导的细胞死亡 |
| 2.2.7 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.2.8 重组腺病毒扩增 |
| 2.2.9 重组腺病毒纯化 |
| 2.2.10 腺病毒的体内注射后肿瘤靶向检测 |
| 2.2.11 溶瘤腺病毒体内抗肿瘤活性检测 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 急性髓系白血病细胞系及样本受体表达分析 |
| 3.1.1 不同急性髓系白血病细胞株相关受体表达 |
| 3.1.2 急性髓系白血病样本相关受体表达检测 |
| 3.1.3 小结 |
| 3.2 sTRAIL与zipper融合表达质粒的构建及蛋白表达纯化 |
| 3.2.1 sTRAIL与zipper融合表达质粒的构建 |
| 3.2.2 重组z-sTRAIL蛋白的表达纯化 |
| 3.2.3 小结 |
| 3.3 重组溶瘤腺病毒的优化 |
| 3.3.1 重组溶瘤腺病毒的体外优化 |
| 3.3.2 优化后重组溶瘤腺病毒zA4性质评价 |
| 3.3.3 重组溶瘤腺病毒的抗肿瘤活性分析 |
| 3.3.4 小结 |
| 3.4 重组溶瘤腺病毒体外抗AML检测 |
| 3.4.1 重组溶瘤腺病毒对AML细胞系感染性差异分析 |
| 3.4.2 重组溶瘤腺病毒体外抗AML活性 |
| 3.4.3 小结 |
| 3.5 重组溶瘤腺病毒体内抗AML评价 |
| 3.5.1 重组溶瘤腺病毒体内靶向效果评价 |
| 3.5.2 重组溶瘤腺病毒皮下荷瘤模型抗AML活性 |
| 3.5.3 重组溶瘤腺病毒体内肝肾毒性检测 |
| 3.5.4 重组溶瘤腺病毒静脉荷瘤模型抗AML活性 |
| 3.5.5 小结 |
| 3.6 Rh2 联合重组溶瘤腺病毒体外抗肿瘤效果评价 |
| 3.6.1 MTT法检测Rh2联合sTRAIL对THP-1细胞体外杀伤评价 |
| 3.6.2 Rh2联合sTRAIL诱导细胞凋亡 |
| 3.6.3 MTT法检测Rh2联合zA4对THP-1细胞体外杀伤评价 |
| 3.6.4 MTT法检测Rh2联合zA4对原代AML细胞体外杀伤评价 |
| 3.6.5 小结 |
| 3.7 Rh2联合重组溶瘤腺病毒体内抗肿瘤效果评价 |
| 3.7.1 Rh2联合重组溶瘤腺病毒体内抗肿瘤效果评价 |
| 3.7.2 Rh2联合重组溶瘤腺病毒对AML细胞组织浸润能力的影响 |
| 3.8 小结 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 作者简历及攻读博士学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（3）肺癌靶向性丝素/ING4-IL-24双基因共表达腺病毒复合物（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 肺癌抑制基因 |
| 1.2 ING4及IL-24基因的抑癌作用 |
| 1.2.1 ING4基因 |
| 1.2.2 IL-24基因 |
| 1.2.3 ING4及IL-24双基因协同作用 |
| 1.3 ING4及IL-24基因的传递载体 |
| 1.4 腺病毒载体 |
| 1.4.1 腺病毒性质 |
| 1.4.2 腺病毒载体的修饰 |
| 1.5 柞蚕丝素蛋白 |
| 1.5.1 柞蚕丝素蛋白的性质 |
| 1.5.2 柞蚕丝素蛋白应用于基因传递载体 |
| 1.5.3 柞蚕丝素蛋白的阳离子化修饰 |
| 1.6 肺癌细胞的靶向配体 |
| 1.6.1 靶向分子 |
| 1.6.2 靶向肽 |
| 1.7 本文的研究目的及内容 |
| 第二章 ING4-IL-24双基因共表达腺病毒的构建及鉴定 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 溶液、卡那板及凝胶的配制 |
| 2.2.2 双基因重组转移质粒的扩增 |
| 2.2.3 双基因重组转移质粒的PCR鉴定 |
| 2.2.4 同源重组腺病毒质粒的构建 |
| 2.2.5 双基因共表达同源重组腺病毒的包装和扩增 |
| 2.2.6 双基因共表达腺病毒的效价 |
| 2.2.7 双基因共表达腺病毒中ING4基因的表达 |
| 2.2.8 双基因共表达腺病毒中IL-24基因的表达 |
| 2.2.9 数据统计分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 双基因共表达质粒的鉴定 |
| 2.3.2 同源重组腺病毒的构建和鉴定 |
| 2.3.3 腺病毒的包装和扩增 |
| 2.3.4 鉴定同源重组腺病毒中双基因的表达 |
| 2.4 本章结论 |
| 第三章 柞蚕丝素蛋白的阳离子化改性 |
| 3.1 实验材料与仪器 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 溶液的配制 |
| 3.2.2 柞蚕生丝脱胶 |
| 3.2.3 柞蚕丝素溶解 |
