一、TRAIL/APO-2L与神经胶质瘤细胞凋亡（论文文献综述）
刘广洋,张晨亮,李欣,苗丽,徐立强,米一,陈瑶瑶,刘拥军[1]（2021）在《TRAIL基因修饰间充质干细胞治疗恶性肿瘤研究进展》文中研究表明间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是一种具有自我更新及多向分化潜能的干细胞。MSCs具有对多种肿瘤组织归巢及定向迁移的特性,可以将其作为治疗肿瘤药物的载体,用来治疗无法通过手术去除的肿瘤;同时,MSCs自身参与重塑肿瘤微环境,影响其侵袭、增殖和转移等生物学行为,并且具有抗炎及损伤组织修复的能力。肿瘤坏死因子相关凋亡配体（TRAIL/Apo2L）作为诱导细胞凋亡的肿瘤坏死因子家族成员之一,可通过结合肿瘤细胞表面两个特异性死亡受体（DR4、DR5）,特异激活肿瘤细胞凋亡。TRAIL基因修饰的MSCs（TRAIL-MSCs）可定位至肿瘤组织并抑制原发肿瘤及转移瘤的增殖、促进其凋亡,有望用于多种实体肿瘤及血液肿瘤的靶向治疗。综述了TRAIL-MSCs治疗肿瘤的研究进展,并讨论了TRAIL-MSCs联合放化疗对肿瘤的治疗效果,为该疗法在肿瘤治疗领域的应用提供理论依据。
李欣,徐立强,米一,苗丽,张晨亮,刘拥军,刘广洋[2]（2021）在《TRAIL基因修饰间充质干细胞对神经胶质瘤细胞杀伤作用研究》文中提出目的研究肿瘤坏死因子相关的凋亡配体（TRAIL）基因修饰间充质干细胞（TRAIL-MSCs）对神经胶质瘤细胞的杀伤作用。方法复苏冻存的脐带间充质干细胞（UC-MSCs）种子库细胞,通过慢病毒转染的方法制备TRAIL-MSCs。ELISA法检测UC-MSCs、TRAIL-MSCs细胞上清中TRAIL的含量;采用CCK-8试剂盒法检测重组TRAIL蛋白（rTRAIL,0、 25、 50、 100、 200、 400 ng/mL）对U87MG、 U251细胞的增殖抑制情况;实时荧光定量PCR （qRT-PCR）法检测U87MG、U251细胞中死亡受体DR4、DR5 mRNA表达水平,比较2种细胞对TRAIL的敏感性;将U87MG、U251细胞分别分为对照组、 UC-MSCs培养上清（阴性对照）组、 TRAIL-MSCs培养上清（含TRAIL约100 ng/mL）组和rTRAIL（100 ng/mL）组,CCK-8法检测细胞增殖抑制率;Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡率;qRT-PCR法检测DR4、DR5 mRNA表达水平。结果 TRAIL-MSCs培养上清中TRAIL表达量显着高于UC-MSCs（P<0.01）;rTRAIL对U87MG细胞的半数抑制浓度（IC50）为162 ng/mL,而对U251细胞的IC50大于800 ng/mL,U87MG对TRAIL的敏感性更高,差异显着（P<0.01）;U87MG细胞DR4、DR5 mRNA相对表达量均显着高于U251细胞（P<0.01）;与对照组比较,TRAIL-MSCs培养上清、rTRAIL对U87MG、U251细胞均有显着增殖抑制及促进凋亡的作用（P<0.05、0.01）,TRAIL-MSCs培养上清作用效果显着优于rTRAIL（P<0.01）;与U251相比,U87MG对TRAIL-MSCs培养上清的敏感性更强;TRAIL-MSCs培养上清处理的U87MG细胞DR4、DR5 mRNA表达量显着降低（P<0.01）。结论 TRAIL-MSCs对神经胶质瘤细胞有显着增殖抑制和杀伤作用,其功能可能与其受体DR4及DR5有关。
赵峰[3]（2021）在《改进型颈动脉注射法构建裸鼠脑转移瘤模型及隐丹参酮治疗脑瘤的研究》文中研究表明第一部分改进型颈动脉注射法构建裸鼠脑转移瘤模型目的:建立桡足类超绿色荧光蛋白（cop GFP）与纳米荧光素酶（Nluc）标记的MHCC97-H人肝癌细胞株,通过改进型颈动脉注射法构建应用小动物活体成像系统观察的裸鼠脑转移瘤模型。方法:使用携带目的基因的慢病毒载体质粒通过磷酸钙法转染293FT细胞,包装慢病毒后感染MHCC97-H细胞,经嘌呤霉素筛选感染阳性细胞,通过有限稀释法纯化得到稳定表达cop GFP及Nluc的单克隆细胞株。体外对比稳定转染细胞株与原始株的增殖、迁移和侵袭等肿瘤细胞表型。通过改进型颈动脉注射法构建裸鼠脑转移模型,应用活体成像系统监测颅内转移灶生长情况。结果:成功建立了cop GFP与Nluc标记的MHCC97-H人肝癌细胞稳定转染细胞株;稳定转染株细胞的增殖、迁移和侵袭能力与原始株相比无显着统计学差异（P>0.05）;分别使用稳定转染株与原始株细胞通过改进型颈动脉注射法造模,两组荷瘤裸鼠体质量变化及生存曲线无显着统计学差异（P>0.05）,使用稳定转染株造模裸鼠可通过活体成像系统实时监测到脑转移的形成,所检测生物发光信号强度随肿瘤生长而逐渐增强。结论:经cop GFP与Nluc双荧光标记的MHCC97-H人肝癌细胞通过改进型颈动脉注射法成功构建裸鼠脑转移模型,可通过活体成像系统进行无创、连续可视化监测,为肝癌脑转移机制的研究及治疗药物的研发提供了理想的动物模型。第二部分隐丹参酮治疗脑瘤的研究目的:研究隐丹参酮与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand,TRAIL）联合应用对胶质瘤U87细胞凋亡的影响并探讨其相关作用机制。方法:恶性神经胶质瘤U87细胞体外培养,隐丹参酮单独以不同时间、不同浓度处理,Western blot法检测死亡受体DR4、DR5、STAT3表达及p-STAT3（Tyr705）修饰水平变化。设置对照组、隐丹参酮组、TRAIL组及隐丹参酮与TRAIL联用组,MTT法检测各组对U87细胞存活率的影响;DAPI染色和Annexin V/PI双染法流式细胞术检测各组对U87细胞凋亡的影响;Western blot法检测各组caspase家族蛋白表达及信号通路STAT3、p-STAT3（Tyr705）表达。结果:隐丹参酮呈时间及剂量依赖的方式提高U87细胞中DR4和DR5的表达、抑制STAT3（Tyr705）磷酸化修饰;隐丹参酮与TRAIL联用显着抑制U87细胞活力（P<0.01）并且促进细胞凋亡率（P<0.01）;联合用药组显着促进了caspase家族蛋白表达,抑制了STAT3（Tyr705）磷酸化修饰（均P<0.05）,并且两者联合应用的效果优于隐丹参酮或TRAIL的单独应用（P<0.05）。结论:隐丹参酮联用TRAIL可协同抑制胶质瘤U87细胞增殖及促进细胞凋亡,其作用机制可能与隐丹参酮上调DR4、DR5的表达及其对STAT3通路的抑制作用有关。
刘霁纬[4]（2017）在《UMI-77与TRAIL联用诱导脑胶质瘤细胞凋亡以及PTPRU和DSTYK在神经系统中的功能研究》文中进行了进一步梳理本文旨在研究神经系统疾病的分子机制和探索新的治疗方法,由下面三部分组成:（1）UMI-77与TRAIL联用诱导脑胶质瘤细胞凋亡胶质瘤是最为恶性与常见的脑内原发性肿瘤。其对TRAIL（肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体）的耐药性是基于TRAIL治疗胶质瘤的一大障碍。本研究中,我们发现抗凋亡蛋白Mcl-1（髓细胞白血病因子1）的小分子抑制剂UMI-77可以使胶质瘤细胞对TRAIL诱导的凋亡更为敏感。UMI-77与TRAIL联用后引起caspase-8、促凋亡蛋白Bid、caspase-3和多聚ADP核糖合成酶的切割、截短型Bid在线粒体聚集以及细胞色素c释放到细胞质中,说明二者联用可引起线粒体外膜透化以及caspase依赖的凋亡途径。UMI-77可以解除Mcl-1对促凋亡蛋白Bim和Bak的隔离并激活Bak,从而实现与TRAIL协同诱导胶质瘤细胞凋亡。敲减Bid会抑制UMI-77与TRAIL联用引起的凋亡,表明Bid在二者联合用药诱导胶质瘤细胞凋亡的过程中起到关键作用。综上,UMI-77通过解除Mcl-1对促凋亡蛋白Bim和Bak的隔离并激活Bak,实现与TRAIL协同诱导胶质瘤细胞凋亡,为胶质瘤的治疗提供了新思路。（2）PTPRU在中脑多巴胺能神经元中的功能PTPRU（受体型蛋白酪氨酸磷酸酶U）是PD（帕金森病）相关蛋白Nurrl（孤核受体）的靶基因,在mDA（中脑多巴胺能）神经元发育早期起到控制中脑区域形成和调控前体细胞增殖的功能。然而其在mDA神经元发育的后期及成年阶段的功能并不清楚。在本研究中,我们构建了在有丝分裂后的多巴胺能神经元中敲除Ptpru的条件性基因敲除小鼠,来分析敲除Ptpru对mDA神经元的影响。我们发现PTPRU缺失导致SNc（黑质致密部）和VTA（腹侧被盖区）的mDA神经元胞体和细胞核变小,这与PD患者SNc区域mDA神经元胞体萎缩类似。Ptpru敲除小鼠SNc和VTA mDA神经元中Akt-mTORC1信号通路活性和GSK3β磷酸化水平的降低可能是导致细胞变小的原因。Ptpru缺失不影响年轻成年小鼠中脑TH（酪氨酸羟化酶）染色强度、纹状体的TH阳性纤维密度,以及一些成熟多巴胺能神经元标志物的表达和定位。提示多巴胺能神经元的特征标记物的表达和黑质纹状体投射在敲除Ptpru后仍得以维持。综上,PTPRU可能通过Akt-mTORC1和GSK3β信号通路调控SNc和VTA mDA神经元的大小,并参与PD发病进程。（3）DSTYK在小鼠神经系统和肾脏发育中的功能DSTYK（双丝氨酸/苏氨酸酪氨酸激酶）被报道是神经退行性疾病SPG23（痉挛性截瘫23型）的致病基因,然而其在神经系统的功能并不清楚。通过利用Dstyk基因敲除小鼠来研究DSTYK在神经系统中的功能,我们发现DSTYK缺失后小鼠学习和记忆功能下降,无明显脑发育和形态异常,这与SPG23病人症状类似。与SPG23病人不同的是,Dstyk基因敲除小鼠无毛发色素异常,其基本运动和平衡能力也与对照小鼠相当。因也有报道指出DSTYK是先天性肾脏及尿路畸形的致病基因,我们对敲除Dstyk后的小鼠肾脏进行了观察,并发现Dstyk敲除导致肾近曲小管F-actin（纤维型肌动蛋白）细胞骨架更为膨胀和弥散,但不影响小鼠肾脏的大体形态。利用CRISPR/Cas9技术,我们构建了 Flag标签敲入在DSTYKN端的HEK293T细胞系,并使用免疫共沉淀/质谱联用的方法在HEK 293T细胞中发现了 67个可能的DSTYK相互作用蛋白,其中最为富集的三类分别为酶（39.0%）、核酸结合蛋白（36.6%）和细胞骨架相关蛋白（14.6%）。我们利用Co-IP实验验证了外源DSTYK与调控F-actin细胞骨架结构的Profilin 1（前纤维蛋白1）和Profilin2（前纤维蛋白2）的相互作用。综上,DSTYK参与小鼠学习与记忆过程,并调控肾近曲小管F-actin细胞骨架的结构。
