一、肺癌单抗识别的肿瘤相关抗原特性分析（论文文献综述）
方佳成[1]（2021）在《泛实体瘤相关抗原图谱的构建及其在抗体偶联药物和嵌合抗原受体T细胞上的应用》文中研究指明癌症已经成为危害人类健康的主要疾病,据世卫组织国际癌症研究机构数据显示,2020年,全球男性和女性将合计出现约1930万和1000万的新发病例和癌症死亡病例,其中的1800万例和930万例将来自实体瘤。然而,对肿瘤治疗的系统评估数据显示,欧洲药物管理局在2009-2013年度批准的大多数抗癌药物未能对患者的整体生命质量产生重大改善。因此,需要继续提高抗肿瘤药物的临床疗效。抗体偶联药物（Antibody-Drug Conjugates,ADC）和嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor,CAR）T细胞疗法是发展迅速的肿瘤靶向治疗技术,它们通过特异性识别在恶性细胞和正常组织细胞之间差异过表达的靶标抗原,达到辨识肿瘤和消融肿瘤的目的。ADC和CAR-T实现安全性与有效性的关键,在于其所识别的靶标抗原是否具备足够的肿瘤特异性。因而,鉴别出理想的靶标抗原至关重要。理想的靶标抗原由恶性细胞特异性表达,然而肿瘤特异性抗原屈指可数。肿瘤相关抗原在肿瘤细胞上表达升高,在正常细胞上限制性表达,这一特性使得它们亦能够作为有效定位恶性肿瘤的靶标分子。目的:以发现理想的肿瘤相关抗原为出发点,着力于打造肿瘤相关抗原发现新平台,构建全面的泛实体瘤肿瘤相关抗原图谱,为癌症研究人员和广泛的科学与医药界科研工作者提供研究便利。方法:1.使用经统一处理的TCGA和GTEx的RNA序列数据,对19种类型实体瘤中的20242个HUGO基因进行差异分析;通过将阈值设置为Benjamini-Hochberg adjusted p值为0.01,log2Fold Change为1.0,保留那些在肿瘤细胞群中显着差异表达的HUGO基因;结合蛋白质亚细胞定位信息,排除不具备胞外结构域的蛋白;使用集成了GTEx,HPA和FANTOM5的m RNA表达信息和HPA和HPM的蛋白质丰度信息的数据集,获取在正常组织中受限表达的蛋白分子;使用公开的Blood Spot平台,发现那些在骨髓Lin-CD34+CD38-CD90+CD45RA-HSCs和Lin-CD34+CD38-CD90-45RA-MPPs中限制性表达的蛋白分子。2.将RNA测序的读段计数数据转换为TPM格式,并将每个基因在其配对适应症和正常组织中的TPM值作为差异表达分析的输入数据。采用非参数Mann-Whitney U检验分析,计算并绘制每个候选靶标分子在特定适应症中的表达相比其在各个人体正常组织中的表达的差异表达谱。3.提取并整理TCGA中泛癌表型数据中的癌组织学分级,病理分级和TNM分期信息;通过挖掘MC3（“多中心多癌种突变识别”）TCGA MAF（“突变注释格式”）数据,确定靶标基因的非沉默体细胞突变（SNP和INDEL）。结合m RNA表达数据,汇编用于评价靶标基因的异质表达模式的综合数据集。4.从TCGA下载并提取靶标基因组变异数据,从Onco KB收集致癌或功能性基因组变异信息,注释并统计靶标基因的变异类型及发生频率,确定在临床上有应用价值的携带特异性驱动变异的功能性靶标。5.通过杂交瘤技术制备CDH17特异性单克隆抗体,进而运用流式细胞术、过表达共定位分析、结合亲和力检测、抗体测序和可变区序列进化关系分析等,多重表征抗体的各项指标。通过偶联mc-Val Cit PABC-MMAE,制备CDH17靶向型ADC。结合体外杀伤实验与细胞内化评估,完成效应分子的初筛验证。6.通过构建KM12SM和COLO205结肠癌细胞系CDX动物模型,综合评估chi2E21-MMAE和chi2F12-MMAE的体内抗肿瘤活性。通过制备和人鼠CDH17蛋白交叉反应的ADC分子,并对给药的荷瘤小鼠的心/肺/肝/肾/结肠/直肠/脾脏进行HE染色,评估CDH17靶向型ADC对小鼠的组织毒性。7.通过慢病毒载体感染CD3+T细胞,制备LYPD3靶向型CAR-T细胞。通过对CAR-T细胞进行分化检测,确定其向效应细胞持续分化的能力。通过体外细胞杀伤实验和细胞因子分泌检测,研究LYPD3靶向型CAR-T细胞对肿瘤细胞的的特异性杀伤作用。通过对荷瘤小鼠循环血中的CAR-T细胞进行计数和检测肿瘤组织中的T细胞浸润水平,揭示LYPD3靶向型CAR-T细胞在小鼠体内发挥持久抗肿瘤作用的机制。结果:1.开发专门的算法和汇编整合有泛实体瘤和正常组织的大型转录组、蛋白质组和基因组信息的综合数据集。2.系统地识别肿瘤相关抗原。通过我们的肿瘤相关抗原发现平台,筛选得到75个潜在的肿瘤相关抗原分子。特别是BACE2、CDH17、CELSR1、CELSR2、COL17A1、COL23A1、CRIM1、DSC3、GPR87、LYPD3、MUC17、NOX1、PTPRN2、SCTR、TRPM8、VCAM1等分子值得做进一步的临床前研究。3.基于CDH17蛋白定向开发的ADC分子可以在体内显着消融KM12SM和COLO205异种移植瘤,并对高表达CDH17蛋白的结肠癌病人来源的异种移植瘤表现出一定的肿瘤抑制效果。chi2F12-MMAE在体外对高药敏度的COLO205显示高水平的细胞毒性（IC50=60.9p M）,chi2E21-MMAE和chi1A13-MMAE对COLO205的抑瘤水平相当（IC50:925.8 p M vs.998.3 p M）。两次单药静脉注射（Q2W）chi2E21-MMAE或chi2F12-MMAE,均能以剂量依赖性的方式抑制KM12SM在小鼠体内的生长,但无法完全清除肿瘤。在COLO205 CDX模型中,按同样的给药方式静注chi2F12-MMAE,1.5 mg/kg剂量的第一针治疗可以起到平缓异种移植肿瘤增长的效果,且两周后的第二针治疗亦能继续起到溶瘤效果;3 mg/kg的中剂量治疗组有部分小鼠的肿瘤在后期出现反弹;6 mg/kg的高剂量治疗可以根治异种移植瘤。4.CDH17靶向型ADC在小鼠体内具有相对可控的组织毒性。制备了能和人鼠CDH17蛋白交叉反应的ADC分子677-MMAE,观察到在677-MMAE给药组小鼠的结直肠的局部组织中有炎症反应,聚集了大量的淋巴细胞;但在其它组织中没有出现炎症反应。此外,在观察期内,小鼠对chi2E21-MMAE、chi2F12-MMAE或677-MMAE的体内耐受良好,用药期间未有小鼠死亡个例出现,亦没有观察到10%以上的减重。5.LYPD3靶向型CAR-T细胞能够在小鼠体内对PC9异种移植肿瘤发挥持久的抗肿瘤作用。且小鼠对LYPD3-CAR-T的耐受良好,在观察期内未有小鼠死亡个例出现,亦没有观察到10%以上的减重。进一步调查发现,LYPD3-CAR-T细胞不仅在小鼠外周血中大量存在,还在高响应LYPD3-CAR-T治疗的PC9异种移植瘤组织中大量浸润。此外,LYPD3-CAR-T治疗组的小鼠脾脏内出现大量CD3+T细胞,但在对照组中却没有。CAR-T细胞的记忆表型对于激发持久的免疫应答至关重要。数据显示,LYPD3-CAR-T细胞在输注前,其中的Tn/Tscm细胞和Tcm细胞比例分别高达52.4%和21.7%,具有良好的向效应细胞分化的潜能。结论:通过开发肿瘤相关抗原识别算法和整合来自19种实体瘤和正常组织的大型转录组、蛋白质组和基因组数据,完成了泛实体瘤相关抗原的探索。通过考察CDH17靶向型ADC和LYPD3靶向型CAR-T细胞在模型小鼠中的抗肿瘤活性,例证了CDH17和LYPD3蛋白分别作为ADC和CAR-T靶标开发的可行性。
姚卓然[2]（2021）在《肺癌免疫治疗相关不良反应的多组学生物标记物探究与预测模型建立》文中进行了进一步梳理研究背景与目的:免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors,ICIs）为肿瘤治疗领域带来革新性的改变,已广泛应用于晚期肺癌的治疗中。患者在接受ICIs治疗过程中出现了一系列全新的不良反应,与ICIs药物引起机体免疫平衡紊乱相关,称免疫相关不良反应（immune-related adverse events,irAEs）。既往队列研究提示irAEs与免疫治疗预后存在相关性,但尚未得出明确结论。另一方面,irAEs预测生物标记物研究是近年热点方向。探究irAEs的生物标记物有助于临床提前预测,早期发现irAEs,具有很好的临床应用价值。目前已知的生物标记物存在指标单一,预测效能低,缺乏有效整合的缺点。本研究拟从肿瘤、外周血、患者遗传信息多维度入手,探究并整合irAEs的预测因子。进一步建立irAEs的预测模型。同时,基于回顾性队列的初步发现,本研究应用meta分析的方法,整合目前已发表文献,评估irAEs与免疫治疗疗效的相关性。研究方法:回顾性队列研究部分:本研究从医科院肿瘤内科接受免疫治疗的肺癌患者队列中选取研究样本。随访统计患者基线临床指标、生存预后及irAEs信息。同时收集其基线外周血血浆和淋巴细胞样本,应用1021panel对ctDNA进行高通量测序,对PD-1+CD4+/CD8+T淋巴细胞进行高通量免疫组库测序技术,用电化学发光法检测血浆73类细胞因子进行检测。分别探究各项指标与irAEs的相关性,并应用Lasso回归法筛选变量,应用Logistic回归确定独立预测因素并建立irAEs预测模型。Meta分析部分:本研究参考系统综述与meta分析优先报告条目进行文献检索与分析。纳入所有报道了irAEs与肿瘤患者接受ICIs治疗疗效关联的研究。主要研究结果为irAEs与总生存期（overall survival,OS）相关性,次要研究结果为irAEs与无进展生存期（progression free survival,PFS）相关性。同时对器官特异性irAEs与不同级别irAEs进行了具体分析。研究结果:回顾性队列研究部分:①本研究纳入55例接受免疫治疗的局部晚期/晚期肺癌患者,irAEs组患者其PFS及OS均显着长于无irAEs组患者（PFS:4.5m vs 2.0m,p=0.005,OS:Not reached vs 4.6m,p<0.0001）。②irAEs 组与非 irAE 组患者基线 NLR、PLR、PNI 水平存在显着差异（NLR:p=0.014、PLR:p=0.044、PNI:p=0.003）。irAEs组患者基线PD-1+CD8+T细胞与PD-1+CD4+T细胞免疫组库多样性显着高于非irAEs组患者（PD-1+CD8+TCR:p=0.016,PD-1+CD4+TCR:p=0.042）。HLA 分布及 bTMB水平在两组间无显着差异。③73类细胞因子中,IL-2,IL-17C水平与irAEs存在相关性（IL-2:p=0.006,IL-17C:p=0.040）。④在多因素构建的irAEs模型中,预测模型的曲线下面积为0.934（95%CI:0.844-1.000）,最佳预测敏感性89.5%,特异性91.7%。Meta分析部分:本研究共纳入30项研究共4791名患者。meta分析结果表明irAEs的发生与接受 ICI 治疗患者的 OS 与 PFS 改善显着相关（OS:hazard ratio（HR）=0.54,95%confidence interval（CI）,0.45-0.65;p<0.001;PFS:HR=0.52,95%CI,0.44-0.61,p<0.001）。基于器官特异性irAEs与不同级别irAEs的分析发现,内分泌（OS:HR=0.52,95%CI,0.44-0.62,p<0.001）、皮肤（OS:HR=0.45,95%CI,0.35-0.59,p<0.001）以及低级别 irAEs（OS:HR=0.57,95%CI,0.43-0.75;p<0.001）与更佳的 OS 预后相关。结论:综上所述,本研究构建了肺癌免疫治疗irAEs患者队列。发现外周血炎症指标、T细胞免疫组库和细胞因子水平和irAEs的发生相关。在此基础上进一步整合多维度指标,建立了 irAEs预测模型。同时,基于回顾性队列数据及meta分析,本研究发现irAEs与患者总生存期与无进展生存期存在显着相关性。
