一、诱导型一氧化氮合酶在不同虫期日本血吸虫虫体中的表达（论文文献综述）
盛兆安[1]（2020）在《大片吸虫及其分泌抗原对宿主肠道菌群与免疫应答调节机制的研究》文中研究说明背景:片形吸虫病主要是由片形属的肝片吸虫和大片吸虫感染所致的人畜共患寄生虫病,对公共卫生安全造成严重威胁。片形吸虫在感染宿主的过程中会不断产生可溶性的分子及胞外囊泡（Extracellular Vesicles,EVs）调控宿主免疫微环境,在宿主体内建立持续感染。脊椎动物的胃肠道内共生微生物在维持免疫系统的发育和功能的同时,对宿主的营养和能量代谢平衡亦起着至关重要的作用。目前已经有大量的研究显示寄生虫与宿主肠道菌群具复杂的相互作用关系,本研究通过描绘大片形吸虫感染后对宿主肠道菌群与免疫相关分子相互关系,对宿主-寄生虫-肠道菌群的复杂关系深入探讨,为实验室研究转化临床应用奠定基础。方法:（1）通过大片吸虫囊蚴感染水牛、BALB/C小鼠,大片吸虫成虫ESP、15k EVs、100k EVs腹腔注射小鼠;（2）对涉及与寄生虫免疫相关的Th1型和Th2型免疫细胞因子、转录因子和Toll样受体,血清中特异性抗体等免疫学指标进行检测,初步推测大片吸虫感染所诱导的宿主免疫反应类型;（3）收集实验动物的肠道内容物,经Illumina Hi Seq测序平台进行16S r RNA测序分析,评价大片吸虫感染对肠道菌群构成和功能的影响;（4）使用差速离心的方法,对大片吸虫产生的两种不同形态的胞外囊泡15,000×g（15k EVs）和100,000×g（100k EVs）进行分离鉴定,使用shoutgun技术对100k EVs所含蛋白成分进行分析;（5）将免疫学指标与肠道菌群数据进行相关性分析,推断大片形吸虫感染与宿主肠道菌群的相互作用机制。结果:发现宿主对大片吸虫的易感性与Th2型免疫反应密切相关,大片吸虫感染早期诱导Th1/2混合型的免疫反应,慢性感染阶段则转为典型的Th2型免疫反应。血清中特异性的IgG和IgG1的抗体水平随感染进程呈上升趋势。表明大片吸虫感染所诱导的Th2型相关的细胞因子和IgG1可能是其在自然宿主水牛体内成功建立感染的关键。同时小鼠模型发现激活的ERK通路和抑制经典的TLRs-IKB-NF-κB（p65）通路,参与了大片吸虫诱导的Th2型免疫反应。依据不同离心力,成功分离鉴定了两种不同形态的胞外囊泡15k EVs和100k EVs,并经shoutgun技术对100k EVs所含蛋白成分进行鉴定,发现其中含有多种与免疫调控、诊断、疫苗候选分子相关的蛋白;体内实验发现ESP、15k EVs、100k EVs均可诱导小鼠Th2/Treg型免疫反应,并通过上调T细胞共抑制分子CLAT-4和PD-1,限制Th1型免疫的发展。水牛感染大片吸虫可显着降低水牛肠道菌群的α-多样性,肠道菌群的构成在不同胃肠道部位的结果差异较大。RDA/CCA分析在科水平上Peptostreptococcaceae和Family＿XIII与高水平的IgG1和IL4相关。F.gigantica感染显着减少水牛结肠中产短链脂肪酸（short-chain fatty acid,SCFAs）菌群Lachnospiraceae＿NK3A20＿group、Alistipes的丰度,降低结肠SCFAs浓度,大片吸虫感染小鼠同样观察到可减少结肠中产SCFAs的uncultured＿bacterium＿Lachnospiraceae丰度,提示Th2型免疫反应与下调菌群产生SCFAs相关。大片吸虫感染与成虫ESP、15k EVs、100k EVs注射均可降低小鼠结肠内容物菌群的α-多样性的,RDA/CCA分析Bacteroidetes和Proteobacteria与Th2和Treg型细胞因子具较强的相关性,而Bacteroidaceae和Cyanobacteria可能参与了大片吸虫感染引起的宿主纤维化的进程。结论:大片吸虫感染可通过调控宿主的肠道菌群的结构与菌群代谢产物影响宿主的免疫应答,促进其在宿主体内存活。对大片吸虫-宿主-肠道菌群作用关系的深入了解有助于我们更好的防控片形吸虫病提供参考。
马小涵[2]（2020）在《旋毛虫感染宿主血清中差异miRNA的功能及诊断价值研究》文中研究表明背景与目的旋毛虫病是一种遍及全世界的人畜共患寄生虫病,目前其感染宿主的机制尚不完全清楚,研究发现在寄生虫感染的宿主血液循环中可稳定地检测到宿主或寄生虫来源的miRNA,它们通过靶向调节宿主mRNA,从而参与宿主-寄生虫的相互调节,或成为有效的生物标志物。本研究应用高通量测序对旋毛虫感染小鼠血清中旋毛虫和小鼠来源的差异miRNA分别进行检测,运用生物信息学方法对差异miRNA进行功能分析,同时对不同感染时期血清中它们的表达水平进行检测,并对宿主血清中发现的旋毛虫miRNA应用于旋毛虫病诊断的临床价值进行分析,以期为揭示旋毛虫病的致病机制、寻找新型生物标志物及治疗靶标等提供新思路。材料方法1.旋毛虫感染血清中宿主差异miRNA的鉴定 将60只小鼠随机平分为感染组和对照组,感染组小鼠经口灌胃旋毛虫肌幼虫500条/只,对照组小鼠经口灌胃生理盐水,于感染后30 d摘眼球取血清,提取总RNA,用于高通量测序及qRT-PCR验证。对高通量测序结果进行分析寻找旋毛虫感染血清中差异的小鼠miRNA,对其进行GO功能及KEGG信号通路分析。另将540只小鼠随机平分为感染组及对照组,在感染后12、18及30 d收集小鼠血清,应用qRT-PCR对不同感染时期血清中差异的小鼠miRNA表达水平进行检测。2.宿主感染血清中旋毛虫来源miRNA的鉴定及诊断价值 实验分组及血清样本采集、总RNA的提取同上,采用高通量测序对小鼠血清中旋毛虫来源的miRNA进行鉴定,应用生物信息学方法对鉴定的旋毛虫miRNA（let-7、miR-9、miR-1、miR-7-5p）进行功能分析,对感染12、18、30 d小鼠血清中它们的表达水平进行qRT-PCR检测,绘制ROC曲线分析其对旋毛虫病的诊断价值。qRT-PCR分析感染6、8、10、12 d小鼠血清中旋毛虫miR-9和miR-1的表达变化,并绘制ROC曲线,分析它们对旋毛虫病早期感染的诊断价值。最后,对旋毛虫及其他寄生虫（并殖吸虫、裂头蚴、囊尾蚴、日本血吸虫、棘球蚴）感染的人血清中这四种miRNA的表达水平进行检测,绘制ROC曲线,明确其对旋毛虫病的特异性诊断价值。结果1.在旋毛虫感染小鼠血清中10个小鼠miRNA发生差异表达,其中5个明显上调（miR-467a-3p、miR-467d-3p、miR-376b-3p、miR-664-3p 和 miR-292a-5p）,5 个明显下调（miR-199a-5p、miR-455-5p、miR-125b-5p、miR-125a-5p 和miR-615-3p）。GO功能及KEGG通路分析显示,它们具有调节蛋白质磷酸化、细胞粘附等功能,参与粘着斑、MAPK等信号通路。qRT-PCR分析显示,在5个表达上调的小鼠miRNA中,miR-467a-3p和miR-467d-3p的表达水平从感染12 d到30 d逐渐增高;miR-376b-3p和miR-664-3p的表达水平在感染18 d时最高,随后逐渐降低。miR-292a-5p的表达水平从感染12 d到30d逐渐降低。在5个下调的miRNA中,除miR-199a-5p在感染30 d时显着下调外,其余4个miRNA（miR-455-5p、miR-125b-5p、miR-125a-5p 和 miR-615-3p）的表达在感染的不同时间均显着下调。2.高通量测序分析显示,在小鼠感染血清中共发现4个旋毛虫miRNA（let-7、miR-9、miR-1和miR-7-5p）。GO功能及KEGG通路分析显示,它们具有激酶活性、细胞间粘附等功能,主要参与Ras1、PI3K-Akt和MAPK等信号通路。qRT-PCR分析显示,小鼠血清中旋毛虫let-7的表达水平从感染12 d到30 d逐渐增高;miR-9的表达水平从感染12 d到30 d逐渐下降;miR-7-5p的表达水平在感染18 d时最高,然后逐渐降低;而miR-1的表达在不同感染时间均显着增高。3.宿主血清中旋毛虫来源的miR-7、miR-9、miR-1和let-7对人旋毛虫病均具有诊断价值（P<0.001）,且四者联合诊断可提高诊断效能,可用于旋毛虫病与其他几种寄生虫病的鉴别诊断。miR-9在旋毛虫感染小鼠早期血清中表达增高,其对旋毛虫早期感染具有诊断价值（P<0.001）。结论1.旋毛虫感染的小鼠血清中共10个小鼠miRNA发生差异表达,它们具有调节蛋白质磷酸化、细胞粘附等功能,参与粘着斑、MAPK信号通路,可能在宿主应对旋毛虫感染的免疫应答等中发挥作用。2.旋毛虫感染的小鼠血清中发现4个旋毛虫来源的miRNA:let-7、miR-9、miR-1及miR-7,具有激酶活性、细胞间粘附等功能,参与PI3K-Akt、Ras1等信号通路,其可能调控宿主的基因表达,从而实现寄生于宿主横纹肌的目的。3.宿主血清中旋毛虫来源的let-7、miR-9、miR-1及miR-7对旋毛虫病有特异性的诊断价值,且miR-9可作为旋毛虫早期感染的有效诊断指标。
陈聪[3]（2020）在《多肽ZLW调控宿主巨噬细胞极化改善血吸虫性肝纤维化》文中研究表明背景和目的:血吸虫病是一种流行于热带和亚热带地区的疾病,目前全世界超过2.4亿人感染血吸虫,且每年导致约500,000至800,000患者死亡。血吸虫感染后导致患者出现肝纤维化、门静脉高压、肝腹水和静脉曲张破裂进而导致上消化道大出血等严重的病理反应,而巨噬细胞极化在其形成过程中发挥着重要作用。本课题前期发现日本血吸虫体表非特异性结合的多肽ZLW有一定的抗血吸虫效果。因此,本研究通过分析多肽ZLW调控宿主巨噬细胞极化偏移,研究其改善肝纤维化的效果,并初步探索其作用机制。方法:（1）用PSIPRED、NetNGlyc 1.0、DISPHOS、ClustalW等软件分析ZLW的结构特点及功能;（2）分别用0.1、1、10、100、1000μg/ml的ZLW刺激RAW264.7细胞后,选取CD11b、F4/80、CD86、CD206作为巨噬细胞标记物,通过流式细胞技术分析ZLW对RAW264.7细胞极化偏移干预效应;（3）小鼠随机分为未感染+NC组、感染+NC组、感染+ZLW组后,将感染+NC组及感染+ZLW组小鼠通过腹腔表皮感染日本血吸虫尾蚴。感染后,未感染+NC组和感染+NC组小鼠每日注射100μl 0.9%的生理盐水,感染+ZLW组小鼠每日注射100μl 100μg的多肽ZLW;（4）分别在第3d、24d、33d、42d、49d分离各组小鼠的肝脏和脾脏巨噬细胞后,选取CD11b、F4/80为巨噬细胞标记物、CD86为M1巨噬细胞标记物、CD206为M2巨噬细胞标记物,通过流式细胞技术检测M1和M2比例变化;（5）分别在第3d、24d、33d、42d、49d取各组小鼠肝脏组织,通过H&E和Masson染色检测肝脏组织病理变化;（6）分别在第3d、24d、33d、42d、49d取各组小鼠肝脏组织,选取CD68为总巨噬细胞标记物、iNOS作为M1型巨噬细胞标记物、CD206和Arg1作为M2型巨噬细胞标记物,通过IHC染色确定肝脏组织中巨噬细胞的定性及定位分析;（7）分别在第3d、24d、33d、42d、49d将小鼠眼球取血,通过ELISA法检测血清中IL-6、TNF-α表达变化。