潘利强[5]（2014）在《肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）偶联物的设计及其特异性抗肿瘤作用研究》文中研究表明1. TRAIL-NC1和TRAIL-TD融合蛋白的设计与复性肿瘤坏死因子（TNF）相关的凋亡诱导配体（TNF related apoptosis-inducing ligand, TRAIL）是TNF超家族的一员,由于其能选择性杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无害而被视为有潜力的抗肿瘤蛋白药物。TRAIL能通过与肿瘤细胞细胞表面的死亡受体结合,从胞外途径传递死亡信号,最终诱导细胞凋亡。然而,目前常见的一些重组TRAIL均存在同样的问题：不稳定和半衰期短。为了克服这些问题,研究者们制备了许多带标签的重组TRAIL融合蛋白,如His-TRAIL, Flag-TRAIL, LZ-TRAIL和iLZ-TRAIL,旨在增强TRAIL的稳定性和活性,另外也是为了纯化方便的考虑。遗憾的是,虽然这些TRAIL融合蛋白表现出极强的肿瘤细胞诱导凋亡能力,同时却也引起了肝毒性。由于带有外源标签的TRAIL同时带有毒副作用,因此有研究者采用内源的融合片段（human pulmonary surfactant-associated protein D）来制备具有双重功能和更高凋亡活性的TRAIL融合蛋白。综上,寻找内源性双功能片段作为TRAIL的融合伴侣,有望解决TRAIL半衰期短、稳定性差和肝毒性等缺点。在本章节中,我们利用来源于人胶原蛋白ⅩⅤⅢ的NC1和NC1中的三聚域（TD）,设计了两种全新的TRAIL融合蛋白：TRAIL-NC1和TRAIL-TD,并且在大肠杆菌表达系统成功表达。由于两种融合蛋白都以不溶的包涵体形式存在于大肠杆菌中,且传统的复性方法难以对它们进行成功复性,因此我们开发了新的复性方法——两步复性法,它结合了稀释复性和凝胶过滤法柱上复性的优点,分步复性融合蛋白,最终成功复性了TRAIL-NC1融合蛋白。分子排阻色谱分析TRAIL-NC1融合蛋白表明它的存在形式为三聚体,而TRAIL-TD融合蛋白为六聚体。TRAIL-NCI融合蛋白的诱导肿瘤细胞凋亡活性与同样方法复性后的TRAIL （114-281）相同,然而大大弱于可溶性的TRAIL（114-281）（活性强50倍左右）,仍未满足最初设计TRAIL-NC1的要求。因此,本章节最主要的贡献为开发了新的两步复性法,丰富了蛋白质复性领域的方法,对于TRAIL存在的缺点,仍需继续设计不同的解决方案。2. TRAIL-vcMMAE的设计与抗肿瘤活性研究TRAIL三聚体通过与细胞表面的死亡受体DR4和DR5结合传递死亡信号,从而诱导细胞凋亡。诱捕受体（DcR1和DcR2）和可溶性受体（OPG）由于只含有部分或不含死亡域（death domain, DD）而不能传递TRAIL的凋亡信号。然而,仍然存在一些肿瘤细胞,其细胞表面表达DR4和DR5,却仍然对TRAIL耐受,比如许多乳腺癌细胞系和黑色素瘤细胞系。研究者们认为细胞内TRAIL信号通路上一些事件导致了上述现象,例如FADD和caspase8存在缺陷、cFLIP过表达等原因。TRAIL可以通过与死亡受体结合被细胞内吞,同时该内吞行为并不是TRAIL诱导凋亡所必需的。因此,为了克服表面表达有DR4和DR5死亡受体的肿瘤细胞对TRAIL的耐受性,我们利用这一内吞过程来使TRAIL通过化学偶联携带剧毒小分子药物进入细胞内,细胞内溶酶体中的多种蛋白酶能够水解偶联物从而释放出剧毒小分子,以另外的途径诱导细胞凋亡。我们选择了海兔毒素衍生物MMAE用于偶联TRAIL,它们通过一个二肽（valine-citrulline,vc） linker相连接。MMAE是一种人工合成的有丝分裂抑制剂,它能通过抑制微管蛋白二聚化阻滞细胞分裂,从而使细胞凋亡。vcMMAE是一个在细胞外稳定的系统,而当它进入细胞后,可经溶酶体中组织蛋白酶B的水解,释放出MMAE,发挥抑制有丝分裂的机制。在本章的研究中,我们设计了两种TRAIL（95-281）突变体（S96C和N109C）用于偶联vcMMAE,并且从体外活性实验中选出活性更优的N109C-vcMMAE进行后续的研究。后续的实验表明N109C-vcMMAE在肿瘤细胞摄取、死亡受体亲和力、内吞、体内靶向等方面有良好的表现,初步证实了TRAIL-MMAE偶联物在抗肿瘤方面的可行性,进而拓宽了抗体偶联药物（ADC）的覆盖范围,使TRAIL能够替代抗体成为ADC中的“靶向弹头”部分。3.一种突变Cys位点特异性PEG修饰TRAIL的方法及其产物的抗肿瘤活性研究在小鼠肿瘤移植模型中,无论是TRAIL单独用药还是与化疗药物联用,都展现出显着的抗肿瘤效果。然而,在2011年,Amgen和Genentech先后将TRAIL（产品名：Dulanermin）从公司产品线上撤下,且未发布具体缘由。可推测的是TRAIL本身的一些缺点制约了其在临床上的进一步进展,比如：半衰期短、稳定性差和潜在肝毒性。Polyethylene glycol （PEG）是一种生物相容性极佳的高分子聚合物,PEG修饰也被公认为是最成功的蛋白修饰方式之一,经过PEG修饰的蛋白具有更长的半衰期、更好的稳定性以及更低的免疫原性。美国食品药物监督管理局（American Food and Drug Administration, FDA）至今已批准了诸多经PEG修饰的蛋白药物和酶类,比如,用于治疗急性淋巴细胞白血病和其他淋巴瘤的PEG-天冬酰胺酶（商品名：Oncaspar）,用于治疗急性联合免疫缺陷症的PEG腺苷脱氨酶（商品名：Adagen）。因此,研究者利用PEG修饰来改善TRAIL的药代动力学特性和稳定性也就是意料之中的事情了。由于N端的氨基比侧链氨基残基具有更小的pKa值,只要控制反应条件就能实现特异性地跟N端氨基的反应,因此之前的研究者们均采用N端特异性PEG修饰的方法。但是该方法所需时间较长、效率较低,因此需要我们找到一种更为简便、高效的PEG修饰TRAIL的方式。在本章中,我们描述了一种新型PEG-TRAIL的制备、分析和活性评价过程,它为在突变Cys位点进行PEG修饰的TRAIL （95-281）突变体。我们选择单甲基化聚（乙二醇）马来酰亚胺（mPEG-MAL）用于修饰TRAIL,因为马来酰亚胺基团能快速与TRAIL突变体上还原后的半胱氨酸巯基（Cys-SH）反应生成硫醚键。我们选择N109C作为反应的TRAIL（95-281）突变体,原因在于N109C突变了一个潜在的N-糖基化位点（Asn-109）且在第三章中成功偶联了MMAE,并展现出很好的抗肿瘤活性。在本章的研究中,我们在突变Cys-SH定点PEG修饰TRAIL（95-281）突变体N109C （mPEGMAL-N109C）的体内外活性、稳定性、药代动力学性质等方面进行了深入研究。同时,我们构建了N-端直接特异性PEG修饰的TRAIL（114-281）（mPEGALD-TRAIL114-281）,用于与mPEGMAL-N109C比较,作为传统PEG定点修饰方式的对照。结果显示,相比野生型TRAIL（114-281）和mPEGALD-TRAIL114-281,mPEGMAL-N109C表现出更高的体内抗肿瘤活性、更好的稳定性、更长的半衰期,同时没有检测到任何的肝肾毒性,表明突变Cys位点的特异性PEG修饰可以成为修饰TRAIL一种更好选择。
