一、食管鳞癌p16和p53蛋白的表达及其意义（论文文献综述）
袁徽[1]（2020）在《食管鳞状上皮永生化和3D类器官体系的建立及其增殖分化稳态调控机制的研究》文中研究指明食管癌是消化系统恶性肿瘤之一,世界恶性肿瘤发病率中排第7位,死亡率排第6位。食管癌病理类型分为食管腺癌和食管鳞状细胞癌,其中90%为鳞状细胞癌。目前已有多项测序数据揭示了食管癌的基因组改变,为食管癌的发生发展提供了坚实的理论基础,但是由于食管癌患者确诊时大多处于晚期,食管癌从早期发展到晚期的驱动基因及其时序性很难被发现。目前已有的大鼠食管癌动物模型,可获取食管鳞癌从增生到乳头瘤再到食管癌的动态变化的病理组织及测序数据,但其周期较长（>35周）,并且肿瘤突变负荷较高,难以区分真正的驱动事件。因此,我们急需背景清楚,基因组稳定,易于操作,并且能反映体内真实情况的体外模型来进行食管癌的相关研究。三维类器官是指干细胞或器官特异性祖细胞在特殊的培养条件下,体外增殖分化为与体内器官功能相似的三维立体结构,是一种很好的可替代体内器官水平相关研究的模型。因此,本研究将以大鼠为基础,建立永生化正常大鼠食管上皮细胞系和其3D类器官培养体系,并探究正常食管上皮在体外增殖和分化稳态的调控机制,为食管癌病因学提供基础。本研究成功建立了D3,F3和A1等永生化的正常大鼠食管上皮细胞系,并且D3细胞系的上皮性质与原代细胞更为相似。用D3细胞系成功建立了三维类器官培养系统,D3类器官与正常食管类器官及正常食管组织结构相似,基底层和基底上层标记物CK13,CK14,SOX2和P63等表达也十分相似。2D和3D类器官培养所需的ROCK抑制剂Y27632主要影响细胞增殖,细胞分化等生物学过程和TGF-β信号通路、WNT通路和粘着斑等多个通路,对BMP信号通路无显着影响。去掉ROCK抑制剂之后细胞增殖能力下降,细胞形态变化,3D类器官形成率下降,分化相关基因表达上调,TGF-β信号通路和Wnt信号通路激活。无Y27632的情况下,衰老相关基因p16蛋白表达上调,分化相关基因p63表达下调,ELF3表达上调。敲降P63的结果显示,D3细胞2D增殖能力下降,细胞形态变化,三维类器官的形成率下降,类器官不分化或者分化较差。缺乏P63表达的类器官基底层和基底上层的标记物表达紊乱,SOX表达降低,与基质胶接触的最外层细胞膜E-cad表达消失,与之对应的,分化相关基因NOTCH1和NOTCH3表达下调,ELF3表达上调。敲降ELF3对P63的表达及核定位无明显影响,对增殖也无明显影响。但是敲降ELF3后分化通路的相关基因NOTCH1,NOTCH3和RBPJ表达上调,并且chip-seq数据显示他们是ELF3直接结合的靶基因。本研究成功建立了永生化大鼠食管鳞状上皮和三维类器官培养体系,可作为食管组织的体外替代物,为食管分化调控,食管干细胞标志物以及食管癌病因学等食管相关研究提供基础,并首次发现TP63和ELF3共同调控食管鳞状上皮的增殖和分化稳态。
张立敏[2]（2020）在《肺耐药蛋白及P16蛋白在食管鳞状细胞癌中的表达及临床病理意义》文中进行了进一步梳理目的:研究肺耐药蛋白（lung resistance protein,LRP）和P16蛋白在食管鳞状细胞癌中的表达及其与临床病理特征间的关系及意义。方法:应用免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）SP法检测44例食管鳞状细胞癌组织和20例正常食管粘膜组织样本中LRP蛋白和P16蛋白的表达情况。并通过SPSS23.0统计软件进行数据统计分析,以α=0.05为检验水准,P<0.05时具有统计学意义。结果:1.LRP蛋白在食管鳞状细胞癌中的阳性表达率为54.54%（24/44）高于正常食管粘膜组织的阳性表达率35%（7/20）,但二者相比无显着差异性（P>0.05）。LRP蛋白表达与患者性别、年龄、肿瘤大小、大体形态、分化程度、浸润深度、临床分期、淋巴结转移无显着相关性（P>0.05）;2.P16蛋白在食管鳞状细胞癌中的阳性表达率为56.82%（25/44）低于正常食管粘膜组织的阳性表达率65%（13/20）,但二者相比无显着差异性（P>0.05）。P16蛋白表达与患者性别、年龄、肿瘤大小、大体形态、分化程度、浸润深度、临床分期、淋巴结转移无显着相关性（P>0.05）;3.对44例食管鳞状细胞癌中LRP蛋白和P16蛋白阳性表达情况进行Spearman相关分析,结果显示LRP和P16的表达无显着相关性（P>0.05）。结论:1.LRP蛋白在食管鳞状细胞癌中的阳性表达高于正常食管粘膜组织的阳性表达,提示LRP蛋白的高表达可能与食管鳞状细胞癌的发生有关;2.P16蛋白在食管鳞状细胞癌中的阳性表达低于正常食管粘膜组织的阳性表达,提示P16蛋白的低表达可能与食管鳞状细胞癌的发生有关;3.在食管鳞状细胞癌中LRP和P16蛋白的阳性表达无显着相关性。
张大凯[3]（2019）在《HPV16-E6联合p53基因影响食管鳞癌放疗敏感性的研究》文中指出食管鳞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）是我国最常见且最具侵袭性的恶性肿瘤之一,预后较差。由于其发病隐匿,不易发现,就诊时中晚期患者占比较高,5年生存率仅有15-30%,采取同样治疗方案但是患者预后却差别极大,提示我们ESCC肿瘤异质性对于预后的影响极为显着。放化疗或术后放化疗是中晚期ESCC的主要治疗方式,但化疗、放疗敏感性的个体差异较大,因此现阶段ESCC放化疗敏感性、预后及正常组织损伤预测等研究方面,普遍存在候选因素单一、预测效能低等弊端,现阶段没有获得公认的、预测效能较高的方法预测ESCC的放化疗敏感性,难以实际指导临床个体化治疗。因此,寻找更多标志物,建立预测效能更高的ESCC放化疗敏感性预测标准,是指导临床个体化治疗亟待解决的难点。目前认为食管癌的发生发展是多种环境因素与宿主基因组相互作用,并经长时间与多阶段演化的结果。研究显示高危亚型人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）感染使野生型P53蛋白泛素化、分解、失活,可能为ESCC的重要病因之一。近年来一部分针对HPV对口咽癌、食管癌及头颈部鳞癌放化疗敏感性的研究,却给出了许多自相矛盾的结论。既往研究表明HPV阳性ESCC放疗敏感性较高,预后较好,然而也有研究显示两者并无相关性。本研究前期工作发现HPV感染可能与p53基因共同影响ESCC放疗敏感性。本研究从HPV对P53等细胞周期相关蛋白作用的角度入手,探索HPV如何与p53基因共同影响ESCC放疗敏感性。第一部分:探索HPV16-E6对突变型ESCC细胞放疗敏感性的影响。研究目的:当前众多研究关于HPV对ESCC放疗敏感性的作用结论不一致,本研究的前期工作发现p53突变可能影响HPV对ESCC放疗敏感性的作用,该部分将HPV16-E6癌基因导入TE1细胞,探索HPV16-E6对携带p53 V272M突变ESCC放疗敏感性的影响。研究方法:1.利用慢病毒载体分别将HPV16-E6和空载质粒分别导入TE1细胞;2.Western Blot实验验证转染效果;3.克隆形成实验检测HPV16-E6对TE1细胞放疗敏感性的影响;4.放疗细胞毒性检测细胞增殖抑制率。研究结果:1.HPV16-E6成功导入细胞并稳定表达目标蛋白;2.导入HPV16-E6后突变型P53蛋白含量稳定;3.导入HPV16-E6后TE1细胞放疗敏感性显着升高（p<0.05）;4.导入HPV16-E6后TE1细胞增殖抑制率显着升高（p<0.001）。研究结论:HPV16-E6可以提高TE1细胞放疗敏感性;HPV16-E6可能不能降解突变型P53蛋白。第二部分:探索HPV16-E6对不同p53基因状态的ESCC细胞放疗敏感性的作用。研究目的:探索HPV16-E6对不同p53基因状态的ESCC放疗敏感性的作用,探索HPV16-E6对野生/突变型P53蛋白的泛素化作用,本部分利用p53 R175H突变及HPV16-E6两种慢病毒载体分别转染p53野生型ECA109细胞,探索这两种干预因素对细胞放疗敏感性的作用。