一、采用Ⅳ型胶原酶构建大鼠脑出血模型（论文文献综述）
刘林[1]（2021）在《Netrin-1来源的功能肽对脑出血后继发性神经损伤修复作用研究》文中认为脑出血（Intracerebral hemorrhage,ICH）是一类原发性的非外伤性脑实质内出血,释放的血液及血液分解产物压迫脑实质并造成继发神经损伤,可导致患者致残甚至危及生命。临床上可通过手术治疗有效清除血肿,但血液分解产物所造成的神经元继发性损伤是脑出血后致残的重要因素,目前仍缺乏有效的药物。因此,如何修复脑出血后神经元继发性损伤并加强神经保护作用,对于脑出血患者临床治疗及功能重建具有关键性作用。Netrin-1是一种分泌性轴突导向因子,通过与其受体结合在神经发育及损伤修复中发挥重要作用。近来临床研究发现,脑出血患者血清Netrin-1含量逐渐上升,提示Netrin-1可能参与脑出血后的功能恢复。在实验性脑出血模型中,脑内注射Netrin-1可以减少受体介导的神经元凋亡。由于Netrin-1是潜在的促癌因子,深入研究Netrin-1的神经保护,减少毒副作用,对于开发和利用Netrin-1具有重要意义。已有的研究表明,Netrin-1与其受体结直肠癌相关蛋白（Deleted in Colorectal Cancer,DCC）相互作用的结构域分别是EGF3和FN5结构域。我们首先通过GST pull down确认EGF3与FN5特异结合,Netrin-1缺失EGF3功能结构域（407-443氨基酸）不能与其受体DCC结合。依据此特点构建的Netrin-1来源多肽片段Pep EGF3,FITC标记的Pep EGF3可以特异性的结合其受体DCC,有效激活下游信号分子,包括粘着斑激酶（focal adhesion kinase,FAK）、Src家族激酶（Src family kinase,SFK）成员SRC及细胞外信号调节激酶（Extracellular Signal Regulated Kinase,ERK）。为了优化Netrin-1来源多肽的最小功能片段,我们将EGF3分为两个肽段:E1多肽（Pep E1）为407-422位氨基酸,E2多肽（Pep E2）为423-433位氨基酸。免疫印迹实验表明Pep E1与Pep E2能够与其受体DCC相互结合,激活下游信号分子磷酸化,具有时间和浓度依赖的特征。两种多肽之间区别在于Pep E1仅激活FAK与SFK信号通路,而Pep E2除了活化FAK与SFK外,还可以激活ERK磷酸化。为了探究Pep E1和E2在神经损伤中的修复作用,我们在体外培养的NLT（Gn RHexpressing neuronal cells）细胞及原代神经元中使用血红素（Hemin）构建神经元损伤模型,模拟脑出血后继发性神经损伤。Hemin处理不同时间的NLT细胞检测结果显示,Hemin刺激6h后Netrin-1表达达到高峰,随后下降。随后,在Hemin诱导的损伤细胞中给予不同浓度的Pep E1、E2共孵育。细胞活力检测及细胞存活实验结果显示,Pep E1依赖DCC激活FAK与SFK磷酸化,将细胞的存活率由50%提高到60～76%。这些结果表明Netrin-1来源的Pep E1具有神经保护性作用,在Hemin诱导的神经元损伤模型中Pep E1能够有效的减少细胞损伤及体外原代培养神经元死亡。未能观察到Pep E2明显的神经保护作用,可能与细胞损伤后ERK磷酸化促进细胞坏死有关。通过小鼠右侧纹状体立体定位注射Ⅶ型胶原酶方式建立脑出血动物模型,该模型小鼠表现为左侧前肢精细动作异常。脑出血诱导小鼠皮层中Netrin-1蛋白表达上调,损伤后2天达到高峰。为了明确Pep E1在小鼠脑出血中神经保护作用,在确保脑出血模型小鼠的初始血肿体积相似的前提下,腹腔注射Netrin-1来源的Pep E1,该肽段有效穿过血脑屏障,可以提高脑出血模型小鼠生存率,明显改善脑出血模型小鼠前肢不对称的异常行为;Pep E1通过激活FAK和AKT信号途径有效降低纹状体血肿体积,减少神经元损伤。综上所述,我们发现源自Netrin-1的一段功能性短肽Pep E1,可以特异性结合受体DCC且激活下游FAK和SRC信号通路。Pep E1可以减轻体内外神经细胞损伤,提高脑出血模型小鼠生存率,改善小鼠脑出血症状,这些结果为开发和利用Netrin-1功能短肽的神经保护作用提供了理论依据。
刘若凡[2]（2021）在《基于脑出血急性期大鼠模型探讨活血化瘀法对血肿的影响及应用时间窗》文中研究表明目的:1.系统回顾并分析脑出血急性期应用活血化瘀法的随机对照试验（randomized con-trolledtrial,RCT）中活血化瘀法的干预时点及药物特点;2.基于文献分析结果,设置不同干预时点,以脑血疏口服液作为代表活血化瘀法的实验药物,探索脑血疏口服液不同时点应用对大鼠神经功能和血肿体积的影响,探讨其用药时间窗;3.借助网络药理学方法预测脑血疏口服液影响血肿吸收的潜在效应机制。方法:1.本研究在中国知网、万方、PubMed数据库中检索脑出血急性期应用活血化瘀药治疗的RCT,并查询临床试验注册系统ClinicalTrials.gov及中国临床试验注册中心,检索时限均为2001年至2020年,文种限定为中文和英文,以脑出血、脑出血急性期、出血性中风急性期、出血性卒中急性期、活血、化瘀、破血、逐瘀等为检索词。将纳入研究中涉及的干预时点、药物、方药组成等录入Excel中建立文献数据库,运用SPSS进行统计和聚类分析。2.将SPF级SD大鼠随机分为假手术组（A组）、模型组（B组）、预给药组（C组）、造模后6h给药组（E组）、造模后24h给药组（G组）5组,每组8只。采用尾状核注射Ⅶ型胶原酶构建大鼠脑出血模型。造模前,C组予1.8 mL/kg.d-1脑血疏口服液灌胃7 d,其余4组予1.8mL/kg·d-1生理盐水灌胃7d;造模后,A组和B组予1.8mL/kg.d-1生理盐水灌胃,C组和E组在造模6h后予1.8 mL/kg·d-1脑血疏口服液灌胃,G组在造模24h后予1.8 mL/kg·d-1脑血疏口服液灌胃,每组大鼠均每隔24h给药一次,共3d。术后1d、3d用改良的神经功能缺损评分标准对大鼠行为学进行记录和评估,磁共振成像（magnetic resonance imaging,MRI）技术扫描获得大鼠颅脑影像,使用Sante DICOM Viewer软件重复3次测量取平均值,利用公式计算获得血肿体积并计算血肿吸收率。用药3 d后大鼠断头取脑,通过Western Blot和免疫组化方法,观察CD36蛋白表达情况。3.借助中药系统药理学数据库与分析平台和Pubchem数据库获得脑血疏口服液组成中药的活性成分,通过SwissADME数据库及SwissTargetPrediction数据库进行有效活性成分筛选和靶点预测,采用GeneCards数据库和人类孟德尔遗传数据库（Online Men-delian Inheritance in Man,OMIM）获得脑出血血肿吸收靶点,借助Cytoscape软件及插件进行基因本体（Gene Ontology,GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路分析,初步探索脑血疏口服液影响脑出血血肿吸收的可能机制。结果:1.共纳入102项RCT,29项研究未对活血化瘀药的干预时间进行详细说明,1项研究将干预时间限制在发病6 h内,2项研究将干预时点明确至发病6-24 h内,共有31项研究将活血化瘀药的干预时点明确在发病24 h后。明确用药时点的73项研究中,共55项研究使用中药汤剂、口服液或胶囊等口服活血化瘀药,涉及处方40个,中药68味,用药频次总共320次,结合治疗思路可以聚类为四大类,第一类包括大黄、水蛭、川芎、三七、赤芍、桃仁、红花、黄芪、石菖蒲、蒲黄、丹参、地龙、芒硝、牛膝,第二类包括泽泻、猪苓、土鳖虫,第三类包括茯苓、益母草、甘草,第四类包括黄芩、栀子、厚朴、当归。2.造模后第1天对大鼠进行神经功能评分,B组、C组、E组及G组的评分差异无统计学意义;与造模1 d后相比,造模3d后各组大鼠评分均有下降,其中B组、C组、E组及G组评分下降明显（P<0.05）;造模后第3天对大鼠进行神经功能评分,与B组相比,C组及E组神经功能评分降低（P<0.05）。造模后1 d使用MRI扫描比较血肿体积,B组、C组、E组及G组的大鼠血肿体积进行组间比较,差异无统计学意义（P>0.05）。造模后3d进行MRI扫描,与造模后1 d测得大鼠血肿体积相比,C组、E组、G组造模后3 d测得血肿体积减小（P<0.05）;造模后3 d测得各组大鼠血肿体积进行比较,C组、E组的大鼠血肿体积小于B组（P<0.05）;与B组相比,C组、E组的血肿吸收率显着提高（P<0.05）。Western Blot结果显示,与A组相比,B组、C组、E组及G组的CD36表达水平升高（P<0.05）;与B组相比,C组和E组的CD36表达水平显着升高（P<0.05）。免疫组化结果显示,与B组相比,C组、E组和G组光镜下可见血肿周围CD36免疫标记阳性表达染色加深,数量增多;平均光密度值进行半定量分析结果显示,与B组相比,C组、E组和G组的大鼠血肿周围CD36表达水平显着升高（P<0.01）。3.经筛选后得到脑血疏口服液包含候选活性成分共235个,其中川芎73个,大黄28个,黄芪33个,牡丹皮21个,牛膝32个,石菖蒲51个,水蛭33个;预测后得到229个潜在作用靶点,其中川芎40个,大黄66个,黄芪123个,牡丹皮107个,牛膝114个,石菖蒲116个,水蛭45个;借助Cytoscape构建有效活性成分-预测靶点相互作用网络,每个活性成分平均与9.9个预测靶点相互作用,每个预测靶点平均与2.7个活性成分相互作用;经筛选获得脑出血血肿吸收的相关靶点437个;通过构建脑血疏口服液影响脑出血血肿吸收蛋白互作网络,筛选后获得关键靶点126个。对126个关键靶点分别进行GO功能注释,共得到43条生物学过程信息、68条细胞组分信息、39条分子功能信息（均P<0.05）;对126个关键靶点进行KEGG富集分析,得到72条信号通路（均P<0.01）,聚类后得到34大类信号通路,结合前项研究中CD36研究结果,预测通过调节 Toll 样受体（Toll-likereceptors,TLR）和核因子-κB（nuclear factor-kappaB,NF-κB）信号通路调控CD36蛋白表达,可能是脑血疏口服液影响脑出血血肿吸收的作用机制之一。结论:1.脑血疏口服液在脑出血急性期6 h内给药未加重大鼠神经功能损伤,未导致大鼠血肿扩大。脑血疏口服液在脑出血急性期6 h内给药可改善大鼠神经功能,促进大鼠血肿吸收,优于在脑出血后24h给药,脑出血后6h内使用脑血疏口服液对大鼠神经功能恢复及血肿吸收最有益。脑出血后6 h内使用脑血疏口服液可通过提高CD36蛋白表达更早启动血肿清除。2.脑血疏口服液可直接或间接通过调控多个靶点促进血肿吸收,多条信号通路参与其中。结合前项研究结果,预测脑血疏口服液可以通过调节TLR/NF-κB信号通路调控CD36蛋白表达,促进内源性血肿清除。