张妍[6]（2014）在《rh-Apo2L联合长春瑞滨诱导人肺鳞癌细胞凋亡及相关机制的实验研究》文中研究表明目的：观察rh-Apo2L、长春瑞滨及两药联合对人肺鳞癌细胞（SK-MES-1）的增殖抑制和凋亡作用；探讨rh-Apo2L联合长春瑞滨诱导人肺鳞癌细胞（SK-MES-1）凋亡的相关机制。方法：1、检测rh-Apo2L、长春瑞滨分别对人肺鳞癌细胞株（SK-MES-1细胞）的体外增殖影响：采用CCK-8法检测不同浓度的rh-Apo2L、长春瑞滨干预SK-MES-1细胞24小时和48小时后，各组细胞的增殖抑制情况，计算药物半数抑制浓度（IC50），并选择亚毒性药物浓度用于后续实验研究。2、检测rh-Apo2L、长春瑞滨对人肺鳞癌细胞株（SK-MES-1细胞）的凋亡作用：取对数生长期的SK-MES-1细胞分为四组，分别为空白对照组、rh-Apo2L组、长春瑞滨组、rh-Apo2L联合长春瑞滨组，给予相应药物干预24小时后，在显微镜动态观察细胞形态学变化，并采用AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞技术检测各组细胞凋亡情况。3、检测不同组的凋亡相关蛋白的表达情况：采用Western blot技术检测上述分组药物干预SK-MES-1细胞24小时后，细胞凋亡相关蛋白DR4、DR5、Caspase-3表达的情况。结果：1、CCK-8法检测结果显示：rh-Apo2L在体外对人肺鳞癌SK-MES-1细胞的增殖具有抑制作用，其抑制作用与药物浓度之间呈剂量-效应正相关，计算得到24h、48h rh-Apo2L的IC50分别为28.57μg/ml、8.97μg/ml；长春瑞滨在体外也对SK-MES-1细胞的增殖具有较强的抑制作用，其抑制作用与药物浓度之间呈剂量-效应正相关，计算得到24h、48h长春瑞滨的IC50分别为27.30μg/ml、7.87μg/ml。rh-Apo2L联合长春瑞滨对SK-MES-1细胞的生长抑制作用，与单药组比较明显增强，具有统计学差异（P<0.05），计算出24h、48h联合组两药相互作用指数（q值）分别为1.937和2.400，提示rh-Apo2L与长春瑞滨两药联合对SK-MES-1细胞的抑制作用具有协同性。2、流式细胞计量术结果显示：rh-Apo2L与长春瑞滨联合应用干预24h后，人肺鳞癌SK-MES-1细胞早期凋亡率为25.64%，与rh-Apo2L单药组（16.80%）、长春瑞滨单药组（5.93%）相比，早期细胞凋亡率显着增加，具有统计学差异（P<0.05）；rh-Apo2L与长春瑞滨联合应用干预24h后，联合组SK-MES-1细胞晚期凋亡率为49.24%，与rh-Apo2L单药组（11.96%）、长春瑞滨单药组（31.38%）相比，晚期细胞凋亡率显着增加，具有统计学差异（P<0.05）。3、蛋白印迹法检测结果显示：与空白对照组、rh-Apo2L单药组相比，长春瑞滨单药组及两药联合组上调了凋亡相关蛋白DR4、DR5表达，具有统计学差异（P<0.05）；两药联合组与其他组相比，两药联合组的Caspase-3表达增加，具有统计学差异（P<0.05）。结论：1、rh-Apo2L、长春瑞滨可通过诱导细胞凋亡的方式抑制人肺鳞癌SK-MES-1细胞的增殖；2、rh-Apo2L与长春瑞滨能协同诱导人肺鳞癌SK-MES-1细胞的细胞凋亡作用；3、长春瑞滨可能是通过上调SK-MES-1细胞表面DR4、DR5蛋白的表达，Caspase-3的活化而增强rh-Apo2L联合长春瑞滨诱导SK-MES-1细胞的凋亡作用。
李功权[7]（2014）在《Mcl-1和IAPs家族蛋白介导肝癌细胞抗凋亡作用及其分子机制的研究》文中研究说明凋亡是程序性细胞死亡，细胞凋亡主要通过内源性、外源性2个信号传导通路。许多研究证明，肝细胞肝癌（HCC）细胞内源性凋亡缺陷是导致化疗失败的原因之一。 Bcl-2家族蛋白是控制细胞生存与死亡的关键蛋白，在调节细胞凋亡信号中发挥重要作用。髓细胞白血病基因-1（myeloid cell leukemin-1，Mcl-1）属于Bcl-2家族独特的成员，由于Mcl-1半衰期短（1-4小时），对于各种刺激应答快，其表达在转录、转录后以及蛋白等水平受多种信号的严密调控，以及由于Mcl-1在肝癌等多种恶性肿瘤中普遍高表达，Mcl-1一直是肿瘤分子靶向治疗研究的热点。ABT-737、 ABT-263（Navitoclax）是一种人工合成的小分子BH3模拟物，体内、外临床前期研究显示，ABT-737、ABT-263（Navitoclax）对多种类型的白血病和实体肿瘤（小细胞肺癌等）有很好的治疗作用，已经进行Ⅰ/Ⅱ期临床试验。ABT-737、ABT-263（Navitoclax）同时作为小分子Bcl-2和Bcl-xL抑制剂，对Bcl-2、Bcl-xL具有高的亲和力，但对Mcl-1的亲和力极低。HCC和其它高表达Mcl-1的肿瘤细胞和组织对这个化合物诱导的凋亡抵制，这成为阻碍ABT-737、ABT-263（Navitoclax）进入临床应用的一个主要问题。有研究证明，联合其他化疗药物能有效增强肿瘤细胞对ABT-737、ABT-263（Navitoclax）治疗的敏感性。去甲斑蝥素（NCTD）是一个小分子抗肿瘤药物，它衍生于传统中药斑蝥。一些研究显示，NCTD的抗肿瘤作用可能和Bcl-2家族成员的作用相关。在前期研究中，我们注意到NCTD极大地抑制了Mcl-1在HCC细胞中的表达。阿斯匹林（乙酰水杨酸）是一种常见的非类固醇抗炎药物（NSAID），它具有退热、镇痛和抗炎作用。和其它NSAIDs一样，阿斯匹林在多种肿瘤细胞中显示了强烈的抗癌作用。近期研究显示，阿斯匹林在结直肠癌、口腔鳞癌、宫颈癌和白血病细胞中的抗肿瘤作用和下调Mcl-1水平有关。然而，阿斯匹林能否抑制HCC细胞中Mcl-1的表达，是否能用来克服HCC细胞对Navitoclax的耐药没有被研究。本研究应用肝癌细胞株观察小分子BH3模拟物ABT-737和ABT-263（Navitoclax）对肝癌细胞的治疗作用及其和传统中药NCTD及阿斯匹林联合抗肿瘤效果，并研究其具体作用的分子机制。目的观察小分子BH3模拟物ABT-737、ABT-263（Navitoclax）单独和联合NCTD、阿斯匹林对HCC细胞的作用效果，研究2种小分子BH3模拟物单药、联合NCTD和阿斯匹林的抗癌活性及其作用的分子机制。方法分别应用4株、2株肝癌细胞株，SMMC-7721、BEL-7402、HepG2、Hep3B。采用MTT、克隆形成实验、台盼蓝拒染法、细胞转染、siRNA技术、qRT-PCR检测、流式细胞、westernblotting等方法，观察NCTD和阿斯匹林分别对2种小分子BH3模拟物ABT-737、ABT-263治疗肝癌的增强作用效果，并探讨具体分子机制。结果1.1NCTD抑制HCC细胞中Mcl-1的表达。用4种HCC细胞株HuH-7、HepG2、BEL-7402和SMMC-7721观察NCTD对Mcl-1表达的影响。15μM NCTD部分抑制了Mcl-1的表达，30、60μM NCTD完全抑制了Mcl-1在4株肝癌细胞中的表达。用NCTD治疗HCC细胞HuH-7、HepG2，细胞用蛋白酶抑制剂MG132预处理。结果显示，MG132处理导致两株细胞Mcl-1表达增加，MG132对NCTD介导的Mcl-1的下调有很小的作用，显示Mcl-1的下调不是依赖于蛋白酶依赖蛋白降解所致。30μM NCTD处理HuH-7和HepG2细胞6小时，提取RNA，RT-PCR检测发现，NCTD极大减少了Mcl-1mRNA水平。1.2阿斯匹林抑制肝癌细胞中Mcl-1的表达。2.5、5、10mM阿斯匹林处理HepG2和BEL-7402细胞，结果显示，阿斯匹林抑制了Mcl-1的表达。但2株肝癌细胞株中Bcl-2、Bcl-xL、XIAP和Survivin的表达没有变化。5mM阿斯匹林作用于细胞48h，部分抑制了Mcl-1的表达，10mM阿斯匹林完全抑制了Mcl-1的表达。2.1NCTD增强了ABT-737介导的肝癌细胞的增殖抑制和诱导的凋亡。MTT检测NCTD对ABT-737诱导的HCC细胞增殖抑制作用。实验结果显示，HuH-7和HepG2细胞对ABT-737不敏感。但是，在NCTD联合1-3μM ABT-737极大地抑制了4株肝癌细胞的增殖。在HuH-7和HepG2细胞中，NCTD或ABT-737单药处理细胞48小时对诱导细胞凋亡的作用很小。联合处理细胞则引起了2株细胞中大量的细胞凋亡。2.2阿斯匹林增强Navitoclax介导的肝癌细胞增殖抑制。阿斯匹林、Navitoclax单药或2种药物联合作用于肝癌细胞48小时，MTT检测细胞的存活抑制率。阿斯匹林或Navitoclax单药对2株HCC细胞有很小的杀伤作用。联合用药后极大地抑制了2株HCC细胞的增殖。实验中发现联合用药的效果和阿斯匹林抑制Mcl-1的作用密切相关。5、10mM阿斯匹林几乎完全抑制了Mcl-1的表达，5、10mM阿斯匹林和Navitoclax联合对肝癌细胞的增殖抑制率为80-100%。阿斯匹林主要通过下调Mcl-1，增强了Navitoclax对肝癌细胞的增殖抑制作用。3.1NCTD增强了ABT-737触发的PARP切割和caspases激活。westernblotting结果显示，ABT-737和NCTD联合处理细胞48h，导致了PARP蛋白的切割，单药对PARP的表达影响很小。caspase-9活化片段（37/35kd）在2株HCC细胞中明显增加。ABT-737和NCTD联合处理细胞后极大增加了caspase-3的水解片段（19/17kd）。用50μM泛caspase抑制剂（zVAD.fmk）预处理HuH-7和HepG2细胞1小时，然后加入30μM NCTD和3μM ABT-737。抑制caspase活性显着降低了联合用药诱导的细胞死亡，显示两药联合的抗癌活性依赖于caspases通路。3.2阿斯匹林增强Navitoclax介导的抗癌活性主要通过诱导肝癌细胞的凋亡，诱导了PARP的切割和caspase-9、-3的激活。5mM阿斯匹林、Navitoclax单药或它们的联合作用肝癌细胞48小时。膜联蛋白-V/碘化丙啶（Annexin-V/PI）双染，流式细胞仪检测细胞凋亡。结果显示，阿斯匹林或Navitoclax单药对2株HCC细胞诱导细胞凋亡的作用很小，联合用药处理BEL-7402、HepG2细胞分别诱导了89%、81%的细胞凋亡。western blotting检测显示，两个单药处理细胞后对PARP切割和Caspase-9、-3激活几乎没有影响，但两药联合处理细胞后，极大诱导了PARP切割和Caspase-9、-3激活。4.1NCTD增强了ABT-737触发的细胞色素C的释放。细胞色素C从线粒体内释放进入胞浆是Bcl-2家族蛋白调节细胞凋亡的一个主要事件。对照组和ABT-737单药处理的细胞胞浆中没有检测到细胞色素C，NCTD处理后胞浆中细胞色素C也成低水平，但联合用药后细胞色素C显着增加。4.2阿斯匹林通过线粒体凋亡信号通路增强了Navitoclax介导的抗癌活性。