刘书霞[3]（2021）在《抗肿瘤药物浓度分析新方法及结直肠癌早期诊断标志物研究》文中提出本论文的研究内容分为两个部分:第一部分以我国自主研发的1类新药FCN-411和特瑞普利单抗为研究对象,基于质谱技术分别建立了快速、可靠和灵敏的超高效液相色谱串联质谱方法（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS）,测定人血浆中药物浓度,为这两种药物的临床药代动力学研究以及治疗药物浓度监测、药效学等方面的研究提供了评价方法和合理用药依据。第二部分基于高通量蛋白芯片技术揭示结直肠癌患者血浆中自身抗体表达情况,筛选和验证有潜力成为结直肠癌早期诊断和良恶性结直肠肿瘤鉴别诊断的自身抗体标志物。第一部分:建立FCN-411和特瑞普利单抗的检测方法第一章:建立和验证人血浆中FCN-411浓度检测的UPLC-MS/MS方法。FCN-411是新型的二代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epithelial growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI）,具有部分三代 EGFR-TKI 的特性。为进一步探索FCN-411对非小细胞肺癌患者的疗效,我们建立了 UPLC-MS/MS方法用于临床药代动力学和药效学研究。应用操作简便的蛋白沉淀法对血浆样品进行前处理,并根据生物样品分析方法的指导原则进行全部的方法学验证。结果显示血浆样品中FCN-411的标准曲线在2-500ng/mL范围内线性较好,三批次分析结果中r2均大于0.98;低定量下限样品的批内和批间的精密度在9.18%～17.46%之间,准确度在-17.50%～7.14%之间;其余三个浓度质控样品的批内和批间的精密度在4.24%～14.35%之间,准确度在2.00%～11.89%之间;低、高浓度质控样品内标归一化基质因子均值分别为101.67%和94.74%,变异系数分别为4.69%和2.27%,不同个体间的基质差异不影响FCN-411的定量;低、高浓度质控样品中FCN-411的相对提取回收率均值在85%～100%之间,变异系数分别为5.78%和1.23%,较为一致;血浆样品在室温放置2h、-80℃保存7天和冻融循环三次以及样品被处理后在10℃进样器放置26 h后均保持稳定,且FCN-411和内标的储备液在-20℃冰箱放置4.8个月仍稳定。该方法顺利通过全部的方法学验证,并成功用于检测1例FCN-411的Ⅰ期临床试验中接受4 mg剂量治疗的非小细胞肺癌患者血样,初步验证该方法具有较好的临床适用性。单个样品的检测时间仅需4.5分钟,能在较短时间内实现大批量样本的检测,满足临床样本的检测需求,为后续进行FCN-411的Ⅰ期临床试验的药代动力学研究建立了方法学基础。第二章:建立和验证人血浆中特瑞普利单抗浓度检测的UPLC-MS/MS方法,并与电化学发光免疫分析法（electrochemiluminescence immunoassay,ECLIA）进行比较。特瑞普利单抗是针对PD-1的人源化IgG4型单克隆抗体,我们建立UPLC-MS/MS法检测特瑞普利单抗的浓度,用于后续临床药物治疗浓度监测。我们应用数据库筛选结合基质样本的上机检测,筛选出特瑞普利单抗的特征性肽段,基于其序列合成延长同位素标记的内标标准品,优化前处理和色谱质谱参数,并完成全部的方法学验证,结果均符合生物样品分析方法的检测要求。我们成功检测了特瑞普利单抗Ⅰ期临床研究入组患者的77份血浆样本,证实该方法具有较好的临床适用性。同时基于56个样本检测结果,与ECLIA方法进行比较。结果显示两组数据具有较好的相关性（r=0.96）,但UPLC-MS/MS方法的检测结果显着高于ECLIA的结果（p<0.0001）。Passing-Bablok线性回归和Bland-Altman分析均表明两组数据存在一定的系统差异和比例差异。这主要是由于两种方法的检测原理不同所致,ECLIA法采用双抗原夹心法测定血浆中游离态的单抗药物,并且血浆中存在的可溶性PD1抗原可能与特瑞普利单抗结合,可能影响药物的定量;而我们建立的UPLC-MS/MS法通过监测单抗酶解后的特征性肽段来间接定量单抗的浓度,血浆中结合和游离态的单抗都能被酶解生成肽段而被检测到,因此我们的方法检测血浆中总的特瑞普利单抗浓度,并且不易受血浆基质的干扰。综上,我们建立的方法可以作为ECLIA方法的补充,用于检测不同形式单抗的浓度。第二部分:结直肠癌早期检测相关的血浆自身抗体研究第一章:Anti-p53自身抗体对结直肠癌诊断价值的meta分析。基于在Pubmed、Embase和Cochrane library这三个数据库提取相关文献,最终筛选到80篇文献,囊括145个自身抗体。约70%以上文献结果显示自身抗体的灵敏度低于30%,约80%的结果显示其特异度相对较高,超过90%。我们针对研究最多的anti-p53自身抗体进行meta分析,包括来自24篇文献的27个研究。由于纳入的研究间存在明显的异质性,meta回归和亚组分析显示阈值效应是主要的异质性来源。我们将研究根据阳性界值的定义分为5组,由于其余4组依然存在阈值或非阈值效应,只有group 3组内的研究间较为均一,因此我们将group 3的研究采用固定效应模型进行合并分析。group3由5篇文章组成,包括733例结直肠癌患者和172例对照（126例健康个体和46例良性疾病）。合并灵敏度、特异性、阳性和阴性似然比,诊断比值比和受试者工作特性曲线下面积分别为0.21、0.99、12.26、0.80、15.46和0.87。基线外周血中抗p53自身抗体可能有助于将结直肠癌与健康对照或良性疾病区分开来,但需进一步探索与其他标志物联合使用以提高检测的灵敏度。第二章:应用高通量蛋白芯片筛选和验证与结直肠癌早期检测相关的自身抗体研究。基于高通量Huprot蛋白芯片的发现阶段和候选蛋白芯片的验证阶段这两步实验,揭示血浆自身抗体在结直肠癌、良性结直肠肿瘤和健康人群中的表达情况。Huprot蛋白芯片发现阶段,共纳入35例早期结直肠癌患者（TNM分期Ⅰ-Ⅱ期）、25例良性结直肠肿瘤患者和20例健康人,经过两两比较后共筛选到198个差异自身抗体;候选蛋白芯片验证阶段,纳入305例早期结直肠癌患者、61例良性结直肠肿瘤患者和240例健康人,我们首先基于早期结直肠癌患者和健康人的数据评价4种定义阳性界值法,发现最大约登指数+至少90%特异度法能确保较高的特异度,同时提高检测的灵敏度,后续采用这种方法进行分析,结果如下:（1）发现11个与结直肠癌早期诊断相关的差异自身抗体,单个自身抗体的检测阳性率在12.46%～20.00%之间,其中 p53、GATA6、MAP3K5、SOX9-AS 1frag 和 TIMM8A 这 5 个自身抗体组合构建Logistic回归模型时,灵敏度达到51.47%,特异度为75.42%;（2）发现13个用于Early CRC和Benign组鉴别诊断的差异自身抗体,单个抗体的检测灵敏度在14.10%～28.20%之间,其中6个自身抗体HIST1H1C、OSGIN1、CRY2、PRR7、REG3A和SLC43A2被纳入构建Logistic回归模型,AUC达到0.78,灵敏度达74.10%,特异度为70.49%,具有较好的潜力用于良恶性结直肠肿瘤的鉴别诊断;（3）发现13个与良性结直肠肿瘤相关的自身抗体,单个抗体的检测阳性率在1.64%～24.59%之间,其中p53、RXFP2和UROS这3个自身抗体组合构建Logistic回归模型,检测的灵敏度为34.43%,特异度为86.67%;（4）与健康人和良性结直肠肿瘤患者相比,早期结直肠癌患者主要表达≥2个阳性自身抗体,因此限定≥2个阳性抗体时能显着提高联合检测的特异度,诊断价值与Logistic回归模型的相当。综上,多个血浆自身抗体在早期结直肠癌和良性肿瘤患者中出现显着升高,具有较大潜力用于结直肠癌的早期诊断和良恶性鉴别诊断,后续可在更大的人群队列中再次验证,确认最佳的联合检测组合,以最大程度识别出早期结直肠癌患者。
陈震[4]（2021）在《Hsa＿circ0006332和Hsa＿circ0000069调控宫颈癌发展的机制研究》文中研究说明研究背景和目的宫颈癌（Cervical Carcinoma,CC）是由人乳头瘤病毒（HPV）感染引起的常见的妇科恶性肿瘤。我国是CC患病人数最多的国家之一,CC的预防和治疗任务繁重。HPV疫苗和宫颈涂片筛查虽然能够有效的预防CC发生,但晚期CC预后通常很差。环状RNA（circRNAs）在肿瘤的发生和发展中发挥着重要作用,这也包括在CC中。此外,由于具有高稳定性,特异性表达等特点,circRNAs在肿瘤的治疗与诊断中前景可期。然而,当前很大一部分circRNAs的表达和功能尚不清楚。本研究旨在探讨hsa＿circ＿0006332（Hsa＿circ00063322）和hsa＿circ＿0000069（Hsa＿circ0000069）在CC发展中的作用及其表达升高的相关分子机制。研究方法1.Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069环状性质验证及其在宫颈癌细胞和组织中的表达通过RnaseR消化实验和基因组DNA扩增实验验证Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069的环状结构。放线菌素D实验和核质分布实验检测Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069的高稳定性和细胞分布。采用实时定量聚合酶链反应（qPCR）法分别检测CC和正常组织与细胞中Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069的表达,以确定宫颈组织癌变后Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069的表达变化。2.Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069表达升高的机制研究通过数据库分析,发现Hsa＿circ00063322表达可能受转录因子FOXA1调控,而Hsa＿circ0000069表达受RNA m6A甲基化修饰调控。通过染色质免疫共沉淀实验验证FOXA1与Hsa＿circ00063322启动子结合;qPCR法检测FOXA1对Hsa＿circ00063322表达的调节;荧光素酶实验确认了FOXA1与Hsa＿circ00063322启动子区的结合位点。m6A RNA免疫共沉淀（Me-RIP）检测CC和正常细胞中Hsa＿circ0000069的m6A修饰水平,以及METTL3敲低后Hsa＿circ0000069的m6A修饰变化。qPCR法验证METTL3对Hsa＿circ0000069表达的调节。放线菌素D实验检测METTL3敲低对Hsa＿circ0000069稳定性的影响,以及两个m6A修饰位点处m6A修饰分别对Hsa＿circ0000069稳定性的影响。制备Hsa＿circ0000069 m6A修饰位点单突变体和双突变体,然后通过Me-RIP和qPCR实验检测Hsa＿circ0000069两处m6A修饰之间的关系。3.Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069的细胞功能制备并通过qPCR验证Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069稳定敲低的细胞。制备Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069瞬间过表达细胞。采用细胞计数试剂盒-8（CCK8）和5-乙基-2′-脱氧尿苷（Ed U）检测Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069敲低和过表达细胞的增殖能力。将Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069敲低和过表达细胞进行顺铂和氟尿嘧啶处理,采用流式细胞术检测细胞凋亡,采用划痕和Transwell实验检测Hsa＿circ0000069敲低和过表达细胞的迁移能力。4.Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069分别靶向调节miR-548q和miR-4426,miR-548q靶向抑制L2的表达通过qPCR验证Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069分别对miR-548q和miR-4426的调节关系,以及miR-548q对HPV16小衣壳蛋白L2的调节关系。荧光素酶实验验证Hsa＿circ00063322与miR-548q,Hsa＿circ0000069与miR-4426,以及miR-548q与L2的结合位点。qPCR检测肿瘤和正常组织中miR-548q,miR-4426和L2的表达。