一、人锰超氧化物歧化酶基因的克隆及高表达（论文文献综述）
任映玥[1]（2021）在《马铃薯SOD基因家族生信分析及其在块茎愈伤活性氧产生中的功能研究》文中提出马铃薯块茎愈伤期间所需的活性氧主要来自于NADPH氧化酶（NADPH oxidase,NOX）途径,其产生的O2-很快被超氧化物歧化酶（Superoxide diamutase,SOD）歧化为H2O2。但马铃薯SOD的基因家族成员的相关信息及其在块茎愈伤过程的作用尚不清楚。本研究鉴定马铃薯SOD基因家族成员并进行生物信息学分析;通过二苯基碘（Diphenyleneiodonium,DPI）处理,分析处理对块茎愈伤期间Strbohs和StSODs的表达量以及活性氧产生的影响;应用分子生物学技术获得StMSD干扰表达块茎,分析干扰表达StMSD块茎愈伤期间StSODs的表达差异及活性氧含量,同时观察软木脂和木质素在伤口处的积累。主要结果如下:1.在马铃薯数据库鉴定出8个SOD基因,各成员含有不同的特征结构域。StSODs的启动子区存在大量胁迫响应元件。StSODs在根、茎、叶、芽和块茎中均有表达。其中StCSD1、StCSD2和StFSD2在块茎中表达较高,StCSD3和StFSD1在叶片中高表达。2.愈伤期间,DPI处理显着抑制了块茎伤口处Strbohs的表达,其中对Strboh A、Strboh B、Strboh D和Strboh E的抑制效果更明显,在愈伤第7d时,Strboh A和Strboh B的表达量仅为对照的3%和8.9%。第5d时,Strboh E的表达量仅为对照的0.5%。DPI对StSODs也产生了部分抑制,对StFSD3和StMSD几乎所有时间点均有抑制。此外,DPI处理还显着降低了块茎伤口处的O2-和H2O2含量。3.利用Gateway技术构建干扰表达载体pHellsgate-StMSD。采用农杆菌侵染法侵染试管薯,诱导薯块分化和再分化。通过生根筛选和NPTII检测获得转基因植株。4.干扰表达块茎中StSODs的表达均明显下调,在愈伤第1d时,StCSD2、StCSD3和StFSD2的表达量仅为野生型的7.3%、3.5%和22.8%。干扰表达块茎中的O2-含量在愈伤中后期升高,第5d时,为野生型的2.49倍。H2O2含量则显着减少,第7d时,为野生型的71.8%。干扰表达块茎中StPAL、StC4H、St4CL和StCAD的基因表达被明显抑制,在愈伤中后期对StPAL、StC4H和St4CL的表达抑制作用明显。干扰表达也减缓了块茎伤口处软木脂和木质素的沉积速度和沉积量。综上所述,马铃薯中的8个SOD家族成员含有不同的特征结构域;DPI可抑制块茎愈伤期间伤口处Strbohs和StSODs的表达水平,对Strbohs的抑制作用更为明显;StMSD干扰表达块茎的StSODs表达显着下调,H2O2积累减少,愈伤速度也明显减缓。
德英[2]（2021）在《老芒麦种质资源耐盐性评价及EsABI5基因作用机制研究》文中研究指明老芒麦（Elymus sibiricus L.）是禾本科（Gramineae）中比较耐盐的优质牧草,不仅在盐碱地治理和改良中具有较大潜力,而且是小麦族（Triticeae）作物的重要抗逆基因源。ABA途径在植物响应盐胁迫重要信号转导途径,ABI5基因是ABA信号转导过程中重要的转录因子,在植物抵御外界胁迫过程中起着重要的作用。本研究对我国20份野生老芒麦种质资源进行萌发期和苗期耐盐性评价,并从耐盐性强的老芒麦种质（单位编号E02）中克隆ABI5基因（EsABI5）;NaCl和ABA处理老芒麦幼苗,分析老芒麦叶片和根系EsABI5基因表达的差异;转入烟草中分析其功能。本文旨在筛选出强耐盐老芒麦种质并探讨EsABI5基因的作用机制,为老芒麦及其小麦族近缘植物的耐盐调控、耐盐分子机制、耐盐育种的研究提供种质材料和理论基础。主要研究结果如下:1.20份野生老芒麦种质的耐盐性由强到弱依次为E02、E41、E15、E45、E19、E23、E31、E38、E42、E26、E18、E36、E20、E43、E01、E40、E21、E33、E17、E14,得到1份耐盐性强的老芒麦种质。平方欧式距离=5时,可分为强、中、弱、极弱4类,其中,强耐盐种质占5%,中耐盐种质占35%,弱耐盐种质占55%,极弱耐盐种质占5%,老芒麦耐盐性强和极弱的种质占比少,中和弱耐盐种质较多,说明老芒麦较耐盐。2.首次克隆获得老芒麦ABI5基因的cDNA全长,命名为EsABI5,Gen Bank登录号为MN607227.1。EsABI5全长1563 bp,包括一个1170 bp的开放阅读框（ORF）,编码389个氨基酸,亲水性不稳定蛋白,无信号肽和跨膜区,位于细胞核,有显着卷曲区域。EsABI5蛋白与大麦（Hordeum vulgare）Hv ABI5蛋白的同源性最高,含有与逆境表达紧密相关的b ZIP46、CBLZ和b ZIP1结构域。EsABI5蛋白有10个互作相关性0.7及以上的互作蛋白,包括CIPK22、CIPK29、SAPK3等。表明EsABI5属于b ZIP类转录因子,与ABA信号通路密切相关,在植物适应逆境胁迫过程中发挥着重要作用。3.NaCl和ABA能够调控EsABI5基因的表达,它们调控EsABI5基因表达的机制是:NaCl上调叶片和根系EsABI5表达,叶片上调的幅度大于根系上调的幅度;ABA上调叶片EsABI5表达,下调根系EsABI5表达,当ABA浓度为50μmol/L时,叶片EsABI5上调表达的幅度是对照的7倍,根系EsABI5下调表达的幅度是对照的41倍。此时生理指标分析结果表明,脯氨酸含量显着高于对照和250 mmol/L的NaCl处理,根系活力最高,丙二醛含量最低;超氧化物歧化酶活性最高,因此,根系EsABI5的下调表达可能是老芒麦ABA信号转导途径的关键步骤,该基因可能起负调控的作用。4.EsABI5基因转入烟草中进一步分析该基因的功能。将扩增EsABI5编码区成功构建到载体p ART-CAM中,使用农杆菌介导的方法侵染烟草叶盘,并诱导芽分化,获得了阳性幼芽。对转基因成功的烟草以及野生型烟草进行盐处理,转基因植株黄化萎蔫程度均较野生型植株严重,各项生理指标均表明转基因植株对盐胁迫更加敏感。ABA和MAPK途径相关的15个基因在转基因烟草（OT）和野生型烟草（WT）中表达情况明显不同,基因相对表达量WT低于OT的有11个基因,分别为PYL4、PYL9、ABI1、MEK1、MKK3、MPK7、CPK17、ABI2、SAPK3、MPK4、MPK17;相对表达量WT高于OT的基因有:SAPK2、MAPKKK17、SAPK9、SAPK10。受到盐胁迫后,WT除MPK17上调外,其它14个基因均下调;OT除SAPK3、MKK3、MAPKKK17、MEK1、CPK17上调外,其它10个基因均下调。结果表明,EsABI5参与了ABA信号转导途径和MAPK级联反应途径抗盐反应的复杂调控网络,并且作为负调控因子发挥作用。
吴丹丹[3]（2021）在《小桐子PP2C、CP及cystatin基因家族和相应miRNAs的鉴定及其在低温响应与适应中的作用》文中研究指明小桐子（Jatropha curcas）又名麻疯树,是一种多用途的能源植物,也是热带亚热带起源的冷敏感植物（Chilling-sensitive plants）,低温是限制小桐子生长分布和生产的主要因素。本实验室研究结果表明,12℃冷锻炼可以显着提高小桐子幼苗在1℃低温胁迫下的耐冷性。已知蛋白磷酸酶2C（Protein phosphatase 2C,PP2C）,半胱氨酸蛋白酶（Cysteine protease,CP）和半胱氨酸蛋白酶抑制剂（Cystatin）家族在调控植物可逆蛋白磷酸化及蛋白质的有序降解中起重要作用,进而调控植物的生长发育和对逆境胁迫的响应与适应。但在小桐子中,上述3个基因家族及其与之相互作用的miRNAs的鉴定以及它们在小桐子低温响应与适应过程中的作用尚未见报道。基于本实验室近期完成的小桐子低温响应过程中转录组、mi RNA组和降解组数据,本研究在全基因组水平上对小桐子蛋白磷酸酶2C、半胱氨酸蛋白酶和cystatin基因家族及靶向该家族成员的miRNAs进行了鉴定,对这三个基因家族的系统进化、保守结构域、染色体定位、表达特性及成员基因与miRNAs互作参与调控小桐子对低温的响应进行了解析,并对部分重要的基因进行了克隆和初步的功能验证,主要结果如下:1.PP2C基因家族及对应的miRNAs的全基因组解析及其在小桐子对低温响应与适应中的作用从小桐子基因组中共鉴定到60个PP2C基因,定位到11条染色体上,可分为12个亚家族（A～J,L,M）,编码136～1094个氨基酸,理论等电点4.73～9.76,蛋白序列比对和结构域分析结果表明,该家族成员都具有PP2C蛋白保守结构域,基因结构分析显示,同一亚家族成员外显子与内含子在数量上基本保持一致。表达分析显示,该家族的基因不同组织及器官在受到盐、干旱和激素胁迫处理时,具有差异化的表达。基于mi RNA组和降解组测序结果,发现有1186个miRNAs靶向调控小桐子PP2C基因家族的32个成员。对靶向JcPP2C9和JcPP2C14的miRNAs在低温处理过程中的共表达分析表明,mi R164-x、mi R395-y和novelm0284-3p与JcPP2C14;mi R3699-y、mi R5371-y、mi R7741-y、novel-mo238-5p和novel-m0294-5p与JcPP2C9在低温胁迫下呈明显的负相关,表明miRNAs与JcPP2C基因家族的某些成员的互作可能在小桐子对低温胁迫的响应与适应中起重要作用。根据上述的结果,本研究挑选了在低温下响应明显的JcPP2C9、JcPP2C14和JcPP2C29三个基因进行了克隆及酵母表达验证和烟草的过表达验证。结果表明,JcPP2C14的过表达可以提高酵母菌对盐胁迫的耐受性,但是该基因的过表达对低温耐受性的提高不是很明显;JcPP2C29的过表达明显提高了酵母菌在低温下的耐受性,但是对盐胁迫耐受性的提高不显着,表明PP2C家族的不同成员对不同逆境胁迫响应的作用不同。2.小桐子半胱氨酸蛋白酶家族和相应的miRNAs的鉴定及其对低温锻炼的响应从小桐子基因组中共鉴定到39个半胱氨酸蛋白酶基因,定位到11条染色体上,可分为6个亚家族（C1A、C2、C12、C13、C14、C15）,编码181～2158个氨基酸,理论等电点4.66～9.49,蛋白结构域分析表明,该家族都具有半胱氨酸蛋白酶Cys和His的活性位点。表达分析显示,该家族的基因在种子、花蕾、叶片、茎端具有差异化的表达。基于mi RNA组和降解组测序结果,发现有283个miRNAs靶向调控小桐子半胱氨酸蛋白酶基因家族的14个成员。对靶向JcDEK1、JcRD21B和JcXBCP3L的miRNAs在低温锻炼过程中的共表达分析表明,mi R1314-y和mi R5156-x与JcDEK1、mi R1151-y与JcRD21B及mi R6483-y与JcXBCP3L在低温锻炼期间呈明显负相关,暗示着这些miRNAs参与了半胱氨酸蛋白酶基因表达的调控,且这种调控可能与低温锻炼诱导的小桐子耐冷性增强有关。基于上述的结果,挑选对低温下高响应的JcRD19C和JcUCH2进行了基因克隆及酵母过表达验证。结果表明,JcRD19C的过表达可以增强酵母菌在低温下的抗冻性,但对盐胁迫下的耐受性不明显。JcUCH2的过表达可以提高酵母菌在低温下的耐性,但对盐胁迫耐受性的提高不显着。表明半胱氨酸蛋白酶家族的不同成员对不同逆境胁迫的响应具有差异。3.小桐子cystatin家族基因和相应miRNAs的鉴定及其在低温响应中可能的作用从小桐子基因组中共鉴定到5个cystatin基因,定位到6、8和10号染色体,可分为3个亚家族（A、B、C）,编码106～242个氨基酸,理论等电点4.97～9.17,序列比对发现cystatin的结构域基本保守且位于N端。表达分析显示,JcCYS1在种子、花蕾、叶子、茎端表达量较高,而JcCYS2在授粉期间表达量高。基于mi RNA组和降解组测序结果,发现有10个miRNAs可能靶向调控cystatin基因家族的3个成员JcCYS1、JcCYS2和JcCYS5。q RT-PCR分析表明,小桐子cystatin家族的5个基因的表达水平在12°C冷锻炼期间总体呈现出显着响应,尤其是在冷锻炼早期（12～24 h）。此外,对靶向JcCYS2和JcCYS5的miRNAs在冷锻炼过程中的表达分析表明,mi R11036-y、mi R396-z与JcCYS2;mi R8154-x与JcCYS5在冷锻炼期间呈明显负相关,暗示着这些miRNAs的确参与了cystatin基因的调控,且这种调控应该与冷锻炼诱导的小桐子耐冷性有关。根据以上结果,挑选对低温下响应强烈的JcCYS2基因进行了克隆及酵母表达验证。结果表明,JcCYS2基因的过表达在一定程度上提高了酵母对低温的抵抗能力,但是在耐盐胁迫下对盐的耐受性的提高不显着。综上所述,这些研究结果有助于更好了解小桐子PP2C、半胱氨酸蛋白酶和cystatin基因家族的功能及其与相应miRNAs的互作、以及这种互作如何调控小桐子对低温胁迫的响应与适应。