阿斯匹林和Navitoclax单药处理细胞后，胞浆中没有检测到从线粒体释放的细胞色素C。两药联合处理细胞后，检测到了细胞色素C的表达，提示联合用药后激活了线粒体凋亡信号通路。实验中应用Caspase-9的抑制剂Z-LEHD-FMK，探讨两药联合抗肿瘤作用是否依赖于线粒体介导的细胞凋亡诱导。用Caspase-9的抑制剂预处理HCC细胞1小时，然后加入5mM阿斯匹林和1μM Navitoclax。结果发现Z-LEHD-FMK几乎完全抑制了联合用药诱导的HCC细胞死亡。5.1下调Mcl-1增强了HCC细胞对ABT-737治疗的敏感性。用siRNA技术下调Mcl-1，western blotting检测显示下调Mcl-1显着增强了ABT-737触发的PARP切割和Caspase-3激活。下调细胞中Mcl-1的表达增强了ABT-737诱导HCC细胞的死亡作用。5.2通过siRNA下调Mcl-1模拟阿斯匹林在HCC细胞中对增强Navitoclax介导的抗肝癌中的作用。用siRNA下调Mcl-1，Navitoclax单独作用于2株肝癌细胞株获得了和5mM阿斯匹林联合用药后类似的抗肝癌效果。6Bax和Bak在NCTD增强ABT-737诱导的HCC细胞凋亡中发挥了必不可少的作用。用siRNA技术下调Bax和Bak并且检测抑制Bax/Bak后，对于两药联合处理HuH-7和HepG2细胞对PARP切割和诱导细胞死亡的影响。结果显示，下调细胞中Bax/Bak的表达，显着减少了ABT-737和NCTD联合处理HCC细胞后PARP蛋白的切割和诱导的细胞死亡。结论NCTD和阿斯匹林能提高肝癌细胞对小分子BH3模拟物治疗的敏感性，这种抗肝癌作用主要是NCTD和阿斯匹林通过下调Mcl-1的表达，疏通了BH3模拟物诱导肝癌细胞凋亡的信号通路实现。肝癌的恶性生物学行为如，局部侵袭、远处转移以及手术后复发和抗药性等与凋亡抑制家族蛋白（Inhibitor of Apoptosis Proteins，IAPs）在肝癌的过度表达引起癌细胞凋亡失衡关系密切。IAPs在HCC中的过度表达导致了HCC对化疗的抵抗和高复发率。IAPs的凋亡抑制功能可被一种称为第二个线粒体衍生的半胱氨酸天冬氨酸水解酶（caspase）激活剂（second mitochondria-derived activator of caspase，Smac）的线粒体蛋白质拮抗，小分子Smac模拟物通过以IAPs为靶点诱导肿瘤细胞的凋亡，进而发挥其抗肿瘤的作用。根据Smac蛋白质的功能结构研制的抗癌新药小分子Smac模拟物已经进入临床研究。小分子Smac模拟物可通过特异性地拮抗IAPs在多种恶性肿瘤的过度表达，显着地增进这些肿瘤对化疗药物的敏感性。目前，有关小分子Smac模拟物介导肝癌化疗增敏作用的研究尚未见报道。本研究应用肝癌细胞株、原代培养的肝癌细胞评价小分子Smac模拟物SM-164对肝癌的治疗及其对APO2L/TRAIL和阿霉素抗肿瘤的增敏作用，应用流式细胞学、siRNA技术、western blotting等实验技术探讨药物对凋亡通路相关蛋白影响，研究其抗肝癌作用的具体分子机制。目的观察IAPs抑制剂Smac模拟物单独和联合化疗药物对HCC的抗肿瘤效果，探讨Smac模拟物的抗肿瘤活性及其对化疗药物增敏的分子机制。方法4株肝癌细胞株SMMC-7721、BEL-7402、HepG2、Hep3B和1株正常的肝细胞株L02，收集12例HCC手术病人切除的新鲜肝癌组织并进行原代培养的细胞用在本研究中。其中12例HCC患者中男9例，女3例。年龄32-72岁，平均年龄48.9岁。采用MTT、台盼蓝拒染法、流式细胞、western blotting等方法，观察小分子Smac模拟物SM-164对肝癌化疗的增敏效果，并研究其分子机制。HCC细胞经过Smac模拟物SM-164处理后，MTT检测细胞存活率、台盼蓝拒染法检测诱导的细胞死亡、克隆形成实验等方法用于评估抗癌活性；Western blotting检测和广谱的caspases抑制剂（zVAD-fmk）用于探讨具体的分子机制。结果1SM-164单独作用于4株HCC细胞，诱导HCC细胞中cIAP-1的迅速降解，但对HCC细胞有很小的杀伤作用。Western blotting检测0.1μM SM-164处理HCC细胞株BEL-7402、SMMC-7721、HepG2和Hep3B后cIAP-1和XIAP表达水平的变化。结果显示，0.1μM SM-164作用于HCC细胞1h后cIAP-1的表达减少，但是SM-164作用于这些HCC细胞24h后检测，XIAP表达没有变化。SM-164处理这4株HCC细胞4天，细胞存活率仅有很小或没有变化。Hep3B是对SM-164最敏感的的细胞株，其IC50是21μM。HepG2最耐受，100μM SM-164细胞存活抑制率小于50%。此外，SM-164对BEL-7402、SMMC-7721作用的IC50分别是45和63μM。2SM-164能增强APO2L/TRAIL的抗HCC活性。MTT法检测BEL-7402、SMMC-7721、HepG2和Hep3B4株HCC细胞株细胞对APO2L/TRAIL作为单药的敏感程度。结果显示，BEL-7402细胞株细胞对APO2L/TRAIL敏感。10、30、100ng/ml APO2L/TRAIL处理细胞4天，细胞的存活抑制率分别是27%、54%和74%。SMMC-7721、HepG2和Hep3B3株细胞对APO2L/TRAIL耐受。用1000ng/ml APO2L/TRAIL处理3株细胞株细胞4天，对细胞的抑制率<10%。APO2L/TRAIL和SM-164联合作用于HCC细胞的结果显示，在BEL-7402细胞，0.1μM SM-164显着增强了由APO2L/TRAIL介导的细胞存活抑制作用（p<0.05）。SM-164也极大提高了在对APO2L/TRAIL治疗耐受的HCC细胞SMMC-7721、HepG2和Hep3B的抗癌活性。在SMMC-7721细胞株中，1000ng/mlAPO2L/TRAIL单药对细胞几乎没有杀伤作用，100、300ng/ml APO2L/TRAIL和SM-164联合之后对细胞的生存抑制率分别是80%和100%。3SM-164增强了APO2L/TRAIL介导的肝癌细胞的集落形成能力的抑制。集落形成实验检测SM-164和APO2L/TRAIL的联合作用对HCC细胞是否有长期的效果。SM-164和APO2L/TRAIL的联合处理对APO2L/TRAIL治疗耐受的SMMC-7721和HepG2细胞株2周后观察。在SMMC-7721细胞，细胞对SM-164和APO2L/TRAIL单药的治疗效果不明显，但是联合用药处理后，细胞的集落形成能力完全抑制（p<0.001）。此外，在HepG2细胞中，尽管SM-164和APO2L/TRAIL联合联合处理后对细胞存活抑制率和凋亡率作用很小，但是在集落形成实验中，相对于单药，相同浓度的药物联合处理细胞后极大地抑制了细胞集落形成能力（p<0.001）。4SM-164没有增强APO2L/TRAIL对人正常肝细胞的细胞毒性。用人肝细胞L02细胞株检测SM-164是否能增强APO2L/TRAIL对人正常肝细胞的毒性作用。结果显示，用300和3000ng/ml APO2L/TRAIL处理L02细胞4天，细胞的存活抑制率分别是7%和23%。0.1μM SM-164和APO2L/TRAIL联合处理细胞后，也没有增强APO2L/TRAIL介导的细胞存活抑制作用。5SM-164增强了APO2L/TRAIL诱导的HCC细胞株细胞的凋亡。SM-164和APO2L/TRAIL单药或联合处理SMMC-7721细胞后，用Annexin-V染色和流式细胞学检测细胞的凋亡率。相对于对照组，SM-164、APO2L/TRAIL联合处理24h细胞凋亡率分别是7%和14%。但是两药联合处理细胞后凋亡率是77%。Westernblotting结果显示，SM-164显着增强了APO2L/TRAIL触发的凋亡信号通路上的主要蛋白caspase-8、caspase-3和激活状态PARP的累积。但是泛Caspases抑制剂z-VAD-fmk能减弱SM-164和APO2L/TRAIL这种联合作用。6SM-164和APO2L/TRAIL联合后抑制了AKT在HCC细胞中的活性。SM-164、APO2L/TRAIL单药或联合处理SMMC-7721、BEL-7402、HepG2细胞，western blotting检测AKT蛋白的表达。结果显示，AKT蛋白在所有3株HCC细胞株中被激活。APO2L/TRAIL单药没有明显抑制AKT的激活，APO2L/TRAIL联合SM-164显着减少了AKT的磷酸化水平。7SM-164增强了APO2L/TRAIL诱导的原代HCC细胞的死亡。原代HCC细胞从12个HCC外科手术病人的切除的新鲜标本获取，分离、培养。用0.1μMSM-164、100ng/ml APO2L/TRAIL单药和两药联合处理细胞24h，台盼蓝拒染法检测细胞死亡率。SM-164单药作用12个HCC细胞中，只诱导了2个原代HCC细胞明显的细胞死亡（NO.9和NO.12）。但SM-164和APO2L/TRAIL联合用药后诱导了12种细胞中的11个原代培养细胞死亡。从7个病人标本培养的原代细胞显示了统计学差异（p<0.05）。SM-164+APO2L/TRAIL对原代HCC细胞的死亡诱导作用使PARP蛋白激活，SM-164增强原代培养的HCC细胞对APO2L/TRAIL敏感和疾病的发展阶段没有关系。8SM-164增强了阿霉素对HCC细胞的抗癌活性。实验中同时观察了SM-164是否能够增强临床上常用的化疗药物阿霉素对HCC细胞的治疗作用。1μM阿霉素（Dox）、0.1μM SM-164分别单药和Dox+SM-164联合处理细胞48h，研究发现，Hep3B细胞株对Dox单药治疗最敏感，用1μM阿霉素作用细胞48h后导致了41%的细胞死亡。10μM阿霉素分别诱导SMMC-7721、BEL-740232%、31%细胞死亡。实验中同时发现，0.1μM SM-164显着增强了所有3株HCC细胞株由阿霉素诱导的细胞死亡。western blotting分析结果显示，SM-164+阿霉素处理3株HCC细胞后，激活状态的caspase-3和PARP蛋白表达增加。9SM-164联合阿霉素抑制了HCC细胞中AKT的激活。在Hep3B HCC细胞株中用1μM阿霉素，在BEL-7402、SMMC-7721细胞用10μM阿霉素单药、0.1μM SM-164单药或/和两者联合处理细胞24h，western blotting检测AKT水平。SM-164、阿霉素单药作用于HCC细胞对AKT磷酸化没有或是作用很小。但是SM-164+阿霉素联合治疗组的HCC细胞中AKT的磷酸化水平明显降低。结论IAPs抑制剂能有效增强APO2L/TRAIL和阿霉素抗HCC效果，这种治疗作用主要是增强了APO2L/TRAIL和阿霉素诱导HCC细胞的凋亡信号和抑制生存信号。本研究同时也提示作为IAPs抑制剂的Smac模拟物是一种新的对HCC有良好治疗效果的药物。