研究方法:1.利用p53 R175H突变及HPV16-E6两种慢病毒载体分别或共同转染ECA109细胞,建立ECA109-Mp53、ECA109-HPV、ECA109-Mp53-HPV三株细胞,空载体质粒转染ECA109建立ECA109-NC作为空白对照组;2.免疫荧光及Western Blot验证转染效果;3.免疫共沉淀验证HPV16-E6与R175H、V272M突变型P53蛋白结合情况;4.克隆形成实验检测细胞放疗敏感性变化;5.放疗细胞毒性检测细胞增殖抑制率。研究结果:1.ECA109-NC、ECA109-Mp53、ECA109-HPV、ECA109-Mp53-HPV四株细胞均转染成功;2.免疫荧光及Western Blot验证显示目的蛋白成功表达;3.免疫共沉淀结果显示HPV16-E6能结合野生型P53蛋白,不能结合R175H、V272M突变型P53蛋白;4.克隆形成实验显示HPV16-E6可降低ECA109细胞放疗敏感性,可提高ECA109-Mp53细胞放疗敏感性（p<0.05）;5.放疗细胞毒性检测显示HPV16-E6可降低ECA109细胞增殖抑制率（p=0.001）,可提高ECA109-Mp53细胞增殖抑制率（p<0.001）。研究结论:1.HPV16-E6能结合野生型P53蛋白,不能结合R175H、V272M突变型P53蛋白;2.HPV16-E6可增加p53突变ESCC放疗敏感性,降低p53野生型ESCC放疗敏感性。第三部分:裸鼠成瘤实验验证HPV16-E6对不同p53基因状态的ESCC放疗敏感性的影响。研究目的:为了明确HPV16-E6对不同p53基因状态的ESCC放疗敏感性的影响,我们建立六株细胞的裸鼠皮下移植瘤模型,对裸鼠移植瘤型0/6Gy放疗,检测肿瘤生长抑制率,免疫组化检测肿瘤增殖系数Ki-67,分析HPV16-E6对不同p53基因状态ESCC放疗敏感性的影响。研究结果:1.HPV16-E6显着提高TE1细胞、ECA109-Mp53细胞放疗体积生长抑制率;降低ECA109细胞放疗体积抑制率。2.HPV16-E6显着提高TE1细胞、ECA109-Mp53细胞增殖系数Ki-67（p<0.05）;降低ECA109细胞增殖系数Ki-67（p<0.05）。研究结论:HPV16-E6提高TE1、ECA109-Mp53细胞增殖系数Ki-67及放疗敏感性,降低ECA109增殖系数Ki-67及放疗敏感性。
张红飞[4]（2017）在《候选食管癌相关抗原的筛选鉴定及其对食管鳞癌的诊断价值》文中研究说明目的使用血清蛋白质组学分析技术（serological proteome analysis,SERPA）筛选、检索基因组学与食管鳞癌诊断相关文献、系统综述抗肿瘤相关抗原（tumor associated antigens,TAAs）自身抗体与食管癌诊断相关研究,回顾总结本课题组前期研究结果,鉴定可能的特异性候选食管鳞状细胞癌（食管鳞癌,esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）相关抗原,设计并优化出可以用于ESCC诊断的抗-TAAs自身抗体组合,构建相应的ESCC患病预测模型,对所优化组合用于ESCC早期诊断的可能性和可行性进行全面的评价,并使用一组独立的人群样本资料对所构建的患病预测模型的诊断价值进行验证,为建立一种新的食管鳞癌早期体外非侵入性诊断技术提供依据和资料。方法1.蛋白质组学技术筛选和鉴定可能的候选ESCC相关抗原。1)Western blot方法初步筛选候选ESCC相关抗原及对应抗体阳性的患者血清:使用102例ESCC患者血清和58例正常对照血清与食管鳞癌细胞系TE-2、TE-8、EC1和EC9706全蛋白进行Western blot杂交,筛选ESCC患者血清中对应自身抗体阳性率≥10%,并且对应自身抗体在ESCC患者血清中阳性率大于正常对照血清中阳性率（p<0.05）的反应条带所对应的蛋白作为可能的候选ESCC相关抗原,同时挑选出针对候选ESCC相关抗原特异性阳性反应的ESCC患者血清。2)使用免疫荧光方法进一步验证Western blot筛选出来的针对候选ESCC相关抗原呈阳性反应的患者血清,并观察候选肿瘤相关抗原的细胞学定位。3)使用SERPA技术筛选和鉴定候选食管鳞癌相关抗原:裂解TE-8细胞株全蛋白,在相同条件下同时进行三根IPG预制胶条的等电聚焦电泳,SDS-PAGE凝胶电泳后,其中一块凝胶使用考马斯亮蓝R250染色,另外两块凝胶电转到硝酸纤维素膜（nitrocellulose filter membrane,NC膜）后分别与上述挑选出的阳性ESCC患者血清和正常对照血清进行Western blot杂交,杂交后的结果与考马斯亮蓝R250染色凝胶进行比对,将血清学反应阳性的蛋白点进行质谱分析和鉴定,确定所筛选出候选ESCC相关抗原的种类和详细信息。2.候选TAAs的原核表达和纯化:在基于SERPA方法筛选候选TAAs的基础上,检索基因组学与食管鳞癌相关文献,系统综述抗-TAAs自身抗体与食管癌诊断相关文献报道,结合本课题组前期相关研究结果,对可能的食管鳞癌候选TAAs进行原核表达和纯化。1)候选TAAs原核表达载体的构建:提取EC9706细胞株总RNA,逆转录为cDNA,使用特异性PCR引物扩增出目的基因,连接入克隆载体后进行酶切鉴定和测序分析,鉴定正确的目的基因连接入原核表达载体pET-28a中。2)候选TAAs的原核表达和纯化:将重组表达质粒转化入宿主表达菌中,优化IPTG诱导蛋白表达浓度,对表达蛋白进行可溶性分析。可溶性表达蛋白使用不同浓度的咪唑进行纯化,不可溶性表达蛋白使用不同pH值的8M尿素进行纯化,并对纯化后的蛋白进行浓度测定。3)纯化蛋白的免疫学活性鉴定:使用特异性抗体与所纯化蛋白进行Western blot杂交,鉴定所纯化蛋白是否具有免疫学活性。3.候选TAAs自身抗体在ESCC诊断中的价值评价以及ESCC患病预测模型的建立与验证。1)单个抗-TAA自身抗体指标对食管鳞癌的诊断价值评价:采取间接酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）方法检测每种抗-TAA自身抗体在不同研究对象血清中的相对表达量,使用秩和检验或独立样本t检验比较每种抗-TAA自身抗体在ESCC患者组和正常对照组血清中的表达量差异;以受试组（包括324例ESCC患者和324例正常对照）中每个研究对象血清中每种抗-TAA自身抗体的表达含量为自变量,ESCC患病事件作为因变量,采取logistic回归的方法得出每种抗-TAA自身抗体的表达与ESCC患病事件的回归方程并计算出各个研究对象患食管鳞癌的预测概率,以预测概率=0.5作为截断值,判定每种自身抗体用于诊断ESCC的灵敏度和特异度,受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC曲线）分析评价每种自身抗体对ESCC的诊断价值。将ESCC患者分为早期ESCC组（TNM分期为0,I和II期）和晚期ESCC组（TNM分期为III和IV期）,统计并比较各自身抗体指标对不同分期ESCC患者诊断的阳性率,以判定是否具有特异性的早期ESCC相关抗原指标。2)建立ESCC患病预测模型:以受试组人群为研究对象,根据每个研究对象血清中检测自身抗体的含量与ESCC患病事件,采用后退（条件）逐步logistic回归法筛选自变量并构建相应的预测模型,计算出各个研究对象患食管鳞癌的预测概率,以预测概率=0.5作为截断值,判定患病预测模型用于诊断ESCC的灵敏度和特异度,并使用ROC曲线分析评价该模型对受试组中ESCC患者的诊断价值。逐一剔除纳入自变量后对预测模型诊断价值（包括灵敏度、特异度、AUC以及判定结果符合率等）贡献最小的抗-TAA自身抗体指标,构建新的预测模型,并判定所构建预测模型对ESCC的诊断价值,以优化抗-TAAs自身抗体组合。