王若男[3]（2020）在《基于破血化瘀法的脑出血方干预脑血肿吸收机制的研究》文中提出目的:探讨以破血化瘀法为指导的脑出血方对脑血肿及血肿代谢产物吸收的调控作用和分子机制。方法:1.建立胶原酶注射诱导脑出血大鼠模型,根据体重随机分为空白对照组、假手术组、模型组、脑出血方低剂量组、脑出血方中剂量组、脑出血方高剂量组,每组10只大鼠,造模后3h按照时间及组别给予药物灌胃,到达相应时间点（1d、3d、5d、10d）收取样本。观察大鼠神经功能评分、冠状位血肿最大切面面积比和脑血肿体积。通过HE染色观察大鼠血肿周围组织病理情况;Western blot法检测大鼠血肿周围组织中CD47、CD36、CD163、PPARγ、Nrf2、TLR4、NF-κb、MyD88、TRIF、IL-1β蛋白表达的情况。2.将红细胞（RBC）按照40:1的比例与小胶质细胞（Microglial cell）共培养建立脑出血体外模型,分为正常组、模型组、辛伐他汀组、脑出血方低剂量组、脑出血方中剂量组、脑出血方高剂量组,给予相应药物干预。免疫荧光法观察Microglial cell吞噬RBC情况;流式细胞仪检测小胶质细胞吞噬RBC能力;Western Blot检测CD36、CD47、PPARγ、Nrf2、TLR4、NF-κb、MyD88、TRIF蛋白表达;RT-PCR检测CD36基因表达;Elisa法检测TNFα、IL-1β、IL-6蛋白表达。结果:1.在动物实验中,与空白组和假手术组比较,模型组动物Longa评分上升,显示运动神经功能下降,冠状位血肿最大面积比增加,血肿体积增加;与模型组相比,各给药组动物Longa5评分下降,同时冠状位血肿最大面积比减少,血肿体积减小,其疗效与脑出血方给药剂量相关,中剂量组效果较显着。2.在动物实验中,与空白组相比,模型组动物血肿周围组织中CD36、CD163、PPARγ、Nrf2表达上升;CD47、TLR4、NF-κb、TRIF、MyD88、IL-1β表达下降;与模型组比较,各给药组动物血肿周围组织中CD36mRNA表达上升。脑出血方对于CD36相关蛋白及mRNA表达的调节与其给药剂量相关,中剂量组效果较显着。3.在小胶质细胞（Microglial cell）与RBC共培养实验中,与模型组比较,辛伐他汀和脑出血方各剂量组能促进小胶质细胞吞噬清除RBC,对小胶质细胞吞噬RBC的促进作用与脑出血方的给药浓度呈正相关。4.在小胶质细胞与RBC共培养实验中,模型组细胞CD36、CD163、PPARγ、Nrf2表达上升,CD47、TLR4、NF-κb、TRIF、MyD88、TNFα、IL-1β表达下降;与模型组比较,各给药组细胞中CD36、CD163、PPARγ、Nrf2表达上升,CD47、TLR4、NF-κb、TRIF、MyD88、TNFα、IL-1β表达下降。与空白组相比,模型组中CD36mRNA的表达上升;与模型组相比,各给药组动物血肿周围组织中CD36mRNA表达上升。结论:1.脑出血方具有促进脑出血动物模型行为学改善的作用,能够促进小胶质细胞吞噬清除RBC,从而促进血肿吸收,加快脑出血动物神经功能恢复。2.脑出血方能够促进脑出血体内外模型CD36信号通路相关指标CD36、PPARγ、Nrf2的表达,抑制CD47、TLR4、NF-κb、TRIF、MyD88、TNFα、IL-1β表达。说明脑出血方通过激活CD36信号通路,促进脑出血后血肿吸收;抑制TLR4/MYD88炎症通路,减少脑出血后继发炎症损伤,从而改善脑出血后神经功能障碍。3.应用脑出血体外模型验证了脑出血方通过CD36起到促进脑血肿吸收的作用。
袁梦晨[4]（2020）在《基于网络药理学的醒脑静注射液干预脑出血的作用机制研究》文中进行了进一步梳理背景脑出血（Intracerebral hemorrhage,ICH）是指原发性非外伤性的脑实质内血管破裂出血,是最常见的急性脑血管疾病之一,具有起病急,病情险,进展快的特点。ICH发生后,血液积聚在脑实质,对其周围脑组织造成机械性压迫,同时,炎症反应、缺血缺氧、循环障碍、BBB损伤、血液活性物质释放、代谢紊乱等均造成了出血后的继发性损伤。目前,临床上针对ICH的治疗方法都缺乏针对性。醒脑静注射液源自《温病条辨》安宫牛黄丸,是以天然麝香、冰片、栀子、郁金为主要成分复方中药制剂,具有醒脑开窍、清热解毒凉血的功效,对多因素导致的出血和缺血性中风病都有良好的临床效用。网络药理学是基于系统生物学和多向药理学的理论,对生物系统进行网络拓扑分析的新学科。中医药网络药理学研究与中国传统医学的“整体观念”不谋而合,能够充分体现中药及其方剂的多成分、多途径、多靶点协同作用的特点。可以在低成本的情况下预测醒脑静注射液的主要作用成分和关键作用靶点,构建不同药物不同成分不同靶点的相互作用网络。目的通过网络药理学方法研究醒脑静注射液干预脑出血的有效成分、关键作用靶标和作用机制,为醒脑静注射液治疗脑出血提供理论和实验依据。方法1.从 TCMSP、BATMAN-TCM、TCMID、TCM-MESH 以及 ETCM 数据库中醒脑静注射液（麝香、冰片、栀子、郁金组成）的全部化学成分,根据“BBB≥-0.3”和“DL≥0.18”筛选潜在的活性成分,利用TCMSP和BATMAN-TCM数据库构建醒脑静注射液各味中药的活性成分-靶点网络。通过检索 SwissTargetPrediction、DisGenet、CTD、Genecards以及Open Target Platform数据库获得脑出血靶点信息数据集。将醒脑静注射液的靶点基因数据集与脑出血靶点基因数据集进行对比分析,获得重叠基因并进行GO及KEGG分析。通过STRING数据库和Cytoscape软件的MCODE模块功能,对比分析挖掘醒脑静注射液模块（X模块）和脑出血模块（Ⅰ模块）联系与差异,获得经筛选出来的模块中联系密集的靶点,将靶点与CTD数据库获得的神经炎症靶点进行映射,构建醒脑静注射液通过调控炎症反应干预脑出血的药物-成分-靶点-疾病网络。2.使用SPF级健康雄性SD大鼠,运用Ⅶ型胶原酶注入尾状核建立大鼠脑出血模型,将造模成功的大鼠随机分为模型组、醒脑静组和依达拉奉组。采用mNSS神经功能评分和前肢放置试验判断大鼠脑出血后神经功能缺损情况。通过T2加权MRI观察脑血肿量。通过TUNEL染色、尼氏染色观察大鼠脑出血后脑组织病理结构。通过Western blotting检测TGF-β1、ANXA1、iNOS、mTOR蛋白的表达情况。结果1.根据BBB≥-.3,DL≥0.18的筛选标准,共得到麝香主要活性成分4个,靶点547个;冰片主要活性成分4个,靶点67个;郁金主要活性成分19个,靶点47个;栀子主要活性成分21个,靶点158个。合并去重后获得醒脑静注射液靶点635个构建药物-成分-靶点网络。2.醒脑静注射液和脑出血共同作用靶点的GO分析BP结果显示醒脑静注射液可能通过调控白细胞活化激活的炎症反应来干预脑出血,CC结果显示醒脑静注射液干预脑出血的细胞水平与多种突触密切相关,MF分子功能层面与G蛋白耦联受体参与调控的突出后电位离子转运、药靶结合等有紧密联系。KEGG的富集分析显示其作用机制可能与 MAPK signaling pathway、P13K-Akt signaling pathway、mTOR signaling pathway、TGF-β1 signaling pathway等22条信号通路有关,并构建药物-成分-靶标-通路网络。3.模块分析划分醒脑静注射液模块15个和脑出血模块37个通过模块对比分析,剔除了不关联的模块和部分联系不紧密的靶点,选取高关联性的模块合并进行分析,将353个醒脑静注射液与脑出血共同作用靶点集中到176个。通过CTD数据库检索“神经炎症”获得212篇文献2669个靶点,将其与模块筛选出来的176个靶点进行映射,获得88个醒脑静注射液通过调控炎症反应干预脑出血的可能作用靶标,对靶标进行网络拓扑分析,为后续实验验证提供参考标准和理论基础。4.脑出血3天,与模型组相比,醒脑静组大鼠神经功能缺损情况明显改善,T2加权MRI病变体积明显减少,病理观察显示醒脑静组尼氏小体较模型组大、多且清晰,且凋亡细胞数较模型组明显减少,提示醒脑静注射液对神经元保护作用和脑保护作用。5.Western blot的结果显示,与假手术组相比,脑出血模型组大鼠脑组织中ANXA1、iNOS的表达明显升高,TGF-β1、mTOR表达明显降低。与模型组相比,醒脑静组大鼠脑出血后脑组织中ANXA1、TGF-β1、mTOR的表达明显增高,iNOS的表达明显降低。结论醒脑静注射液能够从多靶点、多途径作用减轻神经功能缺损和脑组织损伤,促进血肿吸收,保护神经元的正常功能。
邓洪[5]（2020）在《P2X7受体活化对小鼠脑出血后氧化应激的影响及机制研究》文中研究表明背景:脑出血后继发性损伤会进一步加重血肿周围组织损伤和神经功能的恶化。临床上仍没有比较安全和有效的方法干预脑出血后继发性损伤,更加清晰的阐明脑出血后继发性损伤的病理机制尤为重要。细胞受到刺激或损伤后会向细胞外释放ATP,细胞外异常积聚的ATP激活P2X7受体所致的氧化应激在中枢神经系统变性疾病的发生发展中起着重要作用。目前,P2X7受体在脑出血后氧化应激损伤中研究甚少,本研究旨在探讨P2X7受体是否介导脑出血后氧化应激及其可能的机制。方法:通过立体定位注射VII型胶原酶构建C57BL/6小鼠脑出血模型,后续研究共分为三个部分。第一部分首先通过Western blot检测脑出血后血肿周围组织不同时间点P2X7受体的表达变化,免疫荧光染色确定P2X7受体表达的细胞定位。进一步分别经侧脑室注射P2X7受体的激动剂Bz ATP和腹腔注射P2X7受体抑制剂A438079处理脑出血小鼠。通过Western blot检测P2X7受体的表达;通过试剂盒检测血肿周围组织MDA、SOD、GSH和GSH/GSSH水平反映氧化应激程度;通过TUNEL染色检测血肿周围组织细胞凋亡;通过干湿重法测量脑含水量评估脑水肿程度;通过改良的Garcia评分、墙角实验和前肢放置实验评估小鼠的神经功能损伤。第二部分首先分别用P2X7受体的激动剂Bz ATP和抑制剂A438079处理脑出血小鼠,通过Western blot检测小鼠血肿周围组织NOX2的表达。