张博[8]（2014）在《石胆酸对胶质母细胞瘤线粒体脂质过氧化调控机制的研究》文中认为胶质瘤母细胞瘤是最常见、最具侵袭性的脑肿瘤，其发病率为每年3.17例/100，000人，占原发性脑肿瘤17%，其5年生存率及10年生存率分别为4.5%及2.7%。尽管胶质母细胞瘤的治疗在护理、手术切除、放疗和化疗等领域不断改进，但其中位无进展期及中位生存期仍仅为6.7个月及14.6个月。尽管目前其在手术，放疗和化疗方面目前已有相当大的进展，但胶质母细胞瘤预后并没有得到实质性改善。根据既往研究发现胶质母细胞瘤的预后极差除了其浸润生长方式，其具有免疫抑制表型也是其特征之一。而且，胶质母细胞瘤细胞几乎可耐受不同的凋亡刺激。改变细胞凋亡途径不但促进胶质瘤的发病，而且会促进对传统遗传毒性疗法的耐受，因为目前的治疗方法大多无法有效控制和治疗胶质母细胞瘤，故具有创新性的治疗策略必须得到发展。在过去的几十年中人们已经作出了大量的努力。通过研究发现在生理条件下，虽然胶质母细胞瘤可抵抗受严格调控的凋亡性细胞死亡过程，致使癌细胞的存活率有所提高。然而，细胞凋亡级联反应在胶质母细胞瘤细胞凋亡中扮演重要角色，因此，从诱导肿瘤细胞凋亡角度治疗胶质母细胞瘤成为可能。然而，迄今为止，临床研究都指向靶向治疗途径，显示出的疗效有限。在胶质母细胞瘤治疗中，目前研究高效、低毒性的诱导胶质母细胞凋亡的靶向治疗药物仍然是胶质母细胞瘤研究热点。石胆酸是一种胆汁酸，新近研究发现低浓度的LCA可以使BE（2）-m17和SK-n-MCIXC细胞对过氧化氢诱发的细胞衰亡变得敏感，一定浓度的LCA使人神经元细胞的原始培养物对此类型的细胞死亡具有了一定的抵御能力。在NB细胞系BE（2）-m17和SK-n-MCIXC中，LCA通过与细胞表面紧密结合，启动细胞内级联反应触发细胞内在和外在的细胞衰亡路径，最终导致细胞死亡。LCA与细胞表面紧密结合后，通过激活CASPASE-8引起MOMP，这反过来又会导致MOMP。LCA也会通过cAMP/PKA信号通路刺激TGR5传输MOMP，激活从细胞质膜到线粒体之间的信号。LCA诱发的MOMP可能会导致细胞色素C从线粒体中流出，从而导致衰亡体的形成和所观察到的CASPASE-9活化。CASPASE-9随后会通过酶原-3的蛋白水解过程激活CASPASE-3。CASPASE-3的蛋白水解活化作用也可通过LCA诱发细胞衰亡的外源路径内的CASPASE-8来实现。活化的CASPASE-3通过对蛋白质载体的分解完成LCA驱动型细胞衰亡过程的分解阶段。此外，LCA与细胞表面的紧密结合会引发CASPASE-6的蛋白水解活化作用。该活化作用的机理和LCA驱动型细胞衰亡过程中是否有CASPASE-6的参与仍有待确定。另外，LCA与细胞表面的紧密结合会引起炎症CASPASE-1的抑制。该抑制可能会衰减细胞激素白细胞介素1β和白细胞介素18的产生和分泌，从而阻止B细胞的生长和增殖，这对LCA的抗癌效用会起到一定的效果。并且通过研究发现LCA刺激的TGR5会启动三份子的级联反应，这会触发内在和外在路径的细胞衰亡。首先，它可以通过修改线粒体中的氧化还原过程启动cAMP/PKA信号通路。其次，升高的LCA细胞内ROS响应加剧了囊泡将CD95/Fas死亡受体单体从高尔基体转移向细胞质膜的过程。第三，受LCA刺激的TGR5可以激活MEKK1/2/3-MKK4/7蛋白激酶的级联反应。由于LCA可通过级联反应诱导神经源性肿瘤凋亡，并且一定浓度下具有对正常神经细胞保护作用，故LCA对胶质母细胞瘤抗肿瘤研究具有重要价值，其作用机制仍需进一步研究。石胆酸可杀死胶质瘤细胞，且不损伤正常神经元细胞。但石胆酸抗胶质瘤的机制目前尚不清楚，尤其是对胶质母细胞瘤有无调控作用尚不可知。既往研究得知不饱和醛类可激活Fas/FasL等细胞凋亡途径，而活性氧（ROS）可通过导致细胞结构和功能损伤，甚至细胞死亡，产生损害作用。质子漏通过脂质过氧化作用回到线粒体基质，限制活性氧产生，导致氧化磷酸化的解偶联发生。脂质过氧化引起自由基变化，生成不饱和醛类，是线粒体信号分子，诱发细胞凋亡，及引起突变诱发肿瘤。故建立不饱和醛线粒体模型，提供和搭建了研究石胆酸作用胶质母细胞瘤的分子机制的方法、桥梁和平台，具有重要研究价值。本研究选择胶质母细胞瘤线粒体为研究对象，采用过氧化氢诱导建立胶质母细胞瘤线粒体脂质过氧化模型，及建立不饱和醛线粒体模型，并在石胆酸干预下检测不饱和醛，探索石胆酸对不饱和醛的调控能力，初步阐明石胆酸通过线粒体抗胶质母细胞瘤的分子机制。结果本研究成功建立了生物活性不饱和醛线粒体模型，并实际应用于石胆酸调控胶质母细胞瘤的体外作用机制的研究。借助2-硫代巴比妥酸与生物活性不饱和醛反应，确定建立最佳模型条件：胶质母细胞瘤线粒体1.5mg/ml，H2O20.6mg/ml，反应时间30min，3.0ml46mM硫代巴比妥酸，检测指标为495nm、450nm和532nm峰变化。根据上述线粒体模型，石胆酸抗不饱和醛调控495nm、450nm和532nm变化的最佳条件为100μM，反应时间为15min和酸性微环境。研究结论为石胆酸通过调控495nm，450nm和532nm峰变化，产生抗胶质母细胞瘤作用。故可以得出石胆酸适宜浓度具有抗胶质母细胞瘤作用，不饱和醛胶质母细胞瘤线粒体模型将成为石胆酸机制研究的有效、快捷实用的平台。反式丁烯醛属于亲水性α, β-不饱和醛，可以通过线粒体脂质过氧化内源性产生，在产生位置高效吸收，然后与DNA反应，形成DNA加合物。反式丁烯醛的生物活性羰基，引起脂质过氧化作用，诱导细胞凋亡并产生致癌作用。其紫外光谱主峰为495nm，故之前研究结论石胆酸通过调控495nm，450nm和532nm峰变化，产生抗胶质母细胞瘤作用，有可能通过调控反式丁烯醛实现。但是目前，在分子水平上，关于石胆酸、反式丁烯醛、胶质母细胞瘤线粒体相互作用研究甚少，涉及相互作用机制报道匮乏。故阐明石胆酸作用于反式丁烯醛的作用及机制具有重要科研价值。因此，我们采用反式丁烯醛为靶标，以紫外可见吸收光谱和拉曼振动光谱媒介，观察石胆酸对反式丁烯醛的紫外可见吸收光谱和拉曼振动光谱变化，奠定石胆酸作为治疗脑胶质母细胞瘤机制基础。一方面，有利于阐明石胆酸对反式丁烯醛调控的分子机制，探究石胆酸作用反式丁烯醛可调谐分子靶点。另一方面，为进一步研究石胆酸抗胶质母细胞瘤分子机制提供理论基础。本研究采用紫外可见吸收检测紫外吸收变化，检测范围400-600nm；采用拉曼振动光谱检测反式丁烯醛振动光谱变化，检测范围在500-2000cm-1。结果发现石胆酸对反式丁烯醛具有调控作用，494nm主峰呈现逐渐下降趋势，具有浓度依赖性，表明羟醛缩合反应发生。拉曼振动光谱检测结果显示：极强带1676cm1和强带1642cm1的呈显着下降趋势，结果显示：石胆酸对反式丁烯醛的分子调控靶点可能位于C=O和C=C。石胆酸对反式丁烯醛的调控特征，为石胆酸具有保护正常神经细胞提供了分子学支持，进一步为石胆酸作为治疗胶质母细胞瘤的新药机制进行解释。故本研究通过紫外可见吸收光谱和拉曼振动光谱检测，提供了石胆酸调控反式丁烯醛的光谱特征。结果表明：石胆酸对反式丁烯醛调控表现在紫外可见吸收光谱主峰（494nm）和拉曼振动光谱1676cm1极强带及1642cm1强带的变化。不同浓度石胆酸明显降低反式丁烯醛含量。石胆酸调控反式丁烯醛靶点是C=O和C=C伸缩振动。石胆酸调控反式丁烯醛的分子机制是降低CHO中氧原子电子云，使CHO保持非激活态，防止共轭双键分子极化作用，影响甲基诱导效应和超共轭效应，本研究结果对石胆酸抗胶质母细胞瘤提供分子学支持，并发现石胆酸调控反式丁烯醛的分子靶点，为治疗胶质母细胞瘤药物研发提供了新的思路。