3)预测模型的验证:以验证组人群（包括186例ESCC患者和186例正常对照）为研究对象,将各个研究对象对应TAAs自身抗体含量代入上述构建预测模型中,根据预测概率确定食管鳞癌患病事件,使用ROC曲线分析评价构建模型在验证组中对ESCC的诊断价值。4)所构建预测模型对不同分期ESCC患者的诊断:分别评价并比较上述构建预测模型对受试组和验证组早期ESCC患者和晚期ESCC患者的诊断价值,以分析预测模型是否具有早期ESCC诊断特异性。使用预测模型对研究对象中所有早期ESCC患者与正常对照进行判定,以预测模型从正常人群中区分出早期ESCC患者的能力,从而进一步评价预测模型对于早期ESCC的诊断价值。结果1.使用蛋白质组学技术筛选和鉴定出四种候选的食管鳞癌相关抗原Western blot方法筛选发现分子量在40kD、50kD以及65kD附近的三条蛋白条带的自身抗体在ESCC患者血清中阳性率明显高于正常对照血清;质谱鉴定结果显示SERPA方法筛选出的候选TAAs分别为hnRNP1A2B1 isform A2（异质核核糖核蛋白A2/B1的A2亚型,36kD）、CALR（钙网蛋白,48kD）、ENO1（烯醇酶-1,47kD）和HSPD1（热休克蛋白60,61kD）。2.成功构建了hnRNPA2B1、CALR、HSPD1和NICD（NOTCH1胞内段）四种重组蛋白的原核表达载体,并成功表达和纯化出这四种候选TAAs重组蛋白,且所纯化出的蛋白均具有免疫学活性。3.对研究对象中15种TAAs（hnRNPA2B1、CALR、ENO1、HSPD1、p53、NICD、c-myc、p62/IMP2、MDM2、p90/CIP2A、p16/INK4A、HCCR/LETMD1、IMP1、Koc/IMP3和Cyclin E）自身抗体水平进行分析,成功建立起一种基于10种TAAs（p53、p62、HCCR、c-myc、MDM2、hnRNPA2B1、NICD、ENO1、Koc和IMP1）的食管鳞癌患病logistic回归预测模型,该预测模型应用于受试组研究对象ESCC诊断的灵敏度为71.6%,特异度为85.2%,AUC为0.871（95%CI:0.843-0.896）,判定结果符合率为78.4%。对抗-TAAs自身抗体组合进行进一步优化,基于9种抗-TAAs抗体组合（p53、p62、HCCR、c-myc、MDM2、hnRNPA2B1、NICD、ENO1和Koc）的预测模型用于ESCC诊断所对应的AUC最大（AUC=0.872,95%CI:0.844-0.897）,而基于7种自身抗体（p53、p62、HCCR、c-myc、MDM2、hnRNPA2B1和NICD）的预测模型对研究对象是否患病的判定结果符合率最高（判定结果符合率为79.2%）。该7种自身抗体预测模型对于受试组食管鳞癌诊断的AUC为0.864,灵敏度为71.9%,特异度为86.4%,对于验证组食管鳞癌诊断的AUC为0.862,灵敏度为65.6%,特异度为90.3%。与其它组合相比,该7种自身抗体组合具有较高的诊断效能和更高的性价比,并且该模型能够较好的从正常人群中区分出早期ESCC患者,对早期ESCC患者诊断的AUC为0.864,灵敏度为71.9%,特异度为87.8%,总判定结果符合率为83.7%。结论1.hnRNP1A2B1、CALR、ENO1和HSPD1可能是候选的食管鳞癌相关抗原。2.基于7种抗-TAAs自身抗体组合（p53、p62、HCCR、c-myc、MDM2、hnRNPA2B1和NICD）的预测模型能够对食管鳞癌,尤其是早期食管鳞癌提供一定的诊断价值。
李晶[5]（2016）在《食管癌中p16INK4A、p53蛋白的表达与HPV感染的相关性研究及其临床意义》文中研究指明目的:检测哈萨克族食管鳞状细胞癌组织中p16INK4A和p53蛋白的表达及其临床意义,并探讨二者的表达与食管鳞癌中HPV感染状态的相关性。方法:收集石河子大学医学院第一附属医院、新疆自治区人民医院及新疆伊犁友谊医院1984年至2013年期间经手术切除的哈族食管鳞癌组织标本163例及其临床信息（包括性别、年龄、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期等）,所有病例术前均未行放化疗。运用免疫组织化学方法检测163例哈族食管鳞癌中p16INK4A和p53的表达,聚合酶链式反应检测123例哈族食管鳞癌组织中HPV DNA。采用χ2检验或Fisher’s确切概率法分析临床信息与p16INK4A、p53的表达、HPV感染间的关系;采用Spearman’s等级相关系数分析HPV感染与p16INK4A和p53表达的相关性。所有检验均以P<0.05（双侧）为显着检验性标准。结果:（1）163例哈族食管鳞癌中p16INK4A的阳性表达率为19.0%,且其阳性表达明显与淋巴结转移密切相关（P=0.038）,但与HPV感染不存在相关性（相关系数=-0.062,P=0.499）。p16 INK4A的阳性表达并不增加HPV感染阳性肿瘤的比值比（OR=0.727,95%CI=0.288–1.836）,p16INK4A作为HPV标记物的敏感性为0.164,特异性为0.788,阳性预测值为0.391;（2）哈族食管鳞癌中p53的阳性表达率为88.3%,且与HPV感染明显呈负相关（相关系数=-0.186,P=0.039）。此外,p53的阳性表达能够降低HPV感染阳性肿瘤的比值比（OR=0.292,95%CI=0.086–0.990）,p53作为HPV标记物的敏感性为0.179,特异性为0.940,阳性预测值为0.714;（3）哈族食管癌中HPV阳性率为45.5%（56/123）,但未发现其与临床病理参数或p16INK4A/p53的共表达之间的相关性。结论:（1）哈族食管癌中p16INK4A的阳性表达与淋巴结转移相关;（2）p53的阴性表达有可能成为提示食管癌中HPV感染状态的一个标记物,但需要进一步研究证实。
陈艳[6]（2012）在《新疆哈萨克族食管鳞癌早期高相关基因的筛查分析》文中研究表明目的:尽管新疆哈萨克族居住环境及生活方式发生了变迁,但是哈萨克族食管癌的发病率和死亡率仍维持在较高水平。这是由于食管癌难以早期发现且预后较差,其5年生存率低于10%。目前,内镜下活检是食管癌早期发现及确诊的主要手段。活检组织主要是依靠病理作为定性诊断,但由于病理学诊断方法本身的局限性,对于一些癌前病变缺乏准确诊断。因此,识别各种病变的转化规律是关键。现有研究表明,癌基因和抑癌基因的表达异常,可能是导致细胞异常增生并进一步发生癌变的关键因素。所以,通过分析食管癌前病变基因的变化,筛选出特异的早期高相关基因,用于进行早期基因诊断,才是提高内镜诊断特异性和弥补病理形态学诊断不足的有效方法。而众多研究表明,食管癌癌旁组织的改变代表了早期食管癌的变化。因此,本研究以新疆哈萨克族食管鳞癌作为对象,采用RT-PCR、Western blot、免疫组织化学和相互作用的拓扑学方法,通过分析癌旁组织和远端无癌组织中癌基因和抑癌基因的表达改变,试图发现并确立食管鳞癌发生发展的早期高相关基因,并将哈萨克族食管鳞癌早期高相关基因与国际上其他民族、地区食管癌早期相关基因进行拓扑学分析,比较二者的差异。这将为实施新疆哈萨克族食管鳞癌早期基因诊断提供实验依据和理论基础,建立的早期高相关基因将极大的提高内镜下活检诊断的特异度。同时也为食管鳞癌多基因发病机理研究奠定基础。方法:（1）应用半定量RT-PCR,分别在48例哈萨克族食管鳞癌组织和远端无癌组织,对42个候选基因进行mRNA水平的检测,依据mRNA表达比率的变化,筛选出高相关基因。高相关基因进一步在10例食管鳞癌癌旁组织和远端无癌组织中运用半定量RT-PCR进行mRNA检测,依据结果,初步筛选出早期高相关基因,并应用Western blot检测部分早期高相关基因在10例鳞癌癌旁组织和远端无癌组织的蛋白表达。（2）扩大样本,在新的一组16例哈萨克族食管鳞癌癌旁组织和远端无癌组织中运用半定量RT-PCR对筛选出的早期高相关基因进行检测。同时,以正常食管粘膜组织作为对照,将40例食管鳞癌癌旁组织样本,600张切片分成26组,每组18例,利用免疫组织化学方法对早期高相关基因蛋白进行检测。