5.Hsa＿circ00063322/miR-548q/L2和Hsa＿circ0000069/miR-4426信号通路的验证采用qPCR检测Hsa＿circ00063322过表达以及Hsa＿circ00063322和miR-548q同时过表达或者Hsa＿circ00063322敲低以及Hsa＿circ00063322和miR-548q同时敲低后L2表达变化,采用免疫荧光（IF）、Ed U、流式和Transwell实验检测miRNA过表达以及circRNA和miRNA同时过表达或者miRNA敲低以及circRNA和miRNA同时敲低后细胞的功能表型变化。研究结果1.CC组织和细胞中环状RNA Hsa＿circ00063322的表达显着上调,利用Hsa＿circ00063322表达能够准确的区分肿瘤和正常组织（ROC分析AUC=0.8597）。Hsa＿circ00063322具有高稳定性,主要分布在胞浆中。FOXA1是Hsa＿circ00063322的转录因子,与MYBL2（Hsa＿circ00063322亲本基因）启动子区在两个位点结合。2.制备Hsa＿circ00063322稳定敲低细胞系。Hsa＿circ00063322敲低可显着抑制CC细胞的增殖能力,并增加其对顺铂和氟尿嘧啶的敏感性;而Hsa＿circ00063322瞬时过表达可促进其增殖能力,并削弱其对顺铂和氟尿嘧啶的敏感性。3.Hsa＿circ00063322可与miR-548q靶向结合,并且调节miR-548q的表达。与癌旁正常组织相比,宫颈癌组织中miR-548q的表达显着降低,且miR-548q和Hsa＿circ00063322的组织表达水平负相关。4.miR-548q与L2转录本在两个位点结合,介导了Hsa＿circ00063322对L2表达的调节。Hsa＿circ00063322过表达阻遏了miR-548q的抑癌活性,而Hsa＿circ00063322敲低抑制了miR-548q抑制剂的促癌活性。5.CC组织和细胞中环状RNA Hsa＿circ0000069的表达显着上调,利用Hsa＿circ0000069表达能够准确的区分肿瘤和正常组织（AUC=0.7901）。Hsa＿circ0000069具有高稳定性,主要分布在胞浆中。6.相比正常宫颈细胞,CC细胞中Hsa＿circ0000069的m6A修饰水平显着升高。m6A修饰提高了Hsa＿circ0000069稳定性。Hsa＿circ0000069转录本中存在两处m6A修饰位点,二者的作用相互协同。7.制备Hsa＿circ0000069稳定敲低细胞系。Hsa＿circ0000069敲低显着抑制了CC细胞的增殖和迁移能力,而Hsa＿circ0000069瞬时过表达促进了CC细胞的增殖和迁移能力。8.Hsa＿circ0000069可与miR-4426靶向结合,并且调节miR-4426的表达。Hsa＿circ0000069过表达阻遏了miR-4426的抑癌活性,而Hsa＿circ0000069敲低抑制了miR-4426抑制剂的促癌活性。研究结论1.CC中,转录因子FOXA1促进了Hsa＿circ00063322的表达,Hsa＿circ00063322通过吸附miR-548q,防止了L2被降解,并促进了CC细胞的增殖能力,削弱了CC细胞对化疗药物的敏感性。2.CC中,m6A修饰提高了Hsa＿circ0000069的稳定性,Hsa＿circ0000069通过吸附miR-4426,促进了CC细胞的增殖和迁移能力。
柳思琪[5]（2020）在《外周血肿瘤相关天然自身抗体与非小细胞肺癌发病的关系研究》文中指出目的:肺癌在恶性肿瘤中的发病率与死亡率均位居前列,严重威胁着人类身心健康,实现肺癌的早期诊断对于肺癌患者的治疗和预后评估意义重大。目前临床工作中用于肺癌诊断的生物标志物众多,但其敏感性及特异性都不高,对于肺癌早期诊断和治疗仍有一定局限性。本研究组的前期研究中,已经筛选出一些与非小细胞肺癌相关的肿瘤抗原。本研究在此基础上进一步优化设计了一些新的肿瘤相关抗原,在单个抗原检测的基础上,探索进行肿瘤相关抗原的联合检测,以期寻找到对非小细胞肺癌早期诊断有高敏感性和高特异性的生物学标志物,并为非小细胞肺癌的治疗及预后评估提供一定的指导意义。方法:1.设计抗原多肽:从NCBI数据库检索HER2、MUC1、VEGFR1、ABCC5、MYC、TNF-α和POU5F1的完整氨基酸序列,利用生物信息学数据库和在线工具（http://www.iedb.org）设计并合成了7个线性抗原多肽,制备了9种抗体检测试剂盒,其中7种由单价抗原多肽制备而成,即HER2、MUC1、VEGFR1、ABCC5、MYC、TNF-α和POU5F1;另外2种分别由3个独立抗原多肽混合后制备而成,即HER2-MUC1-VEGFR1和CD25-MUC1-VEGFR1。其中CD25是在我们前期研究中发现的与非小细胞肺癌诊断和预后密切相关的生物标志物。2.检测血浆中天然自身抗体水平:选取211例未经任何抗癌治疗的首次诊断为非小细胞肺癌患者作为实验组研究对象,同期选取200例健康受试者作为对照组,利用ELISA方法检测并比较两组血浆中天然自身抗体水平。同时,将研究对象分别按照性别、年龄、肿瘤组织学类型及肿瘤分期进行分组,研究血浆中天然自身抗体水平与性别、年龄、肿瘤组织学类型及肿瘤分期的关系。3.筛选血浆:收集150例健康献血者的血浆,应用ELISA方法分别检测血浆中HER2、MUC1、VEGFR1天然自身抗体水平。选择天然自身抗体水平排名首位的健康献血者血浆命名为阳性组;选择天然自身抗体水平排名末位的健康献血者血浆命名为阴性组。上述两种血浆用于后期细胞培养。4.研究富含天然自身抗体的血浆对非小细胞肺癌细胞增殖的影响:应用富含和低含HER2、MUC1、VEGFR1天然自身抗体的血浆分别培养非小细胞肺癌细胞株A549和NCI-H2122,应用CCK-8测定两种细胞的增殖,计算细胞活度,研究富含三种天然自身抗体的血浆对非小细胞肺癌增殖的影响。5.检测非小细胞肺癌细胞中HER2、MUC1和VEGFR1 mRNA的表达:分别提取A549和NCI-H2122的总RNA,应用实时定量PCR方法检测两种肿瘤细胞的HER2、MUC1和VEGFR1 mRNA的表达。结果:1.成功设计并合成抗原多肽片段,序列如下:HER2: H-kllallppgaastqvctgtdm klrlpasp-OHMUC1: H-crynltisdvsvsdvpfpfsaqsgah-OHVEGFR1: H-dlklsctvnkflyrdvtwillrtvnnrtmhysi-OHABCC5: H-tstsgthrdredskfrrtrplecqdal-OHMYC: H-rvkldsvrvlrqisnnrkcfellptpplsps-OHTNF-α: H-cqlqwlnrranallangvelrdnqlv-OHPOU5F1: H-keleqfakllkqkritlgytqadvgltc-OHCD25: H-iyhfvvgqmvyyqcvqgyralhrgpaesve-OH2.天然自身抗体在非小细胞肺癌患者和健康对照组中的水平变化:（1）比较211例非小细胞肺癌患者和200例健康对照者血浆天然自身抗体水平,发现非小细胞肺癌患者血浆中抗VEGFR1、抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体（IgG）水平显着低于对照组（P<0.001）。（2）将非小细胞肺癌患者和健康对照组按照性别分组,分别进行分析,发现女性非小细胞肺癌患者,血浆抗MUC1、抗VEGFR1、抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体（IgG）水平均显着低于健康对照组（P<0.001）;男性非小细胞肺癌患者,血浆抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体（IgG）水平显着低于健康对照组（P<0.001）。（3）将非小细胞肺癌组和健康对照组按照年龄<60岁和≥60岁进行分组,发现非小细胞肺癌患者血浆抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体（IgG）水平在两个年龄组中均显着低于健康对照组（P<0.001）,抗VEGFR1天然自身抗体（IgG）水平仅在<60岁组显着低于健康对照组（P<0.001）。（4）将非小细胞肺癌患者根据组织学病理类型分为腺癌及鳞癌两组,研究发现,与健康对照组比较,腺癌患者（124例）血浆中抗HER2、抗MUC1、抗VEGFR1、抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体（IgG）水平均显着降低（P<0.001或P<0.05）,而鳞癌患者（87例）血浆中仅抗VEGFR1、抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体（IgG）水平显着降低（P<0.001或P<0.05）。（5）根据非小细胞肺癌临床分期,将非小细胞肺癌患者分为A组（I期和IIA期）、B组（IIB期）和C组（III期和IV期）三组。研究发现,与健康对照组比较,血浆抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体（IgG）水平在三组非小细胞肺癌患者中均显着降低（P<0.001）,抗VEGFR1天然自身抗体（IgG）水平在早期和晚期非小细胞肺癌患者中均显着降低（P<0.001;P<0.05）,抗MUC1天然自身抗体（IgG）水平仅在早期非小细胞肺癌中显着降低（P<0.05）。3.ROC曲线分析发现,确定特异性为95.0%时,抗VEGFR1、抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体（IgG）对非小细胞肺癌诊断的敏感性分别为19.0%、19.0%和42.2%,抗CD25-MUC1-VEGFR1三种抗原多肽联合的天然自身抗体（IgG）对早期非小细胞肺癌的检测敏感性高达49.6%。4.Kaplan-Meier生存分析发现,非小细胞肺癌患者血浆抗HER2、抗MUC1、抗VEGFR1、抗ABCC5、抗MYC、抗TNF-α、抗POU5F1、抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体（IgG）水平与非小细胞肺癌患者总生存期无关（P>0.05）。5.体外细胞学研究发现,经过抗HER2天然自身抗体（IgG）阳性血浆处理组,NCI-H2122细胞活力显着低于阴性血浆处理组（P<0.05）,A549细胞活力高于阴性血浆处理组（P<0.05）;经过抗MUC1或抗VEGFR1阳性血浆处理组,NCI-H2122细胞活力均显着低于阴性血浆处理组（P<0.001）,A549细胞活力无显着差异（P>0.05）。6.肿瘤相关基因表达研究发现,NCI-H2122细胞中HER2、MUC1和VEGFR1基因mRNA表达水平均显着高于A549细胞（P<0.001）。结论:1.非小细胞肺癌患者血浆中抗VEGFR1、抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体（IgG）水平显着低于健康对照组,提示血浆抗VEGFR1、抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体（IgG）水平可作为非小细胞肺癌的生物标记。2.非小细胞肺癌患者血浆中抗CD25-MUC1-VEGFR天然自身抗体（IgG）对早期非小细胞肺癌诊断的敏感性最高,达到49.6%。因此,抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体（IgG）联合检测有望成为非小细胞肺癌早期诊断新的生物标记。3.血浆中抗MUC1天然自身抗体（IgG）水平在早期非小细胞肺癌中显着降低,提示抗MUC1天然自身抗体（IgG）可能对早期非小细胞肺癌具有一定的诊断价值;在女性非小细胞肺癌患者显着低于健康对照组,提示抗MUC1天然自身抗体（IgG）水平可能对女性非小细胞肺癌患者具有一定的诊断意义。4.血浆中抗HER2和抗MUC1天然自身抗体（IgG）在肺腺癌患者中显着低于健康对照组,提示抗HER2和抗MUC1天然自身抗体（IgG）可能对肺腺癌具有一定的诊断价值。5.非小细胞肺癌患者血浆抗HER2、抗MUC1、抗VEGFR1、抗ABCC5、抗MYC、抗TNF-α、抗POU5F1、抗HER2-MUC1-VEGFR1和抗CD25-MUC1-VEGFR1天然自身抗体（IgG）水平与非小细胞肺癌患者总生存期无关,对判断非小细胞肺癌患者预后无指导意义。6.富含抗HER2、抗MUC1或抗VEGFR1天然自身抗体的血浆可显着抑制NCIH2122细胞增殖。提示含有天然自身抗体的血浆对非小细胞肺癌可能具有潜在的治疗作用。7.NCI-H2122细胞HER2、MUC1和VEGFR1 mRNA表达显着高于A549细胞,这就是为什么富含HER2、MUC1和VEGFR1天然自身抗体的血浆抑制NCI-H2122细胞增殖作用比A549细胞更强的原因。