朱熙[4]（2021）在《马铃薯中与胁迫相关StMAPKs基因的分离及功能研究》文中研究说明丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase,MAPK）级联是真核生物中高度保守的信号转导模式,由MAPKKK、MAPKK和MAPK组成。该级联途径通过三种激酶依次逐级磷酸化将感知的外源信号放大并传递下去,从而产生应激反应介导细胞增殖、分化和死亡。马铃薯（Solanum tuberosum L.）为世界第四大粮食作物,日益突出的土地干旱和盐碱化问题造成其减产。目前,关于植物MAPK在干旱、盐及渗透胁迫条件下的基因功能研究十分有限。迄今为止,马铃薯StMAPKs基因响应非生物胁迫和植物激素诱导表达模式的系统研究仍未见报道,而且其在马铃薯不同组织和器官中的表达模式也不清楚。本研究主要解析StMAPKs是否介导多种与胁迫相关的信号转导途径,StMAPKs是否在干旱、盐和渗透胁迫下起作用以及其潜在机制。本研究对StMAPKs响应不同非生物胁迫和植物激素处理表达模式行了分析,同时还分析了其在不同组织和器官中的表达模式。从马铃薯“大西洋”中分离得到一个与盐和渗透胁迫相关的StMAPK3功能基因和一个与干旱胁迫相关的StMAPK11功能基因,并通过亚细胞定位、酵母双杂文库筛选、酵母双杂检测互作蛋白、双分子荧光互补、磷酸化蛋白组学,以及对过表达和RNA干扰表达转基因的植株在胁迫下生理指标和光合指标的检测做了研究。取得的主要研究结果如下:1.通过qRT-PCR技术分析了马铃薯15个StMAPKs基因在不同非生物胁迫和植物激素处理以及不同组织和器官中的表达模式。结果表明:马铃薯中15个StMAPKs基因不仅在非生物胁迫和植物激素处理时表达差异显着,而且在不同组织和器官中的特异性表达差异也显着。2.从马铃薯中克隆得到两个促分裂原活化蛋白激酶基因StMAPK3和StMAPK11,其中StMAPK3是与盐和渗透胁迫相关,而StMAPK11与干旱胁迫相关,构建了pCAM35s-GFP-StMAPK3和pCAM35s-GFP-StMAPK11亚细胞定位载体,并在烟草表皮细胞中进行了瞬时表达。结果表明,StMAPK3和StMAPK11均定位于细胞膜和细胞核。3.构建了原核重组表达载体pET28b-StMAPK11,并将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）后,IPTG诱导并纯化StMAPK11重组蛋白,制备兔抗StMAPK11多克隆抗体,Western blot结果显示制备好的抗体可以很好的与StMAPK11蛋白特异性结合。4.分别构建了酵母双杂和双分子荧光互补载体,通过酵母双杂交和双分子荧光互试验验证结果显示,StMAPK3可以与StDof1、StSR2、StACS5、StMEK2和StMAPKK1发生互作,其中StMAPK3与StSR2在细胞核内相互作用。StMAPK11可以与StbZIP2、StPTP1和StVQP9发生互作,其中StMAPK11与StbZIP2在细胞核内相互作用。5.与盐和渗透胁迫相关StMAPK3基因的功能分析。在盐和渗透胁迫条件下,与非转基因植株相比,过表达StMAPK3植株中过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）的酶活性和脯氨酸含量均增加,在RNA干扰表达植株中,结果相反,而在StMAPK3过表达植株中H2O2和丙二醛（MDA）含量减少,RNA干扰表达植株中H2O2和MDA含量增加。同时过表达StMAPK3提高了盐和渗透胁迫下植株的蒸腾速率、净光合速率、气孔导度和水分利用效率,在RNA干扰表达植株中,这些光合指标与非转基因植株相比都不同程度的降低。并且还发现在盐和渗透胁迫下转StMAPK3基因对马铃薯植株的气孔开合度、植株高度、茎粗、鲜重、根长和侧根数都有不同程度的影响。结果表明StMAPK3能明显提高马铃薯植株对盐和渗透胁迫的抗性。6.与干旱胁迫相关StMAPK11基因的功能分析。在干旱胁迫条件下,与非转基因植株相比,过表达StMAPK11植株（马铃薯、烟草和拟南芥）中CAT、POD、SOD酶活性和脯氨酸含量均增加,但在RNA干扰表达马铃薯植株中,结果相反,在StMAPK11过表达植株（马铃薯、烟草和拟南芥）中H2O2和MDA含量减少,但在RNA干扰表达马铃薯植株中H2O2和MDA含量增加。同时过表达StMAPK11提高了干旱胁迫下马铃薯植株的蒸腾速率、净光合速率、气孔导度和水分利用效率;在RNA干扰表达植株中,这些光合指标与非转基因相比都不同程度的降低。并且还发现转StMAPK11基因在干旱胁迫下对马铃薯植株的鲜重、干重、根鲜重和根干重都有不同程度的影响。表明StMAPK11能明显提高植株（马铃薯、烟草和拟南芥）对干旱胁迫的抗性。7.对StMAPK3过表达和RNA干扰表达马铃薯植株进行磷酸化蛋白质组学分析共鉴定得到2180种磷酸化蛋白。通过修饰位点定量分析在两组中共同鉴定到的修饰位点2922个,其中差异显着的修饰位点总数78个,显着上调的修饰位点总数49个,显着下调的修饰位点总数29个。通过磷酸化蛋白差异分析两组共鉴定蛋白2023个,其中上调表达蛋白15个,下调表达蛋白14个。利用GO、KEGG、COG数据库对鉴定的磷酸化蛋白质进行功能注释,结果表明这些蛋白质主要在植株生长发育过程,信号转导和代谢途径中发挥相应功能。
孜拉吉古丽·西克然木[5]（2021）在《荒漠甲虫小胸鳖甲两种SOD基因增强细菌及果蝇耐寒性的研究》文中研究说明低温是影响昆虫地理分布和季节性活动方式的主要环境约束因子。荒漠昆虫小胸鳖甲（Micordera punctipennis）属于避冻型昆虫,可将机体的过冷却点降到过冬所处微环境的温度以下,从而防止体内结冰,允许昆虫在冬季持续进行低速有氧代谢。然而,这种低速有氧代谢可能在昆虫体内诱发活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的产生,并由此引起ROS对生物大分子的持续损害。因此,昆虫的耐寒抗冻机制中可能包含抗氧化防御。超氧化物歧化酶（SOD）是生物体内主要的抗氧化酶家族之一,可清除机体内的超氧阴离子自由基（O2·-）,这是生物体内最初产生的ROS分子,可引发更多ROS的形成。因此,SOD被认为是抵抗氧化胁迫的第一道防线。在植物中,关于低温胁迫与SOD基因的表达调控方面已开展了很多研究。但是在昆虫,尤其是耐寒性昆虫中相关研究很少见。本文首次从荒漠耐寒性昆虫小胸鳖甲中克隆获得了胞外和胞质2个Cu/Zn-SOD基因,并对昆虫在低温下Cu/Zn-SOD基因的表达模式、体内总SOD酶活性与超氧阴离子含量的相关性进行了系统研究。研究发现胞外Cu/Zn-SOD基因的表达可迅速响应4℃低温胁迫,低温下总SOD酶活性与O2·-含量存在负相关关系,SOD在避冻昆虫耐寒响应的生理机制中发挥一定的保护作用。利用原核表达系统和转基因果蝇品系研究了小胸鳖甲Cu/Zn-SOD基因在增强细胞和昆虫耐寒性方面的重要作用。通过测定脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤指标,明确了SOD基因在耐寒性昆虫中通过清除冷胁迫下其体内形成的ROS,可有效抵御ROS对生物大分子的氧化损伤。研究结果有助于深入理解荒漠昆虫SOD基因增强细胞耐寒性的功能,为耐寒性昆虫抗寒机制的研究提供了新角度,可丰富昆虫低温生物学的研究内容。本研究的主要内容概述如下。1.小胸鳖甲两种Cu/Zn-SOD基因的克隆及其表达对低温的响应克隆获得了荒漠昆虫小胸鳖甲两种Cu/Zn-SOD基因的全长c DNA序列,其中,MpecCu/Zn-SOD全长800 bp,开放读码框为669 bp,编码222个氨基酸,其N端包含一个17-氨基酸的信号肽;Mpic Cu/Zn-SOD全长769 bp,包含462 bp的开放读码框,其ORF编码153个氨基酸,但N端没有信号肽。MpecCu/Zn-SOD的编码蛋白与其他已知昆虫的同源蛋白的相似性为60%80%;Mpic Cu/Zn-SOD编码蛋白的相似性为79%93%。生物信息学分析表明两种基因的编码蛋白都包含酶活性所需的保守结构域和金属离子结合位点。实时定量PCR结果表明,4℃低温0.5 h就能够显着诱导MpecCu/Zn-SOD基因的表达,而Mpic Cu/Zn-SOD基因mRNA水平在研究的11 h内不受4℃低温诱导。小胸鳖甲体内超氧阴离子自由基（O2·-）含量的测定结果显示,在4℃胁迫0.5 h,其体内O2·-含量就急剧增加,并在随后的胁迫期间出现波动,与MpecCu/Zn-SOD mRNA的变化趋势相一致。小胸鳖甲体内的O2·-含量与总SOD活性呈负相关,相关系数为-0.437。综上所述,本研究的结果表明MpecCu/Zn-SOD可能在寒冷条件下发挥清除ROS的作用。2.小胸鳖甲两个Cu/Zn-SOD基因增强E.coli细胞耐寒性的功能鉴定为了研究每个MpCu/Zn-SOD的功能,分别将两种MpCu/Zn-SOD基因克隆到原核表达载体p ET-32a中,获得重组质粒p ET32a-MpecCu/Zn-SOD和p ET32a-Mpic Cu/Zn-SOD。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,过表达小胸鳖甲胞外、胞内Cu/Zn-SOD的融合蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD和Trx-His-Mpic Cu/Zn-SOD,并通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定。本研究中将转入p ET32a-MpecCu/Zn-SOD和p ET32a-Mpic Cu/Zn-SOD重组质粒的转化菌BL21分别简称为胞外转化菌和胞内转化菌,转入p ET32a空载质粒的转化菌BL21简称为对照菌。融合蛋白的可溶性分析结果显示,Trx-His-MpecCu/Zn-SOD主要以包涵体形式存在,在25～45℃温度范围内具有稳定的酶活性,并且在35℃时活性最高,表现出广泛的酸碱耐受性（p H 3～12）,最适p H为9.0。融合蛋白Trx-His-Mpic Cu/Zn-SOD在上清和沉淀中均有表达,在上清中所占比例高于沉淀。其酶活性在p H 3～11范围内比较稳定,酶活性在p H为8.0时最高,同时也表现出广泛的温度耐受性（25～55℃）,最适温度为35℃。上述结果表明纯化的两种MpCu/Zn-SOD的酶活性相对比较稳定。抗氧化活性检测表明,两种转化菌BL21在H2O2培养板上的抑菌圈直径均小于对照菌的直径,表明两种转化菌都具有较高的抗氧化能力。在-4℃冷处理下的存活曲线和酶活性检测结果表明,与对照菌相比,两种转化菌表现出更高的耐寒性和SOD活性。相应地,在-4℃冷处理下,胞内转化菌和胞外转化菌的电导率和丙二醛（MDA）含量均低于对照菌。综上所述,过表达两个MpCu/Zn-SOD的大肠杆菌细胞通过清除ROS增强了其对冷胁迫的抵抗力,并减轻了在寒冷条件下由ROS引起的潜在细胞膜脂质损伤。3.两个MpCu/Zn-SOD基因转化果蝇的耐寒性分析基于P因子介导的转基因技术将小胸鳖甲MpecCu/Zn-SOD和Mpic Cu/Zn-SOD基因分别转入果蝇基因组中。通过平衡杂交、筛选和染色体定位,成功获得了5个能稳定遗传的转MpCu/Zn-SOD果蝇品系。将Actin-Gal 4品系与构建好的转基因果蝇品系杂交,启动了两个靶基因在果蝇后代中的高表达。在低温和氧化胁迫下,两种转基因果蝇的存活率均显着于对照品系。与对照组果蝇品系相比,冷胁迫提高了转基因品系的SOD酶活性并显着降低了两种转基因果蝇体内O2·-的积累。此外,在低温条件下,两种转基因果蝇在一定程度上表现出比对照果蝇更少的氧化损伤。研究表明,果蝇中MpecCu/Zn-SOD和Mpic Cu/Zn-SOD基因的过表达,通过消除冷胁迫下其体内形成的O2·-,从而抵御ROS对脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤,由此增强其抗寒性。
周春艳[6]（2021）在《转录组和代谢组联合分析低温胁迫对天麻生长影响及其SOD和GS基因克隆与功能鉴定》文中进行了进一步梳理天麻（Gastrodia elata）是与真菌共生的异养多年生草本植物,也是一种名贵传统中药材。天麻素和4-羟基苯甲醇是天麻的主要药效成分,具有防治老年痴呆、阿尔兹海默症、抑郁症、中风以及改善记忆等功效。由于天麻营养丰富,是目前备受青睐的保健食品。近年来,随着生态环境不断破坏和人工采挖,野生天麻资源减少或濒临灭绝。目前天麻供不应求,人工栽培天麻将成为满足市场需求的唯一有效途径。气候条件影响天麻生长发育,温度是影响天麻生长的关键因子之一,影响到栽培天麻产量、品质和分布。长时间的低温胁迫会使天麻出现黑斑,严重时会腐烂坏死。然而,关于低温对天麻生长发育影响的生理分子机制尚未见报道。本研究以不同温度下生长的天麻为研究对象,利用转录组和代谢组联合分析研究不同温度条件下天麻基因表达水平和体内代谢物成分变化,从差异代谢物中寻找关键基因差异表达情况,推断不同温度对天麻生长发育规律的影响,并对差异表达基因超氧化物歧化酶（SOD）和谷氨酰胺合成酶（GS）基因进行克隆与功能鉴定。研究结果为提高天麻的产量和品质,培育抗寒天麻新品种提供理论依据。主要获得以下结果:1、本研究以13℃母麻（NS）、23℃母麻（TB）和23℃箭麻（SS）为实验材料,进行转录组和代谢组联合分析阐明温度对天麻生长发育的调控。转录组分析共获得126787个Unigene,注释到6大数据库的Unigene数有59501个,占总Unigene数的46.93%;基于显着差异表达的阈值|log2（变化倍数）|≥1且（P<0.05）,在NS-vs-SS、NS-vs-TB和SS-vs-TB中分别有17201、17162和10322个差异表达基因（DEGs）。KEGG通路富集分析表明差异表达基因主要参与代谢途径、次生代谢产物的生物合成和RNA转运等途径。代谢组分析共检测到437个代谢物,其中NS-vs-SS、NS-vs-TB和SS-vs-TB分别获得200、204和87个含量差异代谢物,其中分别有52、51和34个代谢产物含量上调,148、153和53个代谢物含量下调。这些差异物分布于糖醇类、氨基酸、有机酸、脂质类、核苷酸、酚酸类和维生素7类物质中。代谢组数据分析表明,在低温下,天麻母麻中大多数的糖醇类代谢物、氨基酸及其衍生物含量水平下调,为箭麻生长提供的营养物质少,仅能维持自生的生命活动,不利于天麻生长;而大多数为脂质、有机酸、核苷酸及其衍生物和酚酸类代谢物含量水平上调,为防止低温胁迫脂质抗氧化和酚酸次生代谢清除ROS而增加,有机酸和核苷酸新陈代谢减缓而积累。两组学联合分析发现代谢物的含量与合成酶基因表达水平呈正相关,而与分解酶基因表达水平呈负相关。4℃母麻（FS）、NS、TB和SS的MDA、H2O2、GSH和淀粉含量常规分析结果表明随温度的降低天麻中MDA、H2O2和GSH含量增加,而淀粉含量降低。2、基于转录组数据分析,筛选出显着差异表达的超氧化物歧化酶（SOD）基因,找出CDS序列,通过RACE-PCR技术扩增出SOD基因全长序列为720bp,编码239个氨基酸残基。构建天麻SOD基因的原核表达载体,原核表达分析表明SOD为可溶性蛋白,其分子量47.4 k Da。酶活分析表明SOD为金属酶,本研究中SOD最适温度为60℃,热稳定较好,最适p H为6.0,不同金属离子对SOD酶活影响不同,且高浓度的金属离子比低浓度对SOD的酶活影响大。构建了天麻SOD基因的真核过表达载体,通过农杆菌法转入拟南芥sod突变体中,验证基因功能。通过农杆菌法转染蜜环菌,获得转SOD基因的工程蜜环菌可以抵抗低温胁迫,提高转基因蜜环菌的抗氧化活性,为进一步培育抗寒天麻提供实验基础。3、基于转录组数据分析,筛选出显着差异表达的谷氨酰胺合成酶（GS）基因,找出CDS序列,通过RACE-PCR技术扩增出GS基因全长序列为1062 bp,编码342个氨基酸残基。构建天麻GS基因的原核表达载体,原核表达分析表明GS为可溶性蛋白,其分子量约为59.94 k Da。酶活分析表明本研究中GS最适温度为50℃,热稳定性较好,最适p H为4.0。不同金属离子对GS酶活影响不同,高浓度的金属离子比低浓度对GS的酶活影响大。构建天麻GS真核过表达载体,通过农杆菌转染蜜环菌获得转GS基因工程蜜环菌,可提高工程菌抗低温胁迫作用,推测含转GS基因蜜环菌可以促进氮同化,降低低温对天麻生长中的氧化损伤,提高天麻的产量,为培育抗寒新品种天麻提供理论依据。