结果:（1）多肽ZLW是长为39个氨基酸残基的多肽,富含多个磷酸化位点,且与鼠Zfp36l2蛋白存在高度同源性。（2）流式细胞技术检测发现,当多肽ZLW作用RAW264.7细胞的终浓度为100μg/ml时,M1巨噬细胞达到最大值50.73%,而M2巨噬细胞占比达到较小值3.28%。（3）流式细胞技术检测显示,多肽ZLW作用后,感染+ZLW组小鼠肝脏中M2/M1比例在第24天时最高,在第49天降到最低值,且均显着低于未感染+NC组和感染+NC组;脾脏中M2/M1比例在第33天时最高,在第42天后M2/M1比例接近于未感染+NC组,且均与感染+NC组存在显着性差异（P<0.01）。（4）H&E和Masson染色分析发现,感染+ZLW组小鼠肝脏组织病变程度和炎症细胞浸润现象明显减轻且纤维结缔组织增生明显减少。（5）IHC结果显示,感染+NC组及感染+ZLW组小鼠肝脏组织中CD68+细胞明显增多;感染+ZLW组小鼠肝脏组织中CD206+细胞相比感染+NC组明显有所减少;感染+ZLW组第42天的肝细胞胞浆中iNOS表达明显增加,而Arg1表达明显下降。（6）ELISA法检测第3、24、33、42、49天各组小鼠外周血血清发现,在各检测时间点感染+ZLW组IL-6浓度分别平均低于感染+NC组1.11、1.87、1.64、1.61、1.37倍,且均存在显着性差异（P<0.05）;在各检测时间点感染+ZLW组TNF-α浓度分别平均高于感染+NC组1.05、1.57、1.44、1.52、2.79倍,除第3d外,均存在显着性差异（P<0.05）。结论:（1）多肽ZLW能诱导小鼠肝脏和脾脏巨噬细胞M1极化,且抑制M2极化;（2）多肽ZLW可通过调节精氨酸代谢进而影响小鼠肝脏巨噬细胞极化;（3）多肽ZLW可以改善血吸虫病肝纤维化的进程。
贾骁晔[4]（2020）在《肝片吸虫病诊断候选抗原的筛选和制备》文中研究指明肝片吸虫病是由肝片吸虫（Fascioloa hepatica,F.hepatica）寄生于人和家畜肝脏、胆管,引起肝炎、胆管炎以及全身性营养障碍的一种新兴人畜共患寄生虫病。该病严重影响了全球畜牧业的发展,也造成了极其严重的公共卫生问题,吸引了全世界的广泛关注。为了丰富和拓展肝片吸虫病的诊断靶点,突破肝片吸虫病原学诊断方法的局限性,研究更加经济、快速、特异、敏感的肝片吸虫感染病的诊断方法,本研究通过肝片吸虫噬菌体展示cDNA文库的筛选、肝片吸虫特异性抗原分子的生物信息学分析、相应抗原基因的克隆、重组质粒的构建以及重组蛋白的诱导表达与Western Blot鉴定分析等研究方法和技术对肝片吸虫病的诊断候选抗原进行了筛选和制备。结果如下:（1）通过对肝片吸虫噬菌体展示cDNA文库的筛选和分析,成功获得了38条肝片吸虫基因,包括24条为已明确的肝片吸虫蛋白基因,14条为肝片吸虫假定蛋白基因。并从中筛选了5个肝片吸虫特异性抗原基因作为肝片吸虫病诊断候选抗原用于后续探索研究:组织蛋白酶L（Cathepsin L,Cat）、假定蛋白D915000758、假定蛋白D915001617、假定蛋白D915005900以及假定蛋白D915010969。（2）对5个候选抗原分子进行了基本的生物信息学分析,并成功预测了这些抗原分子的蛋白质空间结构。组织蛋白酶L具有完整的开放阅读框,编码区序列长981 bp,编码326个氨基酸;该蛋白为稳定的亲水性蛋白,其多肽链和主链骨架盘绕折叠形成了包含103个的α-螺旋、65个延伸链、22个β-转角和136个无规则卷曲的构象。假定蛋白D915000758开放阅读框完整,编码区序列长345bp,编码114个氨基酸;是一种稳定的亲水性蛋白,其空间构象包含58个的α-螺旋、7个延伸链、7个β-转角和42个无规则卷曲。假定蛋白D915001617开放阅读框完整,编码区序列长798 bp,编码265个氨基酸;为不稳定的疏水性蛋白,其空间构象包含159个的α-螺旋、40个延伸链、14个β-转角和52个无规则卷曲。假定蛋白D915005900开放阅读框完整,编码区序列长345 bp,编码114个氨基酸;为不稳定的亲水性蛋白,其空间构象包含11个的α-螺旋、27个延伸链、4个β-转角和72个无规则卷曲。假定蛋白D915010969开放阅读框完整,编码区序列长147 bp,编码48个氨基酸;该蛋白为稳定的亲水性蛋白,其空间构象包含17个的α-螺旋、9个延伸链、6个β-转角和16个无规则卷曲。（3）通过PCR克隆了诊断候选抗原基因片段,并成功连接表达载体pET-32a,转化至BL21（DE3）感受态细胞。（4）通过IPTG成功诱导重组蛋白进行原核表达。SDS-PAGE表明重组蛋白pET-Cat L、pET-000758、pET-001617、pET-005900和pET-010969在37℃被诱导6 h后,均以包涵体形式进行表达,蛋白分子量大小分别为:55 kDa、32 kDa、50 kDa、32 kDa和25 kDa。Western-Blot证明这5种重组蛋白都可以被肝片吸虫阳性血清特异性识别,具有良好的免疫反应性。综上所述,得出以下结论:肝片吸虫组织蛋白酶L、假定蛋白D915000758、假定蛋白D915001617、假定蛋白D915005900以及假定蛋白D915010969具有良好的免疫反应性,可成为潜在的肝片吸虫病诊断候选抗原靶点,应用于肝吸虫病的诊断研究中。
袁晓丹[5]（2019）在《大片形吸虫两种ES产物的重组蛋白对山羊PBMCs功能的影响》文中研究表明片形吸虫病（fascioliasis）是由片形科、片形属（Fasciola）吸虫,如大片形吸虫（Fasciola gigantica）、肝片形吸虫（Fasciola hepatica）及其中间型（intermediate form）的感染引起的一种人兽共患寄生虫病。大片形吸虫病分布于热带和亚热带地区,肝片形吸虫病主要分布于温带地区,给畜牧业生产带来巨大的经济损失,同时严重威胁公共卫生安全。钙结合蛋白（Calcium-binding protein,CaBp）属于蠕虫钙结合蛋白家族,具有钙结合位点,可通过与不同信号分子的结合在多种生物学过程中发挥作用,参与调节细胞存活、增殖、黏附、迁移、血管新生等多种肿瘤特征性生物学过程。亮氨酸氨基肽酶（Leucine aminopeptidases,LAPs）是一种广泛存在于原核和真核细胞的金属蛋白酶,是从蛋白质和肽段切割N端残基而发挥作用的胞浆酶,具有消化、与宿主互作、蛋白质周转、肿瘤生长、组织侵袭和新陈代谢等多种功能。本实验通过采取形态学与分子生物学相结合的方法来进行大片形吸虫的鉴定。鉴定正确后,以肝片形吸虫CaBp2（Fh CaBp2）的序列为参考,对大片形吸虫CaBp2（FgCaBp2）基因进行克隆、生物信息学分析,重组FgCaBp2（rFgCaBp2）和重组FgLAP（r FgLAP）蛋白表达、纯化,实现两种蛋白的大量可溶性表达。两种重组蛋白经Western-blot分析,可识别人工感染大片形吸虫的山羊阳性血清和两种重组蛋白免疫家兔制备的多克隆抗体,分别在约23 ku和63 ku处出现特异性条带,证明它们具有作为大片形吸虫病诊断抗原的潜力。本实验进行了r FgCaBp2和rFgLAP对山羊外周血单个核细胞（PBMCs）功能的影响研究,包括与山羊PBMCs的特异性结合能力、细胞因子的分泌情况、总NO的产生、细胞增殖、细胞迁移和凋亡情况,以及对山羊单核细胞吞噬作用的影响。结果显示,间接免疫荧光实验（IFA）证明两种蛋白与山羊PBMCs有良好的结合作用;rFgCaBp2在低浓度时能显着抑制IFN-γ、IL-4和IL-10的分泌,但高浓度时显示促进作用,该蛋白极显着地促进TGF-β的分泌;rFgLAP在低浓度时显着促进TGF-β的分泌,但显着抑制IL-4、IL-10和IFN-γ的分泌;rFgCaBp2蛋白在低浓度时显着促进NO的产生,高浓度抑制NO的产生;r FgLAP低浓度时对其促进作用较弱,高浓度时显着促进NO的产生;两种蛋白都能显着促进山羊PBMCs的增殖;两种蛋白均显着促进迁移小室中山羊PBMCs的迁移;rFgCaBp2可抑制山羊PBMCs的凋亡,rFgLAP对其凋亡的抑制作用较弱;两种蛋白均可与山羊单核细胞作用,促进其吞噬功能。本实验获得了FgCaBp2与FgLAP重组蛋白,两种蛋白可被阳性血清所识别,表明其具有很强的免疫反应性;两种蛋白对山羊PBMCs的功能影响结果说明其具有免疫调节作用,推测这两种蛋白可能在大片形吸虫抗宿主免疫中起到重要的作用。本研究结果为进一步筛选大片形吸虫免疫诊断抗原、探索大片形吸虫ES蛋白与宿主的互作机制及大片形吸虫免疫逃避机制提供了重要参考。
孙阁阁[6]（2019）在《旋毛虫丝氨酸蛋白酶的表达与鉴定及用于免疫诊断的研究》文中指出由旋毛虫引起的旋毛虫病是一种呈全球性分布的食源性人兽共患寄生虫病,主要是通过食用含有旋毛虫感染性幼虫的生的或者不熟的肉类所导致的。近年来在我国周边国家如韩国、泰国、老挝、越南等国也已发生了多次人体旋毛虫病暴发,因此,旋毛虫病作为了一种新现和再现的人兽共患疾病,对人体健康、社会、经济均造成了巨大的影响。目前,国内外对旋毛虫病的诊断主要集中在肌肉幼虫阶段的旋毛虫抗原。国际旋毛虫病委员会（ICT）建议旋毛虫肌幼虫ES抗原可作为诊断旋毛虫的金标准。然而,当旋毛虫肌幼虫ES抗原用于检测旋毛虫感染小鼠或猪的血清时,抗旋毛虫抗体IgG直到感染后3-4周才能检测到阳性;并且感染旋毛虫的病人在感染28天以后抗旋毛虫的抗体阳性率才能达到100%。因此,在旋毛虫感染后存在有23周的“窗口期”（window phase）。在旋毛虫的生活史中,肠道感染性幼虫（IIL）和成虫是旋毛虫对宿主肠黏膜的侵入期,其ES蛋白最早与肠黏膜直接接触并相互作用,能够接触宿主的免疫系统首先引起宿主的免疫应答;因此,IIL和成虫的排泄分泌抗原含有刺激宿主产生早期免疫应答的主要成分。在旋毛虫感染后的早期,最早出现的抗旋毛虫抗体也是针对这些抗原的。由于旋毛虫感染宿主后4周才发育为成囊期幼虫（肌幼虫）且被包裹在胶原囊中,肌幼虫接触宿主的免疫系统比较晚,因此宿主产生的抗肌幼虫抗体也比较晚。所以,现在迫切的需要从旋毛虫肠道期虫体中鉴定和筛选特异性的早期诊断抗原。本研究运用血清学诊断的方法检测旋毛虫成虫ES抗原对旋毛虫病的早期诊断价值,从成虫ES蛋白中筛选出旋毛虫假定的丝氨酸蛋白酶（Trichinella spiralis putative serine protease,TsSP）进行克隆表达和功能鉴定,同时检测rTsSP对旋毛虫感染的早期诊断及疫苗靶标的潜在应用价值。材料方法1旋毛虫、实验动物、血清、菌种及细胞系不同种旋毛虫在本实验室传代保种备用。整个实验所用的动物均购买于实验动物中心。血清:旋毛虫不同种属、弓形虫、裂头蚴、日本血吸虫和广州管圆线虫感染小鼠血清,以及其他寄生虫感染病人血清。细胞系:IEC,C2C12,于本实验室液氮中冻存。载体和菌种:克隆载体pGEM-T,表达载体pQE-80L,宿主菌为BL21,为本实验室冻存。2旋毛虫成虫ES抗原的早期诊断价值评估AW ES-ELISA诊断旋毛虫病的敏感性和特异性。准备30只雌性BALB/c小鼠,感染不同剂量的旋毛虫（100条/只和500条/只）。AW ES-ELISA检测旋毛虫早期和轻度感染小鼠血清的敏感性。