一、HCV感染后机体保护性免疫缺陷原因探讨（论文文献综述）
王亦心[1]（2021）在《利用人源化小鼠模型研究人肺脏对于甲型流感病毒感染后的免疫应答》文中研究说明研究目的:流感病毒属于正粘病毒科,分为甲、乙、丙、丁四型。甲型流感病毒（Influenza A viruses,IAVs）是导致人类流感大流行的主要原因,对公众健康造成潜在威胁。目前对于IAVs主要的预防措施是应用流感病毒疫苗,但是由于存在抗原漂移及抗原突变的情况,使得这种方式难以发挥较好的保护作用,并且一种疫苗难以针对不同种病毒毒株进行中和。很多研究发现组织定居记忆性T细胞（Tissue resident memory T cells,Trm cells）可能对于抵抗流感病毒感染有一定的作用,因此近些年针对于T细胞疫苗的研究也逐渐开展。甲型流感病毒的研究主要依赖于小鼠模型,但小鼠的肺组织结构及细胞比例与人肺脏存在一定的差异,因此小鼠的肺脏在感染后的免疫变化可能无法完全反应在人肺中的情况。而轻、中度流感病毒患者的肺组织样本往往难以取材,多数样本来源于癌旁组织及器官捐献,这些样本难以进行流感病毒感染期间肺内免疫细胞的动态观察研究。因此我们在给NCG免疫缺陷小鼠重建人的免疫系统（human immune system,HIS）的基础上,同时在鼠背部皮下移植同源HL组织,建立人免疫系统-人肺小鼠（HIS with autologous lung xenograft,HISL mice）模型。通过对移植后的人肺脏组织进行甲型流感病毒感染,来研究人肺中以及各个器官在感染之后的免疫应答情况,探究此模型的重要临床意义。研究方法:（1）通过给NCG小鼠肾被膜下移植人胚胎胸腺组织、背部皮下移植同源肺脏组织（HL）及尾静脉注射同源肝脏来源CD34+造血干细胞,建立HISL小鼠模型;（2）给予HISL小鼠皮下人肺移植物接种H1N1病毒,对照组给予PBS等体积接种,研究两组小鼠免疫细胞的变化、特异性抗体的产生、转录组的特征及差异;（3）给予HISL小鼠皮下HL预先接种H1N1病毒,再给予HISL小鼠致死剂量H1N1病毒经鼻接种,探求预先接种对于HISL小鼠接受致死剂量H1N1经鼻感染后的保护作用。研究结果:（1）给予接受全身辐照后的NCG小鼠肾被膜下胚胎胸腺组织移植、皮下同源胚胎肺组织移植、尾静脉注射同源胚胎肝脏来源的CD34+造血干细胞后,成功建立HISL小鼠模型,其人CD45+细胞嵌合比例可达90%以上,以T细胞、B细胞为主,髓系细胞、自然杀伤细胞比例较低;小鼠皮下移植的HL组织在模型建立成功后可见其具有与成人肺中相似的、完整的呼吸性气道等结构。（2）H1N1病毒感染小鼠皮下移植的人肺组织后,H1N1组HISL小鼠人肺中的HLA-DR+CD11c+细胞和CD20+细胞比例显着高于对照组,且H1N1组小鼠HL中CD4+Trm、CD8+Trm水平较PBS组显着升高,其水平与HLA-DR+CD11c+细胞和CD20+细胞的比例呈正相关;H1N1组HISL小鼠HL中HLA-A*0201限制性H1N1抗原特异性的CD8+T细胞的比例相比对照组显着升高;H1N1组HISL小鼠血清中产生病毒特异性的Ig、IgG抗体;两组小鼠人肺的转录组测序后表达基因存在显着差异,H1N1组小鼠HL中H1N1流感病毒感染相关、免疫相关的基因表达显着上调。（3）HISL小鼠皮下HL经过5000TCID50 H1N1病毒单次接种后,再次给予小鼠致死剂量（5000TCID50）病毒的经鼻接种,小鼠死亡;预先给予HISL小鼠多次500 TCID50 H1N1病毒皮下HL内接种,小鼠在经过致死剂量流感病毒经鼻感染后生存时间较对照组显着延长。研究结论:（1）HISL小鼠模型可实现对人肺脏组织结构、免疫细胞水平及变化等的研究。（2）HISL小鼠可研究人肺脏组织在流感病毒感染后人肺中的免疫细胞的变化,可进一步研究其中T细胞亚型的特点、基因组的差异以及血清中特异性抗体的产生。（3）多次低剂量H1N1病毒预先感染HISL小鼠皮下HL可提供一定的保护作用,延长该小鼠在接受致死剂量病毒经鼻感染后的生存时间,并提高其生存率。综上所述,本课题首次建立了可用于流感病毒研究的人肺脏组织及免疫系统的小鼠模型,为后期进一步研究感染后免疫系统的变化、T细胞表型特点、特异性抗体的产生、转录水平的差异等提供了有力的工具,并对后期疫苗的研发及其他肺部感染性疾病的研究等具有重要意义。
李浩然[2]（2021）在《弓形虫感染小鼠T细胞表面TIGIT分子的表达和功能研究》文中提出背景刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）作为一种专性细胞内寄生原虫,可以感染大多数温血动物,引起人兽共患弓形虫病,严重威胁着人和动物的健康,然而至今尚无理想的治疗药物。大量研究表明,宿主T细胞介导的免疫应答在抗弓形虫感染中发挥重要作用。T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制性基序结构域[T-cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif（ITIM）domain,TIGIT]作为一种免疫调节因子,在多种感染性病原体诱导的细胞免疫反应中发挥重要调节作用。但TIGIT在弓形虫感染的宿主免疫细胞表面的表达特征尚不明确,其对弓形虫特异性T细胞免疫功能的影响也有待研究。目的明确弓形虫感染是否调节宿主T细胞表面TIGIT分子的表达及其与疾病进程的相关性,并初步探究TIGIT通路的阻断是否能够改善弓形虫感染的结局,为临床弓形虫病的干预提供理论依据。方法1.将150只C57BL/6小鼠随机分为:健康对照组（Nc组）和弓形虫I型强毒株RH株速殖子感染组（RH组）。通过以下指标探究在急性弓形虫感染过程中,T细胞表面TIGIT的表达情况与宿主免疫功能之间的相关性:1)记录两组小鼠脾指数,HE染色检测RH株弓形虫速殖子感染后不同时期的脾脏病理变化;2)RT-qPCR检测两组小鼠不同时期的外周血及脾脏中TIGIT、CD226和弓形虫速殖子特异性基因Tg SAG1的m RNA表达水平变化;3)流式细胞术检测两组小鼠不同时期的外周血及脾脏中T细胞表面TIGIT和CD226分子的表达情况,以及TIGIT+T细胞的表型变化情况。2.将300只C57BL/6小鼠随机分为:Nc组和弓形虫II型弱毒株PRU株包囊感染组（PRU组）。通过以下指标阐明在慢性弓形虫感染过程中,TIGIT介导宿主T细胞功能衰竭的发生机制:1)记录两组小鼠脾指数,HE染色检测PRU株弓形虫包囊感染后不同时期的脑组织及脾脏病理变化;2)RT-qPCR检测两组小鼠不同时期的脑组织及脾脏中弓形虫特异性基因B1、TIGIT、CD226、颗粒酶B、穿孔素及炎性细胞因子的m RNA表达水平变化;3)流式细胞术检测两组小鼠不同时期的脑组织及脾脏中T细胞表面TIGIT和CD226分子的表达情况、TIGIT+T细胞的表型变化以及TIGIT+T细胞内颗粒酶B和穿孔素分子的表达情况。3.构建TIGIT基因缺失(TIGIT-/-)小鼠,将野生型（WT）C57BL/6小鼠30只和TIGIT-/-小鼠30只,各自分为弓形虫I型强毒株RH株速殖子感染组和弓形虫II型弱毒株PRU株包囊感染组。通过记录存活率以及慢性弓形虫感染后脑组织内弓形虫包囊数量及大小来初步探究TIGIT通路的阻断是否能够改善弓形虫感染带来的不良结局。结果1.急性弓形虫感染过程中宿主T细胞表面TIGIT分子的表达情况1)感染小鼠脾脏的损伤程度与脾脏内弓形虫虫荷呈正相关;2)感染后小鼠外周血和脾脏内Tg SAG1和TIGIT转录水平同时显着上调;3)小鼠脾脏及外周血CD4+与CD8+T细胞表面TIGIT的表达水平在感染早期降低,在感染晚期显着升高;4)感染过程中小鼠脾脏内部分TIGIT+TCM细胞激活转化为TIGIT+TEM。2.慢性弓形虫感染过程中宿主T细胞表面TIGIT分子的表达情况1)感染小鼠脑组织和脾脏的损伤程度均与组织内弓形虫虫荷呈正相关;2)感染后小鼠脑组织与脾脏内T细胞表面TIGIT分子持续性大量表达;3)感染过程中小鼠脑组织和脾脏内部分TIGIT+TCM细胞激活转化为TIGIT+TEM;4)感染后小鼠脑组织与脾脏内TIGIT+T细胞的细胞毒作用减弱;5)感染后小鼠血清中IFN-γ和TNF-α的含量增加。3.TIGIT基因敲除对急、慢性弓形虫感染结局的影响1)TIGIT基因敲除后可显着提高急、慢性弓形虫感染小鼠存活率;2)TIGIT基因敲除后可减少慢性弓形虫感染小鼠脑组织内包囊的数量和大小。结论1.急性弓形虫感染过程中宿主T细胞表面选择性表达TIGIT,同时脾脏内部分TIGIT+TCM激活转化为TIGIT+TEM;2.慢性弓形虫感染过程中宿主T细胞表面持续性表达TIGIT并减弱其细胞毒作用;3.TIGIT基因敲除可显着降低急、慢性弓形虫感染的致死率,同时降低小鼠脑内包囊的数量并减少包囊的大小。
修磊[3]（2020）在《γδT细胞在金黄色葡萄球菌乳腺感染中的作用及机制研究》文中研究表明金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）是一种寄生于动物体表的条件性致病菌,能引起人和多种动物的感染性疾病,如心内膜炎、肺炎、骨髓炎和菌血症等。此外,S.aureus还可引起哺乳期妇女和动物的乳腺炎,严重威胁人类健康和畜牧业健康发展。S.aureus耐药菌株的涌现和疫苗预防效果的局限性使得深入研究其发病的免疫学机制已迫在眉睫。目前,S.aureus乳腺感染的相关免疫调控机制并不完全清楚,最新研究表明,一些非传统的T细胞群（如γδT细胞）参与了病原微生物感染的免疫应答,并且在调节免疫反应类型和强度上发挥重要作用。γδT细胞作为连接固有免疫应答与适应性免疫应答的桥梁,广泛分布于各种黏膜和皮下组织,在黏膜免疫防御中扮演着重要的角色。有研究表明,γδT细胞对细菌感染的免疫应答因感染部位的不同而存在着差异。乳腺作为机体的特殊组织器官,在感染S.aureus后,乳腺组织中γδT细胞动态变化如何?发挥怎样的功能?具体机制如何?尚未见报道。本研究通过S.aureus感染小鼠乳腺模型,系统分析乳腺组织中γδT细胞的动态变化、应答规律和分泌细胞因子特征;利用TCRδ-/-小鼠,探究乳腺γδT细胞在感染S.aureus后的主要功能。利用Vγ4抗体清除的小鼠和IL-17A-/-小鼠,明确乳腺γδT细胞在S.aureus感染过程中发挥作用的机制。研究内容及方法:建立小鼠S.aureus乳腺感染模型,检测感染24 h内乳腺组织及脾脏中NK细胞、NK T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞以及γδT细胞的动态变化;流式细胞术和ELISA法检测乳腺组织内γδT细胞的表型及分泌细胞因子情况。