随后进一步经腹腔注射NOX2的抑制剂GSK2795039处理脑出血小鼠,通过试剂盒检测血肿周围组织MDA、SOD、GSH和GSH/GSSH水平反映氧化应激程度;通过干湿重法测量脑含水量评估脑水肿程度;通过改良的Garcia评分、墙角实验和前肢放置实验评估小鼠的神经功能损伤。第三部分首先分别用P2X7受体的激动剂Bz ATP和抑制剂A438079处理小鼠,通过Western blot及免疫荧光染色检测血肿周围组织ERK1/2、JNK、p38、NF-κB及其相应的磷酸化蛋白p-ERK1/2、pJNK、p-p38、p-NF-κB。进一步分别经侧脑室注射ERK1/2激活抑制剂U0126和NF-κB转录活性抑制剂JSH-23处理小鼠,通过Western blot检测血肿周围组织NOX2的表达;通过试剂盒检测血肿周围组织MDA、SOD、GSH和GSH/GSSH比值水平反映氧化应激程度;通过TUNEL染色检测血肿周围组织细胞凋亡。结果:在第一部分实验中,P2X7受体在小鼠脑出血后表达逐渐升高,在出血后24小时达到峰值,随后逐渐降低;免疫荧光染色表明血肿周围组织神经元表达P2X7受体比例最高。P2X7受体激动剂Bz ATP处理小鼠后进一步增加出血后24小时P2X7受体的表达,而P2X7受体抑制剂A438079处理能减少脑出血后P2X7受体的表达。通过抑制P2X7受体后能减少出血后24小时血肿周围组织MDA水平和提高SOD活力、GSH水平和GSH/GSSH比值;同时也能减轻脑出血后细胞凋亡、脑水肿和神经功能损伤。在第二部分研究中,P2X7受体激动剂Bz ATP处理小鼠后会进一步增加出血后24小时血肿周围组织NOX2的表达,而P2X7受体抑制剂A438079处理则能减少NOX2的表达。通过GSK2795039抑制NOX2后能减轻脑出血后P2X7受体活化所致的氧化应激、脑水肿和神经功能损伤。在第三部分研究中,P2X7受体激动剂Bz ATP处理小鼠后会进一步增加出血后24小时血肿周围组织ERK1/2和NF-κB的磷酸化水平,而P2X7受体抑制剂A438079处理则能减少血肿周围组织ERK1/2和NF-κB的磷酸化。通过U0126抑制脑出血后ERK1/2的激活,能减轻P2X7受体活化所介导的出血后24小时血肿周围组织NOX2表达上调、氧化应激和细胞凋亡。同时,通过JSH-23抑制NF-κB的转录活性后也能减轻P2X7受体活化所介导的出血后24小时血肿周围组织NOX2表达上调、氧化应激和细胞凋亡。结论:我们的研究表明,脑出血后P2X7受体的活化通过激活ERK1/2和NF-κB信号通路加重NOX2介导的氧化应激。同时,新型的NOX2抑制剂GSK2795039用于治疗脑出血后继发性损伤可能具有远大前景。
任思颖[6]（2020）在《miR-18a靶向调控RUNX1影响大鼠脑出血后血脑屏障通透性的分子机制研究》文中研究指明目的:微小RNA（mi RNA）与脑水肿的形成密切相关,但其机制尚不清楚。本研究旨在探讨脑出血后mi R-18a是否通过靶向结合RUNX1导致血脑屏障（Blood-brain Barrier,BBB）紧密连接相关蛋白Occludin和ZO-1表达减少从而导致BBB通透性增高进而形成脑水肿的分子机制。方法:1.细胞实验:体外培养脑微血管内皮细胞（Brain Microvascular Endothelial Cell,BMVEC）与星形胶质细胞（Astrocyte,AC）,采用VIII因子及神经胶质原纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP）相关抗原免疫荧光分别鉴定BMVEC和AC表达,建立BMVEC与AC共培养的体外BBB细胞模型,分为八组:（1）模型组（model）:BBB细胞模型建立好后加入20U/m L凝血酶培养24h构建体外脑出血BBB细胞模型;（2）过表达对照组:按照MOI=1:10（Multiplicity of Infection,MOI,即感染复数,指感染时病毒与细胞数量的比值）的比例加入mi R-18a过表达对照的腺病毒（空载体）;（3）mi R-18a过表达组（mi R-18a）:按照MOI=1:10的比例加入过表达mi R-18a的腺病毒（可以计算成细胞数量的10倍的病毒）;（4）干扰对照组:按照MOI=1:10的比例加入mi R-18a干扰对照的腺病毒（空载体）;（5）mi R-18a干扰组（sh-mi R-18a）:按照MOI=1:10的比例加入干扰mi R-18a的腺病毒;（6）正常对照组:按照MOI=1:10的比例加入RUNX1过表达对照的腺病毒（空载体）;（7）mi R-18a和RUNX1同时过表达组（mi R-18a+RUNX1）:按照MOI=1:10的比例分别加入过表达mi R-18a及过表达RUNX1的腺病毒;（8）mi R-18a和RUNX1同时干扰组（sh-mi R-18a+sh-RUNX1）:按照MOI=1:10的比例分别加入干扰mi R-18a及干扰RUNX1的腺病毒。通过腺病毒转染技术调控mi R-18a和RUNX1表达,应用跨内皮细胞电阻值（Transendothelial Electric Resistance,TEER）和荧光素钠（Fluorescein Sodium,Na-Flu）通透性实验评估体外脑出血BBB细胞模型的通透性,q RT-PCR及Western Blot检测mi R-18a、RUNX1、Occludin和ZO-1m RNA相对含量及蛋白水平的表达,采用双荧光素酶报告基因实验验证mi R-18a与RUNX1的靶向结合。2.动物实验:建立SD大鼠脑出血模型,分为六组:（1）假手术组（sham组,模拟大鼠脑出血的造模过程,不注血,作为对照组）;（2）脑出血模型组（model组,大鼠基底节区注入自体非抗凝动脉血50μL制备脑出血模型）;（3）mi R-18a过表达组（mi R-18a组,脑出血模型大鼠血肿周围4个点位置各注入过表达mi R-18a的腺病毒1μL）;（4）mi R-18a干扰组（sh-mi R-18a组,脑出血模型大鼠血肿周围4个点位置各注入干扰mi R-18a的腺病毒1μL）;（5）mi R-18a过表达+RUNX1过表达组（脑出血模型大鼠血肿周围4个点位置各注入过表达mi R-18a及过表达RUNX1的腺病毒2μL,注射前等体积混合病毒）;（6）mi R-18a干扰+RUNX1干扰组（sh-mi R-18a+sh-RUNX1组,脑出血模型大鼠血肿周围4个点位置各注入干扰mi R-18a及干扰RUNX1的腺病毒2μL,注射前等体积混合病毒）,以上六组大鼠每组又分为3d、5d、7 d三个亚组,每组10只大鼠,n=30。通过腺病毒转染技术调控mi R-18a和RUNX1表达,q RT-PCR及Western Blot检测血肿周围脑组织mi R-18a、RUNX1、Occludin和ZO-1m RNA相对含量及蛋白水平的表达,免疫荧光染色观察血肿周围脑组织RUNX1、Occludin和ZO-1蛋白的表达,同时观察大鼠神经功能评分、BBB通透性及脑组织水含量变化,应用染色质免疫共沉淀（Ch IP）技术检测RUNX1与Occludin和ZO-1基因启动子区域的结合情况。结果:1.细胞实验:（1）通过VIII因子及GFAP相关抗原免疫荧光成功鉴定BMVEC与AC;（2）与模型组（model）比较,过表达mi R-18a导致体外脑出血BBB细胞模型TEER值降低、Na-Flu的比例增高,提示BBB通透性增高,组间差异有统计学意义（P<0.05）,干扰mi R-18a则导致TEER值增高、Na-Flu的比例下降,表明BBB通透性降低,组间差异有统计学意义（P<0.05）;（3）q RT-PCR及Western Blot均表明,与model组比较,过表达mi R-18a导致RUNX1、Occludin和ZO-1m RNA相对含量及蛋白水平下降,组间差异有统计学意义（P<0.05）,干扰mi R-18a则导致上述三种蛋白表达增加,组间差异有统计学意义（P<0.05）;（4）双荧光素酶报告基因实验表明,mi R-18a+RUNX1野生型质粒组相对荧光素酶活性较阴性对照+RUNX1野生型质粒组明显降低（P<0.05）,表明mi R-18a能够与RUNX1m RNA 3′UTR结合,有效抑制野生型质粒荧光素酶活性,而mi R-18a+RUNX1突变型质粒组相对荧光素酶活性与阴性对照+RUNX1突变型质粒组比较无统计学意义（P>0.05）,说明对RUNX1预测靶位点进行突变后,mi R-18a即无法与RUNX1突变型质粒结合,对荧光素酶活性无影响,表明mi R-18a同RUNX1具有靶向结合作用,RUNX1是mi R-18a的靶基因。2.动物实验:（1）成功建立SD大鼠脑出血模型;（2）q RT-PCR及Western Blot均表明,与模型组（model）比较,过表达mi R-18a导致RUNX1、Occludin和ZO-1m RNA相对含量及蛋白水平下降,干扰mi R-18a则导致上述三种蛋白表达增加,组间差异有统计学意义（P<0.05）;（3）免疫荧光染色表明,与model组比较,过表达mi R-18a导致血肿周围脑组织RUNX1、Occludin和ZO-1蛋白表达减少,干扰mi R-18a则导致上述三种蛋白表达增加,组间差异有统计学意义（P<0.05）;（4）大鼠神经功能评分在3d组达到峰值,5d组略有下降,7d组评分最低。与model组比较,过表达mi R-18a导致大鼠神经功能评分增加,干扰mi R-18a导致神经功能评分降低,表明干扰mi R-18a大鼠神经功能有改善,组间差异有统计学意义（P<0.05）;（5）BBB通透性,与model组比较,过表达mi R-18a导致BBB通透性增高,干扰mi R-18a则导致BBB通透性降低,组间差异有统计学意义（P<0.05）;（6）血肿周围脑组织含水量,与model组比较,过表达mi R-18a导致脑含水量增高,反之则减少,组间差异有统计学意义（P<0.05）;（7）Ch IP-q PCR实验结果表明,与model组比较,过表达mi R-18a抑制了RUNX1与Occulin和ZO-1启动子的结合,干扰mi R-18a促进RUNX1与Occulin和ZO-1启动子的结合,组间差异有统计学意义（P<0.05）。结论:1.在脑出血模型大鼠血肿周围脑组织中,mi R-18a与RUNX1的表达呈相反趋势,mi R-18a增高,RUNX1降低;2.mi R-18a能够与RUNX1m RNA的3′UTR结合,RUNX1是mi R-18a的靶基因,Occludin和ZO-1是RUNX1调控的目的蛋白,mi R-18a通过调控RUNX1表达从而抑制Occludin和ZO-1蛋白的表达,增加BBB的通透性,加重脑水肿;3.特异性阻断mi R-18a/RUNX1通路后,Occludin和ZO-1表达水平升高,BBB通透性降低,脑水肿程度降低,脑出血大鼠神经功能得到改善;4.在脑出血后第3d、5d、7d天不同时点,mi R-18a、RUNX1、Occludin以及ZO-1的表达不同,BBB的破坏以及脑水肿的严重程度不同,脑出血后3d组BBB通透性达到高峰。