最后AW ES-ELISA检测旋毛虫感染早期及晚期病人血清及其他寄生虫病人血清,进一步评估AW ES对旋毛虫病早期诊断价值的敏感性和特异性。3旋毛虫假定的丝氨酸蛋白酶（TsSP）生物信息学分析,克隆表达及鉴定将早期感染血清识别的成虫ES蛋白进行质谱分析后,从被鉴定的蛋白中挑选出了具有潜在早期诊断价值的旋毛虫假定的丝氨酸蛋白酶（Trichinella spiralis putative serine protease,TsSP）。应用NCBI,ExPasy,SignalP3.0serve及TMHMM Server v.2.0等在线软件分析预测了TsSP的结构域、理化性质、信号肽与跨膜结构域;在大肠杆菌中克隆表达并纯化,将纯化后的rTsSP皮下接种免疫小鼠,获得rTsSP免疫血清,Western-blot检测rTsSP的免疫原性及抗原性;通过RT-PCR和q-PCR检测TsSP基因在旋毛虫不同发育虫期是否转录及转录水平的高低;通过间接免疫荧光（IFA）检测TsSP在不同发育虫期虫体表面及内部的表达;对不同虫期虫体进行石蜡包埋及冰冻组织切片,通过IFA观察TsSP在不同时期虫体的具体定位;制备不同虫期的可溶性蛋白,通过ELISA和Western blot,检测TsSP蛋白在不同虫期是否表达及表达量的高低。4 TsSP与宿主肠上皮细胞的特异性结合及其功能鉴定通过Far-Western、ELISA及IFT分析了rTsSP与小鼠肠上皮细胞（IEC）的特异性结合作用。将不同稀释度的抗rTsSP血清、感染血清及正常血清分别与肠道感染性幼虫（IIL）混合后,分别接种到IEC单层中体外孵育2h进行幼虫体外侵入实验,镜下观察不同血清对IIL侵入IEC的抑制作用。通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）检测抗rTsSP血清对虫体的杀伤作用,镜下观察幼虫的活性和巨噬细胞粘附情况,并计算幼虫死亡率,并将抗rTsSP抗体依赖的ADCC作用后的ML经口感染小鼠,计算ADCC作用后肌幼虫的感染率。5 rTsSP对旋毛虫病的早期诊断按重度（500条/只）、中度（300条/只）及轻度（100条/只）3个剂量,将不同剂量的旋毛虫感染小鼠,每组各10只,感染后开始隔天采血,rTsSP-ELISA检测rTsSP对旋毛虫早期感染血清的识别、检测rTsSP对旋毛虫感染小鼠血清的敏感性与特异性。同时检测旋毛虫感染猪血清,旋毛虫感染早期及晚期病人血清及其他寄生虫病人血清,进一步评估rTsSP对旋毛虫病的早期诊断的潜在应用价值。6 rTsSP在免疫保护中的应用为了评估rTsSP的免疫保护作用,每只小鼠皮下免疫20μg rTsSP,隔10天免疫1次,共免疫3次,检测免疫后抗rTsSP抗体水平及所诱导的体液免疫应答,并计算成虫和肌幼虫的减虫率;并用霍乱毒素亚单位（CTB）作为佐剂,通过滴鼻途径对小鼠接种rTsSP。间隔10d免疫1次,共免疫3次,分别检测滴鼻免疫后肠道内总的和特异性sIgA水平;肠道分泌sIgA细胞及杯状细胞的数量;检测脾细胞和肠系膜淋巴结诱导的细胞因子水平的变化;计算感染后收集不同天数成虫和肌幼虫的减虫率。7统计学分析用SPSS17.0分析软件和Graphpad Prism对所有结果和数据进行统计学分析及图表绘制,采用单因素方差分析,重复资料方差分析,t检验和卡方检验进行统计分析,检验水平α=0.05。结果1.成虫ES抗原的早期诊断应用成虫ES-ELISA检测感染旋毛虫不同剂量后不同天数的小鼠血清,结果表明,成虫ES抗原与粗抗原和肌幼虫ES在检测感染100条旋毛虫感染血清时,分别在感染后8、12及12天检测到抗旋毛虫抗体IgG,在检测高剂量组（500/条）时分别在10,8,10天检测到抗旋毛虫抗体。用这3种抗原分别检测旋毛虫早期和晚期病人血清结果表明,成虫ES的敏感性和特异性分别是100%和97.48%。2.TsSP生物信息学分析预测TsSP基因（GI:164521948）序列全长为1372bp,编码429个氨基酸残基,其分子质量为47.55kDa,等电点为8.73;不稳定指数为42.25,脂肪指数为71.52,总的平均亲水性是-0.360,认为该蛋白为亲水性蛋白。该蛋白N端具有明显的疏水性区域,无跨膜区。预测TsSP为分泌型蛋白,存在信号肽,切割位点在18-19位氨基酸残基之间,表明成熟的肽段始于第19位氨基酸,具有信号肽SP序列,认为其能够分泌到细胞外。该蛋白在第37-277位之间是个高度保守的结构功能域Tryp-SPC。I-TASSER预测TsSP属于丝氨酸蛋白酶家族。3.TsSP的克隆表达及鉴定设计PCR外引物和具有特异性酶切位点的内引物,通过巢式PCR扩增出大小为1236bp的TsSP基因,将TsSP基因连接到克隆载体pGEM-T中,双酶切后将TsSP基因再连接到表达载体pQE-80L上构建重组表达质粒,转染E.coli BL21感受态细胞。双酶切鉴定重组质粒构建成功。对连接成功的单菌落加入IPTG诱导表达,收集菌体进行SDS-PAGE,发现在45.2kDa处出现一条明显条带,而未经诱导的细菌未见此条带,表明TsSP重组蛋白表达成功。Western blot分析显示,rTsSP蛋白能被旋毛虫感染小鼠血清和抗rTsSP血清识别,表明rTsSP具有良好的免疫原性和抗原性。RT-PCR和qPCR结果表明TsSP基因在旋毛虫不同发育虫期（ML,IIL,3dAW,6dAW和NBL）均转录,并且各个发育期转录水平没有差异（P>0.05）。Western blot和ELISA结果表明TsSP在旋毛虫的各个虫期均表达,并且在IIL和NBL表达水平相对较高;IFA结果显示,TsSP在以上5个虫期均表达,并且主要定位在虫体的表皮,杆状体和胚胎部位。4.TsSP与宿主肠上皮细胞的特异性结合及其功能鉴定4.1 rTsSP与肠上皮细胞结合的特异性分别通过Far-Western、ELISA及IFT分析了rTsSP与小鼠肠上皮细胞（IEC）的特异性结合作用,Far-Western结果显示抗rTsSP免疫血清识别了24条蛋白带,分子量为14.4kDa86.5kDa,而rTsSP不能与C2C12蛋白结合,表明rTsSP能与IEC蛋白特异性结合。ELISA检测亦发现rTsSP能与IEC蛋白结合且具剂量依赖性。IFT发现rTsSP可与IEC和肠粘膜特异性结合;共聚焦显微镜检查结果表明rTsSP与IEC的结合部位是细胞膜与细胞质。4.2抗rTsSP抗体对幼虫侵入IEC的抑制或阻断作用体外侵入实验结果表明,在相同血清稀释度（1:50）时,抗rTsSP血清、感染血清及正常血清组的幼虫侵入率分别为31.48%,15.84%及84.16%（P<0.01）,且抗rTsSP抗体对幼虫的侵入作用具有抗体剂量依赖性,随血清稀释度的增加而降低（P<0.01）,表明抗rTsSP抗体对幼虫侵入IEC具有明显的抑制作用。4.3抗rTsSP抗体依赖的ADCC对旋毛虫幼虫的杀伤作用将抗rTsSP血清、感染血清及正常血清分别与新生幼虫（NBL）和肌幼虫（ML）共孵育,再分别加入小鼠腹腔巨噬细胞孵育不同时间后,镜下观察幼虫的活性和巨噬细胞粘附情况,并计算幼虫死亡率。结果显示当血清稀释度为1:100时,抗rTsSP血清能促进巨噬细胞对NBL和ML的粘附。抗rTsSP血清对NBL和ML的细胞毒性分别为52%与44.67%,明显高于正常血清的21.33%和18%（P<0.01）;细胞毒性具有抗体剂量依赖性,且随孵育时间的延长而增加（P<0.01）。结果表明抗rTsSP抗体依赖的ADCC在体外对NBL和ML具有特异性杀伤作用。将抗rTsSP抗体依赖的ADCC作用后的100条ML经口感染小鼠,与正常血清组相比,感染后3d与42d的成虫与肌幼虫减率分别为89.4%和36.50%,表明抗rTsSP抗体可通过ADCC方式杀伤ML,并可明显降低ML的感染性及其在肠道中的发育。5.rTsSP的诊断价值在旋毛虫重度、中度和轻度感染小鼠,rTsSP-ELISA分别在感染后8、7及7天检测到抗rTsSP抗体,并且在感染后16、10及10天抗体检测阳性率达到100%;rTsSP-ELISA检测旋毛虫感染小鼠的敏感性与特异性均为100%。rTsSP-ELISA诊断早期和晚期旋毛虫病人时的敏感性分别为95.24%和100%,对于早期旋毛虫病人诊断的敏感性明显高于肌幼虫ES诊断的敏感性（75%,P<0.05）;rTsSP-ELISA诊断旋毛虫病人的特异性（99.49%）明显高于ES-ELISA的特异性（91.41%）（P<0.05）。6.rTsSP的免疫保护6.1皮下接种rTsSP诱导的免疫第1次与第2次免疫后血清中rTsSP特异性抗体IgG水平明显升高,末次免疫后10d抗rTsSP抗体IgG效价为1:105;免疫后10、20、30及40d,IgG1水平明显高于IgG2a（P<0.01）,表明rTsSP免疫小鼠诱导了Th2型为主的体液免疫应答。与PBS组相比,rTsSP免疫组和佐剂对照组在攻击感染后5d的成虫减虫率分别是52.70%和10.30%（P<0.05）;感染后42d,rTsSP免疫组和佐剂对照组的肌幼虫减虫率分别是52.1%和3.66%（P<0.05）。结果表明,rTsSP皮下免疫小鼠可诱导明显的免疫保护。6.2经鼻接种rTsSP诱导的免疫保护用rTsSP经鼻免疫小鼠可引起明显的肠道总sIgA及TsSP特异性sIgA水平升高;血清TsSP特异性抗体IgG/IgM/IgA水平亦明显升高;在免疫接种小鼠的十二指肠中能检测到更多的杯状细胞/酸性粘蛋白和IgA分泌细胞。与对照组相比,rTsSP免疫组的IFN-γ,IL-4和IL-10水平显着增加。末次免疫后10d用300条幼虫攻击感染,与PBS对照组相比,感染后3、5、7、9d的成虫减虫率分别是49.95%、61.30%、68.30%及71.10%（P<0.001）;感染42d免疫组和佐剂组的肌幼虫减虫率分别是62.1%及13.9%（P<0.001）。结果表明,rTsSP经鼻免疫小鼠后诱导了明显的肠道sIgA应答及全身的Th1/Th2混合型免疫应答,并对旋毛虫攻击感染产生了明显的保护效果。结论1.旋毛虫成虫ES抗原对旋毛虫病早期诊断具有较高的敏感性和特异性,为旋毛虫病的早期诊断提供一个新的诊断抗原来源;2.克隆表达了旋毛虫TsSP,TsSP在旋毛虫的各个虫期均有转录和表达,主要定位在虫体的表皮,杆状体和胚胎;3.rTsSP蛋白能够与肠上皮细胞特异性结合,抗rTsSP抗体能够抑制旋毛虫体外侵入肠上皮细胞,抗rTsSP抗体能够介导巨噬细胞对NBL和ML的杀伤作用。TsSP可能是旋毛虫对IEC的主要侵入蛋白;4.rTsSP-ELISA诊断旋毛虫病具有较高的敏感性和特异性,可作为旋毛虫病潜在的早期诊断抗原;5.rTsSP蛋白皮下/经鼻免疫小鼠后,诱导了局部粘膜和全身的Th1/Th2混合型免疫应答,并对旋毛虫攻击感染产生了明显的保护效果。