利用TCRδ-/-小鼠乳腺感染模型,检测敲除γδT细胞后乳腺组织中S.aureus定殖量、病理变化、趋化因子表达量、嗜中性粒细胞数量及MPO活性;流式细胞术分析小鼠乳腺Th1,Th2,Th17,Tc以及Treg细胞变化情况,明确乳腺γδT细胞在S.aureus感染过程中所发挥的功能。进一步,分析S.aureus感染后乳腺γδT细胞的亚型,明确其主要亚型Vγ1和Vγ4γδT细胞的动态变化及分泌细胞因子特征。利用InVivoMAb anti-mouse TCR Vγ1（clone 2.11）单克隆抗体和InVivoMAb anti-mouse TCR Vγ4（clone UC3-10A6）单克隆抗体清除乳腺Vγ1和Vγ4γδT细胞,检测乳腺组织中S.aureus定殖量、病理变化情况及嗜中性粒细胞募集情况,确定乳腺Vγ1和Vγ4γδT细胞在S.aureus感染中的作用。最后,利用IL-17A-/-小鼠,检测乳腺组织中S.aureus定殖量、病理变化、趋化因子表达及嗜中性粒细胞募集情况,分析探讨乳腺Vγ4γδT细胞在抗S.aureus感染中的作用机制。实验结果:1)S.aureus感染小鼠乳腺后,乳腺组织中CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞及NK T细胞无显着变化,而γδT细胞变化显着。在感染24 h内,乳腺内γδT细胞呈先升高后降低的趋势,感染S.aureus 3 h后达到峰值,至24 h时其比例降为1.95%,与对照组相比差异不显着。对乳腺中γδT细胞表型进行检测后发现其高表达CD44和CD69分子,进一步对γδT细胞分泌的细胞因子进行检测后发现,乳腺γδT细胞主要分泌IL-17A和IFN-γ。2)S.aureus感染TCRδ-/-小鼠后,对乳腺内细菌定殖量和病理变化情况进行检测,结果发现TCRδ-/-小鼠乳腺组织细菌定殖量显着升高,乳腺组织病理程度加剧。进一步探究发现TCRδ-/-小鼠乳腺组织中趋化因子KC、MIP-2及IL-8的表达量显着降低,中性粒细胞数量显着减少,组织MPO活性显着下降,IL-17A和IFN-γ的表达量降低。另外,与WT小鼠相比,TCRδ-/-小鼠乳腺及脾脏中Th1、Th17、Tc以及Treg细胞比例显着降低,而Th2细胞比例则无明显变化。提示乳腺γδT细胞在S.aureus感染过程中起到免疫保护作用。3)S.aureus感染小鼠乳腺后,流式细胞术检测γδT细胞主要亚型及其动态变化情况,结果发现,Vγ1和Vγ4γδT细胞在感染后3 h和6 h的比例显着升高,与对照组相比差异显着;进一步发现,Vγ1γδT细胞在S.aureus感染早期主要产生IFN-γ,而Vγ4γδT细胞在S.aureus感染早期主要产生IL-17A。利用抗体分别将乳腺组织内Vγ1γδT细胞和Vγ4γδT细胞清除,结果发现,与对照组相比,Vγ1γδT细胞清除小鼠和Vγ4γδT细胞清除小鼠乳腺内细菌定殖量均显着增加,病理程度加剧,中性粒细胞数量显着降低,提示Vγ1和Vγ4γδT细胞是乳腺抵御S.aureus感染的主要γδT细胞亚型。4)进一步利用IL-17A-/-小鼠,探讨Vγ4γδT细胞在S.aureus感染中的机制。结果发现,与WT组小鼠相比,IL-17A-/-小鼠乳腺中细菌定殖量显着增加,病理程度加剧,趋化因子KC、MIP-2及IL-8的表达量显着降低。流式细胞术检测WT小鼠与IL-17A-/-小鼠乳腺组织内中性粒细胞的数量,结果显示,与WT组相比,IL-17A-/-小鼠乳腺内中性粒细胞数量显着降低,提示γδT细胞是通过分泌IL-17A,进而招募趋化因子,募集中性粒细胞,清除细菌,发挥免疫保护作用。研究结论:1.γδT细胞是乳腺感染S.aureus早期最主要的T淋巴细胞类型。这类细胞高表达CD44和CD69分子,并分泌IL-17A和IFN-γ。2.敲除γδT细胞后,乳腺中性粒细胞和趋化因子减少,乳腺炎症和细菌定殖量增加。表明γδT细胞在乳腺S.aureus感染早期对细菌清除和降低组织损伤方面起关键的正调控作用。敲除γδT细胞后,乳腺Th1、Th17、Tc以及Treg细胞比例降低,提示γδT细胞可能对机体适应性免疫应答具有一定的调节作用。3.S.aureus感染后,γδT细胞以Vγ1和Vγ4两种亚型为主,Vγ1γδT细胞主要分泌IFN-γ,Vγ4γδT细胞主要分泌IL-17A。Vγ1γδT细胞和Vγ4γδT细在乳腺S.aureus感染早期对细菌清除和降低组织损伤方面起关键的正调控作用,是抵御S.aureus感染的主要γδT细胞亚型。4.乳腺Vγ4γδT细胞通过分泌IL-17A,进而招募趋化因子,募集中性粒细胞,清除细菌,发挥免疫保护作用。本研究丰富了乳腺局部抗感染免疫应答的资料,为S.aureus乳腺炎的预防和治疗提供理论依据与实验数据。
杨倩婷[4]（2020）在《组织驻留记忆T细胞在结核病人组织中的表达特征和功能研究》文中研究指明在抗结核免疫中T细胞起着不可或缺的作用,其中主要为CD4+和CD8+T细胞的调控作用。然而目前大部分相关研究来源于外周血免疫细胞的研究,在感染组织局部免疫调控的情况尚不清楚。近年来研究发现一群存在于组织局部的免疫细胞-组织驻留记忆性T细胞（Resident memory T cells,TRM）,该细胞被认为是抗外来病原体感染的第一道防线,与机体的保护免疫有关。在结核研究中发现,结核菌感染的小鼠肺组织驻留T细胞起保护作用。另外,在结核疫苗研究发现疫苗免疫小鼠能诱导TRM细胞产生并且疫苗诱导的保护性免疫与TRM细胞有关。这些结果提示TRM细胞在结核免疫中起保护作用。然而,目前在结核中有关TRM细胞的研究主要是在小鼠中进行,在结核病人中TRM细胞的表达和作用如何,目前尚没有相关的研究。为此,本研究收集结核病人不同类型的组织,利用全基因组测序、质谱流式、细胞流式等技术系统描绘结核病人组织中TRM细胞的蛋白和基因表达图谱,系统的揭示该细胞在结核病中的表达特征。进一步通过体外实验明确结核病人组织TRM细胞对巨噬细胞的影响及其机制。本研究结果揭示了结核病人组织TRM细胞的表达、表型和功能,为我们目前对结核感染局部免疫环境提供了新的认识。研究方法1.利用流式细胞技术检测结核病人不同类型组织中TRM细胞的表达水平。2.利用质谱流式技术检测结核病人不同类型组织中28个蛋白分子的表达。3.利用基因测序技术检测TRM细胞全基因图谱。4.体外利用结核菌感染TRM细胞,利用谱流式技术检测18个细胞因子/趋化因子表达。5.流式细胞仪分离结核病人TRM细胞后,与感染了结核菌的巨噬细胞共培养,观察TRM细胞对巨噬细胞的杀菌能力、细胞因子和极化的影响。结果1.结核病人不同组织有不同水平的TRM细胞表达,并且表现为效应性T细胞。2.结核病人TRM细胞表达高水平的活化、趋化和凋亡标记物。3.结核病人TRM细胞表达高表达多种活化、趋化和细胞因子的基因。4.结核病人TRM细胞产生多种结核抗原特异性的细胞因子,并且表现为多功能T细胞的表型。5.结核病人TRM细胞能增强巨噬细胞杀伤结核菌的能力,并且增加IFNγ和TNFα的表达、诱导巨噬细胞向M1分化。结论1.TRM细胞在结核病人不同组织中表达,并且为效应性、活化性、细胞毒的表型。2.结核病人TRM细胞具有独特的基因表达谱。3.结核病人TRM细胞表现为结核抗原特异性多功能T细胞的表型。4.结核病人TRM细胞可能通过诱导高水平细胞因子表达及诱导巨噬细胞向M1分化从而增强巨噬细胞杀菌能力。
张义伟[5]（2020）在《弓形虫、疟原虫感染小鼠免疫细胞表面TIM-3分子的差异表达及生物学效应研究》文中研究表明T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3（T-cell immunoglobulin and mucin domain 3,TIM-3）,是一种免疫球蛋白和粘蛋白结构域家族中的细胞表面分子,常被称为免疫检查点受体和免疫衰竭标志物,在肿瘤以及一些寄生虫如日本血吸虫、疟原虫等多种寄生虫的免疫逃避进程中均发挥了重要作用。在寄生虫感染过程中,机体的免疫状态与感染的寄生虫的毒力密切相关,且已有的研究表明不同毒力寄生虫感染诱导宿主产生的免疫反应不同。本课题组前期研究显示,在日本血吸虫感染过程中,小鼠关键免疫细胞表面TIM-3的表达升高,并诱导宿主Th2偏向的免疫反应;我们的研究还发现在恶性疟原虫感染的患者和伯氏疟原虫感染小鼠的体内,关键免疫细胞表面TIM-3表达也升高。然而,对于不同毒力寄生虫诱导宿主免疫细胞表面TIM-3表达及产生的免疫应答水平的差异仍不清楚,且TIM-3在被寄生虫感染小鼠中的生物学效应仍有待进一步研究。因此,本研究在课题组前期工作基础上,选取了两种专性细胞内寄生的顶复门原虫—弓形虫和疟原虫为研究对象,对不同毒力疟原虫、弓形虫感染过程中宿主免疫细胞TIM-3的表达情况、其诱导宿主免疫应答的能力及其在抗病和发病机制中的意义进行了研究。疟原虫主要寄生于红细胞内,而弓形虫主要寄生于有核细胞,两者感染宿主后均会在宿主的免疫系统中触发一系列信号和级联反应,从而有利于宿主控制寄生虫感染。疟原虫感染常会引起患者周期性寒热发作,伴有头痛、恶心等症状,严重者可危及生命。与疟原虫不同,弓形虫感染免疫正常的宿主后,通常会由速殖子逐渐转化为缓殖子,形成包囊以逃避免疫系统的破坏,最终在宿主体内长期寄生,甚至伴随其一生,只有在宿主免疫系统低下或遭受破坏时才会造成致命损害。这些都有可能与TIM-3的表达导致宿主免疫衰竭相关。已有的研究结果表明,抗疟原虫或弓形虫免疫反应及基于此设计的疫苗和药物可以有效地控制寄生虫的感染,甚至在某些情况下预防寄生虫感染。因此,本课题对TIM-3进行的一系列研究有望为抗疟药物靶标的选择、慢性弓形虫病的治疗及为揭示弓形虫在宿主体内的长期寄生机制提供一定的理论依据。本课题首先利用流式细胞术检测了感染不同毒力疟原虫、弓形虫感染小鼠主要免疫细胞群及其表面TIM-3的变化。在对疟原虫进行的研究中发现,TIM-3在感染伯氏疟原虫ANKA株小鼠脾脏和外周血T细胞上的表达水平高于感染伯氏疟原虫NK65株和ΔP.b Tat D株的小鼠,同时,TIM-3在感染伯氏疟原虫小鼠脾脏和外周血T细胞表面表达的增加,伴随着这些细胞频率的降低。在对弓形虫进行的研究中发现,TIM-3在感染弓形虫RH株的小鼠脾脏和外周血T细胞表面的表达高于感染弓形虫ME49株的小鼠,同时,TIM-3在感染弓形虫小鼠脾脏T细胞表面的表达增加,伴随这些细胞频率的降低。体外研究发现,用抗TIM-3抗体阻断TIM-3信号通路可抑制淋巴细胞的早期凋亡。因此,强毒力寄生虫诱导宿主产生高水平的TIM-3,且淋巴细胞上的TIM-3的升高表达对细胞介导的抗寄生虫感染免疫具有负调节作用。