骆磊[7]（2021）在《基于转录组学的克氏原螯虾对温度和盐度响应机制探究》文中研究说明克氏原螯虾（Procambarus clarkii）,俗称小龙虾,是一种淡水经济类虾,因其肉味鲜美,蛋白含量高,而广受消费者欢迎。近年来,随着我国克氏原螯虾养殖产量的不断增加,养殖面积飞速扩增,产业迅猛发展的同时,也存在一些问题。如市场供需季节性和地域性严重失衡的突出问题,主要表现为长期高低温环境和盐碱地养殖受到制约。因此,开展克氏原螯虾对不同温度和盐度胁迫的响应机制研究,可为后续克氏原螯虾养殖区域扩大和开展反季节养殖提供分子理论基础。本文建立了克氏原螯虾在急性温度和盐度胁迫下的肝胰腺转录组数据库,对关键差异表达基因（DEGs）和显着富集通路进行了筛选与分析。其次,检测了急性温度和盐度胁迫下的克氏原螯虾肝胰腺、鳃组织的免疫、代谢和应激相关酶活指标,观察了急性盐度和温度胁迫下的肝胰腺和鳃组织的显微结构。最后,通过转录组数据库筛选出分别对温度响应和盐度响应的两个基因,进行了生物信息学分析以及探究了它们分别在不同温度和不同盐度胁迫下的组织表达变化。本文主要结果如下:一、利用转录组测序技术构建了克氏原螯虾不同温度胁迫下的转录组数据库,三个不同温度组共获得了421,547,922个原始reads,经过数据过滤后,获得了409,214,520个清洁reads。随后经过拼接和整合共获得了116,432个单基因,随后被NR、NT、KO等数据库注释。其中,在所有基因库中均注释的单基因共有1893个（1.62%）,并且在至少一个数据库中注释的单基因有37255（31.99%）个。差异表达基因统计显示,30℃高温组和10℃低温组分别发现了2092个DEGs和6929个DEGs。KEGG通路富集结果表明,免疫途径是克氏原螯虾10℃胁迫后的主要应激途径,代谢途径是30℃处理后的主要响应途径。流式细胞分析还发现了高温和低温胁迫均引起克氏原螯虾血细胞不同程度的凋亡,动态转录热图分析鉴定了HSPs家族基因,免疫相关基因和凋亡途径基因在不同温度胁迫下的差异表达。此外,高温（30℃）和低温（10℃）胁迫下的克氏原螯虾代谢相关酶丙酮酸激酶（PK）、脂肪酸合成酶（FAS）、免疫与抗氧化相关酶溶菌酶（LYS）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和热应激蛋白HSP90的表达量与中温（25℃）对照组相比差异性显着。组织切片分析也发现了高温和低温条件下克氏原螯虾肝胰腺和鳃组织细胞显微结构受到不同程度损伤。二、利用转录组测序技术建立了克氏原螯虾盐度梯度转录组数据库,从15组不同盐度和时间点处理的克氏原螯虾肝胰腺中共获得了882,552,854个清洁reads。经过Trinity软件对清洁reads进行组装后,产生了平均长度为1000bp的52533个单基因。通过blastx程序将52533个单基因比对到Nr、Swiss Prot、KEGG和COG等数据库后,发现被注释的基因总数为16957个,在所有基因库中均注释的单基因共有7748个（14.75%）。差异表达基因统计显示,在15个不同比较组中,低盐24h组与对照组相比DEGs最多,为2545个（1368个上调,1177个下调）;DEGs数目最少的为高盐6h和低盐6h比较组,为16个（9个上调,7个下调）。通路富集以及DEGs归类显示,6个盐度处理组与对照组的所有差异表达基因中,糖代谢途径是克氏原螯虾面对盐度胁迫后的最主要反应通路（256个DEGs）。其次为蛋白质和氨基酸代谢（182个DEGs）和免疫与抗氧化途径（165个DEGs）。在信号通路中,MAPK信号通路是起主要作用的通路,不同盐度胁迫下共有64个DEGs。其次为Longevity调控通路,有26个DEGs。此外,FoxO、Hippo、Wnt和Phosphatidylinositol信号通路也参与到了克氏原螯虾应对盐度变化的调控机制中。对溶质载体家族蛋白基因（SLC家族）差异统计情况显示,各比较组中共有90个SLC家族基因参与盐度应激,钠/葡糖糖协同转运蛋白（SLC5A1）基因,Na+/Cl-依赖性的神经递质转运蛋白（SLC6A5）基因与锌离子转运蛋白（SLC39A1、SLC39A2）基因为各比较组差异表达基因中出现频率最高且差异倍数较大的4个基因。生化指标探究也表明,克氏原螯虾能量代谢相关酶PK活性、FAS活性以及免疫相关酶LYS活性、CAT活性、SOD活性和应激蛋白HSP90的表达量在急性低盐到高盐胁迫中具有不同的表达趋势,与对照组相比均有不同程度的差异表达。组织学探究还显示了急性高渗环境会造成克氏原螯虾肝胰腺分泌细胞、储存细胞与鳃组织呼吸上皮细胞、微腔血细胞等结构受损,盐度越高,受损越严重,高盐24ppt条件下会造成不可逆的结构损伤。三、从温度和盐度转录组数据库中发掘到了热应激蛋白基因PcHSP27和盐度响应的6-磷酸葡萄糖转运蛋白基因PcSLC37A2,并通过三代测序基因组中获得了基因序列。PcHSP27序列全长3040bp,开放阅读框ORF长2418bp,编码805个氨基酸。PcSLC37A2序列全长2264bp,开放阅读框ORF长1479 bp,编码492个氨基酸。qRT-PCR显示这两个基因在被检测的12个组织（胃、卵巢、肠、精巢、鳃、脑、肝胰腺、触角腺、心脏、神经、肌肉、表皮）中广泛分布。其中,PcHSP27在精巢、肌肉、胃、卵巢中有较高表达,肠中的表达量最高,表明PcHSP27可能在克氏原螯虾消化吸收、生理代谢、生殖发育方面起到重要作用;而PcSLC37A2在胃中表达量最高,表明了克氏原螯虾可能通过胃中SLC37A2基因的高表达来参与糖类的吸收与转运,以维持血糖平衡。急性高、低温胁迫下PcHSP27在肝胰腺与鳃组织中的表达均与常温25℃对照组有显着性差异,在胁迫2h后反应迅速,胁迫96h后,高温组和低温组PcHSP27有不同的表达趋势。慢性温度胁迫4周、8周后,PcHSP27的表达量在肝胰腺和鳃组织中均显着高于对照组,呈上升趋势。急性盐度胁迫下,PcSLC37A2在肝胰腺和鳃组织有不同的表达模式。6ppt盐度下,PcSLC37A2在各时间点的表达量都显着低于对照组,而高盐（18ppt）组只在8h时高于对照组,其余时间点均低于对照组。在鳃组织中,盐度胁迫2h、4h、8h时,高盐组和低盐组与对照组相比PcSLC37A2表达量均有不同程度的下调,随着胁迫时间的延长,表达量又有上升的趋势。慢性盐度胁迫2周、4周时,PcSLC37A2可能已对3ppt盐度产生了适应,表达量较稳定。在9ppt盐度还有持续性高表达,以应对高渗的外部环境。
何鹏[8]（2020）在《黄瓜SOD基因CsCSD1和CsFSD2的克隆及原核表达分析》文中研究说明超氧化物歧化酶（SOD）基因广泛存在于植物界,在植物抵御非生物胁迫中起着至关重要的作用。黄瓜属于葫芦科,具有较高的经济效益。在逆境条件下,黄瓜的产量与效益会明显减少,因此提高黄瓜抗逆性是目前研究的重点方向之一。为了探索黄瓜SOD基因对植株抗逆性的作用,本文以华北型黄瓜9930作为研究材料,对黄瓜超氧化物歧化酶基因家族做了生物信息学分析;并分析了黄瓜超氧化物歧化酶基因的组织表达特征;利用荧光定量PCR技术对CsCSD1和CsFSD2基因在不同胁迫下进行表达量分析;并克隆了CsCSD1和CsFSD2基因,构建了pET32a-CsCSD1和pET32a-CsFSD2表达载体,利用原核表达方法对黄瓜超氧化物歧化酶基因CsCSD1进行抗逆性研究,主要结果如下:1.在黄瓜基因组中鉴定了8个超氧化物歧化酶基因,包括5个Cu/ZnSODs、2个Fe SODs和1个Mn SOD基因;基因结构和基序分析表明,大多数SOD基因具有相对保守的外显子/内含子排列和基序组成;2.黄瓜超氧化物歧化酶基因的组织表达特征:大多超氧化物歧化酶基因在各组织中都有表达,其中,CsCSD1的表达量相对较高,CsCSD2的表达量相对较低;在ABA、低温、高温、H2O2、盐和PEG等六个胁迫处理下的表达量分析表明CsCSD1和CsFSD2基因都出现表达量的变化,其中CsCSD1在ABA和盐处理下的表达量明显升高,CsFSD2在6个胁迫处理下表达量都显着上升;3.克隆了CsCSD1和CsFSD2基因,构建了pET32a-CsCSD1和pET32a-CsFSD2表达载体,并在BL21中高表达。原核表达分析表明pET32a-CsCSD1和pET32a-CsFSD2的最适菌液诱导浓度为OD600=0.6,最适诱导时间为4h,最适IPTG浓度为1 mmol/L;4.转化大肠杆菌抗逆性结果表明:CsCSD1重组蛋白在不同胁迫处理下都提高了大肠杆菌的的抗逆性。
王维[9]（2019）在《盐胁迫条件下陆地棉活性氧代谢相关基因的功能研究》文中研究说明棉花是世界上主要的经济作物之一。棉花在生长过程中容易受到多种逆境胁迫,其中盐胁迫对棉花的产量影响严重。活性氧是植物生长发育过程中有氧代谢的副产物,可以作为信号分子广泛参与调控不同生物学过程。细胞内维持适量的活性氧可增强植物对逆境胁迫的耐受性,活性氧含量过低或者过高,会对植物产生抑制或毒害作用。因此,研究活性氧代谢过程对提高植物的逆境耐受力来说非常重要。目前,在棉花中,仅有个别活性氧代谢相关基因逆境功能的报道,没有在全基因组水平上研究盐胁迫活性氧代谢及其相关调控机制。本研究在全基因组水平上,鉴定了陆地棉活性氧代谢相关的3个基因家族:呼吸爆发氧化酶同源物（rboh）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）。分析了它们在棉花发育进程中时空表达特性和逆境条件下的表达模式,预测并探讨了在转录水平、转录后水平上棉花rboh、SOD、CAT基因的表达调控网络,验证了陆地棉ghr-miR414c和GhFSD1基因的靶向关系,及其盐胁迫条件下的生物学功能。主要研究结果如下:1、陆地棉SOD基因家族鉴定和分析。在陆地棉基因组中鉴定得到了18个GhSOD基因,分布在12条染色体上,编码Cu/Zn-、Mn-和Fe-SOD三类蛋白。对9种节点植物的系统发育进化分析,发现Mn/Fe-SOD的编码基因出现早于Cu/Zn-SOD,之后3类基因独立进化,同时Cu/Zn-SOD的编码基因取代Mn-SOD的编码基因成为优势基因。对GhSOD基因家族的表达特点分析,结果表明在陆地棉中该基因家族的表达具有时空特异性,同时受到多种逆境胁迫的诱导。对在转录后水平上可能调控该基因家族的miRNAs进行了预测,结果表明有20个陆地棉miRNAs靶向14个陆地棉SOD基因,绝大部分靶位点在编码区,个别在3’UTR,其中ghr-miR414c与GhFSD1之间可能存在靶向关系。2、陆地棉miR414c通过靶向GhFSD1基因调控活性氧代谢响应盐胁迫。从陆地棉中克隆了GhFSD1基因和ghr-miR414c的初级转录本,分析了它们在盐胁迫条件下的表达特性,发现ghr-miR414c表达量下调,而GhFSD1的表达上调,负相关的表达模式间接证明了ghr-miR414c和GhFSD1之间的靶向关系。利用组织化学染色、定量和5’RACE等技术,验证了ghr-miR414c对GhFSD1的切割降解。将GhFSD1基因和ghr-miR414c的初级转录本在拟南芥中过量表达,结果发现,35S::miR414c转基因植株对100和150mM NaCl处理反应敏感,而35S::GhFSD1转基因植株耐盐性提高。利用VIGS技术,将GhFSD1基因在陆地棉中沉默,发现与对照植株相比,GhFSD1沉默植株对盐处理反应敏感;在陆地棉中过表达ghr-miR414c,其对盐胁迫的反应与GhFSD1沉默植株相似。根据以上结果,我们提出ghr-miR414c通过调控GhFSD1的表达,提高棉花耐盐性的模型:在正常条件下,ghr-miR414c通过负调控GhFSD1基因表达,维持棉花体内活性氧代谢平衡;当棉花受到盐胁迫时,ghr-miR414c表达量下调,减弱了其对GhFSD1基因的抑制作用,使得GhFSD1基因表达上调,进而提高体内SOD酶活性,清除体内受盐胁迫诱导产生的过量ROS,以减轻盐胁迫条件下过量ROS对细胞的损伤,从而响应盐胁迫。3、陆地棉rboh基因家族鉴定和分析。陆地棉基组中含有26个Ghrboh基因,以不同的密度分布在18条染色体或scaffolds上。棉属不同种的rboh家族分为6个组,共线性和基因复制分析表明,陆地棉rboh基因家族扩张的主要来源是全基因组复制和染色体片段复制。对Ghrboh基因家族的表达特点分析,表明Ghrboh基因家族的表达具有时间和空间特异性,可能通过介导活性氧代谢参与棉花生长发育,在响应高温、低温、干旱和盐胁迫过程中Ghrboh基因家族发挥重要的作用。4、陆地棉CAT基因家族鉴定和分析。陆地棉CAT基因家族中含有7个成员,系统发育和共线性分析结果表明,GhCAT基因家族分为2个组,在植物进化过程中发生的全基因组复制或多倍体事件是CAT基因家族扩张的主要原因。表达谱分析表明,GhCAT基因家族的表达受到高温、低温、干旱、盐和黄萎病菌侵染等条件的诱导。此外,陆地棉CAT基因家族的表达受到可变剪接的调控,通过介导活性氧代谢,在棉花的生长发育过程和响应逆境胁迫过程中发挥作用。研究结果有助于探讨陆地棉中活性氧介导抗逆机理,加深对植物抗逆代谢通路的认识,为提高农作物胁迫抗性提供一定的理论参考。
李亚男,张海滨[10]（2018）在《海洋无脊椎动物抗氧化酶研究进展》文中研究表明海洋无脊椎动物是重要的经济水产生物和海洋生态系统的主要组成者。抗氧化酶系统在其环境适应性以及非特异性免疫中发挥着重要作用。本文从海洋无脊椎动物主要抗氧化酶类的种类、结构、环境适应性、酶学、基因和蛋白研究等几个方面进行综述并对今后海洋无脊椎动物抗氧化酶的相关研究提出展望。
二、人锰超氧化物歧化酶基因的克隆及高表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人锰超氧化物歧化酶基因的克隆及高表达（论文提纲范文）
（1）马铃薯SOD基因家族生信分析及其在块茎愈伤活性氧产生中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 马铃薯及其采后损失 |
| 1.1.1 马铃薯概述 |
| 1.1.2 块茎的采后损失及其原因 |
| 1.1.2.1 腐烂 |
| 1.1.2.2 发芽 |
| 1.1.2.3 萎蔫和绿变 |
| 1.2 马铃薯块茎的愈伤 |
| 1.2.1 愈伤的过程 |
| 1.2.2 愈伤的机理 |
| 1.2.2.1 植物激素在块茎愈伤中的作用 |
| 1.2.2.2 活性氧在块茎愈伤中的作用 |