季小添[7]（2020）在《黄芩苷抑制神经元铁死亡改善脑出血的作用及机制》文中认为目的:拟在体内水平建立Ⅳ型胶原酶诱导的小鼠自发性急性脑出血（ICH）模型,在体外水平建立血色素及铁死亡诱导剂诱导的神经细胞损伤模型,探索黄芩苷对ICH模型小鼠的治疗作用及对神经细胞损伤模型的保护作用,并验证其减少神经细胞铁死亡现象发生的治疗机制。方法:体内实验使用雄性C57小鼠。将48只小鼠随机平均分为3组:假手术组（Sham）、模型组（Mod）、黄芩苷治疗组（Bai）,每组16只。配置浓度为0.7mg/m L的Ⅳ型胶原酶工作液,除假手术外,其余两组均采用脑内注射Ⅳ型胶原酶进行诱导造模。Bai治疗组于造模完成后的2h内灌胃给予20mg/kg的黄芩苷溶液,Mod组与Sham组于造模完成2h内灌胃给予等体积生理盐水。造模完成后第二天起每天上午Bai组灌胃给予20mg/kg黄芩苷溶液,Mod组与Sham组给予等体积生理盐水,持续三天。同时在造模完成后的三天内每天进行一次行为学检测,包括爬杆实验和转棒实验。三天给药及行为学检测结束后对小鼠进行取材,拍摄脑组织切片高清扫描照片并制作HE染色的脑组织石蜡切片以比较出血灶大小,制作脑组织冰冻切片并进行FJB免疫荧光染色以比较神经元损伤情况,制作脑组织冰冻切片并进行普鲁士蓝染色以比较局部组织铁离子沉积情况,制作脑组织匀浆并提取RNA以进行铁死亡相关基因的PCR验证,最后制作HE染色的肝肾组织切片以比较肝肾毒性。体外实验使用PC12及SH-SY5Y细胞,采用Hemin（血色素）诱导细胞株（PC12）的损伤,构建体外脑出血细胞损伤模型,并采用Erastin（铁死亡诱导剂）诱导细胞株（PC12、SH-SY5Y）损伤,构建体外神经元铁死亡细胞模型。通过MTT实验及活死细胞染色实验以评价黄芩苷对于两种损伤细胞模型的保护效果。通过细胞免疫荧光染色实验及PCR验证实验以研究黄芩苷对细胞损伤模型保护效果的作用机制。结果:行为学实验结果:Mod组小鼠与Sham组小鼠相比,转棒实验中首次掉落时间发生缩短并且总掉落次数增加,爬杆实验中杆上转头时间显着延长并且总爬行时间显着增加,差异具有统计学意义（P<0.05及P<0.01）。而Bai组与Sham组小鼠相比,转棒实验中首次掉落时间无明显改变并且总掉落次数接近,爬杆实验中杆上转头时间及总爬行时间均没有差异。同时Bai组与Mod组小鼠相比,转棒实验中首次掉落时间明显延长,爬杆实验中总爬行时间出现了明显缩短,差异具体有统计学意义（P<0.05及P<0.01）。脑组织出血灶大小比较结果:Mod组小鼠与Sham组小鼠相比,右侧脑组织存在明显的肉眼可见出血灶。而Bai组与Mod组相比,出血灶面积大小得到了明显的控制。脑组织切片染色结果:Mod组小鼠与Sham组小鼠相比,脑组织切片上FJB荧光染色阳性数量明显增多,普鲁士蓝染色阳性区域明显增多,GPX4免疫荧光阳性染色亮度明显增强。而Bai组与Mod组小鼠相比,脑组织内FJB荧光染色阳性数量明显减少,蓝色的普鲁士蓝染色阳性表现区域明显减小,GPX4免疫荧光阳性染色亮度变化不大。脑组织内铁死亡相关基因PCR定量比较结果:Mod组小鼠与Sham组小鼠相比Hmox1、SLC3A2、DMT1的表达均有上调,其差异均存在统计学意义（P<0.01）。而在GPX4、Hmox1、SLC3A2、DMT1四个基因的表达中,Bai组小鼠与Mod组小鼠相比有显着性差异,其差异存在统计学意义（P<0.01）。体外实验结果:损伤模型组细胞与空白对照组细胞相比,MTT细胞存活率结果出现显着降低,活死细胞染色结果显示死亡细胞数量显着增多,免疫荧光染色结果显示GPX4、Nrf2、HO-1的表达升高,PCR验证结果显示GPX4、NFE2L2、Hmox1、SLC7A11、SLC3A2、TFRC、SLC11A2的表达水平均出现显着改变,其差异具有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。而在进行黄芩苷干预之后,给药组细胞与损伤模型组细胞相比,MTT细胞存活率结果出现剂量依赖性的显着提高,活死细胞染色结果显示死亡细胞数量显着降低,免疫荧光染色结果显示HO-1的阳性表达降低,PCR验证结果显示GPX4、NFE2L2、Hmox1、SLC7A11、SLC3A2L、TFRC、SLC11A2的表达能回复至正常水平,其差异具有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。结论:在体内实验中,黄芩苷能够改善ICH模型小鼠的运动能力,减小ICH小鼠的脑内出血灶大小,保护其脑组织内神经细胞。并能够减少ICH小鼠脑组织内铁离子的沉积,改变脑组织内铁死亡相关基因的表达,从而起到降低铁死亡发生可能性的作用机制。在体外试验中,黄芩苷能够提高神经细胞脑出血及铁死亡损伤模型的存活率,并且能够影响铁死亡相关基因的表达结果,从而表明黄芩苷能够保护神经细胞免于损伤,并对于铁死亡现象的发生能够产生抑制作用。
何维佳[8]（2020）在《基于“从肾论治”和“从脾论治”分别运用六味地黄汤和四君子汤干预新生大鼠脑出血的实验研究》文中研究表明研究背景新生儿脑出血是早产儿常见的临床问题,重者可导致死亡或遗留严重的后遗症,其中以生发基质-脑室内出血为最常见的类型。生发基质出血（GMH）多发生于未成熟大脑的脑室管膜下或脑室旁生发基质区域,由于该区域紧邻脑室,有时会发展成为脑室内出血（IVH）,所以合称为生发基质-脑室出血（GMH-IVH）。该病好发于早产儿,临床表现差异较大,可无临床症状或体征,仅在超声或CT检查时发现;也可出现神志异常或呆滞或激惹,肌张力低下,动作减少,呼吸不规律;严重者出现进行性意识障碍,呼吸困难或暂停、抽搐、瞳孔反射消失,四肢肌张力低下。该病预后不良,出血严重者可导致死亡,将近50%的幸存者会出现脑积水、脑瘫、癫痫、偏瘫、学习障碍等一系列神经功能障碍的后遗症。目前国内外对于GMH-IVH发病机制的研究尚不清楚,未成熟的生发基质在结构上的脆弱性是其易出血的基础,但出血后所致损伤的机制和分子路径仍不明确,研究的热点主要集中在血液成分及代谢产物、小神经胶质细胞与炎症、淋巴细胞与免疫因子等方面。治疗方面,本病的治疗手段有限,以对症治疗为主,一些先进的治疗药物如铁螯合剂、激素类、非甾体消炎药和干细胞治疗都尚在研究中,但并未在临床广泛运用。由于在出血初期缺乏有效的干预,患儿常遗留严重的神经系统损伤。目前尚无中医药在本病的治疗报道,因而本研究拟从中医的角度出发,寻找中医治疗该病的临床方向。研究目的本病由于在出血初期缺乏有效的干预,患儿常遗留严重的神经系统损伤,故本研究通过文献研究,分别从肾论治和从脾论治确定六味地黄汤和四君子汤,运用到动物模型上,观察两者对GMH-IVH的治疗效果并探究其机理,以寻找安全有效的方药、探索中医治疗该病的临床方向。文献研究本病的西医病名是基于现代医学解剖学,且目前尚无中医药治疗的报道,但就疾病本身并非只存在于现代医学,因而我们试图从中医的角度出发,在古籍中搜寻与GMH-IVH相似的中医疾病,整理其病因、病机、临床表现及治法,筛选出与GMH-IVH全貌相符合的疾病,参考其论治从而寻找出治疗GMH-IVH的可能立法方向;再深度剖析GMHIVH的中医病机,明确其病机关键点,结合之前的立法方向,确立从肾论治和从脾论治两大治法并拟定六味地黄汤和四君子汤为主方;将六味地黄汤和四君子汤从方义分析再到方剂在临床相关疾病的运用作详细分析,明确其运用的范围。实验研究健康SPF级7日龄SD大鼠160只,雌雄不限,体重13±2克,随机分为四组:脑出血模型组（简称脑出血组）、六味地黄汤组、四君子汤组、假手术组,每组各40只。脑出血组、六味地黄汤组、四君子汤组大鼠通过向其右侧生发基质层立体定位注射Ⅶ型胶原酶（0.3U）构建GMH-IVH模型后,分别予以生理盐水、六味地黄汤、四君子汤灌胃,每日1次,连续7天。假手术组仅将针尖插入颅内,不注射任何药物,术后给与生理盐水灌胃,每日1次,连续7天。实验一通过短期行为学测试（造模后第1天和第3天）、长期行为学测试（造模后第28天）及头颅影像学（造模后第28天）观察两组药物对GMH-IVH造成的大鼠神经功能障碍和脑室扩张有无改善作用;实验二通过比色法在造模后24小时和72小时检测大鼠脑组织中血红蛋白含量,同时在72小时通过免疫组化法检测活化的小胶质细胞——M2型小胶质细胞数量,以评价干预药物对血肿的吸收和小胶质细胞表型转换有无影响。实验三通过酶联免疫吸附法（ELISA）分别在造模后的24小时、第3天、第7天检测大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α并比较各组之间的差异,以评价干预药物对主要炎症因子的影响。实验结果1.神经功能:六味地黄汤及四君子汤对出血继发的短期神经功能障碍无明显改善作用;六味地黄汤能改善出血继发的长期神经功能障碍（P<0.05）,而四君子汤无明显改善作用。2.脑室体积:GMH-IVH会导致出血后28天脑室体积扩张,六味地黄汤可减少因出血造成的脑室扩张体积（P<0.05）,而四君子汤组与脑出血模型组比较脑室体积无统计学差异。3.体重:GMH-IVH可引起大鼠在第28天时体重降低,六味地黄汤和四君子汤均可缓解出血继发的体重下降（P<0.05）,两组之间相比较无统计学差异。4.血肿的吸收:出血后24小时,六味地黄汤组和四君子汤组与脑出血组模型相比较脑组织中血红蛋白含量均无统计学差异。出血后72小时,六味地黄汤组脑组织血红蛋白含量较脑出血模型组减少（P<0.05）,四君子汤组脑组织血红蛋白含量与脑出血模型组比较无统计学差异。5.M2小胶质细胞数量:出血后72小时,免疫组化结果显示,GMH-IVH可诱导小胶质细胞激活和浸润,同时M2型小胶质细胞增多。与脑出血模型组相比较,六味地黄汤组的M2型小胶质细胞增多更明显（P<0.01）,而四君子汤组M2型小胶质细胞与脑出血模型组相比无统计学差异。6.IL-1β:GMH-IVH可引起血清IL-1β的表达增高,在出血后24小时,六味地黄汤组和四君子汤组的IL-1β水平与脑出血模型组相比无统计学差异。但在出血后3天和出血后7天,六味地黄汤能显着降低该炎症因子的水平（P<0.05）,而四君子汤组的IL-1β水平与脑出血模型组相比无统计学差异。7.IL-6:GMH-IVH可引起血清IL-6的表达增高,在出血后24小时,六味地黄汤组和四君子汤组的IL-6水平与脑出血模型组相比无统计学差异。但在出血后3天和出血后7天,六味地黄汤能显着降低该炎症因子的水平（P<0.05）,而四君子汤组的IL-6水平与脑出血模型组相比无统计学差异。8.TNF-α:GMH-IVH可引起血清TNF-α的表达增高,在出血后24小时,六味地黄汤组和四君子汤组的TNF-α水平与脑出血模型组相比无统计学差异。但在出血后3天和出血后7天,六味地黄汤能显着降低该炎症因子的水平（P<0.05）,而四君子汤组的TNF-α水平与脑出血模型组相比无统计学差异。研究结论1.六味地黄汤可改善GMH-IVH引起的长期神经功能障碍、减轻脑室扩张,而对短期神经功能障碍无改善作用。2.六味地黄汤改善长期神经功能障碍的可能作用机制是:通过增加M2型小胶质细胞的数量从而促进GMH-IVH后血肿的吸收,并降低由出血导致的促炎症因子如IL-1β、IL-6和TNF-α的增高,从而减轻继发性脑损伤。3.从长期来看,六味地黄汤和四君子汤均能改善由于GMH-IVH导致的大鼠体重降低。4.六味地黄汤在改善长期神经功能障碍、减轻脑室扩张方面显示出治疗效果,在一定程度上说明“从肾论治GMH-IVH”是可行的。