为检测不同毒力寄生虫诱导宿主产生细胞因子水平的差异,本课题利用细胞因子微球检测技术（Cytometric Bead Array,CBA）检测了小鼠血清中细胞因子的分泌水平,结果显示,在感染伯氏疟原虫小鼠血清中,白细胞介素（Interleukin,IL）-2、IL-4、IL-6、IL-22、干扰素（interferon,IFN）-γ和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）-α急剧升高,且除IL-22外,在感染伯氏疟原虫NK65株小鼠血清中分泌最多。在感染弓形虫小鼠血清中,IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-12p70、IL-22、IL-17A和IL-5的产生水平显着升高,且感染弓形虫ME49株的小鼠比感染RH株的小鼠对TNF-α、IL-17A、IL-12p70和IL-22的诱导能力更强。即感染强毒株寄生虫小鼠血清中部分细胞因子的分泌水平更高。为了进一步研究TIM-3的生物学效应,本课题用α-乳糖（Gal-9的拮抗剂）进行体内TIM-3/Gal-9信号阻断试验,结果在感染疟原虫小鼠体内,α-乳糖无明显保护作用,反而诱导了伯氏疟原虫感染小鼠中另一种免疫抑制分子—含免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）及ITIM结构域的T细胞免疫受体（T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains,TIGIT）的代偿性升高表达。在感染弓形虫小鼠体内,α-乳糖也无明显保护作用,这可能和小鼠体内的不可逆转的淋巴细胞的衰竭状态有关。在肿瘤的免疫治疗中,针对单一靶点进行的治疗往往也不能取得较好效果,所以以上结果提示我们,在对抗寄生虫病的过程中,针对多靶点进行治疗有可能会取得较好效果。
潘艳艳[6]（2020）在《PD-1/PD-L1通路在伯氏疟原虫感染BALB/c小鼠中的作用研究》文中认为目的:疟疾是由疟原虫感染后直接引起的一种寄生原虫感染性疾病,对身体健康有极大的损害。在2019年由世界卫生组织（World Health Organization,WHO）出版的疟疾报告（malaria report）中显示,2018年疟疾新发病例有很大程度上的下降,但是仍然有2.28亿人是新发生的感染病例,死亡人数更是超过了40万,尤其是五岁以下的儿童,死亡超过27万。那么抗疟疾保护性疫苗的研发,就显得尤为重要,但是目前为止还没有完全有效的抗疟疾疫苗。被欧洲药品管理局批准的世界上第一个疟疾疫苗-RTS,S/AS01有效率最多50%,因此,需要充分认识疟疾免疫的特点,这对疟疾疫苗的研发设计以及疟疾有效防控具有重要意义。在疟疾免疫应答中,在抗肝内期和红内期疟原虫感染中都需要T淋巴细胞来发挥作用。疟原虫的抗原在体内被树突状细胞加工提呈给初始T（native T）细胞以后,其会快速成为效应T细胞,最后大部分的T细胞会发生凋亡而被机体清除,能保存下来的只是很少的一部分,成为免疫记忆T细胞。疟原虫感染中发现存在着免疫抑制现象,由于抑制因素的存在,疟原虫感染后会加速T细胞的终末效应分化进程,抑制T细胞免疫记忆的持久性建立,疟原虫特异性T细胞被抑制而出现明显减少。近年来,程序性细胞死亡受体-1（programmed cell death-1,PD-1）以及其配体（PD-L1）信号通路可能参与到疟疾免疫记忆的建立中。研究表明T细胞耗竭参与多种慢性感染和肿瘤的发生发展。目前的研究显示,在疟疾感染中,PD-1能够介导T细胞出现功能耗竭。近期研究结果还发现,疟原虫感染不仅能诱导T细胞出现功能的耗竭也能引起B细胞的耗竭,由此表明PD-1的存在可能会潜在阻断疟疾感染的有效控制。但亦有研究显示,记忆T细胞数量在PD-1基因敲除小鼠和野生型小鼠间无显着性差异。目前PD-1/PD-L1通路在疟疾初次免疫应答以及免疫记忆的形成和维持中的作用及其发挥作用的机制未见明确的报道。为此,利用伯氏疟原虫Plasmodium berghei ANKA（Pb ANKA）感染BALB/c小鼠为模型,PD-1单抗阻断分析PD-1信号缺失对免疫效应细胞功能的影响,探讨PD-1在疟疾初次免疫应答以及免疫记忆建立中的可能作用,以期为控制疟疾感染研发有效疫苗提供新的理论依据。方法:1、实验动物及疟疾感染模型构建。建立伯氏疟原虫Pb ANKA初次感染模型:使用BALB/c小鼠进行腹腔免疫1×106伯氏疟原虫Pb ANK感染的红细胞,此组为初次正常感染组（infection group）。建立伯氏疟原虫Pb ANKA再次感染模型:选BALB/c小鼠腹腔免疫1×106Pb ANKA感染的红细胞。在感染后第4-5天进行氯喹药物治疗。在痊愈后第30天进行腹腔感染同种疟原虫Pb ANKA,此组为再感染组（reinfection group）。建立初次感染小鼠PD-1单克隆抗体阻断模型:初次感染组小鼠在伯氏疟原虫Pb ANKA初次感染后,分别在第0天、第3天、第5天和第7天进行PD-1单抗阻断（200μg i.p./次/只）,此组为初次感染抗体阻断组（PD-1mAb group）。建立再次感染小鼠PD-1单克隆抗体阻断模型:再感染组小鼠在伯氏疟原虫Pb ANKA再感染后,分别在第0天、第3天、第5天和第7天进行PD-1单抗阻断（200μg i.p./次/只）,此组为再次感染抗体阻断组（PD-1 mAb group）。对照组同时段注射等剂量PD-1单抗同型对照。每组9只小鼠。2、计数红细胞感染率以及生存率。在伯氏疟原虫Pb ANKA感染小鼠的不同时间点,各组小鼠采用尾静脉采血的方式,玻片上制成薄血膜,固定晾干,进行Giemsa染色后,显微镜下计数各组小鼠红细胞感染率,动态监测各感染组小鼠原虫血症水平,每日记录各感染组小鼠死亡情况,计算各感染组小鼠生存率。3、制备脾细胞悬液。各组小鼠感染后第5天,在超净工作台中无菌取出脾脏,研磨法将脾脏制成脾细胞悬液。使用24孔板培养脾细胞,将调好浓度的脾细胞悬液（终浓度为1×107个/ml）加入到24孔培养板（FALCON）中,每孔中加入500μl脾细胞悬液,每个样品设置3个孔。CO2培养箱培养48小时后,收集脾细胞,350g离心10min,收集脾细胞培养上清,-80℃冰箱保存,用于之后细胞因子的测定。4、血清分离。初次感染组小鼠感染后第5天,再次感染组小鼠感染后第12天,采取眼球采血方式,于1.5ml离心管中留存各组小鼠的全血,室温下静置1-2小时,4℃过夜,血清自然析出,3000转/分,离心10分钟,分离血清至新的离心管中,做好标记,-80℃冰箱保存,用于之后血清抗体的测定。5、荧光抗体染色流式细胞仪分析。制备的脾细胞悬液进行细胞表面染色:设阴性对照管、单染管和实验管,每管中加入洗好的1×106个脾细胞,阴性对照管中加入同种型对照抗体,其余各管中加入20μl相应的荧光标记单克隆抗体（mAb）,震荡混匀后,室温避光孵育15-20分钟。2000g离心5 min洗掉多余的荧光抗体,弃上清后加入0.5 ml PBS待上机检测。胞内染色方法:设阴性对照管、单染管和实验管,每管中加入洗好的1×106个脾细胞,依次加入PMA（浓度为50ng/ml）、Ionomycin（浓度为1μg/ml）和BFA（浓度为10μg/ml）刺激4-6个小时（37℃,5%CO2的细胞培养箱）,PBS洗3次后阴性对照管中加入同种型对照单克隆抗体,其余各管中加入表面标志的荧光单克隆抗体,4℃避光孵育30 min,PBS洗2次后,加入200μl破膜液4℃避光破膜30 min,破膜洗液洗2次后,实验管中加入胞内染色荧光单克隆抗体,PBS洗2次后。弃上清,加PBS 500μl,待上机检测。使用美国B&D公司流式细胞仪（FACS Celesta）测定检测样本,每个检测的样本首先收集100,000个脾细胞,使用阴性对照管确定电压,用单染管调好补偿,在分析数据时,首先使用前向散射角（FSC）及侧向散射角（SSC）将脾细胞进行分群,将同型对照作为参考,以二维散点图显示,记录百分比。6、细胞因子以及血清特异性抗体检测。用双抗体夹心酶联免疫吸附（ELISA测定）试剂盒检测保存的脾细胞上清中IFN-γ、IL-10、IL-6和TNF-α分泌水平按照使用说明书进行操作,最后检测样本450nm处的OD值,使用全自动酶标仪。利用标准品绘制标准曲线,检测样本中细胞因子的含量（pg/ml）。制备伯氏疟原虫Pb ANKA全虫抗原,表达和纯化裂殖子表面蛋白（merozoite surface protein,MSP）-1 C末端19kD片段(MSP119)重组蛋白,用于检测抗伯氏疟原虫Pb ANKA全虫抗原抗体和抗重组MSP119特异性抗体水平,检测样本450nm处的OD值,使用全自动酶标仪。7、脾细胞细胞因子mRNA表达水平检测。Trizol法提取脾细胞总RNA,去除RNA中的基因组DNA（genomic DNA,gDNA）,RNA反转录成互补DNA（complementary DNA,cDNA）,采用实时荧光Real-time PCR技术,检测脾细胞中IL-10、IL-6、IL-21的mRNA表达水平。8、统计分析。数据使用SPSS软件,版本23.0（SPSS Inc,美国）,使用One-way ANOVA检验比较分析各组均值差异,所有数据采用平均值±标准误差（SEM）的方法表示。p<0.05表示差异具有统计学意义。结果:1、PD-1阻断对伯氏疟原虫Pb ANKA初次感染的影响。伯氏疟原虫Pb ANKA感染的BALB/c小鼠在感染后第6天,外周血中出现疟原虫感染的红细胞,随后红细胞感染率快速升高,在感染后第17天达到40%左右,在感染后第15天小鼠出现死亡,第23天小鼠全部死亡;然而,使用PD-1单克隆抗体之后,小鼠感染率和正常感染小鼠没有明显差异,但PD-1促进小鼠死亡,于感染后第13天开始出现死亡,第18天小鼠全部死亡。在感染后第5天通过流式细胞仪对脾脏经典树突状细胞（conventional dentritic cells,cDCs）和浆样树突状细胞（plasmacytoid DC,pDCs）,DCs上MHCⅡ、CD86以及PD-L1表达情况进行检测。我们发现cDCs和pDC在正常感染出现明显的升高,使用PD-1单抗后,cDCs数量明显下降,pDC没有明显变化,CD11c+DC上CD86和MHCⅡ表达水平在单抗阻断组和正常感染组也没有差异。但是cDCs上PD-L1表达水平在单抗阻断之后出现明显升高。在感染后第5天检测PD-1阻断后对小鼠脾细胞中调节性T细胞（regular T cells,Tregs）、骨髓来源抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）、Th1、活化T、滤泡辅助T细胞（follicular helper cells,Tfh）数量的影响。