| 1.2.2.3 糖代谢在块茎愈伤中的作用 |
| 1.2.2.4 脂肪酸代谢在块茎愈伤中的作用 |
| 1.2.2.5 苯丙烷代谢在块茎愈伤中的作用 |
| 1.3 植物超氧化物歧化酶 |
| 1.3.1 特点 |
| 1.3.2 基因家族 |
| 1.3.3 损伤胁迫下的表达 |
| 1.3.4 参与细胞壁木栓化过程 |
| 1.4 RNA干扰 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 第二章 马铃薯SOD基因家族生物信息学及在不同器官中的表达分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 StSODs的基因家族成员鉴定 |
| 2.2.2 StSODs的染色体定位 |
| 2.2.3 StSODs的系统进化树构建 |
| 2.2.4 StSODs的基因结构分析 |
| 2.2.5 StSODs的启动子和GO注释分析 |
| 2.2.6 总RNA提取和c DNA的合成 |
| 2.2.7 StSODs的 q RT-PCR分析 |
| 2.2.8 统计分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 StSODs的理化性质分析 |
| 2.3.2 StSODs的染色体定位分析 |
| 2.3.3 StSODs的进化分析 |
| 2.3.4 StSODs的保守基序及结构分析 |
| 2.3.5 StSODs的启动子顺式作用元件分析 |
| 2.3.6 StSODs的 GO功能分析 |
| 2.3.7 StSODs的在不同器官中的相对表达量分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 二苯基碘对马铃薯块茎愈伤期间NOX及 SOD家族成员表达的抑制 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 块茎处理 |
| 3.2.2 生化取样 |
| 3.2.3 块茎的Strbohs和 StSODs的表达量测定 |
| 3.2.4 O~(2-)和H_2O_2含量的测定 |
| 3.2.5 数据统计 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 DPI对愈伤期间块茎伤口处Strbohs表达量的影响 |
| 3.3.2 DPI对愈伤期间块茎伤口处StSODs表达量的影响 |
| 3.3.3 DPI对愈伤期间块茎伤口处O~(2-)和H_2O_2含量的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 StMSD干扰表达载体的构建及遗传转化 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 StMSD的基因扩增 |
| 4.2.1.1 StMSD的引物设计 |
| 4.2.1.2 PCR扩增及产物纯化回收 |
| 4.2.1.3 TA连接及连接产物的大肠杆菌转化 |
| 4.2.1.4 载体构建 |
| 4.2.2 马铃薯的遗传转化 |
| 4.2.2.1 无菌试管苗的培养 |
| 4.2.2.2 农杆菌介导的遗传转化 |
| 4.2.2.3 转基因植株的筛选 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 StMSD的片段克隆 |
| 4.3.2 干扰表达载体构建 |
| 4.3.3 农杆菌介导的遗传转化 |
| 4.3.4 转基因植株筛选 |
| 4.3.5 转基因试管薯诱导 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 StMSD在马铃薯块茎愈伤活性氧产生和愈伤组织形成中的功能研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 转基因块茎的损伤及愈伤 |
| 5.2.2 转基因块茎在愈伤过程中StSODs和 StPAL、StC4H、St4CL、StCAD的相对表达量 |
| 5.2.3 转基因马铃薯块茎O~(2-)和H_2O_2含量的测定 |
| 5.2.4 转基因块茎伤口处软木脂和木质素的沉积观察 |
| 5.3 数据统计 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 愈伤期间StMSD干扰表达块茎伤口处StSODs的相对表达量 |
| 5.4.2 愈伤期间StMSD干扰表达块茎伤口处的O~(2-)和H_2O_2含量 |
| 5.4.3 愈伤期间StMSD干扰表达块茎伤口处的StPAL、StC4H、St4CL和 StCAD的相对表达量 |
| 5.4.4 愈伤期间StMSD干扰表达块茎伤口处的软木脂和木质素的沉积 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（2）老芒麦种质资源耐盐性评价及EsABI5基因作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 老芒麦概述 |
| 1.1.1 老芒麦种质资源概况 |
| 1.1.2 老芒麦耐盐性研究进展 |
| 1.2 盐胁迫对植物的伤害 |
| 1.2.1 渗透胁迫与离子毒害效应 |
| 1.2.2 其他次生胁迫效应 |
| 1.3 植物响应盐胁迫的生理和分子机制 |
| 1.3.1 生长发育对植物盐胁迫的响应 |
| 1.3.2 植物激素对植物盐胁迫的响应 |
| 1.3.3 代谢途径对植物盐胁迫的响应 |
| 1.3.4 渗透调节物质对植物盐胁迫的响应 |
| 1.3.5 膜保护物质及活性氧对植物响应盐胁迫的响应 |
| 1.3.6 盐胁迫蛋白对植物盐胁迫的响应 |
| 1.3.7 植物体内的盐胁迫信息传递机制对植物盐胁迫的响应 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 1.5 研究内容 |
| 1.6 技术路线 |
| 2 老芒麦种质资源耐盐性评价 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 盐胁迫对老芒麦种质相对发芽势的影响 |
| 2.2.2 盐胁迫对老芒麦种质相对发芽率的影响 |
| 2.2.3 盐胁迫对老芒麦种质相对苗高的影响 |
| 2.2.4 盐胁迫对老芒麦种质相对发芽指数的影响 |
| 2.2.5 盐胁迫对老芒麦种质相对活力指数的影响 |
| 2.2.6 盐胁迫对老芒麦萌发期各指标综合耐盐系数的影响 |
| 2.2.7 盐胁迫对老芒麦苗期脯氨酸含量耐盐系数的影响 |
| 2.2.8 盐胁迫对老芒麦苗期相对电导率耐盐系数的影响 |
| 2.2.9 盐胁迫对老芒麦苗期根系活力耐盐系数的影响 |
| 2.2.10 盐胁迫对老芒麦苗期丙二醛含量耐盐系数的影响 |
| 2.2.11 盐胁迫对老芒麦苗期超氧化物歧化酶活性耐盐系数的影响 |
| 2.2.12 盐胁迫下老芒麦萌发期和苗期各指标相关分析 |
| 2.2.13 盐胁迫下老芒麦萌发期和苗期各指标主成分分析 |
| 2.2.14 应用隶属函数法进行老芒麦耐盐性综合评价 |
| 2.2.15 老芒麦耐盐性聚类分析 |
| 2.3 讨论 |
| 3 老芒麦ABI5基因克隆及其序列分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 总RNA提取结果检测 |
| 3.2.2 同源基因扩增结果检测 |
| 3.2.3 克隆测序结果 |
| 3.2.4 老芒麦ABI5基因RACE克隆 |
| 3.2.5 亲缘关系分析 |
| 3.2.6 理化性质分析 |
| 3.2.7 亲/疏水性分析 |
| 3.2.8 信号肽预测 |
| 3.2.9 亚细胞定位预测 |
| 3.2.10 二级结构预测 |
| 3.2.11 Coil卷区分析 |
| 3.2.12 跨膜区分析 |
| 3.2.13 结构域预测 |
| 3.2.14 三级结构预测 |
| 3.2.15 蛋白互作分析 |
| 3.3 讨论 |
| 4 EsABI5基因表达分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 供试材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 筛选内参基因 |
| 4.2.2 EsABI5基因相对表达量分析 |
| 4.2.3 生理指标分析 |
| 4.3 讨论 |
| 5 EsABI5基因功能分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 供试材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 EsABI5基因编码区克隆 |
| 5.2.2 过表达载体pART-CAM/EsABI5的PCR检测 |
| 5.2.3 组培烟草的过程 |
| 5.2.4 转基因株系PCR检测 |
| 5.2.5 转基因株系RT-qPCR检测 |
| 5.2.6 盐胁迫对转基因与野生型烟草表型的影响 |
| 5.2.7 盐胁迫对转基因与野生型烟草生理指标的影响 |
| 5.2.8 盐胁迫对ABA和MAPK途径相关基因的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 6 结论 |
| 7 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（3）小桐子PP2C、CP及cystatin基因家族和相应miRNAs的鉴定及其在低温响应与适应中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略表 |
| 第一章 研究背景 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 冷敏植物冷害、冷锻炼的现象及过程 |
| 1.2.1 低温对冷敏植物形态结构的影响 |
| 1.2.2 低温对冷敏植物光合作用和呼吸作用的影响 |
| 1.2.3 冷敏植物的冷锻炼现象 |
| 1.3 冷敏植物对低温的响应及信号转导 |
| 1.3.1 Ca~(2+)与冷锻炼信号转导 |
| 1.3.2 CBF与冷锻炼信号转导 |
| 1.3.3 ABA参与植物冷锻炼信号转导 |
| 1.3.4 MAPK、BIN2、CRPK |
| 1.4 冷敏植物冷锻炼的生化途径及分子机制 |
| 1.4.1 膜系统 |
| 1.4.2 氧化系统 |
| 1.4.3 渗透胁迫 |
| 1.4.4 冷诱导蛋白的基因表达 |
| 1.5 研究展望 |
| 1.6 植物中miRNAs研究进展 |
| 1.6.1 植物中miRNA的合成 |
| 1.6.2 植物miRNA的调控机制 |
| 1.6.3 miRNA在植物抗逆中的作用 |
| 1.7 本研究的目的及科学意义 |
| 1.8 本研究的内容 |
| 1.9 本研究技术路线 |
| 第二章 PP2C基因家族及对应的miRNAs的全基因组解析及其在小桐子对低温响应与适应的作用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 植物材料的培养 |
| 2.2.2 冷锻炼与低温处理 |
| 2.2.3 大肠杆菌和克隆载体 |
| 2.2.4 酵母菌和过表达载体 |
| 2.2.5 农杆菌和烟草过表达载体 |
| 2.2.6 所需培养基 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 转录组、miRNA组和降解组测序 |
| 2.3.2 小桐子PP2C家族成员的鉴定 |
| 2.3.4 系统发育关系、基因结构和蛋白质结构域分析 |
| 2.3.5 JcPP2C基因家族在染色体上定位 |
| 2.3.6 PP2C家族基因的差异表达 |
| 2.3.7 靶向PP2C家族的miRNAs的筛选 |
| 2.3.8 小桐子低温下m RNA和 miRNA的 qRT-PCR验证 |
| 2.3.9 小桐子JcPP2C14和JcPP2C29 基因的克隆及酵母表达验证 |
| 2.3.10 JcPP2C9、JcPP2C14和JcPP2C29 基因克隆及烟草过表达验证 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 小桐子PP2C基因家族中鉴定到的家族成员 |
| 2.4.2 进化树分析 |
| 2.4.3 JcPP2C家族的基因结构分析 |
| 2.4.4 JcPP2C家族的蛋白结构域分析 |
| 2.4.5 JcPP2C基因的染色体定位和复制 |
| 2.4.6 干旱、盐、GA3、BA和冷锻炼条件下小桐子基因表达谱分析 |
| 2.4.7 低温胁迫下小桐子PP2C家族基因的数字化表达谱及qRT-PCR分析 |
| 2.4.8 低温下micro RNA参与JcPP2C的调控分析 |
| 2.4.9 靶向JcPP2C的 miRNAs的数字表达谱分析 |
| 2.4.10 miRNAs及靶基因qRT-PCR验证 |
| 2.4.11 JcPP2C9、JcPP2C14和JcPP2C29 基因的克隆 |
| 2.4.12 JcPP2C9、JcPP2C14和JcPP2C29 基因生物信息学分析 |
| 2.4.13 酵母表达载体构建与转化及抗逆性分析 |
| 2.4.14 JcPP2C9、JcPP2C14、JcPP2C29 转基因烟草的再生 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 小桐子半胱氨酸蛋白酶家族和相应的miRNAs的鉴定及其对低温锻炼的响应 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 植物材料的培养 |
| 3.2.2 低温锻炼处理 |
| 3.2.3 转录组、miRNA组和降解组测序 |
| 3.2.4 小桐子半胱氨酸蛋白酶家族成员的鉴定 |
| 3.2.5 小桐子半胱氨酸蛋白酶家族的系统发育关系、多序列比对、染色体定位和蛋白质结构域分析 |
| 3.2.6 小桐子半胱氨酸蛋白酶家族基因及相应的miRNAs的数字表达谱分析 |
| 3.2.7 筛选和鉴定靶向小桐子半胱氨酸蛋白酶家族基因的miRNAs |
| 3.2.8 低温锻炼过程中小桐子半胱氨酸蛋白酶基因及相关的 miRNAs表达的 qRT-PCR分析 |