| 3.2.4 柞蚕溶液浓度测定 |
| 3.2.5 PEI改性柞蚕丝素蛋白 |
| 3.2.6 CASF的表面Zeta电位 |
| 3.2.7 CASF的核磁共振氢谱 |
| 3.2.8 CASF的X-射线光电子能谱 |
| 3.2.9 CASF的红外吸收光谱 |
| 3.2.10 Cu~(2+)滴定法测定PEI接枝效率 |
| 3.2.11 CASF溶液粘度 |
| 3.2.12 CASF的圆二色光谱 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 PEI改性柞蚕丝素蛋白的反应过程 |
| 3.3.2 CASF的表面Zeta电位 |
| 3.3.3 CASF的核磁共振氢谱 |
| 3.3.4 CASF的红外吸收光谱 |
| 3.3.5 CASF的X-射线光电子能谱 |
| 3.3.6 PEI接枝柞蚕丝素蛋白的效率 |
| 3.3.7 CASF溶液粘度 |
| 3.3.8 CASF的二级结构 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 阳离子化柞蚕丝素蛋白的肺癌靶向肽修饰 |
| 4.1 实验材料与仪器 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 柞蚕丝脱胶、溶解、浓度测定、阳离子化改性 |
| 4.2.2 靶向肽C_9修饰阳离子化柞蚕丝素蛋白 |
| 4.2.3 CASF-C_9的表面Zeta电位测定 |
| 4.2.4 CASF-C_9的核磁共振氢谱测试 |
| 4.2.5 CASF-C_9的X-射线光电子能谱测试 |
| 4.2.6 CASF-C_9的红外吸收光谱测试 |
| 4.2.7 CASF-C_9的能谱测试 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 寡肽C_9修饰阳离子化柞蚕丝素蛋白 |
| 4.3.2 CASF-C_9的表面Zeta电位 |
| 4.3.3 CASF-C_9的能量色散X-射线光谱 |
| 4.3.4 CASF-C_9的核磁共振氢谱 |
| 4.3.5 CASF-C_9的红外吸收光谱 |
| 4.3.6 CASF-C_9的X-射线光电子能谱 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 CASF-C_9/pDNA复合物对肺癌细胞的靶向生物学效应 |
| 5.1 实验材料与仪器 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 琼脂糖凝胶的配制 |
| 5.2.2 质粒的摇菌、抽提及浓度测定 |
| 5.2.3 CASF-C_9/pDNA复合物的制备 |
| 5.2.4 CASF-C_9/pDNA复合物的琼脂糖凝胶电泳 |
| 5.2.5 CASF-C_9/pDNA复合物的表面Zeta电位 |
| 5.2.6 CASF-C_9/pDNA复合物的形貌及粒径 |
| 5.2.7 CASF-C_9/pDNA复合物转染细胞的绿色荧光表达 |
| 5.2.8 CASF-C_9/pDNA复合物的转染效率 |
| 5.2.9 CASF-C_9/pDNA复合物转染细胞的存活率 |
| 5.2.10 数据统计分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 CASF-C_9/pDNA复合物的琼脂糖凝胶电泳 |
| 5.3.2 CASF-C_9/pDNA复合物的表面Zeta电位 |
| 5.3.3 CASF-C_9/pDNA复合物的形貌及粒径 |
| 5.3.4 CASF-C_9/pDNA复合物转染细胞的荧光表达 |
| 5.3.5 CASF-C_9/pDNA复合物的转染效率 |
| 5.3.6 CASF-C_9/pDNA复合物对细胞增殖的影响 |
| 5.3.7 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 CASF-C_9/Ad复合物的制备及其体外生物学效应 |
| 6.1 实验材料与仪器 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 实验仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 柞蚕丝的脱胶、溶解、浓度测定、阳离子化改性 |
| 6.2.2 靶向肽修饰阳离子化柞蚕丝素蛋白 |
| 6.2.3 材料与腺病毒的荧光标记 |
| 6.2.4 不同感染复数的腺病毒体外感染细胞 |
| 6.2.5 CASF-C_9/Ad复合物的制备 |
| 6.2.6 CASF-C_9/Ad复合物的表面Zeta电位 |
| 6.2.7 CASF-C_9/Ad复合物的形貌及粒径 |
| 6.2.8 CASF-C_9/Ad复合物的靶向作用 |
| 6.2.9 CASF-C_9/Ad复合物感染细胞的绿色荧光表达 |
| 6.2.10 CASF-C_9/Ad复合物感染细胞的效率 |