我们发现在感染后第5天,PD-1阻断对Treg、Tfh和活化T没有明显的影响。MDSCs在单抗阻断组出现明显增加,而Th1出现明显降低。对脾细胞mRNA分析发现,IL-10 mRNA在两组之间没有明显变化,IL-21和IL-6mRNA在单抗阻断组出现明显降低。之后对脾细胞培养上清中细胞因子进行检测发现,PD-1阻断后TNF-α没有明显变化,而IFN-γ、IL-10和IL-6都明显降低。在感染后第12天检测PD-1阻断后对小鼠脾细胞中中央记忆T细胞（central memory T cell,TCM）、效应记忆T细胞（effector memory T cell,TEM）、长寿浆细胞、短寿浆细胞数量、抗全虫抗原IgG、IgG1和IgG2a以及特异性抗体抗MSP-119抗体的影响。对于免疫记忆,我们发现感染后第12天,PD-1阻断后TCM被明显抑制,而发挥记忆功能的TEM在两组之间没有明显改变。在单抗阻断组短寿浆细胞明显被抑制,而长寿浆细胞没有出现明显变化。同时,血清抗体IgG、IgG1和IgG2a在两组之间均没有差异,特异性抗体抗MSP-119抗体在两组之间也没有差异。2、PD-1阻断对伯氏疟原虫Pb ANKA再感染的影响。再感染中,正常再感染小鼠,感染率升高很快,在感染后第18天左右感染率达到40%左右,之后小鼠开始出现死亡,而PD-1阻断使小鼠红细胞感染率明显下降,最后痊愈,小鼠全部存活。在伯氏疟原虫Pb ANKA再感染中,通过流式细胞仪对脾脏cDCs和pDCs,DCs上MHCⅡ、CD86以及PD-L1表达情况进行检测。cDCs和pDCs在PD-1阻断后都明显升高,并且DCs表达的CD86和MHCⅡ在单抗阻断组都明显升高,DCs细胞上PD-L1表达在两组之间没有差异。在再感染后第5天,检测PD-1阻断后对小鼠脾细胞中Tregs、MDSCs、Th1、活化T、Tfh数量的影响。PD-1阻断对Treg没有明显的影响。Tfh和活化T在单抗阻断组出现明显增加,对Th1细胞没有显着影响。qRT-PCR对脾细胞细胞因子mRNA进行检测发现,脾细胞IL-21mRNA在单抗阻断组出现增加,但是没有显着差异。ELISA检测脾细胞培养上清中细胞因子发现,在再感染中,PD-1阻断后TNF-α和IL-6都明显升高,而IFN-γ在单抗阻断组没有明显变化,IL-10明显降低。在再感染后第5天检测PD-1阻断后对小鼠脾细胞TCM、TEM、长寿、短寿浆细胞数量、抗全虫抗原Ig G、IgG1和IgG2a以及特异性抗体抗MSP-1抗体的影响。PD-1阻断后TCM在单抗阻断组明显升高,但是TEM没有改变。虽然短寿浆细胞没有明显变化,但是长寿浆细胞在单抗阻断组出现明显升高。而血清抗体抗全虫抗原IgG1和IgG2a在单抗阻断组均出现升高,尤其是特异性抗体抗MSP119抗体IgG明显升高。PD-1阻断后能明显增强小鼠的免疫记忆功能。结论:1、伯氏疟原虫Pb ANKA感染BALB/c小鼠,在初次感染中,PD-1单抗阻断后固有免疫和获得性免疫受损;2、伯氏疟原虫Pb ANKA感染BALB/c小鼠,PD-1单抗阻断后,在初次感染中,记忆细胞被明显抑制;3、伯氏疟原虫Pb ANKA感染BALB/c小鼠,PD-1单抗阻断有助于再次感染中固有免疫和获得性免疫的增强;4、再次感染中,PD-1抑制作用被阻断后,能够增强伯氏疟原虫Pb ANKA感染BALB/c小鼠的记忆细胞和抗体产生。
高文燕[7]（2020）在《TLR2、TLR4、TLR7、TLR9在夏氏疟原虫感染BALB/c小鼠过程中对细胞免疫，体液免疫及免疫记忆形成的生物学作用》文中指出目的:每年在全球范围内估计有2亿例疟疾感染病例,造成超过40万人死亡,其中约70%的致命疟疾发生在5岁以下的儿童中。尽管对疟疾免疫的研究已经有了显着进步,但是对疟疾感染过程中的固有免疫和适应性免疫的具体机制仍尚未明确。疟疾感染导致宿主免疫系统激活,同时产生前炎症反应和相应的负向免疫调控机制。在人类和啮齿类疟疾模型中进行的研究表明,CD4+T细胞在疟疾感染中介导了主要的保护性免疫作用。某些细胞因子,例如肿瘤坏死因子α（TNF-α）和I型干扰素（IFN-I）会在急性感染阶段抑制疟原虫的增殖。免疫记忆通常会在慢性感染阶段形成。免疫记忆细胞会在再次感染疟疾时迅速活化产生高亲和力抗体防止感染。Toll样受体（TLRs）作为模式识别受体（PRR）之一,参与了免疫系统对疟原虫的识别过程,并且在调节宿主体内Th1和Th2细胞反应之间的平衡中发挥关键作用。迄今为止,已鉴定出13种TLRs,其中10种TLRs在人体细胞中发挥生物学功能,目前已明确TLR2、TLR4、TLR7和TLR9参与疟原虫识别及诱导抗疟疾免疫反应过程。这些TLRs的配体均为高度保守分子,细胞膜成分糖基磷脂酰肌醇（GPI）可被TLR2识别,TLR4介导脂多糖（LPS）的识别,TLR7识别纤溶酶体衍生的RNA分子,而TLR9介导病原体内DNA中CpG序列的识别。尽管TLRs既可以介导机体固有免疫反应,也促进了适应性免疫应答,但TLRs活性改变对疟疾保护性免疫反应调节,以及在疟疾感染期间如何影响免疫记忆的建立和维持仍然知之甚少。本课题研究的目的在于明确TLRs活性改变对免疫系统激活和持久性免疫记忆建立的影响。研究方法:1、TLRs活性干预和疟原虫感染。夏氏疟原虫（P.chabaudi）感染前24小时,每只TLRs处理组中BALB/c小鼠腹腔内注射TLRs激动剂或抑制剂。对于TLR2、TLR4和TLR7处理组,每只小鼠腹腔内注射激动剂或抑制剂剂量分别为TLR2组10μg,TLR4组15μg,TLR7组1mg。作为对照组,注射相同体积的PBS。对于TLR9处理组,每只小鼠腹腔内注射TLR9激动剂或抑制剂50μg。作为对照组,注射等体积的对照DNA片段。各实验组中,取5只小鼠进行腹腔感染106个P.chabaudi感染的红细胞（pRBCs）构建初次感染小鼠模型。在初次感染后第40天,当小鼠从最初的感染中恢复后再次感染106个pRBCs,构建再次感染鼠疟模型。初次感染和再次感染后,每2天检测一次红细胞感染率。2、血清IgG亚型浓度检测。在初次感染和再次感染后,检测感染小鼠的血清中IgG1和IgG2a水平。每组取5只小鼠实施安乐死,并根据酶联免疫吸附测定 （ELISA）试剂盒操作说明收集血清用于IgG1和IgG2a测定,并通过OD450的差异表示其浓度的差异。3、细胞因子的测定。初次感染后,使用ELISA和实时定量PCR检测感染小鼠脾细胞中IFN-γ、TNF-α、TGF-β和IL-10的表达水平。每组取5只小鼠实施安乐死并进行脾细胞培养。培养48小时后,收集培养细胞沉淀与上清液,并根据实时定量PCR操作说明和ELISA试剂盒说明书检测各细胞因子表达水平。通过标准曲线计算细胞因子浓度。4、流式细胞分析。初次感染和再次感染后,对小鼠脾细胞进行流式细胞分析检测。每组中取3只小鼠解剖进行脾细胞流式细胞术检测。根据抗体染色说明对实验中使用的所有抗体进行染色。实验中各细胞染色标记如下:TLR2+CD11c+MHCII+（TLR2激活的DCs细胞）、TLR4+CD11c+MHCII+（TLR4激活的DCs细胞）、TLR7+CD11+MHCII+（TLR7激活的DCs细胞）、TLR9+CD11c+MHCII+（TLR9激活的DCs细胞）、CD3+CD4+IFN-γ+（Th1细胞）、CD3+CD4+IL-4+（Th2细胞）、CD4+CD25+Foxp3+（Tregs细胞）、CD4+IFN-γ+PD-1+（表达PD1的Th1细胞）、CD4+IL-4+PD-1+（表达PD1的Th2细胞）、B220+IgG1+（IgG1类别转换B细胞）、B220+IgG2a+（IgG2a类别转换B细胞）、CD138+B220+IgG1+（IgG1类别转换浆细胞）、CD138+B220+IgG2a+（IgG2a类别转换浆细胞）、CD4+CD44+CD62L+（Tcm细胞）、CD4+CD44+CD62L-（Tem细胞）和CD4+PD-1+CXCR5+（Tfh细胞）。5、统计分析。所有试验数据以平均值±平均值的标准误（SEM）表示。使用t检验或方差分析进行显着性分析（SPSS 17.0）,当P<0.05时,认为数据间具有显着性差异。结果:1、TLR4、TLR7和TLR9激活可减轻P.chabaudi感染小鼠的疟原虫血症。所有感染小鼠,感染率在初次感染后开始上升,并在第6至9天达到高峰,然后下降。到第30天,几乎所有受感染的小鼠均从最初的感染中恢复,并且在感染40天内没有小鼠死亡。TLR4、TLR7和TLR9激活可有效降低初次感染小鼠的感染率。再次感染过程中,所有小鼠感染率均低于初始感染。再次感染后 10天左右,感染率达到高峰。用TLR7和TLR9激动剂进行处理后,再次感染期间的小鼠感染率较对照组明显降低。2、TLR4、TLR7和TLR9激活可在初次感染期间有效激活DCs细胞。与对照组相比,TLR4、TLR7和TLR9激动剂组中DCs细胞表面TLRs的表达量显着升高。与未感染小鼠相比,DCs细胞表面的MHC II表达显着增加。在感染后第5天,与对照组相比,TLR4、TLR7和TLR9激动剂处理组中DCs细胞表面MHC II表达显着升高。3、TLR4、TLR7和TLR9激活可在初次感染期间刺激Th1细胞活化。在初次感染后第0、5、10和15天,检测小鼠脾脏中Th1细胞所占脾细胞的百分比。与未感染小鼠相比,所有感染小鼠脾脏中Th1细胞显着扩增。与对照组相比,在TLR4、TLR7和TLR9激动剂处理组中,Th1细胞所占的百分比显着升高。4、TLR4、TLR7和TLR9激活在初次感染过程中促进IFN-γ和TNF-α的表达。初次感染后,检测脾细胞中的IFN-γ和TNF-α表达水平。感染后IFN-γ和TNF-α表达显着上升。在感染后第3天至第5天,经TLR4、TLR7和TLR9激动剂处理的小鼠,IFN-γ和TNF-α的产生较相应对照组显着增加。5、TLR4、TLR7和TLR9激活可在初次感染期间刺激Th2细胞活化。初次感染后,检测小鼠脾脏中Th2细胞所占脾细胞的百分比。与未感染小鼠相比,所有感染小鼠脾脏中Th2细胞显着扩增。与对照组相比,TLR4、TLR7和TLR9激动剂处理组的小鼠,Th2细胞所占的百分比显着升高。6、TLR4、TLR7和TLR9激活抑制Tregs细胞扩增,并减少TGF-β和IL-10分泌。Tregs细胞在感染小鼠脾细胞中所占比例显着增加。感染小鼠脾脏中抑制性细胞因子IL-10和TGF-β的表达水平也出现了相似的升高趋势。与对照组相比,TLR4、TLR7和TLR9激动剂处理组小鼠,脾脏中Treg细胞所占脾细胞百分比显着降低,IL-10和TGF-β的表达水平也显着降低。