陈晓晨[6]（2020）在《PD-1和TIM-3在耗竭T细胞介导B系淋巴瘤免疫逃逸中的作用机制及临床应用研究》文中认为研究背景及目的淋巴瘤是目前发病率最高的血液恶性肿瘤,严重威胁人类健康。淋巴瘤异质性强,病理分型复杂。弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是其中最常见的亚型,发病率约占所有淋巴瘤30%。R-CHOP方案作为标准一线方案应用临床,明显改善了DLBCL患者的疗效和生存,但复发难治（R/R）DLBCL仍然是临床面临的棘手问题。免疫治疗的临床应用,尤其是免疫检查点治疗和嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy,CAR-T）的突破性进展,给R/R DLBCL患者带来新的希望。程序性细胞死亡1受体（PD-1）是关键的免疫检查点分子之一。PD-1单抗治疗R/R霍奇金淋巴瘤的总反应率高达90%。然而,目前PD-1单抗治疗DLBCL的临床数据尚不多见,有待进一步探索和研究。此外,当前CAR-T治疗R/R DLBCL的临床试验也正在国内外广泛开展中。T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3（TIM-3）是另一个重要的免疫检查点分子。文献报道,PD-1单抗治疗后,患者效应T细胞诱导性表达TIM-3上调,这可能是PD-1单抗继发性耐药的机制之一。本课题关注于免疫治疗R/R DLBCL,拟探究T细胞表达PD-1水平对于DLBCL的临床意义;分析PD-1靶向阻断策略（PD-1单抗及PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞）临床治疗R/R DLBCL患者的疗效、安全性、预测生物标记物及耐药机制;并进一步探索PD-1单抗和TIM-3单抗联合治疗B系淋巴瘤的疗效和免疫学机制,为未来相关临床应用提供实验基础。研究方法（1）应用流式细胞仪检测DLBCL患者外周血（40例）和淋巴结（30例）T细胞亚群分布及其细胞表面PD-1表达情况;应用ELISA方法检测患者血浆（40例）可溶性PD-1及PD-L1水平及动态演变。将患者的上述指标与对照组（正常人群及淋巴结反应性增生患者）对比,分析PD-1（膜表达和可溶性表达）以及可溶性PD-L1在DLBCL发病机制中的作用;对DLBCL患者进行临床特征（病理亚型,IPI评分）亚组分析和生存分析,以进一步探究PD-1/PD-L1对DLBCL患者临床特征和生存的影响。（2）应用PD-1靶向阻断策略（PD-1单抗及PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞）治疗R/R DLBCL患者,观察疗效和毒副反应情况;并应用外显子基因捕获二代测序、寡核苷酸阵列芯片和免疫组化技术对患者淋巴结组织进行检测,以探寻PD-1靶向治疗相关的预测生物标记物;应用流式细胞仪监测患者治疗前后外周血T细胞表达PD-1和TIM-3的动态变化,以进一步探究PD-1靶向治疗耐药与耗竭T细胞可能的相关机制。（3）建立BALB/c小鼠A20细胞淋巴瘤皮下模型,观察肿瘤成瘤率及生长速度;分别应用阻断性PD-1单抗单药和PD-1单抗+TIM-3单抗联合方案治疗成瘤小鼠,观察各组治疗效果和生存情况;并应用CD8+磁珠分选、流式细胞仪、ELISA、CCK8等方法进一步探究PD-1+TIM-3单抗联合方案治疗的免疫学机制。研究结果（1）与正常对照组相比,初诊DLBCL患者外周血CD4+T细胞占CD3+T细胞的比例明显下降（45.47±10.07%VS.61.91±10.52%,P=0.036）,而CD8+T细胞比例则相应升高（43.99±9.32%VS.31.94±6.50%,P=0.045）,且CD4+T细胞及CD8+T细胞表达PD-1水平均明显上调（CD4+PD-1+:16.30±4.58%VS.8.96±2.95%,P=0.017;CD8+PD-1+:18.12±5.43%VS.10.13±3.30,P=0.023）。与淋巴结反应性增生患者相比,DLBCL患者淋巴结CD3+T细胞比例明显下降（23.55±15.62%VS.56.65±10.36%,P=0.002）;CD4+和CD8+T细胞占CD3+T细胞的比例差异无显着性（P>0.05）,但CD4+和CD8+T细胞表达PD-1水平均明显上调（CD4+PD-1+:45.95±11.61%VS.18.26±3.61%,P=0.001;CD8+PD-1+:55.11±13.45%VS.19.32±3.78%,P=0.001）。与正常对照组相比,DLBCL患者初诊时血浆可溶性PD-1明显上升（4.49±3.53ng/ml VS.0.47±0.36ng/ml,P=0.002）,PD-L1水平也明显上升（1.21±1.03ng/ml VS.0.26±0.24ng/ml,P=0.039）。对DLBCL患者进行临床特征亚组分析显示PD-1（膜表达和可溶性表达）以及可溶性PD-L1水平和患者临床特征（病理亚型,IPI评分）相关;生存分析显示PD-1（膜表达和可溶性表达）以及可溶性PD-L1高表达组的OS和PFS均明显低于低表达组（P<0.05）;动态分析患者血浆可溶性PD-1及PD-L1水平显示,其与患者病情状态密切相关。（2）应用PD-1靶向阻断策略（PD-1单抗及PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞）治疗R/R DLBCL,部分患者获得了明显疗效（PD-1单抗治疗ORR达33%;PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞治疗ORR达72%）,总体耐受性好,毒副反应较轻;外显子基因捕获二代测序和寡核苷酸阵列芯片分析提示患者肿瘤染色体及基因突变程度高者对PD-1单抗治疗更加敏感（P<0.05）;免疫组化提示肿瘤浸润T细胞数量或/和PD-L1表达高者,对PD-1单抗治疗反应更好（P<0.05）。患者治疗前后外周血T细胞表达PD-1和TIM-3呈动态变化,随着PD-1单抗治疗的进行,T细胞PD-1表达下调,但TIM-3表达上调,且疗效不佳组患者T细胞表达TIM-3上调更加明显（CD4+TIM-3+:29.12±3.52%VS.20.10±2.71%,P=0.001;CD8+TIM-3+:30.12±3.65%VS.19.93±3.52%,P=0.001）。（3）成功建立BALB/c小鼠A20细胞淋巴瘤皮下模型;PD-1单抗+TIM-3单抗联合组疗效和生存明显优于PD-1单抗单药组和对照组;免疫学机制研究提示:PD-1单与PD-1单抗单药组和对照组相比,PD-1+TIM-3单抗联合组瘤体中CD8+T细胞浸润增加（30.12±2.15%VS.14.94±1.42%VS.4.99±0.95%,P=0.001）,且其TIM-3表达明显下调（20.55±1.46%VS.60.14±2.98%VS.40.01±2.52%,P=0.001）;体外T细胞功能学实验提示PD-1+TIM-3单抗联合组瘤体中CD8+T细胞增殖及杀伤能力明显强于PD-1单抗单药组和对照组（P<0.05）;凋亡明显低于另外两组（P<0.05）;PD-1+TIM-3单抗联合组血浆IL-2、IFN-γ及TNF-α动态水平也明显高于另外两组（P<0.05）。结论（1）DLBCL患者T细胞表达PD-1上调和血浆可溶性PD-1/PD-L1水平升高在DLBCL发病机制中发挥重要作用;上述指标与患者临床特征（病理亚型,IPI评分）及生存（OS/PFS）密切相关;患者血浆可溶性PD-1及PD-L1水平动态变化与其病情状态密切相关,可将其作为DLBCL病情监测的潜在生物标记物。（2）应用PD-1靶向阻断策略（PD-1单抗及PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞）治疗R/R DLBCL总体耐受性好,毒副反应较轻,但仅对部分患者有效;外显子基因捕获二代测序、寡核苷酸阵列芯片分析及免疫组化分析提示:患者肿瘤突变程度、肿瘤浸润T细胞数量和肿瘤微环境PD-L1表达等因素,与PD-1单抗疗效密切相关,提示上述指标有可能成为预测PD-1单抗疗效的潜在生物标记物;PD-1单抗治疗后,患者效应T细胞将诱导性上调TIM-3分子表达,这可能是PD-1单抗继发性耐药的机制之一。（3）BALB/c小鼠A20细胞淋巴瘤皮下模型中,PD-1单抗+TIM-3单抗联合组的疗效及生存明显优于PD-1单抗单药组和对照组,从而提示:PD-1单抗和TIM-3单抗联合应用能够发挥更强的抗肿瘤作用。免疫学机制研究进一步揭示:PD-1+TIM-3单抗联合可以抑制效应T细胞的TIM-3诱导性表达,并通过增强CD8+T细胞增殖及杀伤能力、抑制CD8+T细胞凋亡、上调多种因子表达（IL-2、IFN-γ及TNF-α）等机制,避免T细胞耗竭从而增强T细胞抗肿瘤效应。
李振华[7]（2020）在《5-氮杂-2’-脱氧胞苷（DAC）增强MAGE-A10抗原肽表达并改善MAGE-A10特异性CTL杀伤肺癌细胞的研究》文中研究指明肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率居癌症死亡的首位,据世界卫生组织统计,每年约有176万人死于肺癌。由于绝大多数的肺癌患者在临床确诊时多属进展期或难以治愈的Ⅲb期或Ⅳ期,因此失去了手术根治的机会。而近些年来,随着免疫治疗在临床上的逐渐应用,其显示出了一定的优势,并对部分肺癌患者的预后产生了改善,因此被推荐为晚期肺癌标准治疗方案之一。其中肿瘤特异性T细胞是目前具有良好发展前景的免疫细胞,因此发掘能被T淋巴细胞识别的靶抗原是治疗的关键。癌睾丸抗原（cancer testis antigen,CTA）家族是目前已知的肺癌组织中重要的肿瘤相关抗原。癌睾丸抗原家族的表达模式具有相当程度的特异性:该蛋白家族内的成员在多种癌症中均有表达,如肺癌、乳腺癌、黑色素瘤,对于正常组织而言,癌睾丸抗原仅在睾丸细胞中表达,偶尔也可以在胎盘组织中被检测到,且睾丸拥有免疫豁免能力,不会被免疫系统识别并杀伤。因此,癌睾丸抗原家族是肿瘤免疫治疗的理想标靶。黑色素瘤抗原基因（melanoma antigen gene,MAGE）属于CTA亚家族,是一种肿瘤相关性抗原,其具有免疫原性及表达限制性。据研究显示,人类的MAGE家族基因位于X染色体上,其编码的肿瘤排斥抗原（tumor rejection antigen;TRA）,经过细胞内的加工从而产生抗原肽,并与人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）结合形成复合物,被自体细胞毒性T淋巴细胞特异性识别,能诱导对肿瘤细胞具有特异性杀伤能力的细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocyte,CTL）。MAGE家族的表达模式和CTA家族相同,在多种肿瘤细胞中均有表达,如乳腺癌、黑色素瘤、食管癌、结直肠癌,且在大多数正常组织中不表达。本研究认为,MAGE家族有极大的潜力作为CTL介导肿瘤特异性免疫治疗的预备标靶。对于MAGE家族的深入研究和理解有助于肺癌的分子生物学诊断和个体化分子靶向治疗。树突状细胞（dendritie cells,DC）是非单核吞噬细胞中的一种,是人体内已知的功能最强的抗原呈递细胞（Antigen-presenting cells,APC）,抗肿瘤免疫的产生依赖于DC细胞对肿瘤抗原的捕获与加工处理,随后将抗原信息呈递给淋巴组织内的未成熟T细胞并激活机体的特异性抗肿瘤免疫反应。具有肿瘤特异性的细胞毒T细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）具有杀伤能力强、增殖活性强等特点。本研究拟通过MAGE-A10抗原肽与DC细胞共同培养并诱导肿瘤特异性CTL细胞,以有效杀伤癌细胞株。有学者使用与MAGE家族基因序列相似的共同表位肽进行了类似研究,证明了这个短肽对于肿瘤细胞的诱导杀伤能力。抗肿瘤免疫治疗不仅受限于肿瘤细胞表面免疫原性强弱还受到肿瘤特异性抗原的表达量和表达率的限制。靶抗原在肿瘤细胞表面表达是以肽为基础免疫治疗的核心,提升靶抗原的表达量在一定程度上可改善肿瘤免疫治疗的效果。5-氮-2’-脱氧胞苷（5-aza-2’-deoxycytidine or DAC）是一种特异性的甲基化抑制剂,可以降低甲基化水平,应用该药物可以使MAGE-A10表达量升高。