冯玉洁[7]（2017）在《AIF-1对血吸虫感染小鼠Ⅰ型/Ⅱ型免疫应答的影响及机制研究》文中进行了进一步梳理目的:血吸虫病导致的组织虫卵肉芽肿和纤维化其重要的病理损害。在血吸虫感染早期,机体主要表现I型免疫反应,自成虫产卵开始免疫反应向II型偏移,但具体的分子机制尚不明确。研究发现同种异体移植物炎症因子1（AIF-1）可参与多种炎症性病变,并可调节I型/II型免疫反应平衡。本课题组前期研究发现在血吸虫感染小鼠模型中,给予AIF-1多肽可以导致慢性期肝脏纤维化病变减轻。为了证实AIF-1可以通过调节I型/II型反应平衡而参与血吸虫感染小鼠肝脏病变的发展。本研究拟阐明AIF-1对血吸虫感染小鼠I型/II型免疫反应的影响及机制。方法:本研究通过构建AIF-1转基因小鼠(AIF-1Tg),经腹部感染血吸虫尾蚴25条/鼠,建立AIF-1Tg和野生小鼠（WT）感染模型。感染后8周解剖小鼠分别计数虫荷、单条雌虫产卵量,以及血清中ALT和羟脯氨酸水平。在感染后8周、14周取肝组织进行H&E和Masson染色观察肝脏肉芽肿和纤维化病变情况。在感染后4周、8周、14周分出脾脏中单个核细胞,采用荧光抗体CD3、CD8、IFN-γ/IL-4标记细胞。流式细胞术检测CD3+CD8-IFN-γ+和CD3+CD8-IL-4+。提取脾淋巴细胞的RNA,Real-time PCR检测中转录因子T-bet和GATA-3的表达。培养脾淋巴细胞,72小时后分离上清,用ELISA试剂盒检测细胞因子IFN-γ和IL-4的表达。为了进一步研究AIF-1对巨噬细胞分化的影响。在感染后8周处死小鼠分离腹腔巨噬细胞和肝脏巨噬细胞,分别用荧光抗体F4/80、CD16/32、CD206标记细胞,流式细胞术检测M1/M2的细胞数量（F4/80+CD16/32+和F4/80+CD206+）。在AIF-1多肽、LPS、SEA刺激下培养RAW264.7细胞,48h后分离上清和细胞,ELISA检测上清中TNF-α和TGF-β的表达水平。提取细胞的RNA和蛋白,Real-time PCR检测不同刺激条件下iNOS和Arg-1的表达水平。进一步提取细胞核蛋白,Western blot检测胞浆中P38 MAPK、p-P38和核蛋白中NF-κB的表达。结果:相对于WT小鼠,AIF-1Tg小鼠在感染后8周虫荷和肝脏虫卵数量无明显变化,但感染后8周和14周,AIF-1Tg小鼠的肝脏虫卵肉芽肿面积减小,肝纤维化程度减轻。流式细胞术检测发现,相对于对照组,AIF-1Tg小鼠在血吸虫感染后4周脾脏CD3+CD8-IFN-γ+细胞数量增加,感染后8周脾脏CD3+CD8-IL-4+细胞数量下降,其余时间点两组则无明显差异,而计算CD3+CD8-IFN-γ+/CD3+CD8-IL-4+比例显示AIF-1Tg小鼠脾脏Th1/Th2细胞相对比例在感染后4周和8周明显升高,感染后14周无差异;Real-time PCR检测脾细胞中T-bet和GATA-3的水平发现血吸虫感染后在4周和8周AIF-1促进T-bet的表达,抑制GATA-3的表达。ELISA检测SEA刺激脾细胞72h后培养上清中IFN-γ的水平,发现在感染后4周AIF-1Tg组IFN-γ表达升高。在感染后8周,AIF-1Tg小鼠腹腔和肝脏巨噬细胞中M1细胞数量明显高于WT小鼠,而M2细胞则明显降低。在体外实验中,ELISA检测显示AIF-1刺激RAW264.7产生TNF-α和TGF-β,但TGF-β的水平低于SEA刺激下TGF-β的升高水平。Western检测RAW264.7在AIF-1刺激下P38、p-P38、NF-κB的表达水平显示,AIF-1对P38的表达无影响,但能促进p-P38、NF-κB的表达升高。结论:AIF-1在血吸虫感染早期和急性期可以促进Th细胞反应向Th1极化,并通过活化P38 MAPK/NF-κB通路促进巨噬细胞向M1极化。因此,在血吸虫感染后,AIF-1可以影响I型/II型反应的平衡,并通过促进机体I型免疫应答参与血吸虫病肝脏病理改变。
曹晓丹[8]（2016）在《日本血吸虫排泄分泌蛋白的研究》文中研究表明日本血吸虫病是由日本血吸虫感染引起的一种慢性、危害严重的人畜共患寄生虫病。血吸虫释放或分泌一些抗原分子进入宿主体内,这些分子直接暴露于宿主免疫系统,诱导和调节宿主的免疫应答。一些排泄分泌蛋白（excretory/secretory proteins,ESPs）,包括早期童虫和其它不同发育阶段虫体差异表达的排泄分泌蛋白对血吸虫在终末宿主体内感染的建立和维持至关重要。研究日本血吸虫童虫和成虫不同发育阶段排泄分泌蛋白质的组成和变化,鉴定分析与日本血吸虫生长、发育、繁殖等相关的重要分子,将有助于理解血吸虫与宿主间的相互作用机制,有助于发现血吸虫免疫调节关键分子及血吸虫病的疫苗候选分子。1.日本血吸虫14d童虫排泄分泌蛋白质组分析日本血吸虫具有复杂的生活史,童虫是血吸虫在终末宿主体内的早期发育阶段,是疫苗介导保护性免疫的主要靶标。排泄分泌蛋白在宿主与寄生虫相互作用中扮演重要角色,而日本血吸虫童虫排泄分泌蛋白质组至今尚未有研究报道。本实验首次应用高效液相色谱法和串联质谱技术对日本血吸虫14d童虫排泄分泌蛋白质的组成进行分析鉴定,最终鉴定到713种蛋白。这些蛋白的理论分子量介于10kDa和70kDa之间,理论等电点介于3到13之间。生物信息学分析显示,鉴定到的童虫排泄分泌蛋白主要参与应激反应（如heat shock protein）、碳水化合物代谢（如glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）、蛋白质降解（如protein disulfide isomerase）等,其中一些ESPs可能是与日本血吸虫早期童虫适应寄生生活,维持在终末宿主体内生存、发育等相关的重要分子。本研究有助于了解日本血吸虫童虫与宿主间的相互作用机制及血吸虫病疫苗候选分子的筛选。2.日本血吸虫童虫和成虫排泄分泌蛋白质组的比较分析童虫和成虫是日本血吸虫寄生于终末宿主体内的两个主要发育阶段虫体,它们具有不同的形态学和生物学特征。童虫和成虫期别差异表达的排泄分泌蛋白在血吸虫的感染建立和维持、发育和繁殖过程中发挥了不同的生物学功能。本实验首次应用iTRAQ和液质联用技术,完成了日本血吸虫14d童虫和42d成虫排泄分泌蛋白质组的比较分析,最终鉴定到298种差异蛋白。其中,童虫高表达蛋白有161个,包括hot shock proteins、glucose-6-phosphate isomerase、protein disulfide isomerase等,生物信息学分析显示这些蛋白主要参与应激反应、碳水化合物代谢和蛋白降解等过程;成虫高表达蛋白有137个,包括thioredoxin peroxidase、adenine phosphoribosyltransferase等,它们主要与免疫调节和嘌呤代谢等相关;另有31个蛋白在童虫和成虫间不具有显着性差异,如phosphoglycerate mutase等。该研究可为阐述童虫和成虫生理学上的差异,及理解这两个发育阶段虫体差异表达ESPs在血吸虫生长发育中的作用提供实验依据,同时也可为寻找有效的疫苗候选分子提供基础。3.日本血吸虫蛋白质二硫键异构酶SjPDI的克隆、表达及重组蛋白rSjPDI诱导抗血吸虫感染免疫保护效果的评价蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase,PDI）为本研究排泄分泌蛋白组分析中鉴定到的一种日本血吸虫排泄分泌蛋白。本文应用PCR技术对SjPDI基因进行克隆,该基因具有1410bp的开放阅读框,编码469个氨基酸。构建了重组表达质粒pET-28a-SjPDI,并在BL21大肠杆菌中获得成功表达,得到相对分子质量约为55 kDa的可溶性重组蛋白rSjPDI。Western blotting分析显示,rSjPDI可以被日本血吸虫成虫蛋白免疫兔血清识别,日本血吸虫成虫蛋白和成虫排泄分泌蛋白可以被rSjPDI免疫小鼠血清识别,说明重组蛋白rSjPDI具有良好的免疫原性和抗原性,且SjPDI确实存在于日本血吸虫排泄分泌蛋白中。实时定量PCR分析表明SjPDI在各个检测的生长发育阶段虫体中均有表达,且在42天成虫和早期童虫体内呈高表达。免疫荧光试验结果显示,SjPDI主要定位于日本血吸虫表膜及实质组织内。生物学特性分析显示,重组蛋白rSjPDI具有蛋白异构和抗氧化等功能。ELISA实验表明rSjPDI可引起免疫小鼠产生高水平的特异性IgG抗体。在两批小鼠免疫保护实验中,与对照组相比,rSjPDI免疫组分别获得35.32%和26.19%的减虫率及33.17%和31.7%的肝脏虫卵减少率。本研究表明排泄分泌蛋白SjPDI在血吸虫生长发育过程中扮演着重要角色,为一种潜在的日本血吸虫病疫苗候选分子。4.日本血吸虫谷胱甘肽脱氢酶对LPS诱导的巨噬细胞活化的影响及其调节机制研究巨噬细胞在机体抗寄生虫感染中发挥重要的免疫调节作用,在促炎性和抗炎性反应中扮演重要角色。谷胱甘肽脱氢酶为本研究排泄分泌蛋白组分析中鉴定到的另一种重要的日本血吸虫排泄分泌蛋白。该蛋白含有GSTs结构域,与克氏锥虫Tc52免疫调节分子具有相同的结构位点。本实验首次对日本血吸虫谷胱甘肽脱氢酶进行克隆表达,分析该重组蛋白对RAW264.7巨噬细胞活化的影响及其潜在的免疫调节机制。结果表明,重组日本血吸虫谷胱甘肽脱氢酶可抑制LPS诱导的巨噬细胞促炎性细胞因子TNF-α,IL-1β和iNOS的表达,同时可增强巨噬细胞中microRNA-146a分子的表达水平。进一步分析显示,miR-146a对LPS活化的巨噬细胞IL-1β的表达有负调控作用,miR-146a可能参与调节巨噬细胞促炎性免疫应答反应。本研究表明重组日本血吸虫谷胱甘肽脱氢酶可以通过影响巨噬细胞活化和促炎性反应参与宿主免疫应答进程,该分子可能在血吸虫的生存和发育中具有重要作用。综上,本研究应用高效液相色谱法和串联质谱法对日本血吸虫14d童虫排泄分泌蛋白组的组成进行分析鉴定,应用iTRAQ和液质联用技术对日本血吸虫14d童虫和42d成虫排泄分泌蛋白组进行比较分析。对日本血吸虫排泄分泌蛋白SjPDI的编码基因进行了克隆、表达及生物学特性研究,对重组蛋白rSjPDI诱导小鼠抗日本血吸虫感染的免疫保护效果进行评估。对日本血吸虫排泄分泌蛋白谷胱甘肽脱氢酶编码基因进行了克隆和表达,就该重组蛋白对RAW264.7巨噬细胞活化的影响及其潜在的免疫调节机制进行了初步分析。本研究有助于更好的了解血吸虫生长发育机制及血吸虫与宿主之间的相互作用机制,并可为筛选有效的疫苗候选分子提供实验依据。