| 3.2.9 JcRD19C和 JcUCH2 基因的克隆 |
| 3.2.10 酵母表达载体JcRD19C-p YES2和JcUCH2-p YES2 载体的构建 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 小桐子半胱氨酸蛋白酶基因家族成员的鉴定 |
| 3.3.2 系统发育进化树分析 |
| 3.3.3 小桐子半胱氨酸蛋白酶家族的蛋白结构域分析 |
| 3.3.4 染色体定位及基因重复事件分析 |
| 3.3.5 小桐子半胱氨酸蛋白酶家族基因在不同器官中的表达谱分析 |
| 3.3.6 低温锻炼期间小桐子半胱氨酸蛋白酶家族基因的数字表达谱分析 |
| 3.3.7 小桐子靶向半胱氨酸蛋白酶家族基因的miRNAs的鉴定 |
| 3.3.8 低温锻炼期间靶向小桐子半胱氨酸蛋白酶家族基因的miRNAs数字表达谱及qRT-PCR分析 |
| 3.3.9 JcRD19C和 JcUCH2 基因的克隆 |
| 3.3.10 JcUCH2和JcRD19C基因信息分析 |
| 3.3.11 JcRD19C和 JcUCH2 同源性及进化树分析 |
| 3.3.12 JcRD19C和 JcUCH2 酵母表达载体的构建 |
| 3.3.13 JcRD19C-p YES2和JcUCH2-p YES2 重组质粒抗逆性分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 小桐子cystatin家族基因和相应miRNAs的鉴定及其在低温响应中可能的作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 植物材料的培养 |
| 4.2.2 冷锻炼与低温处理 |
| 4.2.3 转录组、miRNA组和降解组测序 |
| 4.2.4 小桐子cystatin家族成员的鉴定 |
| 4.2.5 小桐子cystatin家族的系统发育关系、多序列比对、染色体定位、基因结构和蛋白质结构域分析 |
| 4.2.6 小桐子cystatin家族基因及相应的miRNAs的数字表达谱分析 |
| 4.2.7 筛选和鉴定靶向小桐子cystatin家族的miRNAs |
| 4.2.8 冷锻炼过程中小桐子cystatin基因及相关的 miRNAs表达的 qRT-PCR分析 |
| 4.2.9 JcCYS2 基因的克隆 |
| 4.2.10 酵母表达载体JcCYS2-p YES2 载体的构建 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 小桐子cystatin基因家族成员的鉴定 |
| 4.3.2 小桐子cystatin家族系统发育进化树分析 |
| 4.3.3 小桐子cystatin家族的氨基酸序列比对与蛋白结构域分析 |
| 4.3.4 小桐子cystatin基因的染色体定位及重复性分析 |
| 4.3.5 小桐子cystatin家族基因在不同组织中及逆境胁迫下的表达谱分析 |
| 4.3.6 冷锻炼期间小桐子cystatin家族基因的数字表达谱及qRT-PCR分析 |
| 4.3.7 小桐子靶向cystatin家族基因的miRNAs的鉴定 |
| 4.3.8 冷锻炼期间靶向小桐子cystatin 家族基因的miRNAs数字表达谱及qRT-PCR 分析 |
| 4.3.9 JcCYS2 基因全长克隆 |
| 4.3.10 JcCYS2-p YES2 酵母表达载体的构建 |
| 4.3.11 JcCYS2 蛋白二级结构及三级结构分析 |
| 4.3.12 JcCYS2 多序列比对 |
| 4.3.13 JcCYS2 的进化分析 |
| 4.3.14 靶向JcCYS2的miRNAs的筛选与靶位点预测 |
| 4.3.15 JcCYS2与miRNAs的 qRT-PCR分析 |
| 4.3.16 JcCYS2 重组酵母的抗逆性分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 研究结论与展望 |
| 5.1 研究结论 |
| 5.2 本研究主要创新点 |
| 5.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 项目资助 |
| 攻读学位期间发表的学术论文和研究成果 |
| 致谢 |
（4）马铃薯中与胁迫相关StMAPKs基因的分离及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 缩略语表 Abbreviations |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物MAPK级联途径 |
| 1.1.1 植物MAPK级联途径组成 |
| 1.1.2 植物中的MAPKKK |
| 1.1.3 植物中的MAPKK |
| 1.1.4 植物中的MAPK |
| 1.2 植物MAPK级联途径参与植物激素信号转导 |
| 1.2.1 乙烯信号转导 |
| 1.2.2 脱落酸信号转导 |
| 1.2.3 茉莉酸信号转导 |
| 1.2.4 水杨酸信号转导 |
| 1.2.5 生长素信号转导 |
| 1.2.6 油菜素甾醇信号转导 |
| 1.2.7 赤霉素信号转导 |
| 1.3 MAPK级联参与调控植物非生物胁迫 |
| 1.3.1 盐胁迫 |
| 1.3.2 干旱胁迫 |
| 1.3.3 温度胁迫 |
| 1.3.4 氧化应激响应 |
| 1.3.5 臭氧胁迫 |
| 1.3.6 创伤响应 |
| 1.3.7 重金属胁迫 |
| 1.4 植物中磷酸化蛋白组学研究的应用 |
| 1.5 研究内容及目的意义 |
| 1.5.1 研究内容 |
| 1.5.2 研究目的意义 |
| 第二章 马铃薯StMAPKs的差异表达分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 生化试剂 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 植物材料及处理 |
| 2.1.4.1 非生物胁迫和植物激素处理 |
| 2.1.4.2 马铃薯植株不同组织器官的取样 |
| 2.1.5 试验方法 |
| 2.1.5.1 植物总RNA的提取 |
| 2.1.5.2 反转录cDNA第一链的合成 |
| 2.1.5.3 实时荧光定量qRT-RCR分析StMAPKs表达谱 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 非生物胁迫及植物激素处理下的StMAPKs差异表达分析 |
| 2.2.1.1 脱落酸处理 |
| 2.2.1.2 干旱处理 |
| 2.2.1.3 乙烯处理 |
| 2.2.1.4 赤霉素处理 |
| 2.2.1.5 H_2O_2处理 |
| 2.2.1.6 高温处理 |
| 2.2.1.7 生长素处理 |
| 2.2.1.8 茉莉酸处理 |
| 2.2.1.9 低温处理 |
| 2.2.1.10 NaCl处理 |
| 2.2.1.11 PEG处理 |
| 2.2.1.12 水杨酸处理 |
| 2.2.2 不同组织器官中的StMAPKs差异表达分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 马铃薯StMAPK3 抗盐和渗透胁迫相关的功能研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 生化试剂 |
| 3.1.2 培养基 |
| 3.1.3 引物 |
| 3.1.4 植物材料及处理 |
| 3.1.5 试验方法 |
| 3.1.5.1 植物总RNA的提取 |
| 3.1.5.2 反转录cDNA第一链的合成 |
| 3.1.5.3 目的基因PCR扩增 |
| 3.1.5.4 PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.1.5.5 回收目的片段 |
| 3.1.5.6 植物表达载体构建 |
| 3.1.5.7 马铃薯StMAPK3 的亚细胞定位 |
| 3.1.5.8 酵母双杂试验 |
| 3.1.5.9 双分子荧光互补试验 |
| 3.1.5.10 马铃薯遗传转化及鉴定 |
| 3.1.5.11 盐和渗透胁迫条件下生理指标分析 |
| 3.1.5.12 盐和渗透胁迫条件下生长指标和气孔的分析 |
| 3.1.5.13 盐和渗透胁迫条件下光合指标的分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 马铃薯中与渗透和盐胁迫相关的StMAPK3 基因的分离 |
| 3.2.2 载体的构建 |
| 3.2.2.1 过表达载体pCPB-StMAPK3 的构建 |
| 3.2.2.2 RNA干扰表达载体pCPB121-miRmapk3 的构建 |
| 3.2.2.3 亚细胞定位载体pCAM35s-GFP-StMAPK3 的构建 |
| 3.2.2.4 酵母双杂表达载体的构建 |
| 3.2.2.5 双分子荧光互补(BiFC)表达载体的构建 |
| 3.2.3 StMAPK3 的亚细胞定位 |
| 3.2.4 酵母双杂交筛选与StMAPK3 互作蛋白 |
| 3.2.4.1 诱饵载体pGBKT7-StMAPK3 毒性与自激活检测 |
| 3.2.4.2 StMAPK3 诱饵蛋白筛选马铃薯cDNA文库及分析 |
| 3.2.4.3 酵母双杂交验证蛋白互作 |
| 3.2.5 双分子荧光互补试验(BiFC)验证结果 |
| 3.2.6 转基因马铃薯的植株的获得与检测 |
| 3.2.7 NaCl、甘露醇和PEG处理下的生理指标分析 |
| 3.2.8 NaCl、甘露醇和PEG处理下的光合指标分析 |
| 3.2.9 NaCl、甘露醇和PEG处理下的生长指标及气孔分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 马铃薯StMAPK11 抗旱胁迫相关的功能研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 生化试剂 |
| 4.1.2 培养基 |
| 4.1.3 引物 |
| 4.1.4 植物材料及处理 |
| 4.1.4.1 马铃薯材料及处理 |
| 4.1.4.2 烟草材料及处理 |
| 4.1.4.3 拟南芥材料及处理 |
| 4.1.5 试验方法 |
| 4.1.5.1 植物总RNA的提取 |
| 4.1.5.2 反转录cDNA第一链的合成 |
| 4.1.5.3 目的基因PCR扩增 |
| 4.1.5.4 PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳 |
| 4.1.5.5 回收目的片段 |
| 4.1.5.6 植物表达载体构建 |
| 4.1.5.7 马铃薯StMAPK11 的亚细胞定位 |
| 4.1.5.8 原核表达马铃薯StMAPK11 蛋白 |
| 4.1.5.9 原核表达马铃薯StMAPK11 重组蛋白抗体制备 |
| 4.1.5.10 Western blot |
| 4.1.5.11 酵母双杂试验 |
| 4.1.5.12 双分子荧光互补试验 |
| 4.1.5.13 马铃薯遗传转化及鉴定 |
| 4.1.5.14 烟草遗传转化及鉴定 |
| 4.1.5.15 拟南芥遗传转化及鉴定 |
| 4.1.5.16 干旱胁迫条件下马铃薯植株生理指标分析 |
| 4.1.5.17 干旱胁迫条件下烟草的生理指标分析 |
| 4.1.5.18 干旱胁迫条件下拟南芥的生理指标分析 |
| 4.1.5.19 干旱胁迫条件下马铃薯植株的生物量和生长指标分析 |
| 4.1.5.20 干旱胁迫条件下光合指标的分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 马铃薯中与渗透和盐胁迫相关的StMAPK11 基因的分离 |
| 4.2.2 载体的构建 |
| 4.2.2.1 过表达载体pCPB-StMAPK11 的构建 |
| 4.2.2.2 RNA干扰表达载体pCPB121-miRmapk11 的构建 |
| 4.2.2.3 拟南芥和烟草表达载体pART-CAM-StMAPK11 的构建 |
| 4.2.2.4 亚细胞定位载体pCAM35s-GFP-StMAPK11 的构建 |
| 4.2.2.5 原核重组表达载体pET28b-StMAPK11 的构建 |
| 4.2.2.6 酵母双杂表达载体pGBKT7-StMAPK11 的构建 |
| 4.2.2.7 双分子荧光互补(BiFC)试验表达载体的构建 |
| 4.2.3 原核表达StMAPK11 及抗体制备 |
| 4.2.3.1 原核重组StMAPK11 蛋白表达 |
| 4.2.3.2 间接ELISA法检测兔抗StMAPK11 抗血清效价 |
| 4.2.3.3 兔抗StMAPK11 抗血清的Western blot鉴定 |
| 4.2.4 StMAPK11 的亚细胞定位 |
| 4.2.5 酵母双杂交筛选与StMAPK11 互作蛋白 |
| 4.2.5.1 诱饵载体pGBKT7-StMAPK11 毒性与自激活检测 |
| 4.2.5.2 StMAPK11 诱饵蛋白筛选马铃薯cDNA文库及分析 |
| 4.2.5.3 酵母双杂交验证蛋白互作 |
| 4.2.6 双分子荧光互补试验(BiFC)验证结果 |
| 4.2.7 转基因马铃薯植株的获得与检测 |
| 4.2.8 转基因烟草植株的获得与检测 |
| 4.2.9 转基因拟南芥植株获得与检测 |
| 4.2.10 干旱胁迫下的生理指标分析 |
| 4.2.10.1 干旱胁迫下马铃薯植株的生理指标分析 |
| 4.2.10.2 干旱胁迫下烟草植株的生理指标分析 |
| 4.2.10.3 干旱胁迫下拟南芥植株的生理指标分析 |
| 4.2.11 干旱胁迫下的光合指标分析 |
| 4.2.12 干旱胁迫下的生长指标及生物量分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 马铃薯StMAPK3 磷酸化修饰定量蛋白组学分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.1.2.1 总蛋白提取 |
| 5.1.2.2 蛋白质检 |
| 5.1.2.3 蛋白酶解 |
| 5.1.2.4 磷酸化修饰多肽富集 |
| 5.1.2.5 液质检测 |
| 5.1.2.6 蛋白质的鉴定和定量 |
| 5.1.2.7 蛋白质和差异表达蛋白质的功能分析 |