7、TLR4、TLR7和TLR9激活可下调Th1细胞和Th2细胞表面PD-1的表达。初次感染后,分析Th1细胞和Th2细胞表面PD-1的表达水平。P.chabaudi感染后,所有小鼠体内Th1细胞和Th2细胞表面PD-1的表达均显着增加。与对照组相比,TLR4、TLR7和TLR9激动剂处理组小鼠脾脏中表达PD-1的Th1细胞和Th2细胞显着减少。8、TLR7和TLR9激活有效地增加初次感染和再感染过程中小鼠血清中IgG1和IgG2a含量。在初次感染和再次感染后,所有感染小鼠血清中IgG1和IgG2a的浓度均显着升高,尤其以IgG1升高明显。在TLR7和TLR9激动剂处理组中,血清IgG1的浓度显着高于对照组。TLR9激动剂处理组小鼠的血清中,IgG2a的浓度也显着增加。9、TLR7和TLR9激活促进记忆性B细胞向IgG1或IgG2a的类别转化。与未感染小鼠相比,感染后小鼠脾脏中记忆性B细胞显着扩增。与对照组相比,TLR7激动剂处理后,可促进记忆性B细胞向IgG1的类别转化,但发生IgG2a类别转化的记忆性B细胞无显着性差异。在TLR9激动剂处理组中,发生gG1和IgG2a类别转化的记忆性B细胞显着增加。10、TLR7和TLR9激活可促进浆细胞分泌IgG1和IgG2a。初次感染和再次感染后,所有小鼠脾脏中分泌IgG1或IgG2a的浆细胞数量均显着增加。与脾脏中记忆性B细胞的结果相似,用TLR7和TLR9激动剂进行处理后,可以促进浆细胞发生IgG1或IgG2a类别转化。11、TLR7和TLR9激活可有效促进Tcm细胞和Tem细胞扩增。与未感染小鼠相比,所有小鼠感染后脾脏内记忆性T细胞均显着扩增。与相应对照组相比,TLR7和TLR9激动剂处理组的小鼠脾脏中Tcm细胞和Tem细胞所占CD4+T细胞的百分比显着升高。12、TLR7和TLR9激活可有效刺激Tfh细胞活化。与未感染小鼠相比,感染后小鼠脾脏中的Tfh细胞所占CD4+T细胞的百分比显着增加。与相应对照组相比,抑制剂处理组的实验结果相反。结论:1、TLR4、TLR7和TLR9激活可减轻P.chabaudi感染小鼠的疟原虫血症。2、TLR4、TLR7和TLR9激活可在初始感染阶段有效激活DCs细胞。3、TLR4、TLR7和TLR9激活可在初始感染期间促进Th1和Th2细胞增殖分化。4、TLR4、TLR7和TLR9激活抑制Tregs细胞扩增,并减少TGF-β和IL-10表达。5、TLR7和TLR9的激活有效地提高初次感染和再感染阶段血清中IgG1和IgG2a的含量。6、TLR7和TLR9激活有效促进Tcm、Tem和Tfh细胞扩增。
夏静[8]（2019）在《丙型肝炎（HCV）广谱中和抗体表位分析和作用机制研究》文中指出丙型肝炎（HCV）感染是一个全球性健康问题,全球范围共有7100万人感染了HCV。80%的患者急性感染后转化为潜伏感染,随着时间的推移,逐渐转变为肝硬化和肝癌。目前,HCV是唯一一种疫苗尚未商业化的肝炎病毒,尽管目前高效的直接抗病毒在HCV治疗方面取得了重要的进展,小分子药疗法会因出现耐药株（RAV）而治疗失败,并且直接抗病毒药物因其昂贵的售价,使得发展中国家的病人对其望而却步。更重要的是,尽管治愈,再次感染依旧会发生。世界卫生组织（WHO）计划在2030年内将HCV新感染患者人数降低90%,所以,一个有效的预防性疫苗对于对抗全球HCV流行至关重要。诱导出能与病毒包膜糖蛋白结合的广谱中和抗体是HCV疫苗研究的主要目标。因此,对于自然感染患者中的广谱中和抗体研究是必不可少的。我们从一个慢性丙肝感染患者体内分离出一株能与HCV包膜糖蛋白E2结合的人源抗体,命名为8D6。这株抗体展示出广谱中和抗体活性,即能中和细胞培养产生的所有亚型的HCV病毒颗粒（HCVcc）。通过功能和表位分析,我们发现8D6可以通过靶向E2保守区域进而阻断E2和受体CD81的结合。更重要的是,8D6对直接抗病毒药物（Direct-acting antiviral reagents,DAA）耐药毒株也显示出了广谱中和活性。随后,我们对抗体序列进行分析时发现,8D6 CDRH3区域上存在一个二硫键桥基序（C-C）,并且在二硫键桥中恒定存在4个氨基酸（CX4C）,进一步研究发现,该二硫键桥一旦发生突变,抗体的广谱中和活性会大大降低,甚至丧失。并且这一基序在一类抗体之中都是保守的,说明抗体广谱中和活性的获得与二硫键桥息息相关。最后,我们重建了8D6推测的胚系（iGL）抗体基因并测试其与HCVcc的结合能力和中和活性,并从中找到了一个1b亚型的毒株PR79L9,8D6胚系抗体可以对PR79L9毒株产生很强的中和效果。这暗示了PR79L9毒株的E2序列可以作为疫苗抗原设计来诱导产生类似8D6的广谱中和抗体（bNAbs）。总之,我们发现了一个新的结合E2保守区的广谱中和抗体8D6,并且其胚系抗体可以作为一种潜在HCV疫苗株的探针。
纪伟[9]（2019）在《HCV和HBV的特异性T细胞免疫反应和分子机制研究》文中提出丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（hepatitis Cvirus,HCV）引起的一种主要经血液传播的传染病,呈世界性流行。根据世界卫生组织报告,全球丙型肝炎的流行率平均为3%,估计有1.7亿人感染丙型肝炎病毒,每年新增感染者300万-400万例,死亡25万例,占所有传染病死因的第10位。丙型肝炎已经成为困扰全球公共卫生的一个重要问题。目前,由于HCV基因的多样性以及缺乏理想的动物和细胞感染模型,HCV疫苗研究仍面临很多难题。T细胞免疫在急性HCV感染中病毒是否能自发清除起到关键作用。研究表明,在自限性HCV感染的患者或黑猩猩中发生了强烈的HCV特异性CD8+T细胞应答,但在慢性感染的宿主中观察到较弱CD8+T细胞应答。为了探究T细胞在HCV感染自然进程中的特征,及T细胞免疫与疾病进程的相关性,我们招募河北省某村因献血感染HCV的聚集性人群为研究对象,其中的HCV感染者是1970-1990年左右因献血感染,没有接受过任何治疗。我们用NS3蛋白overlapping多肽库体外刺激PBMC,通过流式分析T细胞细胞因子分泌、记忆细胞分型及抑制性分子表达等,探究T细胞免疫在HCV病毒清除组和慢性感染组的特征及差异。结果表明,病毒清除组的CD8+T和CD4+T细胞因子分泌能力显着高于慢性感染组和健康对照组。两组HCV特异性CD8+T细胞主要以效应性记忆T细胞（TEM）和效应性T细胞为主（TEMRA）,而HCV特异性CD4+T细胞主要以效应性记忆T细胞（TEM）和中心记忆T细胞（TCM）为主。在抑制性分子的表达分析中,慢性感染者病毒特异性CD8+T细胞抑制受体的表达以PD-1高、TIM-3高表达为主要特征,其与以AST或ALT水平异常和形态病理学变化为特征的肝损伤相关。有趣的是,LAG-3在慢性感染者CD8+T细胞上的表达较低,与ALT或AST呈负相关。我们对长时期的HCV感染者的病毒特异性T细胞免疫的特征进行了研究,并有助于阐明免疫应答在相关临床过程中的作用。同时,我们也对慢性感染者感染的HCV病毒进行了分子水平的研究工作。我们对其感染的HCV病毒通过分子生物学实验进行基因分型,并利用一代测序和二代测序手段获得26条全基因组序列。根据基因分型结果,这些感染者感染的是HCV1b（17）、HCV2a（9）两种基因型。对于一代测序的全基因序列,我们根据MEGA7.0的进化距离分析发现,HCV1b间及HCV2a间的序列都有很高的同源性。通过与国内外序列进行系统发育进化树分析,HCV2a的序列相对聚集,聚集在一个独立的分支上,与国外测得的NDM228等株亲缘关系相对较近。HCV1b的17条序列相对分散。对各蛋白编码区也进行了系统进化分析,结果同全基因序列的分析基本一致。通过二代测序,我们获得的信息有原始reads、拼接序列、每条序列每个位点的测序深度、entropy、mutrate等。26条序列的拼接工作已经完成,数据分析还在进行中。我们在病毒“准种”、重要的T细胞表位和中和抗体表位的免疫逃逸突变等角度进行分析,结合临床数据,探究其与肝脏损伤程度的相关性。另外,MHC分子结构在T细胞免疫研究中起了很重要的作用。MHC分子可以限制TCR对多肽的识别,而且多肽与MHC之间的构象协调作用对于TCR的识别至关重要。如果将构像改变的关键氨基酸突变,就会导致pMHC复合物与TCR的结合变弱。同一 MHC-多肽可以被不同TCR识别,MHC-多肽复合物的柔性变化也是TCR可以交叉识别的原因之一。可以看出,MHC-多肽的结合能力以及它们的构象变化影响了TCR识别。我们通过对H-2Kd-HBV peptide复合物分子结构的分析,并结合HLA-B*4001的结构解析及分析,发现两个复合物结构中都有在一个带正电的氨基酸R和负电氨基酸E构成的两种不同形式的盐桥参与MHC与多肽的结合。我们对两个氨基酸进行了单突变和双突变,通过refolding、CD检测MHC与多肽结合的稳定性,以及H-2Kdtetramer对HBV特异性CD8+T的识别,结果证明了盐桥氨基酸的突变影响了多肽与MHC分子的结合能力及多肽-MHC复合物对TCR的识别。综上所述,本研究探究了 T细胞免疫在HCV感染自然进程中的特征和T细胞免疫与肝脏损伤程度的相关性,并对感染者感染的HCV病毒全序列进行了分析。另外,我们基于H-2Kd-HBV peptide HBc87-95和 HLA-B*4001-SARS N216-225复合物结构发现了盐桥在MHC与多肽结合及MHC-多肽复合物对TCR识别的重要性。该研究工作对HCV和HBV的预防和治疗具有一定的提示性和指导性。