艾德宙[9]（2013）在《日本血吸虫精氨酸酶克隆表达及功能分析》文中指出日本血吸虫病是由日本血吸虫（Schistosome japonicum）感染所引起的一种严重危害人畜健康的寄生虫病，筛选新的药物靶标，研制开发高效安全的血吸虫疫预防疫苗是血吸虫病防治研究的重要需求。精氨酸酶作为代谢酶，能够水解精氨酸产生鸟氨酸和尿素，在细胞增殖、胶原沉积和能量代谢过程中发挥着重要的作用，也可通过与一氧化氮合成酶（NOS）竞争消耗性底物精氨酸来调节NO的生成，影响机体的免疫应答。本课题组在前期日本血吸虫体被表膜蛋白研究中鉴定到精氨酸酶，为进一步阐明日本血吸虫精氨酸酶（SjARG）的特性和生物学功能，本文根据血吸虫精氨酸酶的参考序列，设计引物应用PCR克隆了SjARG基因，长度为1095bp，编码364个氨基酸，比对分析显示与曼氏血吸虫精氨酸酶（SmARG）相似性为79.7%。3D建模发现该蛋白结构中心含有两个Mn2+结合位点，与SmARG活性位点相似。构建了重组表达质粒pET-28a-SjARG，在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达并纯化到可溶性重组蛋白rSjARG，分子量约为43kDa。Western-blotting分析显示重组蛋白具有良好的抗原性。实时定量PCR分析显示SjARG在尾蚴时期高表达，基因转录拷贝数约为其它时期的20-100倍，在42d成虫中雌虫的基因转录水平显着高于雄虫。免疫组化实验结果表明SjARG在各期虫体的表膜、实质部分均有分布，在42d成虫雌雄虫生殖器官部位表达较集中。利用纯化的rSjARG重组蛋白建立了体外酶活性分析体系，酶活性分析结果表明重组蛋白rSjARG酶活性为502.67U/mg，最适pH为10.2，最适温度为37℃，Km值为0.0827mol/L。Mn2+能显着提高rSjARG的活性，Cu2+和Zn2+则对rSjARG有极显着的抑制作用。低温4℃和高温70℃均能使rSjARG失去酶活性。在Mn2+存在下，热激对SjARG酶活性影响不大。半胱氨酸能够强烈抑制rSjARG活性，鸟氨酸和赖氨酸能部分抑制其活性；二硫苏糖醇和还原型谷胱甘肽等还原剂对精氨酸酶的抑制程度与其浓度相关。S-（2-boronoethyl）-L-Cysteine（BEC）对精氨酸酶的抑制作用与其浓度成线性关系，2（S）-amino-6-boronohexanoic acid（ABH）对SjARG的酶活性抑制作用最为明显。精氨酸酶特异性抑制剂nor-NOHA和NOHA对SjARG均有抑制作用，但两者的抑制效果和底物精氨酸的浓度有关。将NOHA尾静脉注射感染日本血吸虫尾蚴的BALB/c小鼠，两次动物实验分别诱导了20.23%（P<0.05）和27.47%（P<0.05）的减虫率，以及31.50%（P<0.05）和17.28%（P<0.05）的肝脏减卵率。将尾蚴用NOHA处理后感染小鼠，两次实验分别获得了52.00%（P<0.05）和50.84%（P<0.01）的减虫率，以及31.50%（P<0.05）和55.25%（P<0.01）的减卵率。应用rSjARG重组蛋白结合ISA206佐剂免疫BALB/c小鼠进行了两次血吸虫病免疫保护实验，结果分别诱导产生了28.94%（P<0.01）和36.35%（P<0.05）的减虫率，以及33.64%（P<0.01）和42.67%（P<0.05）的减卵率。ELISA结果表明重组蛋白免疫在小鼠体内诱导产生了高水平的特异性IgG抗体，在三次免疫过程中特异性亚型抗体IgG1/IgG2a比值有下降趋势。血清细胞因子含量分析结果表明免疫组小鼠显着产生了高水平的IL-2、IL-12和IL-10。综上，本文研究结果表明日本血吸虫精氨酸酶具有作为抗血吸虫疫苗候选分子和药物靶标的潜力，也为深入研究该酶的生物学功能提供了基础。
孙缓[10]（2013）在《吡喹酮新衍生物抗日本血吸虫生物学效应研究》文中进行了进一步梳理第一部分吡喹酮（PZQ）衍生物和PZQ消旋体体外抗日本血吸虫生物学效应目的：观察17种DW系列及32种YCH-II-P系列PZQ衍生物和2种PZQ消旋体对体外培养的日本血吸虫成虫和童虫活性的影响。方法：ICR小鼠感染日本血吸虫尾蚴后第17d及第6w肝门静脉灌注法分别收集童虫与成虫，加入不同浓度的化合物于DMEM培养液中，过夜后（16h）无菌生理盐水洗涤虫体3次，换无药物的新鲜培养液继续培养虫体72h,每天置于体视显微镜下观察其死亡率及活力降低情况，收集第72h虫体作扫描电镜观察。结果：经观察17种DW系列对PZQ衍生物日本血吸虫均有一定的杀虫效应，其中以DW-3-15杀虫效应最强，作用浓度为50μmol L时虫体完全死亡，体外抗日本血吸虫成虫及童虫临界致死浓度分别为15μmol L及10μmol L。32种YCH-II-P系列PZQ衍生物筛选出P96、P125、P126、P64种有效化合物。其中P96作用浓度为50μmol L时虫体完全死亡，体外抗日本血吸虫成虫及童虫临界致死浓度均为25μmol L，扫描电镜（SEM）显示虫体皮层及抱雌沟内壁损伤严重。2种PZQ消旋体中R-PZQ作用浓度为100μmol L时成虫及童虫均完全死亡。SEM显示虫体皮层及抱雌沟内壁仅有轻度损伤。结论: DW系列衍生物体外具有一定的杀日本血吸虫作用，其中以DW-3-15杀虫效应最强。YCH-II-P系列衍生物中P96体外具有显着的杀日本血吸虫成虫和童虫作用效应，两种PZQ消旋体中R-PZQ具有显着的杀日本血吸虫成虫作用。第二部分PZQ衍生物P96体内抗日本血吸虫效应目的：观察PZQ衍生物P96对感染小鼠体内不同发育阶段虫体杀虫效应及体内杀虫剂量依赖效应。方法：小鼠感染日本血吸虫尾蚴后，在虫体发育的不同阶段（1d，3d，7d，14d，21d，28d）以200mg/kg/只的剂量及在感染后第14天以不同剂量经灌胃连续给药5d，停药后21d解剖小鼠计算减虫率。进一步于成虫期（28d）经灌胃连续给药5d杀虫，分别于停药后第1d，3d，7d取虫，SEM观察P96对体内虫体的损伤作用。结果：成虫期与童虫期经PZQ衍生物P96作用后检获虫数与对照组相比，显着减少（P<0.05）。其中成虫期（28d）P96组减虫率（53.6%）与PZQ组（67.1%）相近（P>0.05），童虫期（14d）P96组减虫率（58.2%）显着高于PZQ组（19.9%，P<0.05），尤其在童虫期1d、3d、7d、14d、21d的减虫率为43.5%58.2%，均显着高于PZQ组（5.9%45.0%，P<0.05）。P96对体内成虫用药后1d、3d、7d SEM观察显示虫体皮层及抱雌沟内壁严重受损结论：PZQ衍生物P96体内具有显着抗日本血吸虫成虫与童虫的作用，其体内抗日本血吸虫成虫作用与PZQ相仿，体内抗日本血吸虫童虫作用则明显优于PZQ，并存在明显的剂量依赖效应第三部分钙通道阻滞剂与肌动蛋白解聚剂对P96体外抗日本血吸虫效应的影响目的：通过观察钙通道阻滞剂（calcium channel blockers，CCBs）与细胞松弛素-D（cytochalasin D，CyD）对P96体外抗日本血吸虫活性的拮抗作用，探讨PZQ衍生物对血吸虫的药物作用靶点及其机制。方法：在单性日本血吸虫尾蚴感染小鼠6w后，将采用肝门静脉灌注法收集雄性成虫分别与CCBs及CyD预孵育lh，然后加入临界致死浓度的P96与虫体孵育过夜（16h），次日用无菌生理盐水洗涤虫体3次，换至新鲜培养液继续培养虫体72h，每天置于体视显微镜下观察并记录虫体活力，收集第72h虫体作SEM观察。结果：钙通道阻滞剂尼非地平和尼群地平及CyD对P96抗日本血吸虫的拮抗效应均较弱， CCBs或CyD预孵育对P96的抗虫作用基本无影响。结论：钙通道阻滞剂尼非地平和CyD可特异性地抑制肌动蛋白与微丝有关的细胞骨架，干扰细胞膜离子通道(如Ca2+通道)的一些相关功能，可拮抗PZQ的杀虫效应。本实验结果表明，CCBs和CyD无明显拮抗P96抗血吸虫效应，提示P96的对血吸虫的药物作用靶点及其机制可能与PZQ不同，其杀虫效应与细胞Ca2+内稳态的变化相关性较小。
二、诱导型一氧化氮合酶在不同虫期日本血吸虫虫体中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、诱导型一氧化氮合酶在不同虫期日本血吸虫虫体中的表达（论文提纲范文）
（1）大片吸虫及其分泌抗原对宿主肠道菌群与免疫应答调节机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 片形吸虫与片形吸虫病的研究概述 |
| 1.1.1 片形吸虫与片形吸虫病 |
| 1.1.2 片形吸虫病的流行现状 |
| 1.1.3 片形吸虫病的防控现况 |
| 1.2 片形吸虫与宿主的相互作用机制 |
| 1.2.1 片形吸虫的生活史 |
| 1.2.2 片形吸虫宿主适应性 |
| 1.2.3 宿主抗片形吸虫感染的机制 |
| 1.2.4 宿主的免疫应答与片形吸虫感染的互作关系 |
| 1.2.5 片形吸虫的免疫逃避策略 |
| 1.3 蠕虫感染与肠道菌群之间相互作用研究进展 |
| 1.3.1 蠕虫感染对微生物丰富度和多样性的影响 |
| 1.3.2 蠕虫感染对宿主代谢的影响 |
| 1.3.3 蠕虫与肠道菌群相互作用关系的假设 |
| 1.3.4 蠕虫-微生物相互作用关系的应用 |
| 1.3.5 片形吸虫与肠道菌群的可能机制 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 第二章 大片吸虫感染对水牛宿主免疫微环境的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 主要试剂、耗材 |
| 2.2.3 主要设备、仪器 |
| 2.2.4 试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 实验动物感染及取材 |
| 2.3.2 RNA的分离及反转录 |
| 2.3.3 实时荧光定量PCR检测(RT-q PCR) |
| 2.3.4 血清抗体检测 |
| 2.3.5 统计学分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 水牛感染大片吸虫肝门淋巴结免疫学指标变化 |
| 2.4.2 水牛感染大片吸虫脾脏免疫学指标变化 |
| 2.4.3 水牛感染大片吸虫血清中抗大片吸虫ESP特异性抗体检测 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 大片吸虫胞外囊泡的分离鉴定与蛋白质组分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 主要的试剂、耗材 |
| 3.2.3 主要的仪器设备 |
| 3.2.4 主要试剂的配制 |
| 3.3 .实验方法 |
| 3.3.1 大片吸虫ESP和 EVs的收集 |
| 3.3.2 蛋白浓度定量分析 |
| 3.3.3 电镜观察 |
| 3.3.4 粒径检测 |
| 3.3.5 Western blot鉴定胞外囊泡所含蛋白质 |
| 3.3.6 Shotgun鉴定100k胞外囊泡中蛋白 |
| 3.3.7 小鼠免疫与感染 |
| 3.3.8 统计学分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 大片吸虫成虫ESP、EVs的分泌特征 |
| 3.4.2 大片吸虫成虫15k EVs、100k EVs鉴定 |
| 3.4.3 虫体回收 |
| 3.4.4 肝脏病理损伤评分 |
| 3.4.5 血清中ALT、AST的变化 |
| 3.4.6 血清中特异性抗体的变化 |
| 3.4.7 大片吸虫成虫100k EVS的蛋白组整体分析 |
| 3.4.8 大片吸虫成虫100k EVS鉴定的蛋白分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 大片吸虫感染和成虫抗原对小鼠T细胞分化相关TLR-ERK通路的初探 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 实验动物及材料 |
| 4.2.2 主要的试剂、耗材 |
| 4.2.3 主要的实验仪器、设备 |