| 5.1.2.8 基序分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 磷酸化蛋白质组学数据质控与鉴定 |
| 5.2.2 磷酸化蛋白功能注释 |
| 5.2.3 磷酸化修饰位点分析 |
| 5.2.4 磷酸化蛋白差异分析 |
| 5.2.5 差异磷酸化蛋白生物信息学分析 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 附录3 |
| 附录4 |
| 附录5 |
| 附录6 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在读博士期间发表论文 |
| 导师简介 |
（5）荒漠甲虫小胸鳖甲两种SOD基因增强细菌及果蝇耐寒性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.活性氧,氧化胁迫和抗氧化系统 |
| 1.1 活性氧 |
| 1.1.1 活性氧的来源和产生 |
| 1.1.2 活性氧(ROS)的分类 |
| 1.2 ROS的生物学效应和危害 |
| 1.2.1 ROS对脂质的作用 |
| 1.2.2 ROS对蛋白质的作用 |
| 1.2.3 ROS对 DNA的影响 |
| 1.3 抗氧化防御系统 |
| 1.3.1 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD) |
| 1.3.2 过氧化物酶(Catalase,CAT) |
| 1.3.3 谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px) |
| 2.低温胁迫与昆虫抗氧化防御的关系 |
| 2.1 昆虫在低温胁迫下活性氧的产生 |
| 2.2 抗氧化酶在昆虫耐寒性机制中的研究进展 |
| 3.低温胁迫与超氧化物歧化酶研究进展 |
| 3.1 低温胁迫与植物超氧化物歧化酶的表达调控 |
| 3.2 低温胁迫与昆虫SOD表达调控研究进展 |
| 3.3 低温胁迫与昆虫SOD酶活性研究进展 |
| 4.转基因果蝇及其在昆虫基因功能研究中的应用 |
| 4.1 转基因果蝇技术 |
| 4.2 UAS-GAL4二元表达系统 |
| 4.3 在昆虫基因功能研究中的应用 |
| 5.小胸鳖甲研究进展 |
| 5.1 小胸鳖甲生物学特性研究 |
| 5.2 小胸鳖甲应对低温胁迫相关基因及功能研究进展 |
| 5.3 小胸鳖甲低温转录组的研究进展 |
| 6.本研究拟解决的问题及研究意义 |
| 第2章 小胸鳖甲铜锌超氧化物歧化酶基因(icCuZn-SOD和 ecCuZn-SOD)的克隆及对低温的响应 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 昆虫处理以及总RNA提取和cDNA合成 |
| 1.2 小胸鳖甲两个Cu/Zn-SOD基因ORF的扩增 |
| 1.2.1 两种Cu/Zn-SOD基因ORF的 PCR扩增 |
| 1.2.2 PCR产物与pMD18-T载体的连接 |
| 1.2.3 重组质粒转化感受态大肠杆菌细胞(DH5α) |
| 1.3 RACE技术扩增cDNA末端 |
| 1.3.1 RACE引物的合成 |
| 1.3.2 5' RACE和3' RACE cDNA的合成 |
| 1.4 小胸鳖甲两种Cu/Zn-SOD基因的序列分析 |
| 1.5 qRT-PCR检测小胸鳖甲两种Cu/Zn-SOD基因在4℃低温下表达规律 |
| 1.6 小胸鳖甲在4℃不同时间的总SOD活性和O_2·~-含量 |
| 1.7 数据统计分析 |
| 2.结果 |
| 2.1 两种MpCu/Zn-SOD基因核苷酸序列鉴定和预测的氨基酸序列分析 |
| 2.2 两个MpCu/Zn-SOD的预测三维结构 |
| 2.3 两个MpCu/Zn-SOD的系统发育树分析 |
| 2.4 两种MpCu/Zn-SOD基因在低温胁迫下的表达模式 |
| 2.5 4 ℃低温胁迫下,小胸鳖甲体内总SOD活性和O_2·~-含量的变化 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第3章 小胸鳖甲两个铜锌SOD基因增强E.coli细胞耐寒性的功能鉴定 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 主要材料和试剂 |
| 1.2 pET32α-MpecCu/Zn-SOD和 pET32α-MpicCu/Zn-SOD表达载体构建 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 全长扩增 |
| 1.2.3 双酶切 |
| 1.2.4 目的基因与载体的连接和转化 |
| 1.3 两种MpCu/Zn-SOD融合蛋白的诱导表达 |
| 1.4 两种融合蛋白Trx-His-MpCu/Zn-SOD的 Western Blot检测 |
| 1.5 两种融合蛋白Trx-His-MpCu/Zn-SOD的纯化及Western Blot检测 |
| 1.6 两种重组Trx-His-MpCu/Zn-SOD酶的部分酶学性质分析 |
| 1.7 牛津杯法测定转化菌的抗氧化活性 |
| 1.8 两种MpCu/Zn-SOD转化菌的耐寒性测定 |
| 1.9 -4℃冷胁迫下两种MpCu/Zn-SOD转化菌中的酶活性测定 |
| 1.10 -4℃冷胁迫下两种MpCu/Zn-SOD转化菌中的相对电导率和丙二醛(MDA)含量测定 |
| 1.11 数据统计分析 |
| 2.结果 |
| 2.1 两种pET32α-MpCu/Zn-SOD表达载体 |
| 2.2 两种融合蛋白Trx-His-MpCu/Zn-SOD的诱导表达与Western Blot检测 |
| 2.3 两种融合蛋白Trx-His-MpCu/Zn-SOD的纯化 |
| 2.4 两种纯化Trx-His-MpCu/Zn-SOD的部分酶学性质 |
| 2.5 两种MpCu/ZnSOD转化菌的氧化胁迫抗性分析 |
| 2.6 过表达两种MpCu/Zn-SOD细菌在-4℃冷胁迫下的生长曲线 |
| 2.7 两种MpCu/Zn-SOD转化菌在-4℃的SOD酶活性 |
| 2.8 两种MpCu/Zn-SOD转化菌在-4℃的相对电导率 |
| 2.9 两种MpCu/Zn-SOD转化菌在-4℃的丙二醛(MDA)含量 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第4章 两种MpCu/Zn-SOD基因对转基因果蝇抗寒性的增强作用 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 果蝇品系及其饲养条件 |
| 1.1.1 本实验所用果蝇品系 |
| 1.1.2 果蝇玉米基础培养基 |
| 1.1.3 饲养条件 |
| 1.2 转基因果蝇品系的构建 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 MpecCu/Zn-SOD和 MpicCu/Zn-SODORF序列的扩增 |
| 1.2.3 pUAST质粒与目的片段的双酶切 |
| 1.2.4 目的基因与pUAST载体的连接和转化 |
| 1.2.5 目的基因的显微注射,转基因果蝇的筛选、平衡及定位 |
| 1.3 转基因果蝇品系的分子鉴定 |
| 1.3.0 果蝇品系的扩繁及保种 |
| 1.3.1 果蝇基因组DNA的提取 |
| 1.3.2 转基因果蝇的PCR验证 |
| 1.4 UAS-MpCu/Zn-SOD转基因果蝇体内目的基因的激活 |
| 1.4.1 处女蝇的收集 |
| 1.4.2 果蝇品系的杂交 |
| 1.4.3 两种MpCu/Zn-SOD基因在转基因果蝇体内的表达量分析 |
| 1.4.4 两个UAS-MpCu/Zn-SOD/Gal4转基因果蝇的生长周期的观察 |
| 1.5 转基因果蝇的氧化胁迫抗性分析 |
| 1.5.1 果蝇对不同浓度H_2O_2的耐受性测定 |
| 1.5.2 转基因果蝇在H_2O_2胁迫下的死亡率测定 |
| 1.6 转基因果蝇的耐寒性分析 |
| 1.6.1 转基因果蝇在低温胁迫下的死亡率测定 |
| 1.6.2 转基因果蝇在低温胁迫下的O_2·~-含量和总SOD酶活性的测定 |
| 1.6.3 低温胁迫下氧化损伤指标的测定 |
| 1.6.4 转基因果蝇在低温胁迫下的细胞凋亡率测定 |
| 1.7 数据统计分析 |
| 2.结果 |
| 2.1 两种pUAST-MpCu/Zn-SOD表达载体的构建 |
| 2.2 两个重组质粒pUAST-MpCu/Zn-SOD的显微注射和转基因果蝇品系的平衡、筛选以及定位 |
| 2.3 UAS-MpCu/Zn-SOD转基因品系的表型和目的基因的分子鉴定 |
| 2.4 qRT-PCR分析转基因果蝇品系中两个目的基因的表达水平 |
| 2.5 转基因果蝇的发育周期分析 |
| 2.6 转基因果蝇的氧化胁迫结果 |
| 2.6.1 转基因果蝇对H_2O_2半致死浓度的确定 |
| 2.6.2 转基因果蝇在H_2O_2胁迫下的存活率分析 |
| 2.7 在低温胁迫下,MpecCu/Zn-SOD和MpicCu/Zn-SOD过表达对果蝇耐寒性的影响 |
| 2.7.1 转基因果蝇品系在低温胁迫下的存活率分析 |
| 2.7.2 转基因果蝇在0℃下总SOD活性和O_2·-含量的变化 |
| 2.7.3 在0℃下,MpCu/Zn-SOD过量表达可在细胞水平上抵抗氧化应激 |
| 2.7.4 在0℃下,MpCu/Zn-SOD过量表达可保护果蝇细胞免受冷应激和凋亡性细胞死亡 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 结论和展望 |
| 1 结论 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（6）转录组和代谢组联合分析低温胁迫对天麻生长影响及其SOD和GS基因克隆与功能鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 天麻的研究进展 |
| 1.1.1 天麻的生活史 |
| 1.1.2 天麻的生长特性 |
| 1.1.3 天麻的栽培技术 |
| 1.1.4 天麻的药食价值 |
| 1.2 蜜环菌的研究进展 |
| 1.2.1 蜜环菌的培养技术 |
| 1.2.2 共生真菌与天麻的共生关系研究 |
| 1.3 低温胁迫对植物生长发育影响研究进展 |
| 1.3.1 植物低温胁迫与生长 |
| 1.3.2 植物低温胁迫与植物成分含量 |
| 1.3.2.1 低温胁迫对植物糖类含量的影响 |
| 1.3.2.2 低温胁迫对植物氨基酸含量的影响 |
| 1.3.2.3 低温胁迫对植物脂质含量的影响 |
| 1.3.2.4 低温胁迫对植物酚酸类含量的影响 |
| 1.3.3 植物低温胁迫与相关基因 |
| 1.3.4 植物低温胁迫与MDA、H_2O_2和GSH含量 |
| 1.4 转录组测序技术 |
| 1.4.1 转录组概况及方法 |
| 1.4.2 植物转录组RNA-seq技术研究进展 |
| 1.5 代谢组学分析技术 |
| 1.5.1 代谢组学的分析技术 |
| 1.5.2 植物低温下的代谢组学 |
| 1.5.3 植物逆境中的转录组和代谢组联合分析 |
| 1.6 超氧化物歧化酶的研究进展 |
| 1.6.1 超氧化物歧化酶的功能 |
| 1.6.2 超氧化物歧化酶歧化酶在植物逆境中的研究进展 |
| 1.7 谷氨酰胺合成酶的研究进展 |
| 1.7.1 谷氨酰胺合成酶的功能 |
| 1.7.2 谷氨酰胺合成酶在植物逆境中的研究进展 |
| 1.8 研究的目的及意义 |
| 第二章 转录组和代谢组联合分析低温胁迫对天麻生长发育的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 天麻的栽培 |
| 2.1.1.1 蜜环菌菌种与天麻种的获得 |
| 2.1.1.2 蜜环菌菌种活化与培养 |
| 2.1.1.3 蜜环菌菌材的制备 |
| 2.1.1.4 天麻的室内栽培 |
| 2.1.2 天麻样品的采集 |
| 2.1.3 天麻样品转录组测序 |
| 2.1.4 荧光定量PCR引物设计及分析 |
| 2.1.5 天麻样品代谢组检测 |
| 2.1.6 MDA(丙二醛)的测定 |
| 2.1.7 H_2O_2 的测定 |
| 2.1.8 GSH(谷胱甘肽)的测定 |
| 2.1.9 淀粉的测定 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 天麻样品观察与采集 |
| 2.2.2 转录组数据分析 |
| 2.2.2.1 转录组测序数据过滤与组装 |
| 2.2.2.2 转录组测序数据基因功能注释 |
| 2.2.2.3 转录组基因差异筛选分析 |
| 2.2.2.4 差异表达基因的GO分类和KEGG分析 |
| 2.2.2.5 关键差异基因筛选及相对表达水平荧光定量PCR分析 |
| 2.2.3 代谢组数据分析 |
| 2.2.3.1 代谢物检测与分类 |
| 2.2.3.2 代谢物相对含量差异筛选分析 |
| 2.2.4 转录组和代谢组联合分析 |
| 2.2.5 MDA(丙二醛)的测定 |
| 2.2.6 H_2O_2 的测定 |
| 2.2.7 GSH的测定 |
| 2.2.8 淀粉的测定 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 天麻超氧化物歧化酶(SOD)的克隆及分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料与仪器 |
| 3.1.2 引物设计 |
| 3.1.3 天麻总RNA 的提取及cDNA 的合成 |
| 3.1.4 巢式PCR扩增天麻SOD基因的未知片段 |
| 3.1.5 SOD未知片段的胶回收与克隆 |
| 3.1.6 SOD未知片段转化大肠杆菌并拼接 |
| 3.1.7 SOD基因全长克隆 |
| 3.1.8 SOD基因原核表达载体构建 |
| 3.1.9 SOD原核表达重组蛋白的纯化 |
| 3.1.10 SOD酶活及酶学性质的检测分析 |
| 3.1.11 SOD蛋白序列分析 |
| 3.1.12 SOD基因真核表达载体的构建 |
| 3.1.13 sod拟南芥纯化突变体的筛选 |
| 3.1.14 过表达SOD真核载体的拟南芥sod突变体转化 |