因此,本研究采用DAC处理肺癌细胞株,以期望能诱导MAGE-A10的表达升高。目前在肺癌中,高表达的MAGE-A10与患者临床病理学参数及患者生存之间的关系尚无定论。且将MAGE-A10抗原肽及去甲基药物DAC免疫疗法用于肺癌的免疫治疗的研究尚未见报道。因此,本课题设计MAGE-A10抗原肽联合去甲基药物DAC肺癌的体外杀伤作用进行研究。通过免疫组织化学法检测肺癌组织中MAGE-A10在蛋白水平的表达情况,探讨MAGE-A10的表达与患者临床病理特征的关系,通过Kaplan-Meier Plotter在线公共数据库进行生存分析,验证MAGE-A10对肺癌患者预后的影响,在不同的肺癌原代细胞及细胞系中验证去甲基药物DAC是否可以诱导肺癌细胞表面MAGE-A10表达的增加,在去甲基化药物处理过的肺癌细胞系中验证MAGE-A10特异性CTL对去甲基化药物诱导的肺癌细胞的杀伤效果。第一部分MAGE-A10抗原在人肺癌组织的表达及临床意义目的:采用免疫组织化学法,研究MAGE-A10抗原在肺癌患者组织中的表达及其与临床病理参数的相关性,为MAGE-A10抗原肽参与肿瘤免疫治疗建立理论基础。方法:1.免疫组织化学法检测MAGE-A10抗原在正常肺组织中和肺癌组织中的表达。2.分析MAGE-A10抗原表达与患者临床病理参数的相关性。3.采用Kaplan-Meier生存分析法,分析肺癌患者MAGE-A10抗原阳性表达与患者5年总生存率情况。结果:1.免疫组织化学检测结果显示,MAGE-A10蛋白在正常肺组织中阳性表达率低,阳性表达4例,阴性表达26例,阳性表达率为13.3%,在肺癌组织中阳性表达率高,阳性表达198例,阴性表达218例,阳性表达率为47.6%,在肺癌细胞质和细胞核均有表达。2.统计结果显示,MAGE-A10蛋白的表达与肺癌患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤临床分期、没有相关性,（P>0.05）,与淋巴结转移（6.81,0.0090）、复发转移（4.64,0.0313）具有相关性（P<0.05）。3.MAGE-A10分子阳性表达的肺癌患者较阴性表达患者5年总生存率更低。Log Rank检验结果P=5.002e-10。结论:MAGE-A10抗原在肺癌组织呈阳性表达,正常肺组织少有表达,提示MAGE-A10抗原可以作为肺癌免疫治疗的靶抗原。MAGE-A10可能与肺癌患者的不良预后相关。第二部分MAGE-A10抗原在人肺癌细胞系和原代细胞的表达及MAGE-A10的生物信息学分析目的:研究MAGE-A10在人肺癌细胞系及原代细胞中的表达状况;使用生物信息学方法分析MAGE-A10表达与患者生存的关系。方法:1.通过q RT-PCR和Western blot技术检测人类肺癌细胞系A549和H1975及原代细胞L228、L419及L329细胞中MAGE-A10的表达。2.从Kaplan-Meier Plotter在线公共数据库（http://www.kmplot.com）获得1926例OS样本,344例FP样本,982例PPS样本,并进行生存分析。结果:1.在肺癌细胞系中,A549细胞中的MAGE-A10 m RNA呈低水平表达,而在H1975细胞中呈高水平表达;在肺癌原代细胞中,L329细胞中的MAGE-A10 m RNA呈低水平表达,而在L228及L419细胞中呈高水平表达。2.基于开放的公共数据库Kaplan-Meier Plotter的分析结果显示,高表达MAGE-A10的肺癌患者其总生存期、进展后生存期及首次进展时间均短于MAGE-A10低表达的患者（P<0.05）。结论:1.H1975、L228及L419细胞中MAGE-A10 m RNA呈高水平表达,A549细胞及L329细胞呈低表达水平。2.MAGE-A10高表达的肺癌患者其总生存期、进展后生存期及首次进展时间均短于MAGE-A10低表达的患者。第三部分去甲基化药物对MAGE-A10特异性CTL杀伤活性及对肺癌细胞杀伤效应影响的研究目的:研究去甲基化药物DAC对MAGE-A10特异性CTL杀伤活性及对肺癌细胞杀伤效应影响。方法:1.通过q RT-PCR和Western blot技术检测去甲基化药物DAC处理后肺癌细胞H1975、L228、L419、A549及L329细胞中MAGE-A10 m RNA和蛋白的表达。2.ELISA法检测MAGE-A10共同抗原特异性CTL与肺癌组织原代细胞混合培养上清中IFN-γ分泌水平。3.细胞毒性实验检测MAGE-A10特异性CTL对肺癌组织原代细胞杀伤效应的影响。结果:1.去甲基化药物DAC可诱导H1975细胞、L228细胞及L419细胞MAGE-A10表达量增加,且MAGE-A10蛋白表达量和m RNA量呈剂量依赖性。2.IFN-γ释放实验结果显示同时加入MAGE-A10抗原肽与DAC组IFN-γ分泌水平有显着升高,且效靶比越高,IFN-γ分泌水平越高（P<0.05）。3.细胞毒性实验结果显示,在同一效靶比下MAGE-A10抗原肽+DAC组杀伤效率最高。效靶比为40:1时杀伤效率最高。结论:1.去甲基化药物DAC可诱导H1975细胞、L228细胞及L419细胞MAGE-A10表达量增加。2.去甲基化药物DAC能够增强MAGE-A10共同抗原肽特异性CTL对H1975细胞、L228细胞及L419细胞的杀伤功能。
王伟[8]（2019）在《蛋白质芯片在肿瘤标志物筛查中的应用以及利用SELEX技术筛选CD20/486的ssDNA适配体的研究》文中提出目的:肿瘤的快速筛查和治疗是当前医学界的难题,本研究旨在利用高灵敏度化学发光蛋白质芯片技术（iPDMS蛋白芯片）,实现对低丰度的多种肿瘤相关标记物的高效筛选。分析筛选所得到的多种肿瘤相关性标志物,选择其中在8种常见肿瘤细胞中差异表达的CD20作为研究对象,设计和筛选CD20核酸适配体,探讨其检测肿瘤作用,为进一步利用CD20适配体在临床肿瘤靶向治疗奠定基础。方法:1.iPDMS芯片的制备和检测:在传统的聚二甲基硅氧烷（PDMS）材料中加入带烯烃末端的、表面引发聚合反应的引发剂,并通过热交联（硅氢键键合）固定到PDMS的三维结构中,得到一种新的材料即改性硅胶iPDMS。通过表面引发的原子转移自由基聚合反应（SI-ATRP）从活性引发位点处合成poly（OEGMA）高分子刷,即能得抗蛋白质非特异性吸附的iPDMS材料,利用喷点打印技术将肿瘤相关的抗原高通打印于芯片的特定区域,并组装成48孔的iPDMS芯片微孔板。应用iPDMS芯片对1152例临床常见肿瘤患者和192例体检健康者进行了两轮芯片筛查,检测血清样本的肿瘤相关的自身抗体。2.CD20核酸适配体的筛选:通过指数富集的配基系统进化技术（Systematic evolution ofligands by exponential enrichment,SELEX）筛选获得特异性和高亲合力结合肿瘤细胞表面分子标志CD20（Cluster of Differentiation,CD20）主要膜外区和胞质区片段CD20/486的ssDNA适配体（apatmers）,检测和分析所筛选的CD20/486适配体的序列和构象;适配体与靶分子的结合能力以及病理组化染色中的应用,为进一步利用CD20/487适配体在临床肿瘤靶向治疗和诊断奠定基础。本研究先在基因库中查找到人源的CD20基因全序列,找到包括全部膜外区序列的近C端486bp的核苷酸序列,根据密码子简并性将部分密码子进行修改,使之能在原核中表达,再将CD20/486构建到pGEX-4T中,融合表达GST-CD20/486蛋白。运用SELEX技术对融合表达的GST-CD20/486蛋白进行筛选,并用GST蛋白进行反筛。实验首先构建一个长度为80bp含有40个随机序列的单链DNA（ssDNA）文库,PCR扩增为双链DNA（dsDNA）随机文库后,作为初始模板保存,用不对称PCR扩增出每轮筛选的ssDNA随机库作为下一轮筛选适配体库。经10轮筛选后,将ssDNA扩增成dsDNA,连接到T载体上,测序后利用DNAMAN软件对所测定的序列进行序列一级结构和二级结构分析及同源性比较;酶联免疫吸附法（ELISA）方法检测单适配体与纯化的GST-CD20/486蛋白结合能力,流式细胞仪（FCM）检测单适配体与GST-CD20/486蛋白的亲和力。将亲和力最大的适配体用生物素标记后,用于临床肿瘤病理标本组化染色,用SABC试剂显色,同时做常规HE染色作为对照,确定筛选所得到的适配体用于肿瘤诊断的效果。结果:1.建立了用于肿瘤筛查的iPDMS芯片技术方法,检测1152例临床确诊的肿瘤样本,研究发现CD20、VEGF1、VEGF121和VEGF在常见8种肿瘤患者（乳腺癌、肺癌、直结肠癌、胃癌、肝癌、白血病、卵巢癌和淋巴瘤）中差异表达,血清中VEGF1、VEGF121和VEGF对应的抗体水平明显高于体检健康对照组,抗CD20抗体水平明显低于体检健康对照组,两者具有统计学意义（P<0.05）。2.将CD20蛋白C端486bp基因修改后,成功在原核细胞中表达并纯化出GST-CD20/486蛋白,并利用SELEX技术筛选得到特异性结合CD20/486的适配体。将第10轮筛选得到的适配体克隆到T载体得到22个单克隆的测序结果,命名为SW1至SW22,其中单适配体SW11表现出与CD20/486蛋白最强的的结合能力,解离常数（Kd）为28±6nM。3.生物素标记的单适配体SW11能与肿瘤病理切片中的肿瘤细胞CD20结合,CD20适配体在常见肿瘤中免疫组化结果阳性。结论:1.成功构建了一种化学发光标记的iPDMS蛋白芯片,可用于肿瘤相关的抗体或自身抗体的筛查。本研究在常见肿瘤筛查得到的CD20抗体可作为潜在的肿瘤标志物,可为肿瘤的诊断和机理分析提供切入点。2.本研究成功应用SELEX技术筛选得到与GST-CD20/486蛋白特异性结合的ssDNA适配体SW11,有望作为肿瘤检测的新型诊断试剂,并且为进一步进行临床靶向治疗奠定了基础。
李军旗[9]（2019）在《胶质母细胞瘤多基因预后预测方法的建立及CDC45蛋白功能及机制研究》文中认为目的:胶质母细胞瘤是最常见、恶性程度极高的中枢神经肿瘤,呈浸润性生长、复发率高,生存期短。传统的预后判定方法不能准确的给出患者的预后情况,故不能在标准治疗方案的基础上准确、有效的引入免疫治疗。CDC45作为多种肿瘤的分子标记与肿瘤的大小、肿瘤分级及不良预后等有密切关系,但其在胶质母细胞瘤中的机制尚不明确。因此,本研究以胶质母细胞瘤临床样本为起点,分析了样本肿瘤相关基因表达情况,在分子水平上建立预后评估的数学模型,客观、准确、有效的评价了胶质母细胞瘤患者的预后状况,为临床开展有效的治疗方案提供指导和理论依据。同时分别在体内、体外对CDC45进行功能和机制的研究,确定了其在胶质母细胞瘤增殖、迁移及侵袭等方面的重要作用,并通过虚拟筛选得到靶向抑制CDC45的小分子药物,为肿瘤发生、发展机制的更进一步认识及胶质母细胞瘤靶向治疗提供实验依据。方法:1.选用广东三九脑科医院病理证实为胶质母细胞瘤的44例临床样本,采用qRT-PCR的方法进行44例肿瘤组织及10例正常脑组织的87个肿瘤相关抗原和8个肿瘤微环境基因的特异性扩增。采用基于R语言的LASSO模块及COX风险回归模型,经过交叉验证最终确定以基因表达为基础的线性数学模型,并通过逐步引入临床信息的方式提高公式的准确性、敏感性。然后以临床样本及TCGA数据验证公式的适用性、准确性。2.通过测序及TCGA数据库分析CDC45在胶质母细胞瘤中表达情况。在细胞水平（LN229,U251）通过CCK8、Transwell迁移和侵袭实验及划痕实验确定CDC45在细胞增殖、迁移和侵袭方面的功能。移植瘤体内实验模型进一步确定CDC45在体内对肿瘤生长的重要作用。通过虚拟筛选的方法确定能够与CDC45结合的小分子化合物,体外及体内实验验证抑制剂对胶质母细胞瘤的抑制作用,在计算机水平评估小分子化合物与CDC45的结合能力并通过丙氨酸扫描等方法确定关键氨基酸。结果:1.多基因抗原的检测及预后预测分析对44例胶质母细胞瘤及10例正常脑组织进行87个TAAs和8个TME基因的检测,结果显示不同的患者中基因表达情况存在个体差异。不仅存在几乎所有的肿瘤患者都高表达的MELK、YKL39、YKL40等基因,也存在诸如CD133、FABP7等呈现差异表达的基因,同时也存在Trp2、XAGE1b等在各个肿瘤中都相对正常组织低表达的基因。通过对基因表达与生存的相关性分析,建立了能准确预测预后的数学模型（Y1-Y5）,同时在TCGA数据库中验证了我们所得到的数学模型的准确性及敏感性。2.CDC45在胶质母细胞瘤的功能及机制研究通过临床样本测序的方法确定CDC45的表达与不良预后呈正相关,在对多种肿瘤数据分析中发现CDC45在多种恶性肿瘤中的表达显着高于正常组织。