| 4.2.4 主要试剂的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 小鼠囊蚴感染分组 |
| 4.3.2 小鼠腹腔注射分组 |
| 4.3.3 样品收集 |
| 4.3.4 RT-q PCR检测 |
| 4.3.5 抗体ELISA检测 |
| 4.3.6 动物病理组织切片的制备 |
| 4.3.7 组织匀浆的制备 |
| 4.3.8 细胞因子ELISA检测 |
| 4.3.9 Western blot检测 |
| 4.3.10 统计学分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 小鼠感染大片吸虫囊蚴结果 |
| 4.4.2 大片吸虫 成虫 ESP、15k EVs和100k EVs腹腔注射小鼠模型 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 大片吸虫感染对水牛胃肠道菌群的影响 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 主要试剂/耗材 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.4 测序数据的分析 |
| 5.5 结果 |
| 5.5.1 肠系膜淋巴结、肝门淋巴结、脾脏和肝脏TLRs在感染组和对照组的表达情况 |
| 5.5.2 α-多样性分析 |
| 5.5.3 主坐标分析(Principal coordinates analysis,PCo A) |
| 5.5.4 水牛感染大片吸虫对胃肠道菌群各分类水平组成 |
| 5.5.5 LEf Se(Line Discriminant Analysis(LDA)Effect Size,LEf Se)分析 |
| 5.5.6 CCA/RDA分析 |
| 5.5.7 结肠中SCFAs水平检测 |
| 5.6 讨论 |
| 5.7 小结 |
| 第六章 大片吸虫感染和成虫抗原对小鼠菌群的影响 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料 |
| 6.2.1 实验动物及材料 |
| 6.2.2 主要试剂、耗材 |
| 6.2.3 实验设备 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.4 结果 |
| 6.4.1 小鼠囊蚴感染对结肠内容肠道菌群构成的影响 |
| 6.4.2 腹腔注射小鼠模型结肠内容物菌群分析结果 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 第七章 全文结论 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附表1 水牛RT-qPCR使用引物 |
| 附表2 小鼠RT-qPCR使用引物 |
| 附表3 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况及参加科研项目 |
（2）旋毛虫感染宿主血清中差异miRNA的功能及诊断价值研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 引言 |
| 第一部分 旋毛虫感染血清中小鼠miRNA的差异表达及功能分析 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 宿主感染血清中旋毛虫来源miRNA的鉴定及诊断价值分析 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 寄生虫和宿主microRNA在寄生虫病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文及研究成果 |
| 致谢 |
（3）多肽ZLW调控宿主巨噬细胞极化改善血吸虫性肝纤维化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract: |
| 常用英文缩写 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器及耗材 |
| 2.1.2 细胞及主要试剂 |
| 2.1.3 常用试剂配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 生物信息学分析多肽ZLW结构特点及功能 |
| 2.2.2 阳性钉螺的喂养及尾蚴的释放 |
| 2.2.3 小鼠的感染及实验动物的分组 |
| 2.2.4 多肽ZLW的合成 |
| 2.2.5 流式细胞术法测定多肽ZLW作用后小鼠巨噬细胞RAW264.7的偏移 |
| 2.2.6 流式细胞术法测定小鼠肝脏及脾脏巨噬细胞的偏移 |
| 2.2.7 H&E及 Masson染色法检测小鼠肝纤维化的病理改变 |
| 2.2.8 IHC检测CD68、CD206、iNOS、Arg1 定位分析 |
| 2.2.9 ELISA检测IL-6、TNF-α的变化 |
| 2.2.10 统计学分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 .生物信息学软件分析预测多肽ZLW的结构及功能 |
| 3.1.1 多肽ZLW蛋白高级结构分析 |
| 3.1.2 多肽ZLW功能性位点分析 |
| 3.1.3 多肽ZLW序列功能预测 |
| 3.2 .流式细胞术分析巨噬细胞的偏移趋势 |
| 3.2.1 流式细胞术检测多肽ZLW对RAW264.7细胞极化偏移干预效应 |
| 3.2.2 流式细胞术测定各组小鼠肝脏中巨噬细胞的数量变化的影响 |
| 3.2.3 流式细胞术测定各组小鼠脾脏中巨噬细胞的数量变化的影响 |
| 3.3 H&E及 Masson染色法检测小鼠肝纤维化的病理改变 |
| 3.3.1 H&E染色法检测各组小鼠肝组织病理形态改变 |
| 3.3.2 Masson染色法检测各组小鼠肝组织的纤维化改变 |
| 3.4 IHC检测各组小鼠肝组织切片的改变 |
| 3.4.1 IHC检测各组小鼠肝组织CD68+细胞 |
| 3.4.2 IHC检测各组小鼠肝组织CD206+细胞 |
| 3.4.3 IHC检测各组小鼠肝组织iNOS酶的变化 |
| 3.4.4 IHC检测各组小鼠肝组织Arg1 酶的变化 |
| 3.5 ELISA检测各组小鼠血清中IL-6、TNF-α的变化 |
| 3.5.1 ELISA检测各组小鼠血清中IL-6 变化 |
| 3.5.2 ELISA检测各组小鼠血清中TNF-α的变化 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 发表的论文与参与的基金项目 |
| 致谢 |
（4）肝片吸虫病诊断候选抗原的筛选和制备（论文提纲范文）
| 项目资助基金 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 肝片吸虫及肝片吸虫病概述 |
| 1.1.1 肝片吸虫 |
| 1.1.2 肝片吸虫病的流行性 |
| 1.1.3 肝片吸虫病临床症状体征 |
| 1.1.4 肝片吸虫病的防治 |
| 1.2 肝片吸虫检测方法 |
| 1.2.1 病原学检测 |
| 1.2.2 分子生物学检测 |
| 1.2.3 免疫学检测 |
| 1.2.4 其它检查方法 |
| 1.3 肝片吸虫病诊断抗原研究进展 |
| 1.3.1 组织蛋白酶家族(CAT) |
| 1.3.2 天冬氨酰内肽酶(LEG) |
| 1.3.3 谷胱甘肽S-转移酶(GST) |
| 1.3.4 脂肪酸结合蛋白(FABP) |
| 1.3.5 鞘脂激活蛋白样蛋白家族(SAP) |
| 1.4 本研究目的及意义 |
| 第2章 肝片吸虫诊断候选抗原的筛选 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 肝片吸虫噬菌体cDNA展示文库和阳性血清 |
| 2.1.2 主要试剂及耗材 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 噬菌体展示及免疫筛选用相关试剂的配制 |
| 2.1.5 阳性噬菌体初筛 |
| 2.1.6 阳性噬菌体的复筛 |
| 2.1.7 诊断候选抗原的筛选 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 阳性噬菌体初筛 |
| 2.2.2 阳性噬菌体复筛 |
| 2.2.3 阳性克隆的鉴定与分析 |
| 2.2.4 候选抗原的筛选 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 候选抗原蛋白分子的生物信息学分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 生物信息学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 肝片吸虫组织蛋白酶L |
| 3.2.2 假定蛋白D915_000758 |
| 3.2.3 假定蛋白D915_001617 |
| 3.2.4 假定蛋白D915_005900 |
| 3.2.5 假定蛋白D915_010969 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 候选抗原基因的克隆以及重组质粒的构建 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 主要试剂及耗材 |
| 4.1.2 相关培养基和试剂的配制 |
| 4.1.3 肝片吸虫抗原基因特异性引物的设计与合成 |
| 4.1.4 特异性抗原基因的克隆 |
| 4.1.5 重组克隆质粒的构建 |
| 4.1.6 重组表达质粒的构建 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 肝片吸虫组织蛋白酶L |
| 4.2.2 假定蛋白D915_000758 |
| 4.2.3 假定蛋白D915_001617 |
| 4.2.4 假定蛋白D915_005900 |
| 4.2.5 假定蛋白D915_010969 |
| 4.3 讨论 |
| 第5章 候选抗原的诱导表达及鉴定 |
| 5.1 材料及方法 |
| 5.1.1 仪器与试剂材料 |
| 5.1.2 相关试剂的配制 |
| 5.1.3 重组蛋白的诱导表达 |
| 5.1.4 SDS-PAGE检测重组蛋白表达 |
| 5.1.5 包涵体蛋白的纯化 |
| 5.1.6 Western-Blot分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 融合蛋白pET-Cat L的表达与鉴定 |
| 5.2.2 融合蛋白pET-000758 的表达与鉴定 |
| 5.2.3 融合蛋白pET-001617 的表达与鉴定 |
| 5.2.4 融合蛋白pET-005900 的表达与鉴定 |