（3）对鉴定出的新疆哈萨克族食管鳞癌早期高相关基因,利用STRING9.0在线数据库和Pajek软件进行拓扑学分析,并与目前报道的其他地区和民族的早期食管鳞癌异常表达的蛋白质的相互作用,进行对比分析。结果:（1）通过比对42个候选基因在48例食管鳞癌组织和远端无癌组织中mRNA表达比率的差异,筛选出36个新疆哈萨克族食管癌高相关基因。（2）应用半定量RT-PCR、Western blot对36个高相关基因在10例食管鳞癌癌旁组织和远端无癌组织中进行了分析,初步筛选了 26个新疆哈萨克族食管鳞癌早期高相关基因。（3）16例哈萨克族食管鳞癌癌旁组织和远端无癌组织中半定量RT-PCR,以及18例食管鳞癌癌旁组织病理切片免疫组织化学的结果进一步验证了 26个早期高相关基因的表达改变。（4）对26个基因在早期个体标本中的表达分布进行分析,大约40%的个体都呈现的有 survivin、ETV5、MMP-7、TIMP-1、MMP-2、c-myc、c-fos、MTA1、CDK4、cyclinD1、MCM4、SKP2的基因表达组合。（5）新疆哈萨克族食管鳞癌早期高相关基因26个蛋白和目前报道的在食管鳞癌早期异常表达20个蛋白质,两组数据构建的拓扑图截然不同,各组骨架结点图也不同。结论:（1）c-fos、Ki67、MCM4、ETV5、SKP2、TIMP-1、MMP-2、CDK4、MEMD、MTA1、MMP-7、c-myc、c-jun、Survivin、CyclinD1、BAG1、SP-17、c-erbB2、EphB4、CK-1、MGMT、periplakin、Snail、p33、Bax、E-cadherin 共 26 个基因为新疆哈萨克族食管鳞癌的早期高相关基因。（2）联合的多基因检测,可以有效提高特异性,不同基因的26种表达组合可作为早期诊断的实验依据。（3）新疆哈萨克族食管鳞癌早期高相关基因相互作用拓扑图具有民族特异性,其网络中心结点蛋白,对于食管鳞癌分子机制的研究具有一定的提示作用。
刘玲[7]（2012）在《新疆哈萨克族食管癌早期相关基因甲基化分析及功能研究》文中进行了进一步梳理目的： DNA甲基化是肿瘤发生的早期分子事件，CpG岛局部甲基化异常早于细胞的恶性增生，因此基因启动子区高甲基化或低甲基化是肿瘤发生早期的一个高度灵敏的肿瘤生物标志物，可通过检测肿瘤相关基因的甲基化状态，为肿瘤的早期诊断、疗效观察及预后判断提供极为重要的信息。新疆哈萨克族食管癌是我区的特高发疾病，基于目前尚无系统的，在肿瘤发生前即可操作的早期预警体系，本课题拟从研究消化道肿瘤早期相关的原癌基因survivin，cdc42与抑癌基因p16，FHIT在哈萨克族食管癌组织中的mRNA差异表达入手，探讨其启动子区CpG岛甲基化状态与基因表达的关系，在此基础上进一步研究基因启动子区甲基化状态的改变对基因表达的调控及对细胞生物学功能的影响，为新疆哈萨克族食管癌早期预警指标体系的建立，早期诊断，治疗和预后提供理论依据。方法：1)哈萨克族食管癌组织中survivin、cdc42、p16和FHIT基因mRNA水平的表达检测：采集新疆哈萨克族食管癌组织及远端无癌组织标本48对，Trizol法提取总RNA，应用半定量RT-PCR技术检测4个消化道肿瘤早期相关基因在食管癌组织及远端无癌组织中的表达；2)哈萨克族食管癌中survivin、cdc42、p16和FHIT基因启动子区CpG岛的甲基化检测：应用Methprimer软件查找survivin、cdc42、p16和FHIT基因启动子区第一个CpG岛，并设计甲基化引物及非甲基化引物，用亚硫酸氢钠修饰基因组DNA之后运用甲基化特异性PCR技术（MSP）检测survivin、cdc42甲基化状态；利用高分辨率熔解曲线技术（HRM）检测p16和FHIT基因启动子区CpG岛甲基化程度，进而探究甲基化状态或程度差异与基因表达的关系；3)survivin及cdc42启动子区CpG岛重组载体的构建及甲基化状态对报告基因CAT活性的影响：重组体的构建：PCR扩增包含survivin、cdc42基因启动子区第一个CpG岛的DNA片段，及任意一段不含CpG岛的random序列，酶切后分组，一组体外甲基化酶修饰，另一组不修饰，分别与酶切的pCAT3-Enhancer载体相连，构建CpG island-pCAT3-Enhancer重组载体，将未甲基化修饰的重组体及pCAT3-Enhancer空载体转化至甲基化酶缺陷的大肠杆菌ER1793（Mcr-、Mrr-）中，将甲基化修饰的重组载体及pCAT3-Enhancer空载体转化至可持续甲基化状态的大肠杆菌JM109中。挑选阳性克隆，测序并检测甲基化程度；重组载体转染至食管癌细胞株Eca109中：将8种载体转染至食管癌细胞株Eca109中，37℃孵育48小时；报告基因氯霉素乙酰基转移酶（CAT）活性的检测：收获细胞，提取CAT基因表达产物，加C14标记的氯霉素后，用薄层层析法测定CAT活性，以此分析survivin，cdc42启动子区CpG岛甲基化对下游CAT活性调控能力的影响，确定基因启动子区甲基化差异对基因表达的影响。结果：1)在48对食管癌组织标本中，癌组织中survivin，cdc42，p16，FHIT阳性表达率分别为87.50%，97.92%，75.00，83.33%，远端无癌组织中阳性表达率分别为58.33%，100.00%，77.08%，85.42%。癌组织与远端无癌组织比较，survivin阳性表达率明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。cdc42，p16，FHIT阳性表达率癌组织与远端无癌组织之间差异无统计学意义（P＞0.05）。survivin mRNA表达水平癌组织明显高于远端无癌组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。cdc42，p16，FHIT mRNA表达水平癌组织与远端无癌组织差异无统计学意义（P＞0.05）；2)在48例食管癌癌组织中，survivin mRNA的表达与淋巴结转移、临床分期、肿瘤侵犯深度具有相关性（r=0.379、0.488、0.393；P=0.017、0.002、0.019），与分化程度无相关性（P＞0.05）。cdc42mRNA表达与临床分期，肿瘤分化程度具有相关性（r=0.452，r=0.325；P=0.003P=0.034），与淋巴结转移及侵润程度之间均无相关性（P＞0.05）。p16mRNA表达与临床分期、分化程度、淋巴结转移及侵润程度之间均无相关性（P＞0.05）。FHITmRNA表达与肿瘤临床分期具有相关性（r=0.338，P=0.035），而与分化程度、淋巴结转移及侵润程度之间均无相关性（P＞0.05）。3)在20对食管癌标本中，癌组织中70%的survivin基因启动子区CpG岛为杂合型甲基化，远端无癌组织中75%的survivin基因启动子区CpG岛为杂合型甲基化，组织间杂合型甲基化状态无明显差异（P＞0.05）。癌组织中有4例甲基化，其对应的mRNA表达水平均大于远端无癌组织；远端无癌组织中有4例甲基化，其对应的mRNA均未表达；4)在20对食管癌标本中，癌组织中有90%c的dc42启动子区CpG岛呈现出甲基化状态，远端无癌组织中有80%呈现为甲基化状态，组织间甲基化状态无明显差异（P＞0.05）。且cdc42启动子区CpG岛甲基化状态与mRNA水平的表达无相关性；5)在20对食管癌标本中，癌组织及远端无癌组织中p16启动子区CpG岛甲基化例数均为20例，甲基化比例100%。p16启动子区CpG岛甲基化水平在癌组织及远端无癌组织无明显差异（P＞0.05）。p16启动子区CpG岛甲基化水平与食管癌组织TNM分期具相关性（r=0.511，P=0.030），与组织分化，侵润程度，淋巴结转移均无相关性（P＞0.05）。与其mRNA高阳性表达相比，甲基化与mRNA水平的表达无相关性；6)在20对标本中，FHIT启动子区CpG岛呈现低甲基化比例及水平。