陈星[9]（2020）在《早期应用益气活血法防止脑出血大鼠血肿扩大及其作用机制的研究》文中研究说明目的:实验通过立体定位,以IV型胶原酶构建大鼠脑出血模型,分别予以生理盐水、生理盐水、益气活血法（人参、三七提取液）及活血化瘀法（丹红注射液）对各组进行干预。首先,观察脑出血24h时各组大鼠神经功能缺损、颅内血肿量及脑水肿的情况等,明确益气活血法是否适用于脑出血早期的治疗,以及该法是否具有防止脑出血早期血肿扩大、改善预后的作用。其次,探索益气活血法影响早期血肿扩张率、改善神经功能及预后可能的作用机制,为今后在脑出血治疗中的应用提供转化依据。方法:1.实验分组:将158只体重范围在300±20g的雄性SD级大鼠,随机分为假手术组（32只）、空白对照组（42只）、益气活血组（42只）及活血化瘀组（42只）;2.造模:通过脑立体定位仪立体定位基底节区（坐标:前囟点前0.2mm,右侧旁开3.5mm,深度为5.5mm）,尔后以微量注射泵控制微量注射器,缓慢向颅内推注1ul IV型胶原酶（0.5U/ul）;3.模型评价及给药:术后2小时依据bederson评估法对模型进行评估,确定造模成功后纳入研究,于造模3h后,以相应药物对各组大鼠进行干预(假手术组:给予等比生理盐水灌胃,10ml/Kg·d-1,空白对照组:给予等比生理盐水灌胃,10ml/Kg·d-1,益气活血组:给予人参、三七浓缩提取液灌胃,10ml/Kg·d-1,活血化瘀组:给予丹红注射液腹腔注射,2.0ml/Kg·d-1,本试验中各组大鼠一次性给药量均以一天用药量给药);4.凝血功能及血生化检测:模型评估完成后经由下腔静脉抽取血液进行检测,观察药物干预前各组间凝血和生化功能有无差异;5.神经功能缺损评价:ICH24h后依照改良神经功能缺损评分法对各组大鼠进行神经功能缺损评分,判定神经损伤情况（分值越高,神经功能缺损越严重）;6.脑血肿量测定:通过组织学检测测定血肿体积,对大鼠脑组织进行石蜡包埋切片,然后以多田法计算血肿量（血肿体积=Π/6×纵径*横径×切片厚度（mm）×切片数量）;7.脑水肿情况检测:ICH24h后分别测定患侧及健侧脑组织的干重及湿重,根据脑组织含水量（%）=（湿重-干重）/湿重×100%得出各组大鼠脑组织含水量;8.血脑屏障通透性检测:借助酶标仪制作伊文思蓝分光光度标准曲线,通过测定样本脑组织内EB含量,来判断血脑屏障通透性受损情况。利用透射电镜观察各组大鼠血脑屏障超微结构特征;9.脑组织苏木精-伊红染色:通过HE染色观察ICH24h后脑组织形态及神经细胞情况,同时测定变性细胞数,计算变性细胞指数;10.免疫组化检测:通过免疫组化检测ICH24h后血肿周围MMP-2及claudin-5含量;11.统计学分析:通过spass19.0统计软件进行统计学分析,各检测指标以均数加减标准差（?x±s）进行描述,以单因素方差分析比较两两之间的数据差异,以P<0.05作为具有统计学差异的标志。结果:1.凝血功能及血生化水平:在进行药物干预前,各组凝血功能及血生化水平没有显着差异（P>0.05）;2.神经功能缺损评价:假手术组无明显神经功能障碍,脑出血各组与假手术相比神经功能缺损显着（P<0.05）,ICH24h后,进行药物干预的两组与空白对照组相比,前两者神经功能评分分值均显着低于空白对照组（P<0.05）,而两实验组相比,益气活血组神经功能的改善情况更优于活血化瘀组（P<0.05）;3.血肿量测定:ICH24h后两实验组与空白对照组比较,两实验组颅内血肿量明显低于空白对照组,而两实验组相比,益气活血组防止血肿扩大的作用优于活血化瘀组（P<0.05）;4.脑水肿情况检测:健侧各组别间含水量未见明显差距,各组间对比P值均大于0.05,患侧脑含水量测定显示假手术组与其余各组相比,其含水量显着低于其他三组（P<0.05）,两实验组与空白对照组相比,前两者均可降低脑组织含水量,减轻脑水肿（P<0.05）,但两实验组相比,对脑水肿的影响并无显着差异（P>0.05）;5.血脑屏障通透性检测:ICH24h后,与脑出血各组比较,假手术组未见明显的EB渗出（P<0.05）,空白对照组EB渗出量显着高于两实验组（P<0.05）,益气活血组与活血化瘀组相比,两者EB含量无显着区别（P>0.05）。透射电镜超微结构显示假手术组神经元细胞胞核呈圆形,染色质分布均匀,胞浆中可见完整的线粒体、粗面内质网和核糖体等细胞器,血管内皮细胞各结构亦清晰完整且内皮细胞之间可见紧密连接结构,微血管基膜连续。空白对照组则见其神经元细胞凋亡,细胞体积缩小,核固缩,胞浆电子云密度增大,微血管基膜不连续等损害,两实验组上述情况则有明显改善,益气活血组更较为明显,但两者间差距不大;6.HE染色及变性细胞指数测定:脑出血各组均可见组织间隙扩大、水肿、神经细胞排列紊乱等,但益气活血组与活血化瘀组上述表现明显轻于空白对照组,两实验组对比,益气活血组又更轻于活血化瘀组。就变性细胞指数而言,脑出血各组均明显高于假手术组（P<0.05）,益气活血组与活血化瘀组变性细胞指数显着低于空白对照组（P<0.05）,益气活血组变性细胞指数显着低于活血化瘀组（P<0.05）;7.免疫组化检测:假手术组血肿周围claudin-5蛋白表达量要显着高于各实验组（P<0.05）,空白对照组和活血化瘀组血肿周围claudin-5蛋白表达量明显低于益气活血组（P<0.05）,而空白对照组与活血化瘀组相比claudin-5蛋白表达量没有显着差异（P>0.05）;假手术组仅有少量MMP-2表达,脑出血各组MMP-2表达量均显着高于假手术组（P<0.05）,与空白对照组相比,MMP-2在益气活血组及活血化瘀组的表达量均明显偏低（P<0.05）,且益气活血组MMP-2蛋白表达量又显着低于活血化瘀组（P<0.05）。结论:1.益气活血法及活血化瘀法均可适用于脑出血早期的治疗,二者均可降低血肿扩大的发生率,改善脑出血大鼠神经功能。2.实验中各项研究指标表明,益气活血法对于脑出血早期的治疗效果优于活血化瘀法（包括神经功能的改善、防止血肿扩大、降低脑组织变性细胞指数等）。3.益气活血法（人参、三七提取液）和活血化瘀法（丹红注射液）可能通过降低MMP-2蛋白的表达或促进claudin-5蛋白的表达,从而发挥其对脑组织及血脑屏障的保护作用,以降低早期血肿扩张的发生率,改善神经功能。
王晓峰[10]（2019）在《醒脑静通过调控HIF-1α信号通路减轻脑出血继发损伤的机制研究》文中提出研究背景:脑出血（Intracerebral hemorrhage,ICH）是最常见的急性脑血管疾病之一。脑出血具有起病急骤,病情凶险,进展快,患者可在短时间内发生脑疝等严重并发症,致残率与致死率高等特点。脑出血后脑内血液迅速积聚到脑实质导致正常解剖结构的破坏和局部压力的增加,形成血肿及脑组织继发损伤,并产生一系列病理生理改变,包括血肿扩大压迫导致的局部脑血流灌注障碍、血肿周围水肿的形成、血脑屏障（Blood-brain barrier,BBB）的损伤及其通透性的改变等。同时,脑出血后导致脑组织缺血缺氧,造成脑组织中活性氧物质（Reactive oxygen species,ROS）的过量产生,进而引起神经细胞的氧化应激,使脑组织发生多种病理改变,如细胞凋亡、自噬、炎症反应和血脑屏障破坏等,从而导致脑组织的继发性损伤,严重损害神经功能。脑组织缺血缺氧引起缺氧诱导因子（Hypoxiainducible factor,HIF）的表达量上调,HIF的表达可以引起一系列下游基因的转录和表达,在脑出血后脑组织的继发性损伤过程中发挥重要作用。HIF及其下游的BNIP3通路在自噬和细胞凋亡方面具有重要调控作用,是脑出血后脑损伤过程的重要调控因子。醒脑静注射液来源于古验方“安宫牛黄丸”,是以天然麝香、冰片、栀子、郁金为主要成分的中药注射液,能够有效促进ICH病人颅内血肿吸收,减轻炎症反应和脑水肿,改善神经功能。但醒脑静发挥脑保护作用的机制还不清楚。本研究采用胶原酶诱导脑出血大鼠模型,结合病理、分子生物学等方法观察大鼠脑出血脑组织超微结构的改变及相应的病理变化,并检测出血周围脑组织中HIF、BBB相关蛋白、自噬相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达变化,探讨醒脑静减轻保护脑出血继发性损伤的机制。研究目的:1建立大鼠脑出血模型,造模后观察大鼠神经功能缺损情况,检测脑出血和脑水肿形成情况及醒脑静注射液对大鼠脑出血后脑组织的保护效果。2检测大鼠脑出血后脑组织中HIF、BBB相关蛋白、自噬相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达情况,并检测醒脑静注射液对上述蛋白表达的影响,探讨醒脑静注射液通过HIF-BNIP3通路调控自噬、细胞凋亡及血脑屏障通透性的途径和机制,为在“病络-毒损脑络”理论指导下中医药保护脑出血继发性损伤提供理论和实验依据。研究方法:1使用SPF级健康的雄性SD大鼠建立大鼠脑出血模型,将造模成功的大鼠随机分为模型组、醒脑静组和依达拉奉组,通过腹腔注射给药,采用mNSS神经功能评分法,观察大鼠脑出血后神经功能缺损情况。给药三天后,将各组大鼠断头取脑,分别通过HE染色、尼氏染色和透射电镜的方法,观察大鼠脑出血后脑组织病理结构和超微结构改变。2使用上述方法制备大鼠脑出血模型并进行随机分组,分别腹腔注射给药三天。