| 3.1.15 过表达SOD真核载体的蜜环菌转化 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 天麻SOD基因全长的获得 |
| 3.2.1.1 SOD未知片段的扩增与检测 |
| 3.2.1.2 SOD全长序列的拼接与扩增 |
| 3.2.2 天麻SOD基因的原核表达载体构建及重组蛋白纯化 |
| 3.2.2.1 SOD基因原核表达载体的构建及检测 |
| 3.2.2.2 SOD原核表达转化BL21 感受态诱导蛋白表达分析 |
| 3.2.2.3 SOD原核表达重组蛋白的纯化 |
| 3.2.3 天麻SOD酶活及酶学性质分析 |
| 3.2.3.1 SOD蛋白最适酶促反应温度 |
| 3.2.3.2 SOD蛋白促酶最适pH值 |
| 3.2.3.3 SOD蛋白的耐热性分析 |
| 3.2.3.4 金属离子对SOD蛋白活性的影响 |
| 3.2.4 天麻SOD基因的生物信息学分析 |
| 3.2.4.1 SOD基因编码的氨基酸序列 |
| 3.2.4.2 SOD蛋白氨基酸组成及理化性质分析 |
| 3.2.4.3 SOD蛋白的疏/亲水性分析 |
| 3.2.4.4 SOD蛋白的磷酸化位点分析 |
| 3.2.4.5 SOD蛋白亚细胞定位预测 |
| 3.2.4.6 SOD蛋白的二级结构分析 |
| 3.2.4.7 SOD蛋白的三级结构分析 |
| 3.2.5 天麻SOD基因真核表达载体的构建及转化农杆菌 |
| 3.2.5.1 入门载体pENTR2B-SOD的构建 |
| 3.2.5.2 过表达载体pH2GW7.0-35S-SOD的构建及转化农杆菌 |
| 3.2.6 超氧化物歧化酶突变体拟南芥的筛选及转化 |
| 3.2.6.1 超氧化物歧化酶突变体拟南芥的筛选 |
| 3.2.6.2 SOD过表达载体转化拟南芥花序及鉴定 |
| 3.2.7 SOD过表达载体转化蜜环菌及鉴定 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 天麻谷氨酰胺合成酶(GS)的克隆及分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料与载体 |
| 4.1.2 天麻总RNA 的提取及cDNA 的合成 |
| 4.1.3 GS基因巢式引物及全长扩增的设计 |
| 4.1.4 巢式PCR扩增天麻GS基因的未知片段 |
| 4.1.5 GS未知片段的胶回收与克隆 |
| 4.1.6 GS未知片段转化大肠杆菌并拼接 |
| 4.1.7 GS基因全长克隆 |
| 4.1.8 GS基因原核表达载体构建 |
| 4.1.9 GS原核表达重组蛋白的纯化 |
| 4.1.10 GS酶活及酶学性质的检测分析 |
| 4.1.11 GS蛋白序列分析 |
| 4.1.12 GS基因真核表达载体的构建 |
| 4.1.13 过表达GS真核载体转化蜜环菌及筛选转基因蜜环菌筛选 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 天麻GS基因全长的获得 |
| 4.2.1.1 GS未知片段的扩增与检测 |
| 4.2.1.2 GS长的拼接与扩增 |
| 4.2.2 天麻GS基因的原核表达载体构建及重组蛋白纯化 |
| 4.2.2.1 GS基因原核表达载体的构建及检测 |
| 4.2.2.2 GS原核表达转化BL21 感受态诱导蛋白表达分析 |
| 4.2.2.3 GS原核表达重组蛋白的纯化 |
| 4.2.3 天麻GS酶活及酶学性质分析 |
| 4.2.3.1 GS最适酶促反应温度 |
| 4.2.3.2 GS促酶最适pH值 |
| 4.2.3.3 GS耐热性分析 |
| 4.2.3.4 金属离子对GS活性的影响 |
| 4.2.4 天麻GS基因的生物信息学分析 |
| 4.2.4.1 GS基因编码的氨基酸序列 |
| 4.2.4.2 GS蛋白氨基酸组成及理化性质分析 |
| 4.2.4.3 GS蛋白的疏/亲水性分析 |
| 4.2.4.4 GS蛋白的磷酸化位点分析 |
| 4.2.4.5 GS蛋白亚细胞定位预测 |
| 4.2.4.6 GS蛋白的二级结构分析 |
| 4.2.4.7 GS蛋白的三级结构分析 |
| 4.2.5 天麻GS基因真核表达载体的构建及转化农杆菌 |
| 4.2.5.1 入门载体pENTR2B-GS的构建 |
| 4.2.5.2 过表达载体pH2GW7.0-35S-GS的构建及转化农杆菌 |
| 4.2.6 GS过表达载体转化蜜环菌及转基因蜜环菌的筛选鉴定 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 附表A |
| 附录B |
（7）基于转录组学的克氏原螯虾对温度和盐度响应机制探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1.文献综述 |
| 1.1 克氏原螯虾简介 |
| 1.2 温度对甲壳动物的影响 |
| 1.2.1 温度对甲壳动物生长发育的影响 |
| 1.2.2 温度对甲壳动物生理代谢的影响 |
| 1.2.3 温度对甲壳动物免疫防御的影响 |
| 1.3 甲壳动物对温度的分子响应机制研究进展 |
| 1.3.1 热休克蛋白(HSPs) |
| 1.3.2 血蓝蛋白(Hemocyanin) |
| 1.3.3 p53 信号通路 |
| 1.4 盐度对甲壳动物的影响 |
| 1.4.1 盐度对甲壳动物生长繁育的影响 |
| 1.4.2 盐度对甲壳动物渗透调节的影响 |
| 1.4.3 盐度对甲壳动物免疫防御的影响 |
| 1.5 甲壳动物对盐度的分子响应机制研究进展 |
| 1.5.1 G6P/Pi交换蛋白(SLC37 家族) |
| 1.5.2 氯离子通道蛋白 |
| 1.5.3 MAPK信号通路 |
| 1.6 转录组学技术研究进展 |
| 1.6.1 转录组学概述 |
| 1.6.2 转录组学在水产动物中的应用 |
| 2.本研究的目的和意义 |
| 第二章 克氏原螯虾急性温度胁迫后的转录组学探究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验设计与取样 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 克氏原螯虾肝胰腺总RNA提取与检测 |
| 2.2 文库构建与测序 |
| 2.3 数据分析 |
| 2.3.1 数据质控 |
| 2.3.2 转录本拼接与质量评估 |
| 2.3.3 基因功能注释 |
| 2.3.4 差异表达基因筛选与富集分析 |
| 2.4 RT-qPCR验证 |
| 2.4.1 cDNA模板的合成 |
| 2.4.2 引物设计和荧光定量PCR验证 |
| 2.5 血细胞凋亡检测 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 测序数据概述 |
| 3.1.1 数据与质控 |
| 3.1.2 转录本拼接与评估 |
| 3.2 基因功能注释 |
| 3.3 GO、KOG与 KEGG的基因功能分类 |
| 3.4 差异表达基因以及趋势分析 |
| 3.5 KEGG通路富集分析 |
| 3.6 温度响应下的主要差异基因的表达模式分析 |
| 3.7 荧光定量PCR验证 |
| 3.8 凋亡验证 |
| 4 讨论 |
| 第三章 克氏原螯虾急性温度胁迫后生理指标和组织学探究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验设计与取样 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 急性温度胁迫下肝胰腺和鳃组织相关酶活以及蛋白含量的测定 |
| 2.2 急性温度胁迫下肝胰腺和鳃组织组织切片观察 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 急性温度胁迫下克氏原螯虾肝胰腺和鳃组织代谢酶活性变化 |
| 3.2 急性温度胁迫下克氏原螯虾肝胰腺和鳃组织免疫酶活性变化 |
| 3.3 急性温度胁迫下克氏原螯虾肝胰腺和鳃组织HSP90 含量变化 |
| 3.4 急性温度胁迫下克氏原螯虾肝胰腺组织结构变化 |
| 3.5 急性温度胁迫下克氏原螯虾鳃组织结构变化 |
| 4.讨论 |
| 第四章 克氏原螯虾急性盐度胁迫后的转录组学探究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验设计与取样 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 克氏原螯虾总RNA提取与检测 |
| 2.2 文库构建与测序 |
| 2.3 数据分析 |
| 2.4 RT-qPCR验证 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 测序数据概述 |
| 3.1.1 数据与质控 |
| 3.1.2 组装质量统计与评估 |
| 3.2 基因功能注释 |
| 3.3 GO,KOG与 KEGG的基因功能分类 |
| 3.4 差异表达基因分析 |
| 3.5 KEGG通路富集分析 |
| 3.6 差异表达基因的筛选与归类 |
| 3.7 荧光定量PCR验证 |
| 4.讨论 |
| 第五章 克氏原螯虾急性盐度胁迫后生化指标和组织学探究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验设计与取样 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 急性盐度胁迫下肝胰腺和鳃组织相关酶活以及蛋白含量的测定 |
| 2.2 急性盐度胁迫下肝胰腺和鳃组织组织切片观察 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 急性盐度胁迫下克氏原螯虾肝胰腺与鳃组织代谢酶活力变化 |
| 3.2 急性盐度胁迫下克氏原螯虾肝胰腺与鳃组织免疫酶活力变化 |
| 3.3 急性盐度胁迫下克氏原螯虾肝胰腺与鳃组织热休克蛋白90 含量变化 |
| 3.4 急性盐度胁迫下克氏原螯虾肝胰腺组织结构变化 |
| 3.5 急性盐度胁迫下克氏原螯虾鳃组织结构变化 |
| 4.讨论 |
| 第六章 克氏原螯虾温度响应基因 PcHSP27 与盐度响应基因 PcSLC37A2 的生物信息学与表达分析 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验设计与样品采集 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 总RNA的提取与检测 |
| 2.2 基因的获取与验证 |
| 2.3 生物信息学分析 |
| 2.4 荧光定量PCR |
| 3.实验结果 |
| 3.1 序列特征分析 |
| 3.1.1 PcHSP27 序列特征分析 |
| 3.1.2 PcSLC37A2 序列特征分析 |
| 3.2 同源性与系统发育分析 |
| 3.2.1 PcHSP27 同源性与系统发育分析 |
| 3.2.2 PcSLC37A2 同源性与系统发育分析 |
| 3.3 温度胁迫下PcHSP27 基因表达分析 |
| 3.4 盐度胁迫下PcSLC37A2 基因表达分析 |
| 4.讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）黄瓜SOD基因CsCSD1和CsFSD2的克隆及原核表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 超氧化物歧化酶研究进展 |
| 1.1.1 超氧化物歧化酶的发现、分类以及分布 |
| 1.1.1.1 SOD的发现与分类 |
| 1.1.1.2 SOD的分布 |
| 1.1.2 超氧化物歧化酶的结构类型 |
| 1.1.2.1 Cu/Zn SOD的结构类型 |
| 1.1.2.2 FeSOD的结构类型 |
| 1.1.2.3 MnSOD的结构类型 |
| 1.1.2.4 NiSOD的结构类型 |
| 1.1.3 SOD基因的表达特性与调控 |
| 1.1.3.1 SOD基因的表达特性 |
| 1.1.3.2 SOD基因的表达调控 |
| 1.1.4 SOD基因的表达与植物抗逆性 |
| 1.1.4.1 提高植株对盐的耐受性 |
| 1.1.4.2 提高植株对高温的耐受性 |
| 1.1.4.3 提高植株对低温的耐受性 |
| 1.1.4.4 提高植株对干旱环境的耐受性 |
| 1.2 本研究的目的与意义 |
| 第二章 黄瓜超氧化物歧化酶基因的生物信息学分析 |
| 2.1 试验方法 |
| 2.1.1 黄瓜SOD基因的基本信息鉴定 |
| 2.1.2 黄瓜SOD基因的结构分析 |
| 2.1.3 黄瓜SOD基因编码的蛋白保守基序分析 |
| 2.1.4 黄瓜SOD基因家族系统发育分析 |
| 2.1.5 CsCSD1和CsFSD2 基因的启动子顺式元件分析 |
| 2.1.6 CsCSD1和CsFSD2 蛋白的膜结构分析与二级、三级结构预测 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 黄瓜SOD基因的鉴定以及染色体定位 |
| 2.2.2 黄瓜SOD基因的内含子分析 |
| 2.2.3 黄瓜SOD的系统发育分析 |
| 2.2.4 黄瓜SOD蛋白的保守基序分析 |
| 2.2.5 CsCSD1和CsFSD2 蛋白的跨膜结构与亲疏水性分析 |
| 2.2.6 CsCSD1和CsFSD2 蛋白的二级结构与三级结构预测 |
| 2.2.7 CsCSD1和CsFSD2 基因的启动子顺式元件分析 |
| 2.3 讨论与小结 |
| 第三章 黄瓜CsCSD1和CsFSD2 基因的表达分析 |
| 3.1 试验材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料来源与处理 |
| 3.1.2 试剂和仪器 |
| 3.1.3 CsCSD1、CsFSD2 基因q RT-PCR的引物设计 |
| 3.1.4 RNA的提取和反转录 |
| 3.1.5 黄瓜SOD基因的组织表达谱分析 |
| 3.1.6 CsCSD1和CsFSD2 基因在不同胁迫条件下的胁迫反应 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 黄瓜SOD基因的组织特异性表达分析 |
| 3.2.2 黄瓜CsCSD1和CsFSD2 基因在胁迫下的表达分析 |