黄菲[10]（2018）在《创伤弧菌溶血素A在创伤弧菌感染小鼠中的免疫保护作用机制的研究》文中研究说明目的:创伤弧菌溶血素A（Vibrio vulnificus hemolysin A,VvhA）是由结构基因VvhA编码的一种外分泌蛋白,具有溶血活性和细胞毒性。VvhA蛋白抗原性强,序列保守适合体外表达。此外,VvhA蛋白免疫小鼠能够产生中和毒素的VvhA抗体。因此,VvhA蛋白适合作为创伤弧菌候选疫苗。VvhA蛋白作为候选疫苗,其免疫保护效果尚需进一步验证,而免疫保护作用机制更需要深入探讨。本研究首先表达、纯化VvhA蛋白,制备VvhA蛋白疫苗,建立了VvhA蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠模型。然后采用创伤弧菌毒力株感染小鼠模型,通过小鼠生存率、组织病理学、血清学和质谱成像检测,评价VvhA蛋白疫苗诱导免疫保护效果。最后采用流式细胞术、免疫调控、转录组基因测序等技术方法,探讨VvhA蛋白疫苗诱导免疫保护作用机制。本研究为创伤弧菌疫苗研究提供了实验依据,为寻求疫苗更强免疫保护效果提供新的实验方向。方法:1.采用IPTG诱导工程菌pET28a（+）-vvhA-Rosetta（DE3）表达重组蛋白VvhA。使用Ni2+-NTA亲和层析柱纯化蛋白。采用免疫印迹法对目的蛋白所携带的His标签进行鉴定;2.制备VvhA蛋白疫苗,建立VvhA蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠模型。3.通过腹腔注射致死剂量的创伤弧菌毒力菌株,采用血清学、病理学方法、质谱成像技术评价VvhA蛋白疫苗诱导免疫保护效果;4.采用流式细胞术检测VvhA蛋白疫苗免疫小鼠的Th细胞亚群（Th1、Th2、Th17、Th22）Tfh、GC B细胞的应答规律,初步探讨VvhA蛋白疫苗复杂的免疫保护作用机制;5.采用免疫阻断（小鼠腹腔注射IL-21中和抗体）和免疫增强（小鼠腹腔注射IL-21因子）两种手段调控IL-21水平,建立IL-21调控小鼠模型。小鼠腹腔注射致死剂量的创伤弧菌毒力株。通过组织病理学检测,评价IL-21对VvhA蛋白疫苗诱导免疫保护效果的影响;6.采用流式细胞术检测小鼠淋巴结Tfh/GC B细胞的应答变化。同时采用GCBI转录组基因测序检测IL-21调控基因的变化,探讨调控IL-21对VvhA蛋白疫苗免疫保护作用影响的免疫学机制。结果:1.IPTG诱导工程菌pET28a（+）-vvhA-Rosetta（DE3）表达大量的VvhA蛋白,然后经Ni2+-NTA亲和层析柱纯化后获得高纯度蛋白。利用紫外分光光度计检测OD260/280计算蛋白浓度为3mg/ml;制备了VvhA蛋白疫苗,建立了VvhA蛋白疫苗免疫的BALB/c小鼠模型。2.小鼠腹腔注射致死剂量的创伤弧菌毒力株,72小时内,VvhA蛋白疫苗免疫小鼠存活率达到83.3%;对照组小鼠全部死亡。组织病理学检测结果显示,VvhA蛋白疫苗免疫小鼠肝脏和肺组织几乎没有损伤;对照组小鼠肝脏组织出现肝细胞肿胀、坏死;肺组织出现肺间隔增宽,炎细胞浸润等病理改变。血清学检测结果（VvhA蛋白疫苗免疫组:ALT:40U/L,AST:139U/L;对照组:ALT:164U/L,AST:653U/L）与组织损伤结果一致;质谱成像结果显示,相对于VvhA蛋白疫苗免疫组小鼠,对照组小鼠肝脏组织中出现差异蛋白峰,且该蛋白在肝脏组织中的分布与H&E染色结果相对应。3.采用流式细胞术检测两组小鼠的脾脏和淋巴结Th/Tfh/GC B细胞应答变化,检测结果显示,相比对照组,VvhA蛋白免疫组小鼠Th1细胞、Tfh细胞和GC B细胞亚群应答明显增强。4.建立了IL-21调控小鼠模型。研究发现与IL-21因子阻断组（IL-21Ab组存活率为33.3%）相比,IL-21因子增强组能显着提高VvhA蛋白疫苗免疫小鼠的生存率,小鼠存活率达到100%。病理学检测结果表明,增强IL-21因子能显着降低创伤弧菌感染对小鼠脏器的损伤。5.采用流式细胞术检测IL-21调控小鼠淋巴结Tfh/GC B细胞的应答变化,检测结果显示,IL-21因子增强组的小鼠Tfh/GC B细胞应答显着增加。小鼠转录组基因测序结果显示,IL-21可诱导CXCR5等基因表达上调,而且这些表达上调的基因参与了趋化因子信号通路及细胞因子与细胞因子受体相互作用等信号通路。结论:1.成功制备了VvhA蛋白疫苗并建立了VvhA蛋白疫苗免疫BALB/c小鼠模型。2.VvhA蛋白作为创伤弧菌候选疫苗具有很好的免疫保护效果。3.VvhA蛋白疫苗的免疫保护作用可能与Th1/Tfh/GC B细胞应答增强有关。增强IL-21因子后小鼠生存率提高,可能是通过上调CXCR5等基因,而这些表达上调的基因参与了趋化因子及细胞因子与细胞因子受体相互作用等信号通路,从而增强VvhA蛋白疫苗的免疫保护效果。
二、HCV感染后机体保护性免疫缺陷原因探讨（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HCV感染后机体保护性免疫缺陷原因探讨（论文提纲范文）
（1）利用人源化小鼠模型研究人肺脏对于甲型流感病毒感染后的免疫应答（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 课题的假设与提出 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 甲型流感病毒的概述 |
| 2.1.1 流行病学 |
| 2.1.2 结构及致病机制 |
| 2.1.3 预防和治疗 |
| 2.2 流感病毒感染后机体的免疫应答 |
| 2.2.1 病毒如何进入宿主 |
| 2.2.2 病毒编码的几种蛋白 |
| 2.2.3 固有免疫反应 |
| 2.2.4 适应性免疫反应 |
| 2.3 人源化小鼠模型的发展和应用 |
| 2.3.1 人源化小鼠模型的发展 |
| 2.3.2 人源化小鼠模型在流感病毒研究中的应用 |
| 2.4 组织定居记忆性T细胞 |
| 2.4.1 概述 |
| 2.4.2 特征 |
| 2.4.3 发展 |
| 2.4.4 Trm与呼吸系统 |
| 第3章 人免疫系统-人肺小鼠模型的建立 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 人胚胎组织来源 |
| 3.2.3 材料及试剂 |
| 3.2.4 仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 人胚胎肺脏组织处理 |
| 3.3.2 人胚胎肝脏来源CD34~+细胞的分离 |
| 3.3.3 人胚胎胸腺组织处理 |
| 3.3.4 NCG小鼠皮下人肺组织移植模型的构建 |
| 3.3.5 HISL小鼠模型的构建 |
| 3.3.6 HISL小鼠构建后流式细胞术鉴定免疫系统重建水平 |
| 3.3.7 HISL小鼠取材检测 |
| 3.3.8 HISL小鼠各组织器官HE染色 |
| 3.3.9 流式细胞术染色方案 |
| 3.3.10 统计分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 NCG小鼠皮下人肺组织移植模型的构建 |
| 3.4.2 HISL小鼠模型构建 |
| 3.4.3 HISL小鼠免疫系统的重建水平 |
| 3.4.4 HISL小鼠建立后HL结构及其中免疫细胞的水平 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 人免疫系统-人肺小鼠流感病毒感染后的免疫应答 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 SPF鸡蛋 |
| 4.2.3 甲型流感病毒和MDCK细胞 |
| 4.2.4 材料和试剂 |
| 4.2.5 仪器 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 种蛋孵育 |
| 4.3.2 甲型流感病毒的扩增 |
| 4.3.3 甲型流感病毒血凝值的测定 |
| 4.3.4 甲型流感病毒TCID50测定 |
| 4.3.5 人免疫系统-人肺小鼠建立及鉴定 |
| 4.3.6 人免疫系统-人肺小鼠感染甲型流感病毒 |
| 4.3.7 感染甲型流感病毒后21天取材检测 |
| 4.3.8 流感病毒特异性IgM、IgG抗体ELISA检测 |
| 4.3.9 各器官组织化学染色 |
| 4.3.10 流式细胞术染色方案 |
| 4.3.11 转录组测序分析 |
| 4.3.12 统计分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 H1N1流感病毒效价及TCID50 |
| 4.4.2 HISL小鼠感染H1N1后免疫细胞的总体变化 |
| 4.4.3 HISL小鼠感染H1N1病毒后T细胞亚群的表达情况 |
| 4.4.4 HISL小鼠感染H1N1病毒后病毒特异性T细胞的产生 |
| 4.4.5 HISL小鼠感染H1N1病毒后血清特异性抗体的产生 |
| 4.4.6 HISL小鼠感染H1N1病毒后HL基因组测序分析 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 流感病毒预先接种对人免疫系统-人肺小鼠产生保护作用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 材料和试剂 |
| 5.2.3 仪器 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 甲型流感病毒的扩增及TCID50 测定 |
| 5.3.2 人源化小鼠模型建立 |
| 5.3.3 人免疫系统-人肺小鼠的建立 |
| 5.3.4 甲型流感病毒经鼻接种 |
| 5.3.5 统计分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 单次H1N1病毒接种未能给予人免疫系统-人肺小鼠良好的保护作用 |
| 5.4.2 多次H1N1病毒接种可延长致死剂量H1N1病毒经鼻接种小鼠的生存时间 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第6章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）弓形虫感染小鼠T细胞表面TIGIT分子的表达和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 免疫抑制性受体TIGIT在病原体感染中的作用机制研究 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）γδT细胞在金黄色葡萄球菌乳腺感染中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 金黄色葡萄球菌感染与免疫逃逸 |
| 1.1.1 金黄色葡萄球菌概述 |
| 1.1.2 金黄色葡萄球菌感染的发病机制 |
| 1.1.3 宿主对S.aureus的防御策略 |
| 1.1.4 金黄色葡萄球菌的免疫逃逸策略 |
| 1.2 S.aureus乳腺炎研究进展 |
| 1.2.1 乳腺发育及结构 |
| 1.2.2 乳腺的免疫应答 |
| 1.2.3 金黄色葡萄球菌乳腺炎 |
| 1.2.4 金黄色葡萄球菌乳腺炎的治疗 |
| 1.3 γδT细胞在感染性疾病中的作用 |
| 1.3.1 γδT细胞概述 |
| 1.3.2 γδT细胞亚型及分布 |
| 1.3.3 γδT细胞的抗原识别与活化 |