癌组织及远端无癌组织甲基化比例分别为35.00%和30%。甲基化水平均小于10%，且在癌组织及远端无癌组织无明显差异（P＞0.05），甲基化水平与食管癌组织TNM分期，组织分化，侵润程度，淋巴结转移均无相关性（P＞0.05）。与其mRNA高表达比较，提示低甲基化水平可能未影响基因的表达；7)甲基化及非甲基化的pCAT3-Enhancer载体，转染至食管癌细胞株中，甲基化的载体下游报告基因CAT酶的活性显着低于非甲基化的载体；8)甲基化及非甲基化的Random-pCAT3-Enhancer重组载体，转染至食管癌细胞株中，CAT酶的活性均接近阴性水平；9)甲基化及非甲基化的survivin启动子区CpG岛-pCAT3-Enhancer重组载体，转染至食管癌细胞株中，CAT酶的活性均接近阴性水平；10)甲基化及非甲基化的cdc42启动子区CpG岛-pCAT3-Enhancer重组载体，转染至食管癌细胞株中，甲基化的重组载体CAT酶的活性显着低于非甲基化的重组载体CAT酶的活性。结论：1)哈萨克族食管癌癌组织中survivin mRNA水平表达的增高在哈萨克族食管癌的发生、发展过程中起到了一定的作用。4例远端无癌组织中survivin启动子区CpG岛甲基化对应了mRNA的沉默表达，提示在正常组织中启动子区CpG岛甲基化具备调控基因表达的能力。在食管癌细胞株中，survivin启动子区CpG岛的甲基化及非甲基化均导致了CAT的失活。提示在癌组织或癌细胞中，启动子区CpG岛的甲基化可能与基因表达无直接关系，在癌变过程中可能有更多的机制调控了该基因的表达。2)哈萨克族食管癌中cdc42基因mRNA在癌组织和远端无癌组织中阳性表达率及表达水平无差异，提示该基因可能不是参与食管癌发生发展的主要机制。其启动子区CpG岛甲基化状态的阳性率在癌组织和远端无癌组织中也无差异，且甲基化状态与该基因mRNA水平的表达无关。在食管癌细胞株中，cdc42启动子区CpG岛的甲基化降低了下游报告基因CAT酶的活性，而非甲基化使酶保持较高活性。提示cdc42启动子区CpG岛甲基化本身具有调控基因表达的能力，而在哈萨克族食管癌中其启动子区CpG岛甲基化与基因表达无直接关系，说明在癌变过程中可能存在更多的调控机制参与了该基因的表达；3)哈萨克族食管癌中p16mRNA在癌组织和远端无癌组织中均为高表达，p16启动子区CpG岛甲基化比例高达100%，提示p16可能未参与哈萨克族食管癌的发生发展，且甲基化可能不是调控该基因表达的主要分子机制。4)哈萨克族食管癌中，FHIT mRNA在癌组织及远端无癌组织中表达无差异，其启动子区CpG岛甲基化比例及程度均较低，提示FHIT可能未参与哈萨克族食管癌的发生发展，同时低甲基化水平可能未影响FHIT基因的表达。
李朝阳,徐致祥,谭家驹[8]（2012）在《p16基因甲基化与食管癌相关研究进展》文中研究表明2005年国际癌症研究署（IARC）全球癌症统计报告显示,2002年全世界食管癌发病人数为462000人,是世界上最常见的八大恶性肿瘤之一;2002年全世界食管癌死亡人数为386000人,是全球六大致死性肿瘤之一[1]。
阚方功[9]（2011）在《Bmi-1与p14ARF蛋白在食管鳞癌中的表达及其临床意义》文中研究表明目的：通过检测Bmi-1及p14ARF蛋白在食管鳞癌组织与正常食管黏膜的表达状况，分析其与食管鳞癌各临床病理因素间的关系，探讨Bmi-1及p14ARF在食管鳞癌发生发展，浸润转移中的作用及其临床意义。方法：1．应用免疫组织化学Elivision法，以27例食管正常黏膜组织作对照，检测49例食管鳞状细胞癌组织标本中Bmi-1蛋白和p14ARF蛋白的表达状况，分析其与食管鳞癌患者年龄、性别、病灶长度、肿瘤位置、病理分级、临床分期、淋巴结转移、浸润深度等临床病理因素间的关系以及两者间的相关性。2．以鳞癌组织中Bmi-1蛋白表达阴性且p14ARF蛋白表达阳性为有利表达，Bmi-1蛋白表达阳性且p14ARF蛋白表达阴性为不利表达进行分组，综合分析Bmi-1蛋白、p14ARF蛋白在食管鳞癌中的表达与病变各临床病理因素间的关系。3．运用SPSS13.0for windows软件包处理数据，根据数据性质应用χ2检验，Mann-Whitney Test检验，Kruskal-Wallis Test检验，相关性应用Spearman相关性分析，显着性水准α=0.05。结果：1．Bmi-1蛋白在49例食管鳞癌中阳性表达39例，阳性表达率79.59%；在27例正常黏膜中阳性表达3例，阳性表达率11.11%，两者比较有极显着性差异（P<0.01）。p14ARF蛋白在49例食管鳞癌中的阳性表达14例，阳性表达率28.57%；在27例正常黏膜组织中阳性表达20例，阳性表达率74.07%，两者比较有极显着性差异（P<0.01）。2．Bmi-1蛋白的阳性表达与患者的年龄（P=0.447），性别（P=0.889），病灶长度（P=0.52），肿瘤位置（P=0.766），肿瘤浸润深度（P=0.353），食管鳞癌的分化程度（P=0.852），大体病理分型（P=0.356），淋巴结转移（P=0.198）及临床分期（P=0.134）诸方面均无明显相关。3. p14ARF蛋白的阳性表达与患者的年龄（P=0.051），性别（P=0.898），病灶长度（P=0.368），肿瘤位置（P=0.681），肿瘤浸润深度（P=0.764），食管鳞癌的分化程度（P=0.078），大体病理分型（P=0.119），淋巴结转移（P=0.469）及临床分期（P=0.801）诸方面均无明显相关。4．Bmi-1、p14ARF蛋白在食管鳞癌中的阳性表达呈负相关（rs=-0.352, P=0.013）。5．联合检测Bmi-1蛋白及p14ARF蛋白，有利表达组与不利表达组在患者的年龄（P=0.18），性别（P=0.638），病灶长度（P=0.242），肿瘤位置（P=0.562），肿瘤浸润深度（P=0.377），分化程度（P=0.293），大体病理分型（P=0.177），淋巴结转移（P=0.644）及临床分期（P=0.364）方面中的表达均无显着性差异。结论：1．Bmi-1蛋白及p14ARF蛋白在食管鳞癌中表达异常，其在食管鳞癌的发生发展中起重要作用。2．食管鳞癌中Bmi-1与p14ARF蛋白的表达与患者诸临床病理因素间均无明显相关性。3．食管鳞癌中Bmi-1蛋白的表达与p14ARF蛋白的表达呈负相关。提示Bmi-1与p14ARF在食管鳞癌发生发展中起协同作用，Bmi-1—p14ARF通路在食管鳞癌的发生发展中充当重要角色。4．对Bmi-1蛋白和p14ARF蛋白的联合检测无助于食管鳞癌患者的预后判断，两者的联合检测可作为食管鳞癌辅助诊断的参考指标。
朱辉[10]（2011）在《新疆维吾尔族食管鳞癌蛋白质图谱研究》文中研究指明食管癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一。中国是食管癌高发国家,鳞癌约占我国食管癌总数的80%。食管癌流行病学特征除了显着的地域分布差异之外,民族分布差异亦是其主要的特征之一。食管癌的发生在新疆有着显着的地域性和民族聚集性,提示新疆食管癌的发生受环境和遗传因素共同影响。维吾尔族是新疆的主体民族,但是已有的研究对新疆维吾尔族食管癌的相关研究较少。目前仍然缺乏食管癌的早期诊断方法,大部分食管癌患者确诊时已属中晚期,治疗的效果欠佳。手术治疗是食管癌治疗的主要方法,食管癌患者手术后死亡的主要原因是肿瘤复发和转移,肿瘤淋巴结转移是影响食管癌预后的重要因素之一。目前对手术前有无淋巴结转移判断存在不准确的问题,给手术和治疗方式选择带来了一定的盲目性。提高患者手术前TNM分期的准确率,特别是提高对淋巴结转移判断的准确性,对于提高食管癌患者的治疗水准和改善预后具有重要意义。目前还没有找到可以有效应用于食管癌术后复发和转移早期检测的血清标志物。如何提高食管癌早期诊断率、手术前淋巴结转移诊断准确性和有效监测治疗后复发及转移,尤其是寻找方便有效的血清诊断标志物,已经成为目前临床和基础研究的重要要方向。