| 5.2.5 融合蛋白pET-010969 的表达与鉴定 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 :中英文缩略词对照表 |
| 附录二 :作者简介 |
| 致谢 |
（5）大片形吸虫两种ES产物的重组蛋白对山羊PBMCs功能的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 片形吸虫病 |
| 1.1.1 病原及其生活史 |
| 1.1.2 流行情况及危害 |
| 1.1.3 诊断方法及防控措施 |
| 1.2 排泄分泌产物的概述 |
| 1.3 排泄分泌产物在寄生虫免疫功能中研究进展 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 大片形吸虫的鉴定 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 大片形吸虫CaBp2基因的克隆、表达 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 重组FgCaBp2及重组FgLAP蛋白免疫活性研究 |
| 2.3.1 材料 |
| 2.3.2 方法 |
| 2.4 两种蛋白对山羊外周血单个核细胞的作用 |
| 2.4.1 材料 |
| 2.4.2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 大片形吸虫鉴定 |
| 3.1.1 片形吸虫虫体形态学鉴定结果 |
| 3.1.2 片形吸虫分子生物学鉴定结果 |
| 3.2 FgCaBp2基因的克隆表达结果 |
| 3.2.1 FgCaBp2基因克隆结果 |
| 3.2.2 FgCaBp2基因生物信息学分析结果 |
| 3.2.3 重组克隆质粒pMD19-T-rFgCaBp2的鉴定 |
| 3.2.4 重组表达质粒pET-30a-rFgCaBp2的鉴定 |
| 3.2.5 目的蛋白的表达与分析 |
| 3.3 重组FgCaBp2及重组Fg LAP蛋白的免疫活性 |
| 3.3.1 两种蛋白与人工感染山羊的阳性血清的Western-blot分析 |
| 3.3.2 间接ELISA检测两种蛋白免疫家兔制备的多克隆抗体滴度与最佳稀释度 |
| 3.3.3 两种蛋白与相应兔源多克隆抗体的Western-blot分析 |
| 3.4 两种蛋白对山羊外周血单个核细胞的作用 |
| 3.4.1 两种蛋白与山羊外周血单个核细胞的结合作用 |
| 3.4.2 两种蛋白对山羊PBMCs细胞因子分泌及总NO的产生的影响 |
| 3.4.3 两种蛋白对山羊PBMCs的增殖与迁移作用 |
| 3.4.4 两种蛋白对山羊PBMCs凋亡及山羊单核细胞吞噬功能的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 大片形吸虫的鉴定 |
| 4.2 rFgCaBp2基因的克隆、表达与纯化 |
| 4.3 rFgCaBp2蛋白与rFgLAP蛋白的免疫活性 |
| 4.4 两种蛋白对山羊PBMCs功能的影响 |
| 4.4.1 两种蛋白与山羊外周血单个核细胞的体外结合 |
| 4.4.2 两种蛋白对山羊PBMCs细胞因子分泌的影响及总NO的产生 |
| 4.4.3 两种蛋白对山羊PBMCs的增殖与迁移作用 |
| 4.4.4 两种蛋白对山羊PBMCs的凋亡与山羊单核细胞吞噬功能的影响 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）旋毛虫丝氨酸蛋白酶的表达与鉴定及用于免疫诊断的研究（论文提纲范文）
| 摘要 abstract 英文缩略词(Abbreviations) 第一部分 旋毛虫成虫排泄分泌抗原的血清学诊断 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 试剂的配方 |
| 1.4 寄生虫和实验动物 |
| 1.5 血清样本的收集和制备 |
| 1.6 旋毛虫肌幼虫,肠道感染性幼虫和成虫的收集 |
| 1.7 ELISA法检测旋毛虫感染血清 |
| 1.8 SDS-PAGE蛋白分析和Western-blot鉴定 |
| 1.9 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 检测成虫ES和可溶最佳包被条件及Cut-off值 |
| 2.2 成虫ES和成虫可溶检测感染不同旋毛虫虫种小鼠感染血清 |
| 2.3 成虫ES和成虫可溶检测不同寄生虫感染小鼠血清抗体结果 |
| 2.4 成虫ES和成虫可溶检测旋毛虫感染不同剂量不同天数小鼠血清抗体结果 |
| 2.5 检测旋毛虫和其他寄生虫染的病人血清中抗旋毛虫抗体水平 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 第二部分 旋毛虫丝氨酸蛋白酶(TsSP)的克隆表达及功能鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要实验试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 试剂配方 |
| 1.4 旋毛虫种、实验动物、菌体 |
| 1.5 在线预测TsSP蛋白的理化性质 |
| 1.6 TsSP序列比对及进化树的构建 |
| 1.7 设计TsSP的 PCR扩增引物 |
| 1.8 收集旋毛虫不同虫期的虫体 |
| 1.9 旋毛虫不同虫期总RNA的提取 |
| 1.10 RNA反转录制备各个虫期cDNA |
| 1.11 内参基因(GAPDH)检测cDNA质量 |
| 1.12 TsSP目的基因扩增 |
| 1.13 TsSP基因与克隆载体pGEM-T |
| 1.14 制备BL21感受态 |
| 1.15 重组质粒转化入感受态中 |
| 1.16 重组菌落PCR鉴定 |
| 1.17 质粒提取步骤 |
| 1.18 重组质粒pGEM-TsSP的双酶切和测序鉴定 |
| 1.19 目的基因TsSP与表达载体的连接 |
| 1.20 菌种冻存 |
| 1.21 重组菌的诱导表达及可溶性分析 |
| 1.22 rTsSP蛋白的亲和纯化 |
| 1.23 rTsSP免疫血清的制备及效价的测定 |
| 1.24 Western-blot检测rTsSP的抗原性和免疫原性 |
| 1.25 旋毛虫TsSP基因在各个虫期核酸水平的表达 |
| 1.29 旋毛虫TsSP蛋白在各个虫期的表达及定量 |
| 1.30 检测TsSP在旋毛虫各个虫体的表达和定位 |
| 1.31 ADCC-抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用[9-11] |
| 1.32 体外侵入实验 |
| 1.33 rTsSP与肠上皮细胞的特异性结合作用 |
| 1.34 rTsSP免疫保护 |
| 1.35 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 TsSP生物信息学分析 |
| 2.2 旋毛虫TsSP基因引物设计 |
| 2.3 扩增TsSP基因 |
| 2.4 重组质粒PGEM-T-TSsp的测序及序列分析 |
| 2.5 重组表达载体的PCR鉴定及双酶切鉴定 |
| 2.6 重组质粒pQE80L-TsSP诱导表达及可溶性分析 |
| 2.7 rTsSP的亲和纯化 |
| 2.8 ELISA检测rTsSP免疫血清的效价 |
| 2.9 Western-blot分析rTsSP重组蛋白的抗原性 |
| 2.10 旋毛虫TsSP基因转录水平的表达 |
| 2.11 TsSP蛋白在旋毛虫不同发育虫期蛋白表达水平的鉴定 |
| 2.12 IFA检测TsSP蛋白在旋毛虫不同虫期虫体表面的表达及定位 |
| 2.13 IFA检测TsSP在旋毛虫不同发育期虫体内部的表达 |
| 2.14 抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC) |
| 2.15 体外侵入 |
| 2.16 rTsSP与 IEC的结合作用 |
| 2.17 rTsSP诱导免疫类型的鉴定 |
| 2.18 rTsSP的免疫保护作用 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 第三部分 rTsSP在旋毛虫病早期诊断及免疫保护中的应用 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试剂和仪器 |
| 1.2 蛋白的制备 |
| 1.3 不同感染血清的制备 |
| 1.4 Western-blot检测 |
| 1.5 ELISA检测 |
| 1.6 滴鼻免疫实验方案 |
| 1.7 ELISA检测抗体反应 |
| 1.8 肠道冲洗液中sIgA的检 |
| 1.9 免疫荧光分析肠道分泌IgA细胞的数量 |
| 1.10 肠道杯状细胞及粘蛋白的鉴定 |
| 1.11 细胞因子检测 |
| 1.12 旋毛虫攻击感染小鼠及免疫保护评估 |
| 1.13 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Western-blot检测rTsSP对早期旋毛虫感染血清的识别 |
| 2.2 Western-blot分析对rTsSP的敏感性 |
| 2.3 rTsSP-ELISA检测其他旋毛虫种属感染小鼠血清结果 |
| 2.4 rTsSP-ELISA检测其他寄生虫感染小鼠血清结果 |
| 2.5 rTsSP-ELISA检测旋毛虫感染不同剂量不同时间的小鼠血清 |
| 2.6 rTsSP-ELISA检测旋毛虫感染猪血清 |
| 2.7 rTsSP检测旋毛虫和其他寄生虫感染的病人血清 |
| 2.8 rTsSP滴鼻免疫所引起的体液免疫应答 |
| 2.9 肠道粘膜sIgA应答 |
| 2.10 IFA检测旋毛虫天然TsSP在不同期的表达 |
| 2.11 肠道杯状细胞及粘蛋白的检测 |
| 2.12 小肠分泌IgA细胞的荧光鉴定 |
| 2.13 rTsSP滴鼻免疫后细胞因子的变化 |
| 2.14 rTsSP滴鼻免疫后所产生的免疫保护作用 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 全文结论 综述 寄生虫丝氨酸蛋白酶功能与旋毛虫病免疫保护的研究 |
| 1 丝氨酸蛋白酶和酶的作用机制 |
| 2 寄生线虫的丝氨酸蛋白酶 |
| 2.1 鞭虫丝氨酸蛋白酶 |
| 2.2 简单异尖线虫丝氨酸蛋白酶 |
| 2.3 猪蛔虫丝氨酸蛋白酶 |
| 2.4 丝虫丝氨酸蛋白酶 |
| 2.5 犬钩虫丝氨酸蛋白酶 |
| 2.6 小卷蛾斯氏线虫丝氨酸蛋白酶 |
| 2.7 绦虫丝氨酸蛋白酶 |
| 2.8 吸虫丝氨酸蛋白酶 |
| 2.9 旋毛虫丝氨酸蛋白酶 |
| 3 旋毛虫病的免疫生物学 |
| 4 抗旋毛虫感染疫苗的发展 |
| 4.1 虫体提取物和分泌物诱导的保护免疫 |