三天后将各组大鼠断头取脑,制备病理切片,通过伊文思蓝（Evens blue,EB）法测定BBB通透性;通过免疫组化检测HIF,血脑屏障相关蛋白ZO-1、Occludin、AQP4、MMP9和自噬相关蛋白Beclin-1和BNIP3的表达情况。制备各组大鼠脑出血后脑组织提取物,通过Western blot检测HIF,血脑屏障相关蛋白ZO-1、Occludin、AQP4、VEGF,自噬相关蛋白Beclin-1、BNIP3、LC3,凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达情况。研究结果:1 mNSS神经功能评分发现,脑出血模型组大鼠的神经功能评分明显高于假手术组,神经功能明显缺损;与模型组相比,醒脑静组和依达拉奉组大鼠神经功能评分明显降低,神经功能缺损得到明显改善。2HE染色、尼氏染色和伊文思蓝染色的结果显示,与假手术组相比,脑出血模型组大鼠脑组织中血脑屏障通透性明显增加,脑水肿明显增加,神经细胞形态明显改变,损伤加重。透射电镜结果显示,脑出血模型组大鼠脑组织中神经元、星形胶质细胞和血管内皮细胞结构明显被破坏。与模型组相比,醒脑静组和依达拉奉组大鼠脑出血后脑组织血脑屏障通透性降低,脑水肿程度减小;神经元、星形胶质细胞和血管内皮细胞的结构明显改善。3免疫组化的结果显示,脑出血模型组大鼠脑组织中HIF、AQP4、MMP9、VEGF、Beclin-1和BNIP3的表达明显高于假手术组,而ZO-1和Occludin的表达则显着低于假手术组;而与模型组变比,醒脑静组和依达拉奉组大鼠脑出血后脑组织中HIF、AQP4、MMP9、VEGF、Beclin-1和BNIP3的表达明显降低,而ZO-1和Occludin的表达明显升高。4 Western blot的结果显示,与假手术组相比,脑出血模型组大鼠脑组织中HIF、AQP4、MMP9、VEGF、Beclin-1、BNIP3、LC3和Bax的表达明显升高,而ZO-1、Occludin和Bcl-2的表达量则明显降低。与模型组相比,醒脑静组和依达拉奉组大鼠脑出血后脑组织中HIF、AQP4、VEGF、Beclin-1、BNIP3、LC3和Bax的表达明显减少,而ZO-1、Occludin和Bcl-2的表达量则显着升高。结论:醒脑静注射液明显降低大鼠脑出血后的神经功能评分,减轻神经功能缺损,降低血脑屏障通透性,减轻神经细胞的损伤情况。醒脑静注射液明显降低大鼠脑出血后脑组织中HIF的表达,降低BNIP3的表达,减轻细胞凋亡和自噬,在脑出血后发挥神经保护作用。
二、采用Ⅳ型胶原酶构建大鼠脑出血模型（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、采用Ⅳ型胶原酶构建大鼠脑出血模型（论文提纲范文）
（1）Netrin-1来源的功能肽对脑出血后继发性神经损伤修复作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1.引言 |
| 1.1 脑出血的临床病理特征 |
| 1.1.1 脑出血的临床症状 |
| 1.1.2 脑出血的致病原因 |
| 1.2 脑出血造成的脑损伤 |
| 1.2.1 脑出血原发性损伤 |
| 1.2.2 脑出血的继发性损伤 |
| 1.2.2.1 水肿 |
| 1.2.2.2 炎症反应 |
| 1.2.2.3 血液成分毒性 |
| 1.2.2.4 氧化应激损伤 |
| 1.2.2.5 细胞死亡 |
| 1.3 脑出血的治疗 |
| 1.3.1 外科手术治疗 |
| 1.3.2 内科治疗 |
| 1.3.3 神经保护性治疗 |
| 1.4 脑出血模型在脑出血损伤及治疗领域的应用 |
| 1.4.1 自体血注射模型 |
| 1.4.2 胶原酶注射模型 |
| 1.5 Netrin-1 及受体的作用研究 |
| 1.5.1 Netrin-1 蛋白 |
| 1.5.2 Netrin-1 受体 |
| 1.5.3 Netrin-1 激活的信号通路 |
| 1.5.4 受体依赖的细胞死亡及抗凋亡 |
| 1.6 Netrin-1 在神经损伤修复中的研究 |
| 1.6.1 Netrin-1 在脑卒中的应用 |
| 1.6.2 Netrin-1 抑制脊髓损伤模型中运动神经元死亡 |
| 1.6.3 Netrin-1 促进外周神经元轴突再生 |
| 1.7 Netrin-1 及受体在脑出血过程的作用研究 |
| 1.7.1 Netrin-1 及受体在脑出血过程的作用研究 |
| 1.7.2 心肌缺血再灌注损伤的修复 |
| 1.8 研究目的与意义 |
| 1.9 技术路线 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 细胞株 |
| 2.3 质粒构建 |
| 2.4 试剂与抗体 |
| 2.5 主要仪器 |
| 2.6 细胞培养及转染 |
| 2.6.1 细胞培养 |
| 2.6.2 PEI转染 |
| 2.7 蛋白提取 |
| 2.8 GST-pull down |
| 2.9 免疫印迹 |
| 2.10 Netrin-1条件培养基的获得 |
| 2.11 细胞膜表面结合实验 |
| 2.12 皮层原代神经元培养 |
| 2.13 细胞分组及给药方案 |
| 2.13.1 确定Hemin诱导的细胞模型工作时间及工作浓度 |
| 2.13.2 确定多肽作用效能的细胞分组及给药 |
| 2.14 CCK-8 法检测细胞活力 |
| 2.15 细胞存活率检测 |
| 2.16 脑出血模型分组及给药方案 |
| 2.16.1 脑出血模型的分组 |
| 2.16.2 给药方案 |
| 2.17 胶原酶诱导的小鼠脑出血模型 |
| 2.18 Fluoro-Jade(FJB)染色 |
| 2.19 HE染色 |
| 2.20 TUNEL染色 |
| 2.21 行为学实验 |
| 2.22 统计学分析 |
| 3.实验结果与分析 |
| 3.1 EGF3 结构域是Netrin-1 结合DCC的关键区域 |
| 3.1.1 Netrin-1和DCC的相互结合依赖于EGF3 结构域 |
| 3.1.2 氨基酸序列407-443 是EGF3 的核心功能结构域 |
| 3.1.3 FITC标记的Pep EGF3 与细胞膜上DCC结合 |
| 3.2 Pep EGF3 能与DCC结合激活下游信号通路 |
| 3.2.1 Pep EGF3是Netrin-1 激活下游信号通路的关键区域 |
| 3.2.2 GST-EGF3 融合蛋白激活下游信号通路 |
| 3.3 Netrin-1 来源短肽激活下游信号 |
| 3.3.1 Pep E1和Pep E2 激活不同的下游信号通路 |
| 3.3.2 Pep E1 激活下游信号并存在时间依赖性 |
| 3.3.3 Pep E1、Pep E2 依赖DCC发挥作用 |
| 3.4 Pep E1 减少Hemin诱导的细胞死亡 |
| 3.4.1 Hemin诱导的细胞模型中Netrin-1 蛋白表达上升 |
| 3.4.2 Pep E1 减少Hemin诱导的细胞死亡 |
| 3.4.3 Pep E1 减少Hemin诱导的原代神经元死亡 |
| 3.5 小鼠脑出血模型中皮层Netrin-1 表达上升 |
| 3.5.1 利用Ⅶ型胶原酶注射构建小鼠脑出血模型 |
| 3.5.2 脑出血会导致小鼠受损侧皮层中Netrin-1 蛋白表达上调 |
| 3.6 Pep E1 改善脑出血损伤 |
| 3.6.1 FITC标记的Pep E1 可以通过血脑屏障到达损伤区域 |
| 3.6.2 Pep E1 改善脑出血模型行为异常 |
| 3.6.3 Pep E1 减少脑出血的血肿体积 |
| 3.6.4 Pep E1 有效减少脑出血导致的神经元死亡 |
| 3.6.5 Pep E1 不影响脑出血后的血管数目 |
| 3.6.6 Pep E1 不影响脑出血后的星形胶质细胞数目变化 |
| 3.6.7 Pep E1 激活FAK和 AKT的磷酸化 |
| 4.讨论 |
| 4.1 Netrin-1的EGF3 结构域是Netrin-1/DCC结合的关键区域 |
| 4.2 Pep E1 特异性的激活FAK和 SFK磷酸化 |
| 4.3 Pep E1 能够有效的改善脑出血导致的行为学障碍和细胞死亡 |
| 4.4 Pep E1 作为潜在脑出血的神经保护类药物转化医学可行性 |
| 5.主要结论与创新点 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 主要创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间学术成果情况 |
（2）基于脑出血急性期大鼠模型探讨活血化瘀法对血肿的影响及应用时间窗（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 原发性脑出血急性期内科治疗研究进展 |
| 1 前言 |
| 2 现代医学内科治疗脑出血急性期研究进展 |
| 3 中医药治疗脑出血急性期的临床研究进展 |
| 4 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 中药复方应用网络药理学研究现状 |
| 1 前言 |
| 2 中药网络药理学的研究方法及相关数据库 |
| 3 网络药理学在中药复方研究中的应用 |
| 4 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 研究一 活血化瘀法治疗脑出血急性期的文献分析 |
| 1 研究目的 |
| 2 研究方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 研究二 活血化瘀法不同时点干预对脑出血急性期大鼠血肿的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 研究三 脑血疏口服液促进脑出血血肿吸收的网络药理学研究 |
| 1 资料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
（3）基于破血化瘀法的脑出血方干预脑血肿吸收机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 引言 |
| 综述一、脑出血的中西医治疗现状与进展 |
| 1 中医对于脑出血的认识 |
| 2 |
| 3. 小结 |
| 综述二、脑出血的内源清除机制研究进展 |
| 1 小胶质细胞吞噬RBC作用 |
| 2 RBC内源性清除 |
| 3 Hb内源性清除 |
| 4 炎性反应 |
| 5 结语 |
| 实验研究 |