蛋白质是生命活动的具体执行者和体现者,肿瘤的发展过程中往往有蛋白质的动态变化。蛋白质组学能够识别鉴定细胞、组织或机体的全部蛋白质,提供一组蛋白质的功能及其模式的信息,能够同时反映细胞内部的遗传特性和外界因素的影响的结果。因此,可以在蛋白质组的水平进行进一步探索,寻找用于肿瘤的术前诊断、分期和术后随访监测等方面特异、灵敏的标志物。利用差异蛋白质组学的研究方法对肿瘤和正常人群的差异表达蛋白进行定量、定性、表征分析并且筛选出肿瘤相关的蛋白标记物已成为目前研究的热点。随着蛋白质组学相关技术的迅速发展,临床血清蛋白质组学成为当今生命科学领域中极其活跃的学科,临床血清蛋白质组学从新的角度研究肿瘤,寻找肿瘤标志物,为肿瘤的早期诊断、预后和动态监测提供了重要依据。表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱（surface-enhanced laser desorption/ ionization time of flight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS或SELDI）技术是一种将生物样品（如细胞液或体液）中的各种蛋白质通过特定的表面基团吸附于蛋白质芯片上,用激光脉冲辐射使芯片上的蛋白质解析形成荷电离子,这些不同质荷比（M/Z）的离子在真空电场中飞行的时间长短不同,据此绘制出质谱图,以获得各种蛋白质的分子量、丰度等信息。将正常人样本的图谱信息同某种疾病患者比较,就有望发现新的疾病相关蛋白质。SELDI-TOF-MS质谱技术已在许多肿瘤标志物研究中应用并取得成功。应用蛋白质组学SELDI-TOF-MS技术对新疆不同民族血清蛋白质指纹图谱的检测结果提示汉族、哈萨克族、维吾尔族食管癌患者间的血清蛋白质指纹图谱存在着明显的差异。本研究采用SELDI-TOF-MS技术对新疆维吾尔族的血清蛋白质指纹图谱进行检测,结合临床以及病理学资料探讨血清目标蛋白质在新疆维吾尔族食管癌患者诊断和术前淋巴结转移判断当中的价值。分析SELDI-TOF-MS技术对食管癌患者手术治疗前后血清蛋白质表达差异检测结果,探讨可能的临床意义。目的：本研究的目的是通过SELDI-TOF-MS质谱技术分析食管癌鳞癌患者和无癌健康者血清蛋白表达谱的改变以及手术前后的血清蛋白表达谱变化,筛选并建立维吾尔族食管鳞癌诊断和患者淋巴结转移诊断的血清标志物模型。寻找食管癌手术前后变化的血清标志物,进一步完善食管癌诊断、淋巴结转移及预后判断意义的食管癌蛋白表达谱系。这将有助于更深层次的理解食管癌基因学、蛋白组学改变以及加深对肿瘤发生机制的认识,为食管癌疾病早期诊断和和检测术后复发提供血清学的依据。本课题主要进行了三个方面的研究：1)新疆地区维吾尔族食管鳞癌患者与健康者血清差异表达蛋白的研究；2)新疆维吾尔族食管鳞癌淋巴结转移血清蛋白质指纹图谱研究；3)食管癌手术前后血清蛋白质组学变化研究。方法：采用弱阳离子交换蛋白芯片（CM10）和表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱（SELDI）技术检测血清样本,应用ZUCI-Protein Chip Data Analyze System软件包分析所得到的数据。用支持向量机方法建立蛋白质指纹图诊断模型,用留—法交叉验证作为评估模型判别效果的方法。两组之间的蛋白质峰的比较采用Wilconxon秩和检验,P<0.05有统计学意义。1)检测分析了43例维吾尔族食管鳞癌患者和22例性别、年龄匹配的正常对照血清蛋白表达谱,建立新疆维吾尔族食管鳞癌诊断模型；2)检测分析了21例维吾尔族食管鳞癌有淋巴结转移、22例维吾尔族食管鳞癌无淋巴结转移的患者和22例维吾尔族正常对照的血清,筛选维吾尔族食管鳞癌淋巴结转移的血清标记物,建立维吾尔族食管癌淋巴结转移诊断模型。3)检测分析45例食管鳞癌患者的手术前和手术后血清蛋白表达谱,筛选手术前后发生变化的蛋白质标志物。结果：1)维吾尔族食管鳞癌组与正常对照血清蛋白M/Z峰值图谱明显不同。所得到差异性最大的10个蛋白中（P<0.05）,有5个峰在食管癌组呈高表达,M/Z为4487.3973、11693.8038、9160.7745、5494.4509、15963.7368。5个峰呈低表达,M/Z为2763.4477、6648.88、8712.8596、6681.2584、8789.2461。建立了由7个蛋白（M/Z分别为：4487.3973、8712.8596、9160.7745、5494.4509、6681.25843、8789.2461、11693.8038）组成的诊断模型。采用十倍交叉留一法验证,该诊断模型的敏感度为86.05%（37/43）,特异度为68.18%（15/22）；2)新疆维吾尔族食管鳞癌淋巴结阳性患者组,淋巴结阴性组和健康人血清的蛋白M/Z峰值图谱明显不同。筛选了6个蛋白质峰（M/Z4487.7591、5494.0576、7992.6041、5874.1964、5899.7251、8584.908）建立了维吾尔族食管癌淋巴结阴性患者诊断模型。用十倍交叉留一法验证,其敏感度为81.82%（18/22）,特异度为86.36%（19/22）；建立了由6个蛋白质峰（M/Z 4487.6122、2763.5209、8713.1525、5494.5497、11693.2483、2750.9962）组成的维吾尔族食管鳞癌淋巴结阳性患者诊断模型。用十倍交叉留一法验证,其敏感度为80.95%（17/21）,特异度为86.36%（19/22）；建立了由3个蛋白质峰（M/Z 3275.3129、9442.91、2046.0471）组成的维吾尔族食管鳞癌淋巴结转移诊断模型。用十倍交叉留一法验证,模型的敏感度为76.19%,特异度为77.27%；3)食管癌患者手术前后血清蛋白质指纹图谱存在明显差异,表达差异最大的10个蛋白质峰（P<0.05）中M/Z 8712.3909、8788.9114、6450.9811、8585.3391、6649.156、6899.7862手术后表达低于手术前,M/Z 11496.6914、16153.17、7993.1528、11418.0658手术后表达高于手术前。其中3个蛋白质峰（M/Z 8712.3909/8714.1856、8788.9114/8789.6786、6649.156/6649.9783）与此前筛选到的维吾尔族食管鳞癌患者与正常对照之间差异蛋白质峰相同。结论：1)表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术和生物信息学分析软件的联合应用是一种寻找食管癌鳞癌生物标志物的有效方法,构成的诊断模型可以准确灵敏的区分维吾尔族食管鳞癌和健康人；2)维吾尔族食管鳞癌淋巴结阳性患者,淋巴结阴性患者和健康对照组血清蛋白质指纹图谱明显不同。其中5个蛋白峰（M/Z为16081.0634、16152.0842、15962.2598、2019.8519、2044.3842）可能对判定病情预后有重要意义；3)新疆维吾尔族食管癌手术前后血清蛋白质组学变化研究筛选到的3个蛋白质峰（M/Z 8712.3909/8714.1856、8788.9114/8789.6786、6649.156/6649.9783）可能并非是肿瘤分泌的特异性标记物,有可能是与肿瘤患者体内原有的受到抑制免疫相关蛋白或因为进食困难较正常已经降低的营养状况相关指标,其分子特征有待进一步研究。
二、食管鳞癌p16和p53蛋白的表达及其意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、食管鳞癌p16和p53蛋白的表达及其意义（论文提纲范文）
（1）食管鳞状上皮永生化和3D类器官体系的建立及其增殖分化稳态调控机制的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 资金资助 |
| 博士在读期间即将发表的英文文章 |