| 6.2.11 CASF-C_9/Ad复合物中ING4基因在H460细胞中的表达 |
| 6.2.12 CASF-C_9/Ad复合物中IL-24基因在H460细胞中的表达 |
| 6.2.13 CASF-C_9/Ad复合物感染细胞后的存活率 |
| 6.2.14 CASF-C_9/Ad复合物诱导肺癌细胞凋亡 |
| 6.2.15 数据统计分析 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 不同感染复数的裸腺病毒体外感染细胞 |
| 6.3.2 CASF-C_9/Ad复合物的表面Zeta电位 |
| 6.3.3 CASF-C_9/Ad复合物的形貌及粒径 |
| 6.3.4 CASF-C_9/Ad复合物与细胞共作用 |
| 6.3.5 CASF-C_9/Ad复合物感染细胞的绿色荧光表达 |
| 6.3.6 CASF-C_9/Ad复合物感染细胞的效率 |
| 6.3.7 CASF-C_9/Ad复合物对细胞增殖的影响 |
| 6.3.8 CASF-C_9/Ad复合物中外源性双基因在H460细胞中的表达 |
| 6.3.9 CASF-C_9/Ad复合物诱导肺癌细胞H460凋亡 |
| 6.3.10 讨论 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 CASF-C_9/Ad复合物抑制肺癌移植瘤生长的动物实验 |
| 7.1 实验材料与仪器 |
| 7.1.1 实验材料 |
| 7.1.2 实验仪器 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 柞蚕丝的脱胶、溶解、浓度测定、阳离子化改性 |
| 7.2.2 靶向肽修饰阳离子化柞蚕丝素蛋白 |
| 7.2.3 CASF-C9/Ad复合物的制备 |
| 7.2.4 荷瘤小鼠致瘤所需H460细胞数量试验 |
| 7.2.5 建立小鼠H460肺癌移植瘤 |
| 7.2.6 CASF-C9/Ad复合物治疗肺癌移植瘤 |
| 7.2.7 免疫组化检测 |
| 7.2.8 数据统计分析 |
| 7.3 实验结果 |
| 7.3.1 小鼠移植瘤的致瘤细胞数量 |
| 7.3.2 CASF-C9/Ad复合物的抑瘤作用 |
| 7.3.3 HE染色观察肿瘤组织 |
| 7.3.4 免疫组化检测肿瘤相关因子的表达 |
| 7.3.5 讨论 |
| 7.4 本章小结 |
| 第八章 结语 |
| 8.1 全文结论 |
| 8.2 本论文的主要创新点 |
| 8.3 后续研究计划 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读博士学位期间本人发表的论文及着作 |
| 致谢 |
（4）儿童暴发性心肌炎长链非编码RNA表达谱及其功能分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 研究对象与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Long Non-coding RNA Recent Advances in Atrial Fibrillation |
| References |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文目录 |
| 大会交流 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（5）3、7型腺病毒纤毛蛋白差异对其致病力的影响机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 重庆地区急性呼吸道感染住院患儿腺病毒流行病学和临床特征分析 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 3、7型腺病毒纤毛蛋白差异对其致病力的影响 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 3、7 型腺病毒纤毛蛋白与受体CD46、DSG-2 结合介导其致病性差异的机制研究 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（6）固有IL-17A在CVB3诱导的病毒性胰腺炎发病中的作用及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 IL-17A在CVB3感染早期胰腺显着上调并促进病毒性胰腺炎损伤 |
| 1、引言 |
| 2、材料与方法 |
| 2.1 小鼠、细胞和病毒 |
| 2.2 试剂与耗材 |
| 2.3 仪器 |
| 2.4 实验方法 |
| 3、结果 |
| 3.1 CVB3感染C57BL/6小鼠诱导了严重的致死性急性病毒性胰腺炎 |
| 3.2 CVB3感染显着上调胰腺局部早期IL-17A分泌 |
| 3.3 上调的IL-17A在CVB3诱导的病毒性胰腺炎中发挥促炎有害作用 |