| 实验一 脑出血方对脑出血大鼠模型血肿吸收的调控作用及分子机制 |
| 第一章 脑出血方对 IV 型胶原酶诱导脑出血模型大鼠行为学的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 数据处理 |
| 4 实验结果 |
| 5 小结 |
| 第二章 脑出血方对 IV 型胶原酶诱导脑出血模型大鼠血肿周围组织中 CD36 信号通路相关蛋白表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 数据处理 |
| 4 实验结果 |
| 5 小结 |
| 实验二 脑出血方对脑出血体外模型血肿吸收的调控作用及分子机制 |
| 第一章 小胶质细胞与红细胞共培养建立脑出血体外模型 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 小结 |
| 第二章 优化 Microglia 与 RBC 体外共培养模型 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 数据统计分析 |
| 4 实验结果 |
| 5 小结 |
| 第三章 基于破血化瘀法的脑出血方干预小胶质细胞对红细胞的吞噬情况 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 数据统计分析 |
| 4 实验结果 |
| 5 小结 |
| 第四章 基于破血化瘀法的脑出血方对脑出血体外模型相关蛋白表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 数据处理 |
| 4. 实验结果 |
| 5 小结 |
| 第五章 基于破血化瘀法的脑出血方是否通过CD36 影响脑出血体外模型血肿清除 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3. 数据统计分析 |
| 4 实验结果 |
| 5 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简介 |
（4）基于网络药理学的醒脑静注射液干预脑出血的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 醒脑静注射液治疗脑出血的研究进展 |
| 1. 临床研究 |
| 1.1 减轻炎性反应 |
| 1.2 影响凝血系统 |
| 1.3 改善血管通透性 |
| 1.4 抗氧化作用 |
| 1.5 促进铁离子代谢 |
| 1.6 其他 |
| 2. 实验研究 |
| 2.1 保护血脑屏障 |
| 2.2 减轻炎症反应 |
| 2.3 减轻氧化应激反应 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 网络药理学的研究进展 |
| 1. 网络药理学的研究思路 |
| 2. 网络药理学的研究方法 |
| 2.1 模块药理学 |
| 2.2 分子对接 |
| 3. 网络药理学应用于中医药研究的研究进展 |
| 3.1 中医药与复杂网络 |
| 3.2 网络证候学 |
| 3.3 单方/单体的网络药理学研究 |
| 3.4 复方中药的网络药理学研究 |
| 3.5 中药配伍的网络药理学研究 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第二部分 网络药理学研究 |
| 第一章 基于网络拓扑分析醒脑静注射液主要成分和关键靶点 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 数据库与软件 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 醒脑静注射液化学成分检索 |
| 1.2.2 醒脑静注射液活性成分的筛选 |
| 1.2.3 醒脑静注射液活性成分的靶点预测 |
| 1.2.4 醒脑静注射液活性成分-靶点网络构建及拓扑分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 麝香活性成分筛选和成分-靶点网络构建 |
| 2.2 冰片活性成分筛选和成分-靶点网络构建 |
| 2.3 郁金活性成分筛选和成分-靶点网络构建 |
| 2.4 栀子活性成分筛选和成分-靶点网络构建 |
| 2.5 醒脑静注射液成分-靶点网络的构建及拓扑分析 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 醒脑静注射液药物与脑出血疾病共同靶点生物功能注释分析 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 数据库 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 脑出血疾病靶点预测 |
| 1.2.2 醒脑静注射液与脑出血共同靶点的生物信息学分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 醒脑静注射液与脑出血共同靶点数据集 |
| 2.2 醒脑静注射液与脑出血共同靶点的GO和KEGG通路富集分析 |
| 2.2.1 醒脑静注射液与脑出血共同靶点的BP分析 |
| 2.2.2 醒脑静注射液与脑出血共同靶点的CC分析 |
| 2.2.3 醒脑静注射液与脑出血共同靶点的MF分析 |
| 2.2.4 醒脑静注射液与脑出血共同靶点的KEGG分析 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于模块药理学方法分析醒脑静注射液调控炎症反应干预脑出血的作用机制 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 数据库与软件 |
| 1.2 方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 实验研究 |
| 实验一 醒脑静注射液对ICH大鼠脑继发性损伤的保护作用 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 神经功能评分结果 |
| 2.2 前肢放置实验实验结果 |
| 2.3 T2加权MRI检测结果 |
| 2.4 尼氏染色结果 |
| 2.5 TUNEL染色结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 醒脑静注射液通过调控炎性反应对大鼠脑出血后脑组织损伤的保护作用 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 醒脑静注射液对ANXA1表达的影响 |
| 2.2 醒脑静注射液对TGF-β1表达的影响 |
| 2.3 醒脑静注射液对iNOS表达的影响 |
| 2.4 醒脑静注射液对mTOR表达的影响 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（5）P2X7受体活化对小鼠脑出血后氧化应激的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 P2X7 受体活化加重小鼠脑出血后氧化应激损伤 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 P2X7受体活化通过促进NOX2的表达介导脑出血后氧化应激 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 P2X7 受体活化通过激活ERK1/2和NF-κB信号通路诱导NOX2的表达 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 脑出血后氧化应激损伤研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（6）miR-18a靶向调控RUNX1影响大鼠脑出血后血脑屏障通透性的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 总引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 细胞实验 调控mi R-18a和 RUNX1 表达对大鼠体外脑出血BBB细胞模型Occludin、ZO-1 蛋白表达及BBB通透性的影响 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 动物实验 调控mi R-18a和 RUNX1 表达对大鼠脑出血模型Occludin、ZO-1 蛋白表达及BBB通透性的影响 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述:脑出血后继发性脑组织损伤机制和治疗研究新进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 学位论文数据集 |
（7）黄芩苷抑制神经元铁死亡改善脑出血的作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 ICH研究进展 |
| 一、对ICH的中西医认识 |
| 二、现行ICH临床治疗方法比较 |
| 第二节 铁死亡及其与ICH关系研究进展 |
| 一、铁死亡研究进展 |
| 二、铁死亡与ICH关系 |
| 第三节 黄芩苷相关研究进展 |
| 一、黄芩苷药理作用研究进展 |
| 二、黄芩苷对于ICH的药理作用 |
| 三、黄芩苷对组织内铁离子的清除作用 |
| 第四节 小结 |
| 第二章 体内实验部分 |
| 第一节 实验材料 |
| 一、实验动物 |
| 二、实验仪器 |
| 三、实验试剂 |
| 四、主要溶液配制方法 |
| 第二节 实验方法 |
| 一、ICH小鼠模型的制备 |
| 二、动物分组与黄芩苷给药 |
| 三、行为学方法 |
| 四、动物取材方法 |
| 五、脑切片扫描与脑组织石蜡切片制作 |
| 六、脑组织冰冻切片制作 |
| 七、普鲁士蓝染色 |
| 八、免疫荧光染色 |
| 九、实时荧光定量PCR |
| 十、肝肾组织HE染色的石蜡切片制作 |
| 十一、统计学方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 一、行为学实验结果 |
| 二、黄芩苷对ICH小鼠脑内出血灶控制作用比较 |