| 文献综述 上皮永生化与恶性转化 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）肺耐药蛋白及P16蛋白在食管鳞状细胞癌中的表达及临床病理意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 肺耐药蛋白在常见肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）HPV16-E6联合p53基因影响食管鳞癌放疗敏感性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 HPV16-E6对p53 突变型ESCC放疗敏感性的影响 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料与方法 |
| 1.2.1 主要实验材料 |
| 1.2.2 主要实验试剂: |
| 1.2.3 主要实验仪器 |
| 1.2.4 主要试剂配制 |
| 1.3 实验步骤 |
| 1.3.1 TE1 细胞培养 |
| 1.3.2 构建HPV16-E6 转染的TE1 细胞株 |
| 1.3.3 总蛋白提取 |
| 1.3.4 Western Blot检测HPV16-E6、P53 蛋白 |
| 1.3.5 平板克隆形成实验测定细胞放疗敏感性 |
| 1.3.6 细胞增殖活力检测及细胞毒性检测 |
| 1.3.7 统计学方法及应用软件 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 细胞株构建 |
| 1.4.2 Western Blot检测HPV16-E6、P53 蛋白 |
| 1.4.3 克隆形成检测细胞放疗敏感性 |
| 1.4.4 细胞增殖活性检测及细胞放疗毒性检测 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 小结 |
| 第二部分 探索HPV16-E6对p53 突变/野生ESCC放疗敏感性的影响及探索 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 主要实验材料 |
| 2.2.2 主要实验试剂: |
| 2.2.3 主要实验仪器 |
| 2.2.4 主要试剂配制 |
| 2.3 实验步骤 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 构建转染细胞株 |
| 2.3.3 免疫荧光检测导入质粒目标蛋白表达情况。 |
| 2.3.4 总蛋白提取 |
| 2.3.5 Western Blot检测P53 蛋白、HPV16-E6 蛋白。 |
| 2.3.6克隆形成实验 |
| 2.3.7 免疫共沉淀实验检测HPV16-E6与P53 蛋白泛素化结合 |
| 2.3.8 克隆形成测定各细胞放疗敏感性。 |
| 2.3.9 细胞增殖活力及放疗细胞毒性检测 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 细胞蛋白免疫荧光。 |
| 2.4.2 Western Blot检测目标蛋白表达 |
| 2.4.3 免疫共沉淀检测蛋白结合情况 |
| 2.4.4 克隆形成实验检测细胞放疗敏感性 |
| 2.4.5 细胞增殖活性检测及放疗细胞毒性检测。 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三部分 裸鼠成瘤实验验证HPV16-E6对p53 突变/野生ESCC放疗敏感性 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 主要实验材料 |
| 3.2.2 主要实验试剂 |
| 3.2.3 主要实验仪器 |
| 3.2.4 主要试剂配制 |
| 3.3 实验步骤: |
| 3.3.1 建立裸鼠皮下移植瘤模型 |
| 3.3.2 剥瘤固定标本 |
| 3.3.3 免疫组化检测Ki-67 增殖系数 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 裸鼠皮下移植瘤生长曲线及生长抑制率 |
| 3.4.2 免疫组化检测肿瘤增殖系数Ki-67 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（4）候选食管癌相关抗原的筛选鉴定及其对食管鳞癌的诊断价值（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 引言 |
| 1.1 食管癌的流行病学现状 |
| 1.2 目前食管癌诊断与治疗面临的主要问题 |
| 1.3 肿瘤相关抗原自身抗体作为食管癌早期诊断指标的可行性 |
| 1.4 常用的候选TAAs筛选手段 |
| 1.5 研究目的与实施技术路线 |
| 2 蛋白质组学方法筛选候选食管癌TAAs |
| 2.1 材料方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 候选食管鳞癌相关TAAs及相应抗体阳性血清的初步筛选 |
| 2.2.2 候选食管鳞癌TAAs抗体阳性血清的进一步验证 |
| 2.2.3 基于双向电泳和质谱分析的SERPA方法鉴定候选TAAs |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 3 候选TAAs的原核表达和纯化 |
| 3.1 材料方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 四种重组蛋白原核表达载体的构建与鉴定 |
| 3.2.2 四种候选TAAs的原核表达和纯化 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 4 联合检测多种TAAs自身抗体在食管鳞癌中的诊断 |
| 4.1 材料方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 研究对象的临床基本特征 |
| 4.2.2 单个抗-TAA自身抗体指标的诊断价值 |
| 4.2.3 基于抗-TAAs自身抗体组合的食管鳞癌患病预测模型的建立 |
| 4.2.4 验证所构建食管鳞癌患病预测模型 |
| 4.2.5 TAAs组合对不同临床分期食管鳞癌诊断价值比较 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 5 本研究创新与局限性 |
| 5.1 本研究创新点 |
| 5.2 本研究局限性 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 血清自身抗体检测对食管癌早期诊断价值的系统综述 |
| 1 引言 |
| 2 方法 |
| 2.1 检索策略 |
| 2.2 文献筛选 |
| 2.3 数据提取和统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 文献检索结果 |
| 3.2 研究对象的基本特征 |
| 3.3 自身抗体的检测方法 |
| 3.4 自身抗体的诊断价值 |
| 3.4.1 单个自身抗体的诊断价值 |
| 3.4.2 多种肿瘤相关抗原自身抗体联合检测对于食管癌的诊断价值 |
| 3.4.3 不同分期食管癌患者自身抗体阳性率 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 附录 主要试剂及其配制方法 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（5）食管癌中p16INK4A、p53蛋白的表达与HPV感染的相关性研究及其临床意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略表 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要试剂与耗材 |