| 4、讨论 |
| 第二部分 γδT细胞是急性胰腺炎小鼠胰腺早期IL-17A的重要来源 |
| 1、引言 |
| 2、材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3、结果 |
| 3.1 胰腺早期innate IL-17A的主要来源之一是胰腺浸润γδT细胞 |
| 4、讨论 |
| 第三部分: IL-17A~+γδT增加小鼠对CVB3的易感性并显着促进急性胰腺炎发病 |
| 1、引言 |
| 2、材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3、结果 |
| 3.1 γδT细胞促进CVB3急性胰腺炎发病 |
| 3.2 中和抗体清除Vγ4 γδT细胞后病毒性胰腺炎显着减轻 |
| 3.3 TCRδ~(-/-)小鼠回输WT小鼠Vγ4 γδT细胞加重病毒性胰腺炎 |
| 4、讨论 |
| 第四部分 γδT17细胞促进CVB3病毒性胰腺炎的机制与促进中性粒细胞胰腺浸润和诱导Th17应答相关 |
| 1、引言 |
| 2、材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3、结果 |
| 3.1 缺失IL-17A或γδT小鼠胰腺炎减轻均伴随胰腺浸润中性粒细胞显着减少 |
| 3.2 中和抗体清除Vγ4γδT细胞后胰腺浸润中性粒细胞显着减少 |
| 3.3 清除Vγ4 γδT小鼠感染CVB3后上调IFNγ~+CD4~+Th1下调IL-17A~+Th17应答 |
| 4、讨论 |
| 第五部分 早期IL-23-IL-17通路激活胰腺γδT17细胞的机制探讨 |
| 1、引言 |
| 2、材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3、结果 |
| 3.1 CVB3感染第1天诱导胰腺IL-23显着上调表达 |
| 3.2 注射重组IL-23显着加重CVB3诱导胰腺炎的严重程度 |
| 3.3 注射重组IL-23后显着增加体内诱导的IL-17A~+γδT应答 |
| 4、讨论 |
| 结论和思考 |
| 1、结论 |
| 2、创新性 |
| 3、不足和未尽工作 |
| 参考文献 |
| 综述: IL- 17A~+γδT细胞研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略语 |
| 致谢 |
（7）E1A基因修饰的间充质干细胞介导的CD3-HAC阻断PD-1/PD-L1对转移性乳腺癌的免疫治疗研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 附录3 |
| 致谢 |
（8）阳离子化柞蚕丝素改性的hING4-IL-24双基因共表达腺病毒载体（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 ING4和IL-24的抑癌作用及其机制 |
| 1.2 ING4和IL-24基因的表达和传递载体 |
| 1.3 腺病毒基因载体及其表达修饰 |
| 1.3.1 腺病毒的特性 |
| 1.3.2 腺病毒载体表面修饰 |
| 1.4 柞蚕丝素蛋白(ASF) |
| 1.5 本文研究的目的和内容 |
| 第二章 RGD修饰的hING4-IL-24 双基因共表达腺病毒载体的构建及鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 双基因共表达重组转移载体的构建和鉴定 |
| 2.3.2 同源重组腺病毒质粒的构建和鉴定 |
| 2.3.3 同源重组腺病毒载体的包装和扩增 |
| 2.3.4 Western blotting鉴定hING4 基因的表达 |
| 2.3.5 ELISA检测IL-24 基因的表达 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 低分子量聚乙烯亚胺对柞蚕丝素蛋白的阳离子化改性 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 柞蚕丝素蛋白与PEI的反应过程 |
| 3.2.2 Zeta电位 |
| 3.2.3 X-射线光电子能谱 |
| 3.2.4 圆二色光谱 |
| 3.2.5 核磁共振氢谱 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 CASF/Ad复合物的制备及其作为基因载体的体外实验研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 不同感染剂量腺病毒感染细胞的荧光显微镜观察 |
| 4.2.2 CASF/Ad复合物的表面Zeta电位 |
| 4.2.3 CASF/Ad复合物的SEM图片 |
| 4.2.4 CASF/Ad复合物对肝癌细胞、正常肝细胞感染及其对生长的影响 |
| 4.3 本章小结 |
| 第五章 结语 |