| 3.3 讨论与小结 |
| 第四章 黄瓜CsCSD1和CsFSD2 基因的克隆及原核表达 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 试验材料来源与品种 |
| 4.1.2 菌种与载体 |
| 4.1.3 引物设计 |
| 4.1.4 实验试剂与仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 CsCSD1和CsFSD2 的克隆 |
| 4.2.1.1 RNA提取与反转录 |
| 4.2.1.2 PCR扩增CsCSD1和CsFSD2 基因 |
| 4.2.1.3 CsCSD1和CsFSD2 基因的胶回收 |
| 4.2.1.4 CsCSD1和CsFSD2 基因与T载体的连接 |
| 4.2.1.5 连接产物的热激转化 |
| 4.2.1.6 pMD18重组质粒的鉴定 |
| 4.2.2 原核表达载体的构建 |
| 4.2.2.1 pMD18重组质粒提取 |
| 4.2.2.2 p MD18 重组质粒和原核表达载体p ET-32a双酶切 |
| 4.2.2.3 目的基因和原核表达载体载体pET-32a的连接 |
| 4.2.2.4 连接产物热激转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 |
| 4.2.2.5 pET-32a重组质粒的鉴定 |
| 4.2.3 CsCSD1和CsFSD2 蛋白的诱导表达 |
| 4.2.3.1 重组质粒p ET32a-CsCSD1和p ET32a-CsFSD2 的提取 |
| 4.2.3.2 重组质粒的热激转化 |
| 4.2.3.3 重组质粒p ET32a-CsCSD1和p ET32a-CsFSD2 的鉴定 |
| 4.2.3.4 SDS-PAGE电泳检测CsCSD1和CsFSD2 蛋白表达 |
| 4.2.4 CsCSD1和CsFSD2 蛋白原核表达的条件优化 |
| 4.2.4.1 诱导时间 |
| 4.2.4.2 诱导IPTG浓度 |
| 4.2.4.3 诱导菌液浓度 |
| 4.2.5 重组大肠杆菌抗逆分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 CsCSD1和CsFSD2 基因的克隆 |
| 4.3.1.1 黄瓜叶片RNA的提取 |
| 4.3.1.2 目的基因的PCR扩增 |
| 4.3.1.3 目的基因PCR产物的胶回收 |
| 4.3.1.4 重组质粒的转化 |
| 4.3.1.5 重组质粒的菌液PCR鉴定 |
| 4.3.1.6 重组质粒的酶切鉴定与测序 |
| 4.3.2 黄瓜SOD基因CsCSD1和CsFSD2 的原核表达 |
| 4.3.2.1 原核表达载体的构建 |
| 4.3.2.2 较优条件下CsCSD1和CsFSD2 蛋白的诱导表达 |
| 4.3.3 黄瓜SOD蛋白CsCSD1 对大肠杆菌的抗逆性影响 |
| 4.3.3.1 耐高温 |
| 4.3.3.2 耐低温 |
| 4.3.3.3 耐盐 |
| 4.3.3.4 耐旱 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 第五章 全文讨论与结论 |
| 5.1 全文讨论 |
| 5.1.1 黄瓜SOD基因家族生物信息学分析 |
| 5.1.2 黄瓜SOD基因的表达特征分析 |
| 5.1.3 CsCSD1和CsFSD2 基因的原核表达 |
| 5.1.3.1 表达系统的选择和较优条件下CsCSD1和CsFSD2 蛋白的诱导表达 |
| 5.1.3.2 CsCSD1的原核表达对大肠杆菌抗逆性的影响 |
| 5.2 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（9）盐胁迫条件下陆地棉活性氧代谢相关基因的功能研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1 活性氧 |
| 1.1 活性氧概述 |
| 1.2 活性氧代谢 |
| 2 植物活性氧与胁迫应答 |
| 2.1 生物胁迫 |
| 2.2 非生物胁迫 |
| 2.2.1 温度胁迫 |
| 2.2.2 水分胁迫 |
| 3.2.3 盐胁迫 |
| 2.2.4 其他胁迫 |
| 3 植物活性氧代谢调控 |
| 3.1 NADPH氧化酶 |
| 3.2 超氧化物歧化酶 |
| 3.3 过氧化氢酶 |
| 4 本项目研究的意义 |
| 第二章 陆地棉SOD基因家族的鉴定与表达分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 室内培养和取样 |
| 1.1.2 田间种植和取样 |
| 1.1.3 胁迫处理和取样 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.2.1 主要试剂 |
| 1.2.2 主要仪器 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 SOD基因家族鉴定 |
| 1.3.2 系统发育分析 |
| 1.3.3 基因复制分析 |
| 1.3.4 序列分析 |
| 1.3.5 转录组数据分析 |
| 1.3.6 荧光定量PCR实验 |
| 1.3.7 调控预测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 SOD基因家族鉴定 |
| 2.2 SOD基因家族系统发育分析 |
| 2.3 陆地棉SOD基因家族共线性分析 |
| 2.4 陆地棉SOD基因家族基因结构分析 |
| 2.5 陆地棉SOD蛋白序列分析 |
| 2.6 陆地棉SOD基因家族表达谱分析 |
| 2.6.1 电子表达谱分析 |
| 2.6.2 荧光定量PCR分析 |
| 2.7 陆地棉SOD基因家族转录调控分析 |
| 2.7.1 启动子分析 |
| 2.7.2 靶向GhSODs的miRNAs分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 植物SOD基因家族及其进化 |
| 3.2 陆地棉SOD基因家族的表达模式分析 |
| 3.3 陆地棉SOD基因家族的调控机制分析 |
| 3.3.1 陆地棉SOD基因家族启动子中顺式元件预测分析 |
| 3.3.2 ghr-miRNAs介导陆地棉SOD基因家族转录后水平调控 |
| 第三章 陆地棉miR414c通过调控活性氧代谢响应盐胁迫 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 植物材料 |
| 1.1.2 载体与菌株 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 荧光定量PCR实验 |
| 1.2.2 序列克隆 |
| 1.2.3 序列分析 |
| 1.2.4 表达载体构建 |
| 1.2.5 表达载体转化农杆菌 |
| 1.2.6 烟草瞬时转化 |
| 1.2.7 miRNA和靶基因靶向关系验证 |
| 1.2.8 拟南芥转化 |
| 1.2.9 转基因拟南芥筛选与表型鉴定 |
| 1.2.10 病毒诱导的基因沉默(VIGS)载体构建 |
| 1.2.11 VIGS载体转化农杆菌 |
| 1.2.12 陆地棉VIGS实验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 ghr-miR414c和GhFSD1序列扩增和分析 |
| 2.1.1 ghr-miR414c和GhFSD1基因的克隆 |
| 2.1.2 ghr-miR414c和GhFSD1序列分析 |
| 2.2 ghr-miR414c和GhFSD1表达模式分析 |
| 2.3 ghr-miR414c和GhFSD1靶向关系验证 |
| 2.4 转基因拟南芥的盐胁迫耐性分析 |
| 2.4.1 目标序列转化拟南芥与阳性植株筛选 |
| 2.4.2 转基因拟南芥的盐胁迫表型鉴定 |
| 2.5 VIGS棉花的盐胁迫耐性分析 |
| 2.5.1 VIGS棉花的获得与鉴定 |
| 2.5.2 VIGS棉花的盐胁迫表型鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 GhFSD1介导ROS代谢调控棉花对盐胁迫的响应 |
| 3.2 ghr-miR414c通过靶向GhFSD1调控ROS代谢 |
| 第四章 陆地棉Rboh基因家族的鉴定与生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 室内培养和取样 |
| 1.1.2 田间种植和取样 |
| 1.1.3 胁迫处理和取样 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 Rboh基因家族鉴定 |
| 1.2.2 系统发育分析 |
| 1.2.3 基因复制分析 |
| 1.2.4 序列分析 |
| 1.2.5 转录组数据分析 |
| 1.2.6 荧光定量PCR实验 |
| 1.2.7 调控预测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Rboh基因家族鉴定 |
| 2.2 陆地棉Rboh基因家族系统发育分析 |
| 2.3 陆地棉Rboh基因共线性分析 |
| 2.4 陆地棉Rboh基因序列分析 |
| 2.5 陆地棉Rboh基因表达模式分析 |
| 2.5.1 陆地棉Rboh基因在不同组织器官中的表达模式 |
| 2.5.2 陆地棉Rboh基因在不同胁迫诱导下的表达模式 |
| 2.6 陆地棉Rboh基因潜在调控机制分析 |
| 2.6.1 启动子分析 |
| 2.6.2 靶向Ghrbohs的miRNAs分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 植物Rboh基因家族及其进化 |
| 3.2 陆地棉Rboh基因可能通过调节活性氧代谢参与生长发育和胁迫应答 |
| 3.3 陆地棉Rboh基因家族的调控机制分析 |
| 第五章 陆地棉CAT基因家族的鉴定与生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 室内培养和取样 |
| 1.1.2 胁迫处理和取样 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 CAT基因家族鉴定 |
| 1.3.2 系统发育分析 |
| 1.3.3 基因复制分析 |
| 1.3.4 序列分析 |
| 1.3.5 转录组数据分析 |
| 1.3.6 荧光定量PCR实验 |
| 1.3.7 调控预测 |
| 1.3.8 序列克隆 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 CAT基因鉴定 |
| 2.2 CAT基因系统发育分析 |
| 2.3 陆地棉CAT基因共线性分析 |
| 2.4 陆地棉CAT基因序列分析 |
| 2.5 陆地棉CAT基因表达模式分析 |
| 2.5.1 陆地棉CAT基因在不同组织器官中的表达模式 |
| 2.5.2 陆地棉CAT基因在不同胁迫诱导下的表达模式 |
| 2.6 陆地棉CAT基因潜在调控机制分析 |
| 2.6.1 转录因子预测 |
| 2.6.2 可变剪接事件分析 |
| 2.6.3 miRNA靶位点预测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 CAT基因家族在棉属中的进化 |
| 3.2 棉花CAT基因可能通过调节活性氧代谢参与胁迫应答 |
| 3.3 陆地棉CAT基因家族的调控机制分析 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
（10）海洋无脊椎动物抗氧化酶研究进展（论文提纲范文）
| 1 超氧化物歧化酶 (SOD) |
| 1.1 超氧化物歧化酶的发现与作用机理 |
| 1.2 超氧化物歧化酶的种类与分布 |
| 1.3 超氧化物歧化酶的结构 |
| 1.4 活性测定 |
| 2 谷胱甘肽-S-转移酶 (GST) |
| 2.1 发现与作用机理 |
| 2.2 种类与分布 |
| 2.3 结构特征 |
| 3 谷胱甘肽过氧化物酶 (GPX) |
| 3.1 发现作用机理 |
| 3.2 种类与分布 |
| 3.3 结构特征 |
| 4 海洋无脊椎动物主要抗氧化酶研究进展 |
| 4.1 抗氧化酶与环境胁迫 |
| 4.1.1 常规环境因子胁迫 |
| 4.1.2 有机物胁迫 |
| 4.1.3 重金属胁迫 |
| 4.1.4 微生物胁迫 |
| 4.1.5 其他胁迫 |
| 4.2 抗氧化酶与环境监测 |
| 4.3 抗氧化酶酶学研究 |
| 5 展望 |
| 5.1 环境监测生物标记物研究 |
| 5.2 加强基因调控与蛋白功能验证研究 |
| 5.3 深海生物的抗氧化酶研究 |
四、人锰超氧化物歧化酶基因的克隆及高表达（论文参考文献）
- [1]马铃薯SOD基因家族生信分析及其在块茎愈伤活性氧产生中的功能研究[D]. 任映玥. 甘肃农业大学, 2021(09)
- [2]老芒麦种质资源耐盐性评价及EsABI5基因作用机制研究[D]. 德英. 内蒙古农业大学, 2021(01)
- [3]小桐子PP2C、CP及cystatin基因家族和相应miRNAs的鉴定及其在低温响应与适应中的作用[D]. 吴丹丹. 云南师范大学, 2021(08)
- [4]马铃薯中与胁迫相关StMAPKs基因的分离及功能研究[D]. 朱熙. 甘肃农业大学, 2021(01)
- [5]荒漠甲虫小胸鳖甲两种SOD基因增强细菌及果蝇耐寒性的研究[D]. 孜拉吉古丽·西克然木. 新疆大学, 2021
- [6]转录组和代谢组联合分析低温胁迫对天麻生长影响及其SOD和GS基因克隆与功能鉴定[D]. 周春艳. 昆明理工大学, 2021(02)
- [7]基于转录组学的克氏原螯虾对温度和盐度响应机制探究[D]. 骆磊. 上海海洋大学, 2021(01)
- [8]黄瓜SOD基因CsCSD1和CsFSD2的克隆及原核表达分析[D]. 何鹏. 江西农业大学, 2020(07)
- [9]盐胁迫条件下陆地棉活性氧代谢相关基因的功能研究[D]. 王维. 山东农业大学, 2019(01)
- [10]海洋无脊椎动物抗氧化酶研究进展[J]. 李亚男,张海滨. 海洋通报, 2018(03)