胶质母细胞瘤细胞系LN229及U251在过表达CDC45的情况下显着提高了肿瘤细胞在增殖、迁移及侵袭方面的能力,相反在沉默CDC45基因表达的情况下,细胞在增殖、迁移及侵袭方面的能力被抑制。裸鼠体内移植瘤模型也显示了相同的结果。过表达CDC45的LN229及U251细胞测序结果显示,基因富集及信号通路分析CDC45与肿瘤的免疫方面显着相关,进一步的研究显示CDC45通过NF-κB信号通路调节肿瘤的发生、发展。通过蛋白芯片确定在过表达CDC45的GBM细胞及培养上清中显着高表达IL-1β蛋白,而基因富集及信号通路的分析靶向NF-κB信号通路。这表明CDC45可能通过调节NF-κB/IL-1β通路,促使肿瘤的发生、发展和转移。通过虚拟筛选得到CDC45小分子抑制剂JQ-16,该小分子与CDC45亲和力高(KD=1.17×10-11,EC50=15.42/14.84μM),在细胞及体内模型中能够显着抑制GBM肿瘤细胞在增殖、迁移及侵袭方面的能力。结论:通过qRT-PCR的方法快速分析患者基因表达情况,在具有表达共性的同时表现出高度的个体化差异。通过线性回归的方法建立数学模型,并通过临床病例及TCGA数据库验证公式的适用性和准确性,能客观的评价患者预后情况。CDC45通过NF-κB/IL-1β通路,促进肿瘤的增殖、侵袭和迁移。鉴于NF-κB通路及IL-1β在免疫调节方面的重要作用及细胞测序结果,CDC45在影响肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力的同时可能也通过NF-κB/IL-1β调节肿瘤细胞的肿瘤微环境中的免疫逃逸机制。通过虚拟筛选、分子动力学等方法筛选得到特异性结合CDC45的候选小分子化合物,并通过CCK8等实验方法初步筛选,得到JQ-16化合物,该化合物能显着抑制GBM肿瘤细胞在增殖、侵袭和迁移的能力。为GBM的靶向治疗提供理论依据。
陈静[10]（2019）在《抗BAP31胞内抗体的筛选及其抗胃癌作用机制研究》文中研究指明胃癌（Gastric cancer,GC）是全球第4大肿瘤死因,多数患者就诊时已是晚期。化疗虽然能够适当的使肿瘤患者的生存期延长,但是其副作用较为明显。随着对胃癌的各种信号通路的逐渐认识,在分子水平抑制肿瘤生长的治疗受到人们越来越多的关注。胃癌是一种异质性疾病,分子靶点较少。近年来研究发现BAP31是一种新的肿瘤相关抗原,在多种癌症中高表达,并且可以促进一些癌症的发生发展。本文通过Oncomine和GCBI数据库分析发现BAP31在胃癌组织中高表达,胃癌细胞中也验证了此结果。通过抗体芯片分析BAP31与肿瘤相关因子的关系,发现BAP31与p27kip1呈负相关,与EpCAM呈正相关。进一步研究发现BAP31与p27kip1相互作用并且调节其蛋白酶体降解。p27kip1在细胞的生长发育中扮演重要角色,除了调节细胞周期进程,在细胞凋亡与分化中也具有重要作用。抑制p27kip1的降解可能会杀伤胃癌细胞。细胞内抗体是指将小分子抗体基因添加定位信号序列,使其在细胞内特定部位表达,可以中和或调节位于特定亚细胞部位的活性分子或触发免疫反应。细胞内抗体技术作为一种新的基因治疗手段,在神经系统疾病、肿瘤及HIV/AIDS等治疗方面展示了广泛的应用前景。本文利用噬菌体展示技术从人源单域抗体库中筛选得到BAP31的特异性单域抗体基因,添加内质网信号序列,成功构建了内质网滞留型的胞内抗体。其中VH-D1可以特异地阻碍BAP31与p27kip1的相互作用,抑制p27kip1的蛋白酶体降解。本文对VH-D1是否通过抑制p27kipl降解而杀伤胃癌细胞进行了研究。通过体内外实验,结果显示VH-D1通过抑制胃癌细胞增殖、诱导细胞凋亡,抑制了胃癌细胞异种移植在裸鼠体内的生长。胃癌干细胞,是胃癌复发和转移的主要原因。CD44是最早发现的胃癌干细胞标志物。近年来研究发现,CD47也可以作为胃癌干细胞的一个标记物。利用流式细胞分离技术分离出CD44+CD47high细胞。通过Real-Time PCR、Western blot及细胞克隆球形成实验,证明CD44+CD47high具有胃癌干细胞特性。考察VH-D1对胃癌干样细胞的杀伤作用,结果显示,VH-D1可以抑制胃癌干样细胞的干性相关因子的表达,并且抑制了其自我更新和增殖能力。此外,BAP31胞内抗体VH-F12可以特异性的降低EpCAM的表达,诱导MKN-45细胞周期阻滞在G1期,并且诱导细胞产生自噬,抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路。综上所述,本论文的研究结果证明,BAP31的胞内抗体VH-D1通过阻碍BAP31与p27kip1的相互作用,抑制了p27kip1的蛋白酶体降解,使胃癌细胞周期阻滞在G1期并且诱导了胃癌细胞的凋亡,抑制了胃癌细胞在鼠内的生长,VH-D1还可以抑制胃癌干样细胞的增殖和更新。此外,VH-F12可以抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导细胞产生自噬。为胃癌的治疗策略提供了新的思路和理论基础。
二、肺癌单抗识别的肿瘤相关抗原特性分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肺癌单抗识别的肿瘤相关抗原特性分析（论文提纲范文）
（1）泛实体瘤相关抗原图谱的构建及其在抗体偶联药物和嵌合抗原受体T细胞上的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 抗体偶联药物的知识现状 |
| 引言 |
| 1.1.1 ADC发展简史 |
| 1.1.2 获得监管批准的上市ADC |
| 1.1.3 临床试验中的在研ADC及其靶标图谱 |
| 1.1.4 抗体骨架和靶标的选择 |
| 1.1.5 连接子类型和偶联技术 |
| 1.1.6 有效载荷 |
| 1.1.7 ADC在体内的工作原理 |
| 1.1.8 ADC对难治性癌症的治疗 |
| 1.1.9 ADC的毒性问题 |
| 1.1.10 ADC耐药机制 |
| 1.1.11 未来展望 |
| 1.2 嵌合抗原受体T细胞的知识现状 |
| 引言 |
| 1.2.1 CAR-T发展简史 |
| 1.2.2 CAR-T细胞的工作原理 |
| 1.2.3 CAR和T细胞受体的结构 |
| 1.2.4 获得监管批准的CAR-T |
| 1.2.5 CAR-T细胞疗法的毒性 |
| 1.2.6 未来挑战、机会和应用 |
| 1.3 本课题的研究目标 |
| 第二章 基于多组学构建泛实体瘤相关抗原图谱 |
| 引言 |
| 2.1 数据采集与分析方法 |
| 2.1.1 正常组织转录组和蛋白组的数据采集 |
| 2.1.2 蛋白质亚细胞定位数据的采集与编译 |
| 2.1.3 人体组织器官的重排与映射 |
| 2.1.4 正常组织的表达及其分级 |
| 2.1.5 基因在肿瘤及其癌旁组织之间的差异表达分析 |
| 2.1.6 基因在肿瘤与其他正常组织之间的差异表达分析 |
| 2.1.7 肿瘤组织转录组、基因组和表型数据的编译 |
| 2.1.8 功能相关突变的注释 |
| 2.1.9 预测肿瘤相关抗原的蛋白过表达率 |
| 2.1.10 肿瘤相关抗原与癌细胞功能状态的相关性分析 |
| 2.1.11 基因集富集得分分析 |
| 2.1.12 临床试验的检索策略 |
| 2.1.13 统计分析 |
| 2.2 分析结果 |
| 2.2.1 组装综合数据集并通过算法识别肿瘤相关抗原 |
| 2.2.2 肿瘤相关抗原的表达谱与差异表达谱 |
| 2.2.3 肿瘤相关抗原的异质表达谱 |
| 2.2.4 预测肿瘤相关抗原的蛋白过表达率 |
| 2.2.5 癌症驱动基因变异全景 |
| 2.2.6 候选肿瘤相关抗原的组合评估 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 靶向CDH17 的新型ADC的制备及抗结直肠癌活性研究 |
| 引言 |
| 3.1 实验动物 |
| 3.2 实验仪器及试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 TCGA与 GTEx中 CDH17的m RNA数据的获取与分析 |
| 3.3.2 免疫原的设计与制备 |
| 3.3.3 制备靶向CDH17 的单克隆抗体的免疫方案 |
| 3.3.4 抗体可变区基因测序 |
| 3.3.5 鼠-人嵌合抗体的构建与表达纯化 |
| 3.3.6 抗体结合亲和力的测定 |
| 3.3.7 CDH17 靶向抗体偶联vc MMAE |
| 3.3.8 细胞内吞实验 |
| 3.3.9 细胞膜蛋白的提取 |
| 3.3.10 免疫沉淀 |
| 3.3.11 免疫沉淀产物的银染 |
| 3.3.12 蛋白免疫印迹 |
| 3.3.13 免疫组化 |
| 3.3.14 免疫荧光 |
| 3.3.15 流式细胞实验 |
| 3.3.16 体外细胞毒性实验 |
| 3.3.17 体内抑瘤活性实验 |
| 3.3.18 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 CDH17 在消化道肿瘤和正常组织中的表达 |
| 3.4.2 CDH17 靶向抗体的多重表征 |
| 3.4.3 CDH17 靶向ADC的制备与表征 |
| 3.4.4 CDH17 靶向ADC在体外的抗肿瘤活性 |
| 3.4.5 CDH17 靶向ADC在 KM12SM结肠癌异种移植模型中的抗肿瘤活性 |
| 3.4.6 CDH17 靶向ADC在 COLO205 结肠癌异种移植模型中的抗肿瘤活性 |
| 3.4.7 荷瘤小鼠对CDH17 靶向ADC的耐受性 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 靶向LYPD3的CAR-T细胞的抗肺腺癌活性研究 |
| 引言 |
| 4.1 实验动物 |
| 4.2 试剂耗材及设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 TCGA与 GTEx中 LYPD3 m RNA数据的获取与分析 |
| 4.3.2 抗体人源化 |
| 4.3.3 慢病毒包装 |
| 4.3.4 CD3+T细胞的复苏与激活 |
| 4.3.5 CD3+T细胞慢病毒感染 |
| 4.3.6 CAR-T细胞分化与耗竭的检测 |
| 4.3.7 CAR-T体外细胞杀伤 |
| 4.3.8 CAR-T体内活性实验 |
| 4.3.9 细胞因子的检测 |
| 4.3.10 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 LYPD3 蛋白在肿瘤和正常组织中的表达 |
| 4.4.2 LYPD3 靶向的CAR-T细胞的体外抗肿瘤活性 |
| 4.4.3 LYPD3 靶向的CAR-T细胞在PC9 肺腺癌异种移植模型中抗肿瘤活性 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）肺癌免疫治疗相关不良反应的多组学生物标记物探究与预测模型建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 一、肺癌的免疫治疗与免疫相关不良反应 |
| 二、免疫相关不良反应的生物标记物研究现状 |
| 三、免疫相关不良反应与免疫治疗疗效的相关性 |
| 四、研究目的 |
| 一、研究方法 |
| 第一部分:回顾性队列研究 |
| 第二部分:meta分析 |
| 二、研究结果 |
| 第一部分:回顾性队列研究 |
| 第二部分:meta分析 |
| 三、讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 综述: 免疫相关不良反应发病机制的研究现状 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）抗肿瘤药物浓度分析新方法及结直肠癌早期诊断标志物研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词索引 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 建立FCN-411和特瑞普利单抗的检测方法 |
| 研究背景 |