| 1.3.4 产IL-17的γδT细胞 |
| 1.3.5 产IFN-γ的 γδT 细胞 |
| 1.3.6 γδT细胞在感染性疾病中的功能 |
| 1.4 本课题的研究内容和意义 |
| 第二章 γδT细胞在S.aureus感染中的应答特征研究 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 菌株 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 S.aureus ATCC27543 菌株活化 |
| 2.2.2 S.aureus小鼠乳腺感染模型的建立 |
| 2.2.3 临床观察 |
| 2.2.4 乳腺内S.aureus数量检测 |
| 2.2.5 乳腺组织切片的制备与观察 |
| 2.2.6 qPCR检测乳腺内细胞因子 |
| 2.2.7 ELLISA检测炎性细胞因子变化情况 |
| 2.2.8 流式细胞术检测γδT细胞动态变化情况 |
| 2.2.9 免疫荧光检测乳腺组织中γδT细胞变化情况 |
| 2.2.10 γδT细胞表型检测 |
| 2.2.11 胞内细胞因子染色 |
| 2.2.12 统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 S.aureus小鼠乳腺感染模型的建立 |
| 2.3.2 乳腺中γδT 细胞数量在S.aureus感染早期迅速升高 |
| 2.3.3 小鼠脾脏中免疫细胞动态变化结果 |
| 2.3.4 乳腺组织中细胞因子IL-17A、IL-23及IFN-γ的表达量显着增加 |
| 2.3.5 S.aureus感染过程中γδT 细胞高表达CD44和CD69 |
| 2.3.6 乳腺中γδT细胞是IL-17A和 IFN-γ的主要来源细胞 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 γδT细胞在S.aureus感染中的功能研究 |
| 3.1 材料与设备 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 菌株 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 乳腺S.aureus定殖量检测 |
| 3.2.2 乳腺病理切片制备与观察 |
| 3.2.3 乳腺组织MPO及趋化因子KC、MIP2和IL-8 检测 |
| 3.2.4 乳腺组织嗜中性粒细胞检测 |
| 3.2.5 乳腺组织中细胞因子的检测 |
| 3.2.6 乳腺组织T淋巴细胞检测 |
| 3.2.7 统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 敲除γδT 细胞后乳腺组织中S.aureus定殖量显着增加 |
| 3.3.2 敲除γδT细胞后乳腺组织病变程度加剧 |
| 3.3.3 敲除γδT细胞后趋化因子表达量及嗜中性粒细胞数量显着减少 |
| 3.3.4 敲除γδT 细胞后乳腺组织MPO活性降低 |
| 3.3.5 敲除γδT 细胞后乳腺组织中IL-17A和 IFN-γ表达量降低 |
| 3.3.6 敲除γδT细胞后Th1型细胞数量减少 |
| 3.3.7 敲除γδT细胞对Th2型细胞数量无显着影响 |
| 3.3.8 敲除γδT细胞后Th17型细胞数量减少 |
| 3.3.9 敲除γδT细胞后Tc型细胞数量减少 |
| 3.3.10 敲除γδT 细胞后Treg细胞数量减少 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 γδT 细胞在S.aureus感染中的作用机制研究 |
| 4.1 材料与设备 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 菌株 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 Vγ1和Vγ4γδT细胞动态变化检测 |
| 4.2.2 Vγ1和Vγ4γδT细胞胞内细胞因子检测 |
| 4.2.3 小鼠乳腺内Vγ1和Vγ4γδT 细胞清除 |
| 4.2.4 Vγ1和Vγ4γδT 细胞清除后乳腺组织细菌定殖量检测 |
| 4.2.5 Vγ1和Vγ4γδT 细胞清除后乳腺组织嗜中性粒细胞检测 |
| 4.2.6 Vγ1和Vγ4γδT 细胞清除后乳腺组织细胞因子检测 |
| 4.2.7 Vγ1和Vγ4γδT 细胞清除后胞内细胞因子检测 |
| 4.2.8 IL-17A~(-/-)小鼠乳腺S.aureus数量检测 |
| 4.2.9 IL-17A~(-/-)小鼠乳腺病理切片制备与观察 |
| 4.2.10 IL-17A~(-/-)小鼠乳腺组织MPO及趋化因子KC、MIP-2和IL-8 检测 |
| 4.2.11 IL-17A~(-/-)小鼠乳腺组织嗜中性粒细胞检测 |
| 4.2.12 统计分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 S.aureus感染过程中乳腺Vγ1和Vγ4γδT细胞数量显着升高 |
| 4.3.2 乳腺Vγ1γδT 细胞主要产生IFN-γ |
| 4.3.3 乳腺Vγ4γδT细胞主要产生IL-17A |
| 4.3.4 小鼠乳腺内Vγ1和Vγ4γδT 细胞清除效果 |
| 4.3.5 Vγ1和Vγ4γδT 细胞清除后乳腺内细菌定殖量显着增加 |
| 4.3.6 Vγ1和Vγ4γδT 细胞清除后乳腺嗜中性粒细胞数量显着降低 |
| 4.3.7 Vγ1γδT 细胞清除后乳腺组织中IFN-γ表达量显着降低 |
| 4.3.8 Vγ4γδT 细胞清除后乳腺组织中IL-17A表达量显着降低 |
| 4.3.9 IL-17A基因敲除小鼠乳腺S.aureus定殖量增加 |
| 4.3.10 IL-17A基因敲除后乳腺病变程度加剧 |
| 4.3.11 IL-17A基因敲除后乳腺趋化因子表达量及嗜中性粒细胞数量显着降低 |
| 4.3.12 IL-17A基因敲除后乳腺组织MPO活性降低 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 创新点及展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文目录 |
（4）组织驻留记忆T细胞在结核病人组织中的表达特征和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 结核病人不同组织TRM细胞的表达水平 |
| 引言 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 实验结果 |
| 1.3 小结 |
| 第二章 结核病人不同组织中TRM细胞的表型 |
| 引言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 小结 |
| 第三章 结核病人不同组织中TRM细胞的基因表达 |
| 引言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 小结 |
| 第四章 结核病人TRM细胞分泌细胞因子的能力 |
| 引言 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.3 小结 |
| 第五章 结核病人TRM细胞对巨噬细胞功能的影响及其机制 |
| 引言 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.3 小结 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录一:英文缩略词表 |
| 附录二:在读研究生期间科研情况 |
| 致谢 |
（5）弓形虫、疟原虫感染小鼠免疫细胞表面TIM-3分子的差异表达及生物学效应研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 疟原虫感染引起的免疫反应 |
| 1.1.1 肝内期的免疫应答 |
| 1.1.2 红内期的免疫应答 |
| 1.1.3 总结与展望 |
| 1.2 弓形虫感染引起的免疫反应 |
| 1.2.1 弓形虫感染过程中T细胞介导的免疫应答 |
| 1.2.2 弓形虫感染过程中NK细胞介导的免疫应答 |
| 1.2.3 弓形虫感染过程中巨噬细胞介导的免疫应答 |
| 1.2.4 弓形虫感染过程中嗜中性粒细胞介导的免疫应答反应 |
| 1.2.5 弓形虫感染过程中调节性细胞因子介导的免疫应答 |
| 1.2.6 总结与展望 |
| 1.3 TIM-3及其免疫调节作用 |
| 1.3.1 TIM-3的结构 |
| 1.3.2 TIM-3与其配体 |
| 1.3.3 TIM-3对CD4 T细胞反应的调节 |
| 1.3.4 TIM-3对CD8 T细胞反应的调节 |
| 1.3.5 阻断TIM-3的相关免疫治疗研究 |
| 1.3.6 总结与展望 |
| 第二章 感染不同毒力疟原虫的小鼠免疫细胞TIM-3的表达及血清中细胞因子水平的变化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物与虫株 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 流式抗体 |
| 2.1.4 实验耗材 |
| 2.1.5 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验目的及实验设计 |
| 2.2.2 主要实验试剂及溶液的配置 |
| 2.2.3 三种伯氏疟原虫(伯氏疟原虫ANKA株、NK65 株和Tat D-like DNase敲除株)的传代和培养 |
| 2.2.4 伯氏疟原虫感染模型的建立 |
| 2.2.5 小鼠脾脏及外周血免疫细胞中的TIM-3的表达水平检测 |
| 2.2.6 小鼠血清中细胞因子水平的检测 |
| 2.2.7 统计与分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 感染疟原虫后小鼠尾尖血吉姆萨染色结果 |
| 2.3.2 感染疟原虫小鼠脏器的形态学观察及脾指数 |
| 2.3.3 感染疟原虫小鼠脾脏以及外周血中各类免疫细胞的分布变化 |
| 2.3.4 感染疟原虫小鼠外周血主要淋巴细胞亚群及其表面TIM-3表达的变化 |
| 2.3.5 感染疟原虫小鼠脾脏主要淋巴细胞亚群及其表面TIM-3表达的变化 |