| 1.3 PCR引物 |
| 2.方法 |
| 2.1 临床病理学诊断标准及临床病理参数 |
| 2.2 组织芯片的制备 |
| 2.3 样本DNA的制备 |
| 2.4 实验室质量控制方法 |
| 2.5 免疫组织化学染色方法 |
| 2.6 统计方法 |
| 结果 |
| 1.食管鳞癌临床病理特征分析 |
| 1.1 实验样本基本资料 |
| 2.食管鳞癌组织中p16~(INK4A)和p53基因蛋白的表达及临床参数的关系 |
| 2.1 食管鳞癌组织中p16~(INK4A)和p53基因蛋白的表达 |
| 2.2 p16~(INK4A)和p53蛋白表达与食管癌临床病理参数间的关系 |
| 3. HPV感染与哈族食管鳞癌的关系 |
| 3.1 HPV感染与哈族食管癌临床病理参数的关系 |
| 3.2 HPV感染与p16~(INK4A)和p53蛋白共表达的关系 |
| 讨论 |
| 1.p16~(INK4A)与哈族食管鳞癌的关系 |
| 2.p53与哈族食管鳞癌的关系 |
| 3.HPV与哈族食管鳞癌的关系 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师评阅表 |
（6）新疆哈萨克族食管鳞癌早期高相关基因的筛查分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 候选基因在新疆哈萨克族食管鳞癌初步筛查的研究 |
| 1. 研究内容和方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 统计方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第二部分 确立新疆哈萨克族食管鳞癌早期高相关基因的研究 |
| 1. 研究内容和方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 统计方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第三部分 新疆哈萨克族食管鳞癌早期高相关基因的相互作用 |
| 1. 研究内容和方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（7）新疆哈萨克族食管癌早期相关基因甲基化分析及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 消化道肿瘤相关基因survivin，cdc42，p16及FHIT在哈萨克族食管癌中表达的研究 |
| 研究背景与目的 |
| 1.研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象及材料 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第二部分 哈萨克族食管癌中survivin，cdc42，p16，FHIT启动子区CpG岛甲基化的研究 |
| 研究背景与目的 |
| 1.研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象及材料 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第三部分 survivin及cdc42启动子区CpG岛重组载体的构建及甲基化状态对报告基因CAT活性的影响 |
| 研究背景与目的 |
| 1.研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象及材料 |
| 1.2 内容与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（8）p16基因甲基化与食管癌相关研究进展（论文提纲范文）
| 一、p16基因及其甲基化 |
| 1.p16基因: |
| 2.DNA甲基化: |
| 二、食管癌多阶段演变过程中p16甲基化及其表达情况及不同区域间的差异 |
| 1.食管癌癌前病变阶段: |
| 2.食管癌癌变阶段: |
| 3.不同区域间食管癌p16甲基化及其表达情况的差异: |
| 三、p16甲基化检测技术 |
| 1.甲基化特异性焦磷酸微测序技术 (MS-Pyrosequencing) : |
| 2.错配杂交化学发光法: |
| 3.巢式甲基化特异性PCR法: |
| 四、去甲基化在肿瘤治疗中的应用相关研究 |
| 1.地西他滨: |
| 2.Zebularine: |
| 五、结 语 |
（9）Bmi-1与p14ARF蛋白在食管鳞癌中的表达及其临床意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录A 中英文术语和缩略词对照表 |
| 附录B 综述 |
| 参考文献 |
（10）新疆维吾尔族食管鳞癌蛋白质图谱研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 新疆维吾尔族食管鳞癌血清SELDI蛋白质图谱诊断模型的建立 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 生物信息学处理 |
| 1.5 差异蛋白质峰的数据库查询 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第二部分 新疆维吾尔族食管鳞癌淋巴结转移的血清蛋白质图谱分析 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 生物信息学处理 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第三部分 食管癌患者手术前后血清SELDI蛋白质指纹图谱变化的研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 生物信息学处理 |
| 1.5 差异蛋白质峰的数据库查询 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 附 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 个人简历 |
| 新疆医科大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
四、食管鳞癌p16和p53蛋白的表达及其意义（论文参考文献）
- [1]食管鳞状上皮永生化和3D类器官体系的建立及其增殖分化稳态调控机制的研究[D]. 袁徽. 北京协和医学院, 2020
- [2]肺耐药蛋白及P16蛋白在食管鳞状细胞癌中的表达及临床病理意义[D]. 张立敏. 河北医科大学, 2020(02)
- [3]HPV16-E6联合p53基因影响食管鳞癌放疗敏感性的研究[D]. 张大凯. 济南大学, 2019(01)
- [4]候选食管癌相关抗原的筛选鉴定及其对食管鳞癌的诊断价值[D]. 张红飞. 郑州大学, 2017(12)
- [5]食管癌中p16INK4A、p53蛋白的表达与HPV感染的相关性研究及其临床意义[D]. 李晶. 石河子大学, 2016(02)
- [6]新疆哈萨克族食管鳞癌早期高相关基因的筛查分析[D]. 陈艳. 新疆医科大学, 2012(05)
- [7]新疆哈萨克族食管癌早期相关基因甲基化分析及功能研究[D]. 刘玲. 新疆医科大学, 2012(01)
- [8]p16基因甲基化与食管癌相关研究进展[J]. 李朝阳,徐致祥,谭家驹. 医学研究杂志, 2012(01)
- [9]Bmi-1与p14ARF蛋白在食管鳞癌中的表达及其临床意义[D]. 阚方功. 蚌埠医学院, 2011(03)
- [10]新疆维吾尔族食管鳞癌蛋白质图谱研究[D]. 朱辉. 新疆医科大学, 2011(12)