高恒[9]（2013）在《分泌型TRAIL基因修饰人脂肪干细胞靶向脑胶质瘤治疗的研究》文中研究表明研究背景神经胶质瘤（glioma）简称胶质瘤，是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤。胶质瘤包括多种不同的肿瘤类型，各个类型的恶性程度也不相同，其中恶性程度最高的当属多形性胶质母细胞瘤（Glioblastoma multiforme，GBM，WHO IV级）。由于该肿瘤细胞呈弥漫性或者浸润性生长，手术难以彻底切除所有肿瘤组织，即使术后配合放疗和化疗，患者的预后依然不理想。据统计，GBM患者经过治疗后的平均生存时间为14.6个月。因此，如何改善恶性胶质瘤患者的生存率及生存质量，这一直是医学界面临的难题。上世纪90年代初，基因治疗的热潮曾为恶性胶质瘤的治疗带来一线曙光，其中以HSV-TK GCV系统为代表的基因治疗虽然在动物试验中都取得了良好的效果，但是临床试验都未取得预期的疗效，这可能是由于病毒载体不稳定，目的基因不能长期表达，自体免疫，靶向性问题和病毒载体无法追踪浸润瘤细胞所致。目前很多研究表明，骨髓间充质干细胞，人脐带血干细胞，神经干细胞等对肿瘤都有趋化性。这种趋化性与肿瘤分泌的细胞因子和趋化因子有关，并且干细胞能透过破坏的血脑屏障，在肿瘤周围高浓度聚集。这一特性已经在各种体内和体外试验中被证实。这一特性目前认为是将以间充质干细胞作为载体的酶/抗肿瘤前药基因组合靶向治疗肿瘤的理想治疗策略之一。脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）目前也证明具有靶向肿瘤迁徙能力。在体外实验中，肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TNF-relatedapoptosis-inducing ligand，TRAIL）对胶质瘤、神经母细胞瘤、宫颈癌、非小细胞肺癌、肾细胞癌、甲状腺癌、黑色素瘤、肝癌等肿瘤都有诱导凋亡的作用。TRAIL对肿瘤细胞，如Hela宫颈癌细胞、A549肺癌细胞、人肝癌细胞、人乳腺癌细胞、早幼粒细胞有特异性的杀伤作用。体内的初步药效学研究表明，TRAIL可显着地抑制人肝癌细胞在小鼠体内的生长，但对正常小鼠无毒副作用。荷瘤动物应用重组的TRAIL蛋白后能够明显抑制肿瘤细胞生长，甚至使肿瘤消退，而对宿主没有明显的损害。许多实验表明，TRAIL与化疗药物相结合，有较好的抗肿瘤效果。因此TRAIL基因是理想的目标基因，具有明确的抑瘤作用，并且具备更深一步研究的前景。目的：将ADSCs靶向肿瘤迁徙和TRAIL选择性杀伤肿瘤细胞相结合，探索TRAIL修饰ADSCs双重靶向治疗脑胶质瘤的可能。方法：1．人腹部皮下脂肪组织中分离培养脂肪间充质干细胞ADSC，验证干细胞的分化潜能。2.验证脂肪间充质干细胞（adipose derived stem cells，ADSCs）向肿瘤细胞迁移的特性。将腺病毒－绿色荧光蛋白（AAV-GFP）标记的ADSCs悬液加入与U87MG胶质瘤细胞共培养，荧光显微镜下观察绿色GFP阳性ADSCs的积聚状态。体内在建立U87MG胶质瘤模型一周后，将LacZ标记的ADSCs静脉途径移植，观察ADSCs的积聚情况。3.从pROF-sTraIl质粒中获得sTRAIL基因片段，并将其重组于rAAV-GFP载体质粒中，生产出高滴度的AAV-CM-sTRAIL病毒颗粒。将其转染ADSCs后，检测其表达情况。4.采用静脉或瘤床内途径注射sTRAIL修饰的ADSCs，治疗裸鼠的U87MG脑胶质瘤模型，观察对生存期的影响。结果：1.人腹部皮下脂肪组织中分离出ADSCs，并在体外扩增成功，在条件培养基环境里能分化成成熟的脂肪细胞，成骨细胞和成软骨细胞。2.体外实验中荧光显微镜下可观察到，GFP阳性ADSCs均聚积于U87MG胶质瘤细胞克隆中，在无胶质瘤细胞的区域未见GFP阳性细胞。体内在U87MG胶质瘤裸鼠模型中脑肿瘤内的Lacz阳性的ADSCs（117.52±36.13/seetIon）显着高于对侧正常脑组织（34.82±7.14/seetIon）和其它器官（心脏:0/seetIon；肺脏:28.54±7.56/seetIon:肝脏:18.63±5.27/seetIon:脾脏:7.67±5.73/seetIon:.肾脏:31.78±12.04/seetIon）（p<0.001）。种植于肿瘤对侧半球的ADSCs大部分沿着白质纤维束向U87胶质瘤迁徙。3.高滴度的AAV-CM-sTRAIL病毒颗粒转染ADSCs后，对其表型和细胞活性无明显影响，ADSCs可稳定表达sTRAIL。4.采用静脉或瘤床内途径注射sTRAIL修饰的ADSCs，发现两种方法均能显着延长脑胶瘤裸鼠的生存期，其中有36%的ADSCs-sTRAIL治疗组苛瘤鼠生存期超过45天。结论：脂肪间充质干细胞ADSCs非常适合用作细胞基因治疗的载体，能稳定表达sTRAIL，并将sTRAIL成功的靶向运输至肿瘤部位诱导肿瘤细胞发生凋亡。
邢亮[10]（2013）在《TRAIL基因转染神经干细胞的实验研究》文中认为目的：探讨Trail基因在体外转染神经干细胞应用基因治疗的可行性以及转染后神经干细胞能否保持增殖及分化特性。方法：实验共分两部分第一部分；（1）从12～14天孕龄的大鼠胎鼠脑中分离出神经干细胞，并用无血清培养技术进行培养并传代；用免疫荧光对神经干细胞进行鉴定；（2）取传至第3～4代神经干细胞，分别按感染复数（Multiplicity of infection，MOI）为0、1、5、10、20加入携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）基因的慢病毒载体（Lentivirus vector）稀释液。于荧光显微镜下观察各组GFP的表达效率并摄片，行流式细胞仪检测以及神经球计数，得出各组NSCs的GFP阳性转染率以及神经干细胞球生成率。第二部分；（1）取传至第3～4代神经干细胞，用最适感染复数的慢病毒介导的GFP-TRAIL融合基因转染神经干细胞，观察目的基因转染情况及LV／TRAIL-GFP对神经干细胞增殖影响，利用免疫荧光及western-blot鉴定TRAIL基因在神经干细胞表达情况；（2）对转染后神经干细胞进行Nestin鉴定，再将转染后以及未转染的神经干细胞接种于用1%多聚赖氨酸包被的盖玻片上，用含10%胎牛血清和BMEM/F12培养基诱导细胞分化，在倒置显微镜下观察细胞转染前后的分化情况,并通过免疫荧光鉴定分化的细胞。结果：第一部分；（1）经无血清培养的细胞呈悬浮生长，可形成大小不等的细胞球，对细胞行免疫荧光染色呈现Nestin阳性。（2）转染报告基因GFP后，除MOI值为0的空白对照组外，荧光显微镜下观察其余各孔在2～3天后均有绿色荧光的GFP阳性表达。MOI值从0增至10，经流式细胞检测GFP阳性表达率逐渐提高（P<0．05），MOI值为10的组可获得>90％的转染率。经细胞计数发现MOI值从10增至20，形成的神经干细胞球数目却明显减少（P<0．05）。第二部分：（1）将慢病毒介导的GFP-TRAIL融合基因以MOI值10转染神经干细胞细胞，GFP绿色荧光24小时开始出现，72小时达最高分值，并且可以稳定表达，转染后的神经干细胞能增殖并传代。Western-blot结果显示GFP-TRAIL融合蛋白能持续稳定表达，对转染后神经干细胞行免疫荧光染色结果显示Trail表达蛋白阳性。（2）转染后神经干细胞免疫荧光染色呈现Nestin阳性。对转染组及未转染组神经干细胞行诱导分化，转染后神经干细胞能分化神经元及神经胶质细胞，且与未转染组比较无统计学差异，对转染后神经干细胞分化形成的神经元及神经胶质细胞行免疫荧光染色呈现NSE阳性和GFAP阳性。结论：（1）慢病毒可携带TRAIL成功转染神经干细胞；（2）转染TRAIL后神经干细胞仍具有增殖和分化潜能；（3）神经干细胞可以稳定持续表达TRAIL基因；（4）本实验为TRAIL转染后神经干细胞下一步体内、体外实验奠定基础。
二、TRAIL/APO-2L与神经胶质瘤细胞凋亡（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、TRAIL/APO-2L与神经胶质瘤细胞凋亡（论文提纲范文）
（1）TRAIL基因修饰间充质干细胞治疗恶性肿瘤研究进展（论文提纲范文）
| 1 MSCs及其向肿瘤趋化作用 |
| 2 TRAIL及其受体 |
| 3 TRAIL-MSCs治疗恶性肿瘤 |
| 3.1 TRAIL-MSCs对恶性实体肿瘤的治疗作用 |
| 3.2 TRAIL-MSCs对血液系统恶性肿瘤的治疗作用 |
| 4 放化疗提高TRAIL-MSCs抗肿瘤效果 |
| 5 结语 |
（2）TRAIL基因修饰间充质干细胞对神经胶质瘤细胞杀伤作用研究（论文提纲范文）
| 1 材料 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 TRAIL-MSCs制备及检测 |
| 2.2 ELISA法检测TRAIL-MSCs中TRAIL表达量 |
| 2.3 r TRAIL对U87MG、U251细胞的增殖抑制作用 |
| 2.4 U87MG、U251细胞对TRAIL的敏感性 |
| 2.5 TRAIL-MSCs培养上清对U87MG、U251细胞增殖的抑制作用 |
| 2.6 TRAIL-MSCs培养上清对细胞凋亡的影响 |
| 2.7 TRAIL-MSCs培养上清对DR4、DR5表达的影响 |
| 2.8 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 TRAIL-MSCs上清中TRAIL的表达量 |
| 3.2 r TRAIL对UC-MSCs、TRAIL-MSCs的增殖抑制作用 |
| 3.3 U87MG、U251细胞DR4、DR5 m RNA相对表达量 |
| 3.4 TRAIL-MSCs培养上清对U87MG、U251细胞的增殖抑制作用 |
| 3.5 TRAIL-MSCs培养上清对U87MG、U251细胞的凋亡作用 |
| 3.6 TRAIL-MSCs培养上清对U87MG、U251细胞DR4、DR5表达的影响 |
| 4 讨论 |
（3）改进型颈动脉注射法构建裸鼠脑转移瘤模型及隐丹参酮治疗脑瘤的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照表 |
| 第一部分 改进型颈动脉注射法构建裸鼠脑转移瘤模型 |