| 5.1 全文结论 |
| 5.2 本文创新点 |
| 5.3 本文的不足之处 |
| 5.4 今后的进一步研究 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间本人出版或公开的论文 |
| 致谢 |
（9）柯萨奇病毒B3对心肌微血管内皮细胞Fractalkine表达机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 柯萨奇病毒B3对心肌微血管内皮细胞的半数致死量的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 CVB3作用于心肌微血管内皮细胞后对Fractalkine和MAPK通路的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 抑制ERK1/2后对CVB3作用心肌微血管内皮细胞的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四部分 抑制FKN后对CVB3作用心肌微血管内皮细胞的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的科研成果目录 |
| 致谢 |
（10）Annexin A1调控的中性粒细胞心脏浸润在病毒性心肌炎发病中的作用及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 CVB3感染早期诱导了中性粒细胞快速优势的心脏浸润 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 CVB3感染BALB/c小鼠诱导急性病毒性心肌炎 |
| 3.2 CVB3诱导的外周血中性粒细胞、单核细胞扩增 |
| 3.3 CVB3感染上调心脏组织内中性粒趋化因子表达 |
| 3.4 CVB3感染3天诱导的心脏组织中性粒细胞优势浸润 |
| 3.5 CVB3体内外均激活中性粒细胞上调功能性分子MPO及ROS的表达 |
| 4.讨论 |
| 第二部分 注射膜联蛋白ANXA1模拟肽通过抑制中性粒细胞心脏浸润显着减轻CVB3急性心肌炎 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 CVB3感染上调小鼠心脏内源性膜联蛋白表达 |
| 3.2 外源注射膜联蛋白模拟肽Ac2-26可治疗急性病毒性心肌炎 |
| 3.3 外源注射膜联蛋白模拟肽Ac2-26显着改善了小鼠心脏舒张功能 |
| 3.4 外源注射Ac2-26可显着抑制心脏组织病毒载量及复制 |
| 3.5 外源注射Ac2-26显着减少外周血中性粒细胞扩增 |
| 3.6 外源注射Ac2-26显着减少心脏组织内中性粒细胞与单核细胞的浸润 |
| 4.讨论 |
| 第三部分 心脏浸润中性粒细胞促进急性心肌炎的可能机制及ANXA1对其功能的调节 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 中性粒细胞分泌ROS对原代心肌细胞活性的影响 |
| 3.2 CVB3刺激骨髓来源中性粒细胞形成胞外诱捕网及NET对于原代心肌细胞活性的影响 |
| 3.3 小鼠体内注射NET抑制剂提高了小鼠感染CVB3后的生存率 |
| 4.讨论 |
| 结论和思考 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略语 |
| 致谢 |
四、柯萨奇-腺病毒受体在外周血不同类型白细胞的表达（论文参考文献）
- [1]HSV-1溶瘤病毒用于肿瘤精准治疗及肿瘤耐受机制的研究[D]. 沈阳坤. 福建师范大学, 2020(12)
- [2]TRAIL修饰溶瘤腺病毒靶向治疗急性髓系白血病的研究[D]. 王子璇. 吉林大学, 2020(08)
- [3]肺癌靶向性丝素/ING4-IL-24双基因共表达腺病毒复合物[D]. 瞿静. 苏州大学, 2020(06)
- [4]儿童暴发性心肌炎长链非编码RNA表达谱及其功能分析[D]. 刘青青. 山东大学, 2020(02)
- [5]3、7型腺病毒纤毛蛋白差异对其致病力的影响机制研究[D]. 付扬喜. 重庆医科大学, 2019(01)
- [6]固有IL-17A在CVB3诱导的病毒性胰腺炎发病中的作用及机制[D]. 颜克鹏. 苏州大学, 2018(06)
- [7]E1A基因修饰的间充质干细胞介导的CD3-HAC阻断PD-1/PD-L1对转移性乳腺癌的免疫治疗研究[D]. 杨圆圆. 北京协和医学院, 2018(02)
- [8]阳离子化柞蚕丝素改性的hING4-IL-24双基因共表达腺病毒载体[D]. 汪巍巍. 苏州大学, 2018(05)
- [9]柯萨奇病毒B3对心肌微血管内皮细胞Fractalkine表达机制的研究[D]. 温继梨. 武汉大学, 2018(06)
- [10]Annexin A1调控的中性粒细胞心脏浸润在病毒性心肌炎发病中的作用及机制[D]. 杨洋. 苏州大学, 2018(01)