| 4.2 用于诱导保护预防旋毛虫的免疫途径和佐剂 |
| 4.3 重组蛋白和亚型表位所诱导的抗旋毛虫的保护应答 |
| 4.4 抗旋毛虫的DNA疫苗 |
| 4.5 旋毛虫疫苗的远景 |
| 5 结论 |
| 参考文献 个人简历及博士期间发表论文 |
| 1 个人基本信息 |
| 2 教育背景 |
| 3 发表论文情况 |
| 4 获奖荣誉 |
| 5 参加国际会议 致谢 |
（7）AIF-1对血吸虫感染小鼠Ⅰ型/Ⅱ型免疫应答的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 AIF-1对血吸虫感染小鼠Th1/Th2免疫应答的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 AIF-1对血吸虫感染小鼠巨噬细胞M1/M2免疫应答的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录1 实验相关试剂 |
| 附录2 主要仪器和器材 |
| 致谢 |
（8）日本血吸虫排泄分泌蛋白的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 血吸虫及我国血吸虫病防控 |
| 1.2 日本血吸虫的生活史 |
| 1.3 血吸虫感染免疫 |
| 1.3.1 抗原复杂性 |
| 1.3.2 宿主免疫效应机制的多样性 |
| 1.3.3 免疫逃避 |
| 1.3.4 宿主免疫应答作用的两面性 |
| 1.4 单核吞噬细胞 |
| 1.5 排泄分泌蛋白及相关研究 |
| 1.5.1 排泄分泌蛋白 |
| 1.5.2 排泄分泌蛋白与免疫调节 |
| 1.5.3 寄生蠕虫排泄分泌蛋白质组学研究 |
| 1.6 蛋白质组学研究技术 |
| 1.6.1 蛋白质组分分离技术 |
| 1.6.2 蛋白质组分鉴定技术 |
| 1.6.3 蛋白质组分定量分析技术 |
| 1.6.4 蛋白质组生物信息学分析 |
| 1.7 本研究的总体思路 |
| 第二章 日本血吸虫 14d童虫排泄分泌蛋白质组分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 14d童虫排泄分泌蛋白质组的总体分析 |
| 2.3.2 童虫排泄分泌蛋白的分泌特性分析 |
| 2.3.3 童虫排泄分泌蛋白的理化特性分析 |
| 2.3.4 GO注释 |
| 2.3.5 KEGG通路分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 日本血吸虫童虫和成虫排泄分泌蛋白质组的比较分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 SDS-PAGE电泳 |
| 3.3.2 童虫和成虫差异ESPs的总体分析 |
| 3.3.3 童虫和成虫差异ESPs的理论相对分子量和等电点预测及分泌特性分析 |
| 3.3.4 童虫和成虫差异ESPs的GO功能显着性分析及通路分析 |
| 3.3.5 iTRAQ验证试验 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 日本血吸虫蛋白质二硫键异构酶（SjPDI）的克隆、表达及重组蛋白rSjPDI诱导抗血吸虫感染免疫保护效果的评价 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 SjPDI基因的克隆及生物信息学分析 |
| 4.3.2 重组质粒pET28a（+）-SjPDI的原核表达及重组蛋白的纯化 |
| 4.3.3 rSjPDI的抗原性和免疫原性分析 |
| 4.3.4 Real-time PCR检测SjPDI在不同发育阶段虫体内的转录水平 |
| 4.3.5 SjPDI蛋白在虫体内的组织定位观察 |
| 4.3.6 重组蛋白rSjPDI的异构活性和抗氧化活性测定 |
| 4.3.7 重组蛋白SjPDI在小鼠体内诱导的特异性抗体检测 |
| 4.3.8 重组蛋白rSjPDI在小鼠体内诱导的免疫保护效果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 日本血吸虫谷胱甘肽脱氢酶对LPS诱导的巨噬细胞活化的影响及其调节机制研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 日本血吸虫谷胱甘肽脱氢酶基因的克隆及生物信息学分析 |
| 5.3.2 日本血吸虫谷胱甘肽脱氢酶基因的原核表达及纯化 |
| 5.3.3 重组日本血吸虫谷胱甘肽脱氢酶可抑制LPS诱导的巨噬细胞中促炎性细胞因子和iNOS的转录水平 |
| 5.3.4 重组日本血吸虫谷胱甘肽脱氢酶抑制LPS诱导的巨噬细胞中NO的释放 |
| 5.3.5 重组日本血吸虫谷胱甘肽脱氢酶可增强巨噬细胞中miR-146a的转录水平 |
| 5.3.6 mi R-146a负调控LPS诱导的巨噬细胞中IL-1β 的表达 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）日本血吸虫精氨酸酶克隆表达及功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 血吸虫疫苗 |
| 1.2.1 血吸虫疫苗研究进展 |
| 1.2.2 虫源性疫苗 |
| 1.2.3 核酸疫苗 |
| 1.2.4 重组抗原疫苗 |
| 1.2.5 表位疫苗 |
| 1.2.6 血吸虫病疫苗研究展望 |
| 1.3 精氨酸酶的研究背景 |
| 第二章 日本血吸虫精氨酸酶的克隆表达及免疫评估 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物和虫体 |
| 2.2.2 主要酶和试剂 |
| 2.2.3 菌种、质粒和模板 |
| 2.2.4 主要实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 SjARG 基因的克隆及生物信息学分析 |
| 2.3.2 重组质粒 pET28a(+)-SjARG 的构建及鉴定 |
| 2.3.3 重组质粒 pET-28a(+)-SjARG 的表达与纯化 |
| 2.3.4 Western Blotting 分析 |
| 2.3.5 实时定量 PCR 分析 SjARG 在不同时期虫体内和性别差异表达分析 |
| 2.3.6 SjARG 在虫体中的组织定位分析 |
| 2.3.7 重组蛋白 rSjARG 动物免疫保护效果评估 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 SjARG 基因克隆及生物信息学分析 |
| 2.4.2 重组质粒 pET-28a(+)-SjARG 的构建及鉴定 |
| 2.4.3 pET-28a(+)-SjARG 在大肠杆菌中的表达与其重组蛋白的纯化 |
| 2.4.4 Western blotting 分析 |
| 2.4.5 Real-time PCR 分析 SjARG 在不同时期的表达状况 |
| 2.4.6 日本血吸虫精氨酸酶蛋白的表达分布 |
| 2.4.7 重组蛋白 SjARG 诱导的免疫保护效果及评估 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 日本血吸虫精氨酸酶的酶活性及抑制剂分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 生物材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 精氨酸酶活性反应体系的建立 |
| 3.3.2 rSjARG 的 Km 值测定 |
| 3.3.3 pH、金属离子以及温度、热激对 rSjARG 的影响 |
| 3.3.4 氨基酸、还原剂以及其他试剂对 rSjARG 酶活性的影响 |
| 3.3.5 NOHA 和 nor-NOHA 对 rSjARG 酶活性的影响 |
| 3.3.6 日本血吸虫虫体蛋白精氨酸酶比活力测定 |
| 3.3.7 抑制剂 NOHA 对血吸虫作用的初步研究 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 日本血吸虫精氨酸酶活性及 Km 值测定 |
| 3.4.2 pH、离子、温度及热激对 SjARG 的影响 |
| 3.4.3 氨基酸、抑制剂对 SjARG 活性的影响 |
| 3.4.4 日本血吸虫虫体蛋白精氨酸酶比活力测定 |
| 3.4.5 抑制剂 NOHA 动物实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）吡喹酮新衍生物抗日本血吸虫生物学效应研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 第一部分 DW 系列及 YCH-II-P 系列吡喹酮(PZQ) 衍生物和 PZQ 消旋体体外抗日本血吸虫生物学效应 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 PZQ衍生物 P96 体内抗日本血吸虫效应 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 钙通道阻滞剂与肌动蛋白解聚剂对 P96 体外抗日本血吸虫效应的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 附录一 缩写词表 |
| 附录二 主要仪器与设备 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间本人出版或公开发表的论着、论文 |
| 致谢 |
四、诱导型一氧化氮合酶在不同虫期日本血吸虫虫体中的表达（论文参考文献）
- [1]大片吸虫及其分泌抗原对宿主肠道菌群与免疫应答调节机制的研究[D]. 盛兆安. 广西大学, 2020
- [2]旋毛虫感染宿主血清中差异miRNA的功能及诊断价值研究[D]. 马小涵. 郑州大学, 2020(02)
- [3]多肽ZLW调控宿主巨噬细胞极化改善血吸虫性肝纤维化[D]. 陈聪. 南华大学, 2020(01)
- [4]肝片吸虫病诊断候选抗原的筛选和制备[D]. 贾骁晔. 西北民族大学, 2020(08)
- [5]大片形吸虫两种ES产物的重组蛋白对山羊PBMCs功能的影响[D]. 袁晓丹. 黑龙江八一农垦大学, 2019(09)
- [6]旋毛虫丝氨酸蛋白酶的表达与鉴定及用于免疫诊断的研究[D]. 孙阁阁. 郑州大学, 2019(07)
- [7]AIF-1对血吸虫感染小鼠Ⅰ型/Ⅱ型免疫应答的影响及机制研究[D]. 冯玉洁. 华中科技大学, 2017(03)
- [8]日本血吸虫排泄分泌蛋白的研究[D]. 曹晓丹. 中国农业科学院, 2016(01)
- [9]日本血吸虫精氨酸酶克隆表达及功能分析[D]. 艾德宙. 中国农业科学院, 2013(02)
- [10]吡喹酮新衍生物抗日本血吸虫生物学效应研究[D]. 孙缓. 苏州大学, 2013(S2)