| 前言 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 慢病毒法构建双荧光标记稳定转染细胞株结果 |
| 2.2 稳定转染株细胞与原始株细胞增殖、迁移、侵袭能力评估结果 |
| 2.3 稳定转染株细胞体外发光检测结果 |
| 2.4 术后裸鼠行为、体质量及生存情况观察结果 |
| 2.5 活体成像检测结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 隐丹参酮治疗脑瘤的研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 CTS对 U87 细胞DR4、DR5和STAT3 表达的时效、量效关系 |
| 2.2 CTS与 TRAIL单独或联合应用对U87 细胞存活率的影响 |
| 2.3 CTS与 TRAIL单独或联合应用对U87 细胞凋亡的影响 |
| 2.4 CTS与 TRAIL联用对U87 细胞caspase家族及STAT3 表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 联合用药逆转胶质瘤对 TRAIL 耐药的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
（4）UMI-77与TRAIL联用诱导脑胶质瘤细胞凋亡以及PTPRU和DSTYK在神经系统中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 UMI-77与TRAIL联用诱导脑胶质瘤细胞凋亡 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 胶质瘤的简介 |
| 1.2 TRAIL与肿瘤治疗 |
| 1.2.1 凋亡信号通路 |
| 1.2.2 TRAIL的简介 |
| 1.2.3 基于TRAIL治疗肿瘤的策略 |
| 1.2.4 基于TRAIL治疗肿瘤的临床试验 |
| 1.3 基于TRAIL的胶质瘤治疗 |
| 1.3.1 胶质瘤中TRAIL受体的表达情况 |
| 1.3.2 胶质瘤对TRAIL的耐药性 |
| 1.3.3 克服胶质瘤对TRAIL耐药的策略 |
| 1.3.4 Mcl-1抑制剂与TRAIL联用治疗胶质瘤的研究现状 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 试剂 |
| 2.3 慢病毒介导的基因转导 |
| 2.3.1 干扰和过表达质粒的制备 |
| 2.3.2 慢病毒颗粒的包装 |
| 2.4 蛋白的免疫印迹实验 |
| 2.5 免疫共沉淀实验 |
| 2.6 细胞质和线粒体蛋白分离 |
| 2.7 MTT实验 |
| 2.8 流式细胞术 |
| 2.9 数据统计 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 Mcl-1在胶质瘤细胞TRAIL耐药中起到重要的作用 |
| 3.1.1 针对Mcl-1 mRNA的shRNA的有效性验证 |
| 3.1.2 敲减Mcl-1增强胶质瘤细胞对TRAIL的敏感性 |
| 3.2 UMI-77增强胶质瘤细胞对TRAIL的敏感性 |
| 3.2.1 UMI-77半抑制浓度(IC_(50))的测定 |
| 3.2.2 UMI-77与TRAIL联用诱导胶质瘤细胞凋亡 |
| 3.2.3 UMI-77与TRAIL联用导致线粒体外膜透化和caspase依赖的凋亡 |
| 3.3 UMI-77增强胶质瘤细胞对TRAIL敏感性的作用依赖于其对Mcl-1的抑制 |
| 3.3.1 过表达Mcl-1抑制UMI-77与TRAIL联用对胶质瘤细胞的诱凋亡效果 |
| 3.3.2 敲减Mcl-1增强UMI-77与TRAIL联用对胶质瘤细胞的诱凋亡效果 |
| 3.4 UMI-77增强胶质瘤细胞对TRAIL敏感性的机制研究 |
| 3.4.1 UMI-77解除Mcl-1对Bim和Bak的隔离并激活Bak |
| 3.4.2 Bid在UMI-77与TRAIL联用诱导胶质细胞凋亡中起到关键作用 |
| 第4章 本部分小结 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 讨论 |
| 第二部分 PTPRU在中脑多巴胺能神经元中的功能研究 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 中脑多巴胺能神经元(mDA)的简介 |
| 1.1.1 mDA神经元的发育 |
| 1.1.2 mDA神经元的投射和突触连接 |
| 1.1.3 mDA神经元的功能 |
| 1.1.4 mDA神经元与帕金森病 |
| 1.2 PTPRU的简介 |
| 1.2.1 RPTP基因家族 |
| 1.2.2 PTPRU基因的结构和功能 |
| 1.2.3 PTPRU在mDA神经元中的功能研究现状 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 动物的来源及饲养 |
| 2.1.1 动物的来源与购买 |
| 2.1.2 Ptpru条件性敲除小鼠的基因型鉴定 |
| 2.1.3 动物的饲养 |
| 2.2 原位杂交 |
| 2.3 免疫组织化学染色 |
| 2.4 多巴胺能神经元大小分析 |
| 2.5 纹状体TH阳性纤维的密度分析 |
| 2.6 中脑组织取材的方法 |
| 2.7 蛋白免疫印迹实验所用抗体 |
| 2.8 数据统计 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 Ptpru在小鼠脑中的表达情况 |
| 3.2 Ptpru条件性敲除小鼠的构建和鉴定 |
| 3.2.1 Ptpru~(flox/+)小鼠的构建和鉴定 |
| 3.2.2 Ptpru条件性基因敲除小鼠的验证 |
| 3.3 敲除Ptpru不影响mDA神经元TH免疫活性及纤维完整性 |
| 3.4 敲除Ptpru导致mDA神经元变小 |
| 3.5 敲除Ptpru导致中脑mTORC1信号通路活性降低、GSK3β活性升高 |
| 3.6 敲除Ptpru不影响黑质纹状体投射 |
| 3.7 敲除Ptpru不影响mDA神经元成熟标记物的表达和定位 |
| 第4章 本部分小结 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 讨论 |
| 第三部分 DSTYK在神经系统和肾脏发育中的功能研究 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 DSTYK的研究现状 |
| 1.1.1 RIP基因家族 |
| 1.1.2 DSTYK基因的功能 |
| 1.1.3 DSTYK与疾病的关系 |
| 1.2 痉挛性截瘫23型的简介 |
| 1.3 先天性肾脏及尿路畸形的简介 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 动物的来源及饲养 |
| 2.1.1 动物的来源 |
| 2.1.2 小鼠的基因型鉴定 |
| 2.1.3 动物的饲养 |
| 2.2 逆转录PCR和实时荧光定量PCR |
| 2.3 尼氏染色 |
| 2.4 开放旷场实验 |
| 2.5 转棒实验 |
| 2.6 水迷宫实验 |
| 2.7 构建在DSTYK N端敲入Flag标签的HEK 293T细胞系 |
| 2.7.1 sgRNA和ssODN的设计与构建 |
| 2.7.2 sgRNA切割有效性验证 |
| 2.7.3 构建在DSTYK N端敲入Flag标签的HEK 293T细胞系的流程 |
| 2.7.4 基因型鉴定 |
| 2.8 蛋白免疫印迹分析 |
| 2.9 免疫共沉淀实验 |
| 2.10 质谱分析 |
| 2.11 HE染色 |
| 2.12 免疫荧光组织化学染色 |
| 2.13 数据统计 |
| 第3章 DSTYK在神经系统中的功能 |
| 3.1 Dsyk基因敲除小鼠的构建与鉴定 |
| 3.1.1 Dstyk基因敲除小鼠的构建 |
| 3.1.2 mRNA和蛋白水平显示Dstyk~(-/-)小鼠脑中Dstyk基因敲除成功 |
| 3.2 敲除Dstyk后小鼠无明显脑部发育和形态异常 |
| 3.3 敲除Dstyk不影响小鼠基本的运动和平衡能力 |
| 3.4 敲除Dstyk导致小鼠空间学习和记忆功能下降 |
| 第4章 DSTYK在肾脏发育中的功能 |
| 4.1 Dstyk~(-/-)小鼠肾脏中Dstyk敲除的验证 |
| 4.2 敲除Dstyk后小鼠肾脏总体形态和组织学染色没有显着异常 |
| 4.2.1 敲除Dstyk后不影响小鼠泌尿系统的整体外观结构 |
| 4.2.2 敲除Dstyk后小鼠肾脏的H&E组织学染色没有显着异常 |
| 4.3 敲除Dsyk导致小鼠肾近曲小管细胞骨架异常 |
| 4.4 鉴定DSTYK相互作用蛋白 |
| 4.4.1 构建DSTYK基因N端敲入Flag标签的HEK 293T细胞系 |
| 4.4.2 Co-IP/MS鉴定DSTYK在HEK 293T细胞系中相互作用蛋白 |
| 4.4.3 验证DSTYK与细胞骨架蛋白的相互作用 |
| 笫5章 本部分小结 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录Ⅰ 在校期间发表文章和专利 |
（5）肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）偶联物的设计及其特异性抗肿瘤作用研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩写、符号清单、术语表 |