| 第一章 建立和验证人血浆中FCN-411浓度检测的UPLC-MS/MS方法 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第二章 建立和验证人血浆中特瑞普利单抗浓度检测的UPLC-MS/MS方法,并与ECLIA法进行比较 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 结直肠癌早期检测相关的血浆自身抗体研究 |
| 研究背景 |
| 第一章 Anti-p53自身抗体对结直肠癌诊断价值的meta分析 |
| 1. 资料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 第二章 应用高通量蛋白芯片筛选和验证与结直肠癌早期检测相关的自身抗体研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 文献综述 结直肠癌血清自身抗体研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）Hsa＿circ0006332和Hsa＿circ0000069调控宫颈癌发展的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 Hsa_circ00063322 吸附miR-548q促进宫颈癌细胞增殖、减弱药物敏感性并调节HPV L2 表达 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 相关实验仪器及材料 |
| 2.1.2 实验步骤与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 宫颈癌中Hsa_circ00063322 的表达特征及转录调节 |
| 2.2.2 Hsa_circ00063322 影响CC细胞增殖和药物敏感性,以及在体肿瘤生长 |
| 2.2.3 Hsa_circ00063322 作为miRNAs海绵吸附miR-548q |
| 2.2.4 Hsa_circ00063322 通过miR-548q调节L2 表达,以及细胞增殖和药物敏感性 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 Hsa_circ0000069 通过吸附miR-4426 促进宫颈癌细胞增殖和迁移 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 相关实验仪器及材料 |
| 3.1.2 实验步骤与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 宫颈癌中Hsa_circ0000069 的表达特征 |
| 3.2.2 m6A修饰提高了Hsa_circ0000069 转录本的稳定性 |
| 3.2.3 Hsa_circ0000069 促进宫颈癌细胞增殖和迁移 |
| 3.2.4 Hsa_circ0000069 通过吸附miR-4426 促进宫颈癌细胞增殖和迁移 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 妇科肿瘤分子标志物及其个体化精准医疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间学术成果 |
| 致谢 |
（5）外周血肿瘤相关天然自身抗体与非小细胞肺癌发病的关系研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肺癌概述 |
| 1.1.1 肺癌流行病学 |
| 1.1.2 肺癌的危险因素 |
| 1.1.3 肺癌病理分型 |
| 1.1.4 肺癌分期 |
| 1.1.5 早期肺癌的诊断及筛查方法 |
| 1.1.6 肺癌治疗 |
| 1.2 肿瘤免疫 |
| 1.2.1 肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME) |
| 1.2.2 免疫耐受(immunologic tolerance) |
| 1.2.3 肿瘤免疫逃逸(tumor immune escape) |
| 1.3 天然抗体 |
| 1.3.1 天然抗体概述 |
| 1.3.2 IgM天然抗体的特点和作用 |
| 1.3.3 IgG和 IgA天然抗体的特点和作用 |
| 1.3.4 天然抗体与肿瘤 |
| 1.4 肿瘤抗原 |
| 1.4.1 肿瘤抗原概述 |
| 1.4.2 肿瘤抗原的筛选方法 |
| 1.4.3 抗原多肽和免疫信息学 |
| 1.5 本研究相关的抗原 |
| 1.5.1HER2 |
| 1.5.2 MUC1 |
| 1.5.3 VEGFR1 |
| 1.5.4 ABCC5 |
| 1.5.5 MYC |
| 1.5.6 TNF-α |
| 1.5.7 POU5F1 |
| 1.6 小结 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验样本 |
| 2.1.1 人体血浆样本来源 |
| 2.1.2 肺癌患者纳入及排除标准 |
| 2.1.3 样本预处理、分装与保存 |
| 2.1.4 细胞样本来源 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验试剂 |
| 2.3.1 实验试剂及试剂盒 |
| 2.3.2 常用实验试剂配制 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 抗原的选择和设计 |
| 2.4.2 抗原合成 |
| 2.4.3 检测天然自身抗体在血浆中的水平-ELISA方法 |
| 2.4.4 筛选富含和低含天然自身抗体血浆 |
| 2.4.5 细胞培养 |
| 2.4.6 RNA提取 |
| 2.4.7 反转录获得cDNA |
| 2.4.8 实时定量PCR分析 |
| 2.4.9 CCK-8 细胞增殖实验 |
| 2.5 数据处理与分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 抗原的设计 |
| 3.2 肺癌组及健康对照组基本信息 |
| 3.3 肺癌组随访信息 |
| 3.4 血浆天然自身抗体水平分析 |
| 3.4.1 抗体水平正态性检验 |
| 3.4.2 抗体水平在NSCLC和健康对照中的差异 |
| 3.5 天然自身抗体水平与NSCLC患者生存期的关系 |
| 3.6 富含天然自身抗体的血浆对NSCLC细胞增殖的影响 |
| 3.6.1 富含天然自身抗体HER2 的血浆对体外培养的肺癌细胞增殖的影响 |
| 3.6.2 富含天然自身抗体MUC1 的血浆对非小细胞肺癌细胞增殖的影响 |
| 3.6.3 富含天然自身抗体VEGFR1 的血浆对非小细胞肺癌细胞增殖的影响 |
| 3.7 HER2、MUC1和VEGFR1 m RNA在 NSCLC细胞中的表达 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 外周血天然自身抗体作为肿瘤生物学标志物的意义 |
| 4.2 肺癌患者外周血天然自身抗体水平变化的临床意义 |
| 4.2.1 抗HER2 IgG水平变化的临床意义 |
| 4.2.2 抗MUC1 IgG水平变化的临床意义 |
| 4.2.3 抗VEGFR1 IgG水平变化的临床意义 |
| 4.2.4 天然自身抗体联合检测水平变化的临床意义 |
| 4.2.5 其他天然自身抗体水平变化的临床意义 |
| 4.3 富含天然自身抗体血浆对NSCLC细胞的作用 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）PD-1和TIM-3在耗竭T细胞介导B系淋巴瘤免疫逃逸中的作用机制及临床应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 外周血和淋巴结中T细胞PD-1表达以及血浆中可溶性PD-1和PD-L1水平动态变化对弥漫大B细胞淋巴瘤患者预后影响的分析研究 |
| 一、外周血和淋巴结中T细胞PD-1表达对弥漫大B细胞淋巴瘤患者预后影响的分析研究 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 二、血浆中可溶性PD-1和PD-L1水平动态变化对弥漫大B细胞淋巴瘤患者预后影响的分析研究 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 第二部分 PD-1阻断策略临床应用于难治/复发弥漫大B细胞淋巴瘤的疗效和安全性分析及其预后生物标记物和耐药机制研究 |
| 一、PD-1单抗临床应用难治/复发弥漫大B细胞淋巴瘤的疗效和安全性分析及其预后生物标记物和耐药机制研究 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 二、PD-1基因敲减的CAR-CD19T细胞临床应用难治/复发弥漫大B细胞淋巴瘤的疗效和安全性分析及耐药机制研究 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 第三部分 小鼠模型中PD-1及TIM-3单抗联合干预的疗效观察及机制研究 |
| 一、小鼠模型中PD-1及TIM-3单抗联合干预的疗效观察 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 二、小鼠模型中PD-1及TIM-3单抗联合干预的机制研究 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 淋巴瘤免疫治疗的现状及展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（7）5-氮杂-2’-脱氧胞苷（DAC）增强MAGE-A10抗原肽表达并改善MAGE-A10特异性CTL杀伤肺癌细胞的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 MAGE-A10抗原在人肺癌组织的表达及临床意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MAGE-A10抗原在人肺癌细胞系和原代细胞的表达及MAGE-A10的生物信息学分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 去甲基化药物对MAGE-A10 特异性CTL杀伤活性及对肺癌细胞杀伤效应影响的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 肿瘤免疫治疗及MAGE-A抗原在肿瘤免疫治疗中的研究进展和应用现状 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）蛋白质芯片在肿瘤标志物筛查中的应用以及利用SELEX技术筛选CD20/486的ssDNA适配体的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 iPDMS蛋白芯片在恶性肿瘤筛查的应用研究 |
| 1.1 背景 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第二部分 CD20适配体的筛选及功能检测 |
| 2.1 背景 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 小结 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 博士学位期间的主要科研成果 |
| 致谢 |
（9）胶质母细胞瘤多基因预后预测方法的建立及CDC45蛋白功能及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 胶质母细胞瘤多基因抗原的检测及多基因预后预测分析 |
| 1.1 前言 |
| 1.1.1 胶质母细胞瘤概述 |
| 1.1.2 针对胶质母细胞瘤的DC疫苗 |
| 1.1.3 预后预测 |
| 1.1.3.1 肿瘤相关抗原与预后 |
| 1.1.3.2 肿瘤微环境与预后 |
| 1.1.4 预后预测 |
| 1.1.5 研究目的与意义 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 材料 |
| 1.2.1.1 组织样本 |
| 1.2.1.2 试剂 |
| 1.2.1.3 常用仪器设备 |
| 1.2.2 实验方法 |
| 1.2.2.1 组织样品的收取和保存 |
| 1.2.2.2 肿瘤患者OS及PFS的确定 |