| 三、黄芩苷对ICH小鼠脑组织铁离子沉积清除作用观察 |
| 四、黄芩苷对ICH小鼠神经元损伤保护作用评估 |
| 五、黄芩苷对ICH小鼠铁死亡抑制作用机制研究 |
| 六、黄芩苷体内肝肾毒性评价 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 小结 |
| 第三章 体外实验部分 |
| 第一节 实验材料 |
| 一、实验细胞 |
| 二、实验仪器 |
| 三、实验试剂 |
| 四、主要溶液配制方法 |
| 第二节 实验方法 |
| 一、PC12 细胞及SH-SY5Y细胞的培养和传代 |
| 二、体外神经细胞损伤模型构建 |
| 三、MTT细胞毒性实验 |
| 四、活死细胞染色实验 |
| 五、免疫荧光染色 |
| 六、实时定量荧光PCR |
| 七、统计学方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 一、造模结果 |
| 二、黄芩苷对神经细胞脑出血损伤模型的保护作用评估 |
| 三、黄芩苷抑制神经细胞铁死亡作用机制研究 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 小结 |
| 结语 |
| 一、结论 |
| 二、创新点 |
| 三、问题与展望 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1:文中主要缩略词中英对照表 |
| 附录2:动物实验随机分组表 |
| 研究生在学期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（8）基于“从肾论治”和“从脾论治”分别运用六味地黄汤和四君子汤干预新生大鼠脑出血的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写一览表 |
| 引言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1.现代医学对GMH-IVH的认识及治疗现状 |
| 1.1 定义 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 临床表现 |
| 1.4 诊断标准及分度 |
| 1.5 发病机制 |
| 1.5.1 病理过程 |
| 1.5.2 分子机理 |
| 1.5.2.1 血液成分及代谢产物 |
| 1.5.2.2 小胶质细胞与炎症 |
| 1.5.2.3 淋巴细胞与免疫 |
| 1.6 治疗现状 |
| 1.6.1 目前治疗方法 |
| 1.6.2 治疗方法展望 |
| 1.7 预后 |
| 1.8 预防 |
| 1.9 小结 |
| 2.中医对GMH-IVH的认识及治疗探究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 中医与GMH-IVH相似的病名 |
| 2.2.1 胎弱、胎怯 |
| 2.2.2 胎惊、胎搐 |
| 2.2.3 五迟、五软 |
| 2.2.4 中风、血证 |
| 2.2.5 小结 |
| 2.3 GMH-IVH的中医病机分析 |
| 2.3.1 先天不足为疾病的基础——责之肾 |
| 2.3.2 病位为脑髓——责之肾 |
| 2.3.3 病性为出血——责之脾 |
| 2.3.4 小结 |
| 2.4 中医治疗GMH-IVH的立法及方剂选择 |
| 2.4.1 六味地黄汤 |
| 2.4.1.1 六味地黄汤方义分析 |
| 2.4.1.2 六味地黄汤在临床的运用及现代药理研究 |
| 2.4.1.3 六味地黄汤在脑部相关疾病中的运用 |
| 2.4.1.4 小结 |
| 2.4.2 四君子汤 |
| 2.4.2.1 四君子汤方义分析 |
| 2.4.2.2 四君子汤在临床的运用及现代药理研究 |
| 2.4.2.3 四君子汤在脑部相关疾病中的运用 |
| 2.4.2.4 小结 |
| 2.5 总结 |
| 第二部分 动物实验研究 |
| 前言 |
| 实验一六 味地黄汤和四君子汤对GMH-IVH后神经功能学和脑室扩张的影响 |
| 1.研究背景 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 造模后24小时行MRI扫描可见血肿,提示造模成功 |
| 3.2 六味地黄汤及四君子汤对 GMH-IVH 引起的短期神经功能障碍无改善作用 3.2 短期神经功能学检测 |
| 3.3 六味地黄汤能改善 GMH-IVH 继发的长期神经功能障碍 3.3 长期神经功能学检测 |
| 3.4 六味地黄汤能减轻 GMH-IVH 继发的脑室扩张 |
| 3.5 从长期来看,六味地黄汤和四君子汤可缓解 GMH-IVH 继发的体重下降问题 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 实验二六 味地黄汤和四君子汤对GMH-IVH后血肿吸收及M2 型小胶质细胞数量的影响 |
| 1.研究背景 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 脑组织血红蛋白含量 |
| 3.2 六味地黄汤可增加GMH-IVH后M2型小胶质细胞的数量 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 实验三六 味地黄汤和四君子汤对GMH-IVH后炎症因子的影响 |
| 1.研究背景 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 血清IL-1β |
| 3.2血清IL-6 |
| 3.3 血清TNF-α |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第三部分 综合讨论分析 |
| 1.六味地黄汤对长期神经功能障碍有改善作用,而对短期神经功能障碍无改善作用的分析 |
| 2.六味地黄汤改善 GMH-IVH 后长期神经功能障碍的机制 |
| 3.四君子汤对本研究核心指标无改善的分析 |
| 4.六味地黄汤在改善长期神经功能、减轻脑室扩张方面显示出疗效,在一定程度上说明 “从肾论治 GMH-IVH”的可行性 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 存在的问题与研究展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 小胶质细胞的活化及在颅内出血中的作用 综述 |
| 参考文献 |
| 在校期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（9）早期应用益气活血法防止脑出血大鼠血肿扩大及其作用机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 理论论述 |
| 1.现代医学对脑出血的认识及研究 |
| 2.中医学对脑出血的认识及研究 |
| 3.中西医对脑出血早期血肿扩大的认识及研究 |
| 4.人参、三七现代药理学的相关研究 |
| 5.丹红注射液现代药理学的相关研究 |
| 第二章 实验研究 |
| 1.实验路径 |
| 2.实验材料 |
| 3.实验方法 |
| 4.实验结果与分析 |
| 5.讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 中西医防治脑出血早期血肿扩大的研究进展(综述) |
| 参考文献 |
| 在读期间参研课题及公开发表的学术论文 |
（10）醒脑静通过调控HIF-1α信号通路减轻脑出血继发损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 醒脑静注射液治疗脑出血的基础与临床研究进展 |
| 1 醒脑静基础研究进展 |
| 2 醒脑静的临床研究 |
| 3 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 缺氧诱导因子HIF-1α在脑出血中的作用 |
| 1 HIF的结构 |
| 2 HIF表达的调节 |
| 3 HIF-1α与脑卒中继发性损伤中的作用 |
| 4 中医药对脑出血脑组织中HIF-1α表达的作用 |
| 5 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 醒脑静注射液对大鼠脑出血继发性损伤的保护作用 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 实验二 醒脑静注射液对HIF-BNIP3介导的自噬和细胞凋亡的作用 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 实验三 醒脑静注射液保护大鼠脑出血后血脑屏障通透性的机制 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
四、采用Ⅳ型胶原酶构建大鼠脑出血模型（论文参考文献）
- [1]Netrin-1来源的功能肽对脑出血后继发性神经损伤修复作用研究[D]. 刘林. 东北师范大学, 2021(09)
- [2]基于脑出血急性期大鼠模型探讨活血化瘀法对血肿的影响及应用时间窗[D]. 刘若凡. 北京中医药大学, 2021(01)
- [3]基于破血化瘀法的脑出血方干预脑血肿吸收机制的研究[D]. 王若男. 长春中医药大学, 2020(08)
- [4]基于网络药理学的醒脑静注射液干预脑出血的作用机制研究[D]. 袁梦晨. 北京中医药大学, 2020(04)
- [5]P2X7受体活化对小鼠脑出血后氧化应激的影响及机制研究[D]. 邓洪. 华中科技大学, 2020(01)
- [6]miR-18a靶向调控RUNX1影响大鼠脑出血后血脑屏障通透性的分子机制研究[D]. 任思颖. 贵州医科大学, 2020
- [7]黄芩苷抑制神经元铁死亡改善脑出血的作用及机制[D]. 季小添. 广州中医药大学, 2020(08)
- [8]基于“从肾论治”和“从脾论治”分别运用六味地黄汤和四君子汤干预新生大鼠脑出血的实验研究[D]. 何维佳. 成都中医药大学, 2020(01)
- [9]早期应用益气活血法防止脑出血大鼠血肿扩大及其作用机制的研究[D]. 陈星. 成都中医药大学, 2020(02)
- [10]醒脑静通过调控HIF-1α信号通路减轻脑出血继发损伤的机制研究[D]. 王晓峰. 北京中医药大学, 2019(04)