| 第1章 综述 |
| 1.1 TRAIL的结构与功能 |
| 1.2 TRAIL的受体种类 |
| 1.3 TRAIL诱导细胞凋亡机制及其调控 |
| 1.4 TRAIL的生物学活性 |
| 1.5 重组TRAIL的抗肿瘤作用及其毒性 |
| 1.6 TRAIL受体激动型单克隆抗体 |
| 1.7 部分细胞耐受TRAIL的机制 |
| 1.8 TRAIL联用化学药物 |
| 1.9 TRAIL衍生物的研究进展 |
| 1.10 展望 |
| 参考文献 |
| 第2章 TRAIL-NC1和TRAIL-TD融合蛋白的设计与复性 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料及基本操作 |
| 2.3 实验步骤及方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 实验讨论 |
| 2.6 实验小结 |
| 第3章 TRAIL-vcMMAE的设计与抗肿瘤活性研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料及基本操作 |
| 3.3 实验步骤及方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 实验讨论 |
| 3.6 实验小结 |
| 第4章 一种突变Cys位点特异性PEG修饰TRAIL的方法及其产物的抗肿瘤活性研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与基本操作 |
| 4.3 实验步骤与方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.5 实验讨论 |
| 4.6 实验小结 |
| 论文主要创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在读期间主要研究成果 |
（6）rh-Apo2L联合长春瑞滨诱导人肺鳞癌细胞凋亡及相关机制的实验研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 硕士在读期间发表的文章 |
（7）Mcl-1和IAPs家族蛋白介导肝癌细胞抗凋亡作用及其分子机制的研究（论文提纲范文）
| 第一部分 中文摘要 |
| 第一部分 英文摘要 |
| 第二部分 中文摘要 |
| 第二部分 英文摘要 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一部分 Mcl-1 在肝癌靶向治疗中的作用及其分子机制研究 |
| 引言 |
| 1.1 去甲斑蝥素增强 ABT-737 诱导肝癌细胞凋亡作用及其机制研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 主要的仪器设备 |
| 4 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 1.2 阿斯匹林通过抑制 Mcl-1 克服肝细胞癌对 Navitoclax 耐药的作用及其分子机制 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 IAPs 家族蛋白介导肝癌细胞抗凋亡作用及其分子机制的研究 |
| 引言 |
| 2.1 IAP 拮抗剂对 APO2L/TRAIL 的肝癌细胞治疗的增敏作用及其分子机制研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 2.2 SM-164 增强肝癌细胞对阿霉素治疗敏感性作用及其分子机制研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 综述一 Mcl-1 的肿瘤分子靶向治疗 |
| 综述二 IAPs 抑制剂治疗肿瘤的作用及其机制 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（8）石胆酸对胶质母细胞瘤线粒体脂质过氧化调控机制的研究（论文提纲范文）
| 序 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 文献综述 |
| 1.2.1 胶质母细胞瘤凋亡途径的研究 |
| 1.2.2 石胆酸选择性杀灭神经母细胞瘤研究 |
| 第2章 石胆酸经H_2O_2介导的胶质瘤线粒体途径调控具有生物活性的Α,Β-不饱和醛 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料及仪器设备 |
| 2.2.2 试剂设定 |
| 2.2.3 胶质母细胞瘤线粒体的制备 |
| 2.2.4 脂质过氧化线粒体模型 |
| 2.2.5 石胆酸对胶质母细胞瘤线粒体脂质过氧化作用的醛类反应的影响因素的测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 H_2O_2诱导的胶质母细胞瘤线粒体脂质过氧化作用中醛类紫外峰变化的模型特点 |
| 2.3.2 胶质母细胞瘤线粒体脂质过氧化过程中石胆酸对醛类浓度变化的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第3章 紫外可见光光谱法与拉曼光谱法检测石胆酸作用反式丁烯醛的可调谐 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 仪器 |
| 3.2.3 实验步骤 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 石胆酸与反式丁烯醛分子间相互作用的分析 |
| 3.3.2 石胆酸调控反式丁烯醛的紫外可见吸收光谱特征 |
| 3.3.3 石胆酸对反式丁烯醛调控的拉曼振动光谱 |
| 3.4 结论 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及攻读博士期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（9）分泌型TRAIL基因修饰人脂肪干细胞靶向脑胶质瘤治疗的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 脂肪间充质干细胞的分离与培养 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 脂肪间充质干细胞靶向胶质瘤迁徙的实验研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 分泌型sTRAIL成人脂肪间充质干细胞的建立 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 TARIL基因修饰脂肪干细胞诱导脑胶质瘤凋亡的实验研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 TRAIL及其受体在脑胶质瘤治疗中的应用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（10）TRAIL基因转染神经干细胞的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 大鼠神经干细胞培养及慢病毒介导 GFP 基因转染神经干细胞的实验研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 TRAIL 基因转染神经干细胞的实验究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 英汉缩略词对照表 |
| 致谢 |
| 神经干细胞治疗胶质瘤的实验研究进展（综述） |
| 参考文献 |
四、TRAIL/APO-2L与神经胶质瘤细胞凋亡（论文参考文献）
- [1]TRAIL基因修饰间充质干细胞治疗恶性肿瘤研究进展[J]. 刘广洋,张晨亮,李欣,苗丽,徐立强,米一,陈瑶瑶,刘拥军. 药物评价研究, 2021(10)
- [2]TRAIL基因修饰间充质干细胞对神经胶质瘤细胞杀伤作用研究[J]. 李欣,徐立强,米一,苗丽,张晨亮,刘拥军,刘广洋. 药物评价研究, 2021(10)
- [3]改进型颈动脉注射法构建裸鼠脑转移瘤模型及隐丹参酮治疗脑瘤的研究[D]. 赵峰. 桂林医学院, 2021(01)
- [4]UMI-77与TRAIL联用诱导脑胶质瘤细胞凋亡以及PTPRU和DSTYK在神经系统中的功能研究[D]. 刘霁纬. 华东理工大学, 2017(05)
- [5]肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）偶联物的设计及其特异性抗肿瘤作用研究[D]. 潘利强. 浙江大学, 2014(01)
- [6]rh-Apo2L联合长春瑞滨诱导人肺鳞癌细胞凋亡及相关机制的实验研究[D]. 张妍. 福建医科大学, 2014(02)
- [7]Mcl-1和IAPs家族蛋白介导肝癌细胞抗凋亡作用及其分子机制的研究[D]. 李功权. 郑州大学, 2014(02)
- [8]石胆酸对胶质母细胞瘤线粒体脂质过氧化调控机制的研究[D]. 张博. 吉林大学, 2014(09)
- [9]分泌型TRAIL基因修饰人脂肪干细胞靶向脑胶质瘤治疗的研究[D]. 高恒. 苏州大学, 2013(09)
- [10]TRAIL基因转染神经干细胞的实验研究[D]. 邢亮. 泸州医学院, 2013(04)