| 1.2.2.3 组织样品RNA的提取 |
| 1.2.2.4 模板cDNA的获得 |
| 1.2.2.5 qRT-PCR检验模板质量 |
| 1.2.2.6 肿瘤相关抗原的qRT-PCR检测 |
| 1.2.2.7 统计分析 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 肿瘤相关抗原、微环境基因的查找及特异性引物设计 |
| 1.3.2 肿瘤患者临床特征 |
| 1.3.3 44例胶质母细胞瘤患者TAAs及TME基因表达情况分析 |
| 1.3.4 多基因预后预测数学模型的建立 |
| 1.3.4.1 数学模型的建立 |
| 1.3.4.2 数学模型对本研究中44 例患者的生存预测验证 |
| 1.3.4.3 TCGA数据库验证数学模型的准确性 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 胶质母细胞瘤肿瘤相关抗原和肿瘤微环境基因的检测 |
| 1.4.2 胶质母细胞瘤多基因预后预测数学模型的建立 |
| 1.4.2.1 临床特征与预后 |
| 1.4.2.2 数学模型与预后预测 |
| 1.5 结论与展望 |
| 第二章 CDC45在胶质母细胞瘤中的功能及机制研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.1.1 胶质母细胞瘤 |
| 2.1.2 CDC45与DNA复制 |
| 2.1.3 CDC45与肿瘤 |
| 2.1.4 NF-κB与肿瘤 |
| 2.1.5 IL-1β与肿瘤 |
| 2.1.6 靶向治疗 |
| 2.1.7 计算机辅助药物设计 |
| 2.1.7.1 分子动力学与自由能计算 |
| 2.1.7.2 分子对接与虚拟筛选 |
| 2.1.8 本研究的研究目的和意义 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.1.1 临床样本 |
| 2.2.1.2 细胞 |
| 2.2.1.3 实验动物 |
| 2.2.1.4 常用实验仪器 |
| 2.2.1.5 常用试剂 |
| 2.2.1.6 常用试剂配方 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.2.1 组织样品的收取和保存 |
| 2.2.2.2 肿瘤患者终位生存期及无进展生存期的确定 |
| 2.2.2.3 组织样品RNA的提取 |
| 2.2.2.4 模板cDNA的获得 |
| 2.2.2.5 qRT-PCR检验模板质量 |
| 2.2.2.6 肿瘤相关抗原的qRT-PCR检测 |
| 2.2.2.7 免疫组化分析 |
| 2.2.2.8 细胞复苏、培养、传代及冻存 |
| 2.2.2.9 质粒构建、提取 |
| 2.2.2.10 慢病毒包装,保存 |
| 2.2.2.11 病毒感染,筛选 |
| 2.2.2.12 CCK8检测细胞增殖 |
| 2.2.2.13 细胞侵袭和转移 |
| 2.2.2.14 细胞划痕 |
| 2.2.2.15 小分子抑制剂筛选 |
| 2.2.2.16 Western blot |
| 2.2.2.17 蛋白纯化 |
| 2.2.2.18 Biacore蛋白亲和力测定 |
| 2.2.2.19 皮下移植瘤模型建立 |
| 2.2.2.20 统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 CDC45在GBM中的功能探索 |
| 2.3.1.1 CDC45高表达于GBM中,且与不良预后密切相关 |
| 2.3.1.2 CDC45高表达于多种恶性肿瘤 |
| 2.3.1.3 CDC45过表达促进GBM细胞的增殖和单克隆形成 |
| 2.3.1.4 CDC45过表达促进GBM细胞系的迁移和侵袭能力 |
| 2.3.1.5 CDC45过表达促进GBM细胞的迁移能力 |
| 2.3.1.6 CDC45通过EMT通路促进GBM细胞转移 |
| 2.3.1.7 CDC45过表达促进GBM细胞体内肿瘤生长速度 |
| 2.3.1.8 CDC45的瞬时沉默显着抑制GBM细胞的增殖和单克隆形成 |
| 2.3.1.9 CDC45的瞬时沉默显着抑制GBM细胞的迁移和侵袭能力 |
| 2.3.1.10 CDC45的瞬时沉默显着抑制GBM细胞的迁移能力 |
| 2.3.1.11 CDC45的稳定沉默抑制GBM细胞增殖和单克隆形成 |
| 2.3.1.12 稳定沉默CDC45抑制GBM细胞迁移和侵袭能力 |
| 2.3.1.13 稳定沉默CDC45抑制GBM细胞迁移能力 |
| 2.3.1.14 稳定沉默CDC45抑制EMT信号通路关键蛋白 |
| 2.3.1.15 稳定沉默CDC45抑制GBM细胞在体内的肿瘤生长速度 |
| 2.3.2 CDC45通过NF-κB/IL-1β通路调控GBM的增殖,转移 |
| 2.3.3 CDC45靶向小分子抑制剂筛选 |
| 2.3.3.1 计算机辅助筛选CDC45小分子抑制剂 |
| 2.3.3.2 LN229/U251:CDC45初步筛选小分子化合物 |
| 2.3.3.3 CDC45重组蛋白的表达及亲和力测定 |
| 2.3.3.4 JQ-16对GBM细胞有显着的抑制作用 |
| 2.3.3.5 JQ-16特异性靶向CDC45抑制EMT关键蛋白 |
| 2.3.3.6 JQ-16显着抑制GBM体内肿瘤生长速度 |
| 2.3.3.7 CDC45与JQ-16号化合物结合位点分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 CDC45促进GBM的增殖和转移,是潜在的肿瘤标志物 |
| 2.4.2 基于计算机辅助的CDC45抑制剂筛选及功能评价 |
| 2.4.3 CDC45通过NF-κB/IL-1β通路调节肿瘤的发生,发展及转移 |
| 2.5 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词 |
| 在校期间科研成果 |
| 致谢 |
（10）抗BAP31胞内抗体的筛选及其抗胃癌作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 胃癌的研究进展 |
| 1.1.1 胃癌的现状 |
| 1.1.2 胃癌的发病机制 |
| 1.1.3 胃癌的治疗方法 |
| 1.2 BAP31 |
| 1.2.1 BAP31的结构 |
| 1.2.2 BAP31的功能 |
| 1.2.3 BAP31在癌症中的作用 |
| 1.3 细胞内抗体(Intracellular antibody,intrabody) |
| 1.3.1 抗体药物的发展及其分类 |
| 1.3.2 常用抗体库技术 |
| 1.3.3 细胞内抗体的分类应用 |
| 1.4 本文的主要研究内容和意义 |
| 第2章 BAP31在胃癌中的作用机制 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料与实验仪器 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 BAP31在多种癌症中高表达 |
| 2.3.2 BAP31在胃癌组织及胃癌细胞系中高表达 |
| 2.3.3 BAP31与周期蛋白p27~(kipl)负相关 |
| 2.3.4 BAP31调节p27~(kipl)蛋白酶体降解并与其结合 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 2.4.1 本章讨论 |
| 2.4.2 本章小结 |
| 第3章 抗BAP31 VH抗体的筛选及胞内抗体的构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料与实验仪器 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 BAP31 VH单域抗体基因的筛选 |
| 3.3.2 内质网滞留型细胞内抗体的构建 |
| 3.3.3 VH-D1通过与BAP31的C末端特异性结合,阻碍了其与p27~(kip1)的相互作用 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 3.4.1 本章讨论 |
| 3.4.2 本章小结 |
| 第4章 VH-D1在体内外抗肿瘤效果评价 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料与实验仪器 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 VH-D1抑制GC细胞增殖 |
| 4.3.2 VH-D1阻滞GC细胞周期在G1期 |
| 4.3.3 VH-D1诱导GC细胞凋亡 |
| 4.3.4 VH-D1在体内对GC细胞的杀伤作用 |
| 4.3.5 VH-D1感染的细胞对小鼠的影响 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 4.4.1 本章讨论 |
| 4.4.2 本章小结 |
| 第5章 VH-D1诱导GC干细胞分化 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料与实验仪器 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 GC干样细胞的富集与鉴定 |
| 5.3.2 胞内抗体VH-D1对CD44~+CD47~(high)细胞的影响 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 5.4.1 本章讨论 |
| 5.4.2 本章小结 |
| 第6章 VH-F12通过诱导MKN-45细胞自噬引起死亡 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料与实验仪器 |
| 6.2.2 实验方法 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 EpCAM在胃癌组织中高表达 |
| 6.3.2 VH-F12抑制EpCAM的表达 |
| 6.3.3 VH-F12诱导MKN-45细胞周期阻滞在G1期 |
| 6.3.4 VH-F12诱导MKN-45细胞死亡 |
| 6.3.5 VH-F12引起MKN-45细胞自噬 |
| 6.4 讨论与小结 |
| 6.4.1 本章讨论 |
| 6.4.2 本章小结 |
| 第7章 总结与创新点 |
| 7.1 全文总结 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表文章 |
| 作者从事科学研究和学习经历的简历 |
四、肺癌单抗识别的肿瘤相关抗原特性分析（论文参考文献）
- [1]泛实体瘤相关抗原图谱的构建及其在抗体偶联药物和嵌合抗原受体T细胞上的应用[D]. 方佳成. 西北大学, 2021(12)
- [2]肺癌免疫治疗相关不良反应的多组学生物标记物探究与预测模型建立[D]. 姚卓然. 北京协和医学院, 2021(02)
- [3]抗肿瘤药物浓度分析新方法及结直肠癌早期诊断标志物研究[D]. 刘书霞. 北京协和医学院, 2021
- [4]Hsa＿circ0006332和Hsa＿circ0000069调控宫颈癌发展的机制研究[D]. 陈震. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [5]外周血肿瘤相关天然自身抗体与非小细胞肺癌发病的关系研究[D]. 柳思琪. 吉林大学, 2020(08)
- [6]PD-1和TIM-3在耗竭T细胞介导B系淋巴瘤免疫逃逸中的作用机制及临床应用研究[D]. 陈晓晨. 苏州大学, 2020(06)
- [7]5-氮杂-2’-脱氧胞苷（DAC）增强MAGE-A10抗原肽表达并改善MAGE-A10特异性CTL杀伤肺癌细胞的研究[D]. 李振华. 河北医科大学, 2020(01)
- [8]蛋白质芯片在肿瘤标志物筛查中的应用以及利用SELEX技术筛选CD20/486的ssDNA适配体的研究[D]. 王伟. 南方医科大学, 2019
- [9]胶质母细胞瘤多基因预后预测方法的建立及CDC45蛋白功能及机制研究[D]. 李军旗. 暨南大学, 2019(01)
- [10]抗BAP31胞内抗体的筛选及其抗胃癌作用机制研究[D]. 陈静. 东北大学, 2019(01)