| 2.3.6 感染疟原虫小鼠血清中细胞因子的变化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 阻断感染伯氏疟原虫小鼠免疫细胞TIM-3/Galectin9 信号通路的生物学效应研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物与虫株 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 流式抗体 |
| 3.1.4 实验耗材 |
| 3.1.5 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 实验设计 |
| 3.2.2 伯氏疟原虫ANKA株的传代和培养 |
| 3.2.3 小鼠外周血免疫细胞的凋亡情况分析 |
| 3.2.4 抗TIM-3抗体对小鼠淋巴细胞增殖及凋亡的影响 |
| 3.2.5 α-乳糖阻断的生物学效应 |
| 3.2.6 统计与分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 小鼠外周血免疫细胞的凋亡情况 |
| 3.3.2 抗TIM-3抗体对小鼠淋巴细胞的增殖的影响 |
| 3.3.3 抗TIM-3抗体对小鼠淋巴细胞的凋亡的影响 |
| 3.3.4 α-乳糖的保护效果 |
| 3.3.5 α-乳糖对感染伯氏疟原虫小鼠脾脏和肺脏组织病理变化的影响 |
| 3.3.6 α-乳糖对感染伯氏疟原虫小鼠外周血CD226及TIGIT表达的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 TIM-3在感染不同毒力弓形虫小鼠免疫细胞中的表达及生物学效应研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物与虫株 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 流式抗体 |
| 4.1.4 实验耗材 |
| 4.1.5 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 实验背景及设计 |
| 4.2.2 主要实验试剂及溶液的配置 |
| 4.2.3 两种不同毒力弓形虫(ME49株和RH株)的传代、培养及纯化 |
| 4.2.4 弓形虫感染模型的建立 |
| 4.2.5 小鼠脾脏及外周血免疫细胞TIM-3表达水平的检测 |
| 4.2.6 小鼠血清中细胞因子水平的检测 |
| 4.2.7 α-乳糖阻断的生物学效应研究 |
| 4.2.8 统计与分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 感染弓形虫小鼠脏器的形态学观察及脾指数结果 |
| 4.3.2 感染弓形虫小鼠外周血主要淋巴细胞亚群及其表面TIM-3表达的变化 |
| 4.3.3 感染弓形虫小鼠脾脏主要淋巴细胞亚群及其表面TIM-3表达的变化 |
| 4.3.4 感染弓形虫小鼠血清中细胞因子的变化 |
| 4.3.5 感染弓形虫小鼠外周血免疫细胞凋亡情况分析 |
| 4.3.6 α-乳糖对感染弓形虫小鼠的保护作用分析 |
| 4.3.7 α-乳糖对感染伯氏疟原虫小鼠脾脏和肺脏的影响 |
| 4.3.8 外周血TIGIT的表达情况分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 TIM-3 的配体CEACAM1 在感染疟原虫及弓形虫小鼠免疫细胞中的表达研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物与虫株 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 流式抗体 |
| 5.1.4 实验耗材 |
| 5.1.5 实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 主要实验试剂及溶液的配置 |
| 5.2.2 弓形虫RH株和伯氏疟原虫ANKA株的传代、培养及纯化 |
| 5.2.3 弓形虫/疟原虫感染模型的建立 |
| 5.2.4 小鼠免疫细胞CEACAM1 的表达水平检测 |
| 5.2.5 统计与分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 感染弓形虫/疟原虫后小鼠外周血免疫细胞CEACAM1 的表达水平 |
| 5.3.2 感染弓形虫/疟原虫后小鼠脾脏免疫细胞CEACAM1 的表达水平 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 研究结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（6）PD-1/PD-L1通路在伯氏疟原虫感染BALB/c小鼠中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:PD-1在疟疾初次感染中的作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 疟原虫 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 单克隆抗体 |
| 2.1.5 胞内染色试剂盒 |
| 2.1.6 合成引物序列 |
| 2.1.7 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验动物及其模型构建 |
| 2.2.2 计数红细胞感染率以及生存率 |
| 2.2.3 制备脾细胞悬液 |
| 2.2.4 血清分离 |
| 2.2.5 荧光抗体染色及流式细胞仪分析 |
| 2.2.6 Real-Time PCR检测mRNA水平 |
| 2.2.7 细胞因子及血清抗体的检测 |
| 2.2.8 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 使用抗PD-1 单克隆抗体阻断BALB/c小鼠PD-1 |
| 3.2 PD-1抗体阻断对原虫血症水平及生存率的影响 |
| 3.3 PD-1单抗阻断前后固有免疫应答差异分析 |
| 3.4 PD-1阻断对疟原虫感染小鼠细胞免疫的影响 |
| 3.5 PD-1阻断对感染疟原虫的小鼠免疫记忆的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:PD-1在疟疾再感染中的作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 疟原虫 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 单克隆抗体 |
| 2.1.5 胞内染色试剂盒 |
| 2.1.6 合成引物序列 |
| 2.1.7 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验动物及其模型构建 |
| 2.2.2 计数红细胞感染率以及生存率 |
| 2.2.3 制备脾细胞悬液 |
| 2.2.4 血清分离 |
| 2.2.5 荧光抗体染色及流式细胞仪分析 |
| 2.2.6 Real-Time PCR检测RNA水平 |
| 2.2.7 细胞因子及血清抗体的检测 |
| 2.2.8 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 使用抗PD-1 单克隆抗体阻断BALB/c小鼠PD-1 |
| 3.2 PD-1 阻断对Pb ANKA再感染的BALB/c小鼠原虫血症水平及生存率的影响 |
| 3.3 PD-1 阻断前后对Pb ANKA再感染的BALB/c小鼠固有免疫的影响 |
| 3.4 PD-1 阻断后对Pb ANKA再感染的BALB/c小鼠细胞免疫的影响 |
| 3.5 PD-1 阻断对Pb ANKA再感染的BALB/c小鼠免疫记忆的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）TLR2、TLR4、TLR7、TLR9在夏氏疟原虫感染BALB/c小鼠过程中对细胞免疫，体液免疫及免疫记忆形成的生物学作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 论文序言 |
| 第一部分 :Toll样受体(TLR)激动剂及抑制剂对夏氏疟原虫(P.chabaudi)急性感染期的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 仪器与试剂 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小鼠与疟原虫 |
| 2.2.2 TLRs激动剂或抑制剂的处理及夏氏疟原虫感染 |
| 2.2.3 感染率检测 |
| 2.2.4 血清IgG1和IgG2a检测 |
| 2.2.5 RNA提取和实时定量PCR |
| 2.2.6 细胞因子检测 |
| 2.2.7 流式细胞检测 |
| 2.2.8 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 TLR4、TLR7和TLR9 激活缓解P.chabaudi感染的BALB/c小鼠的疟原虫血症 |
| 3.2 TLR4、TLR7和TLR9 活化可有效激活DCs |
| 3.3 TLR4、TLR7和TLR9 激活可以刺激Th1 细胞活化 |
| 3.4 TLR4、TLR7和TLR9 激活促进促炎性细胞因子IFN-γ和TNF-α的表达 |
| 3.5 TLR4、TLR7和TLR9 激活可以促进Th2 细胞分化与激活 |
| 3.6 TLR7和TLR9 激动可有效增加感染小鼠血清中IgG1和IgG2a的含量 |
| 3.7 TLR4、TLR7和TLR9 激活阻断Treg的扩增,并减少TGF-β和IL-10 的产生 |
| 3.8 TLR4、TLR7和TLR9 激活可以延缓小鼠体内Th1和Th2 细胞的耗竭 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 :TLR7和TLR9 激活有助于增强BALB/c小鼠再次感染夏氏疟原虫的免疫保护作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 仪器与试剂 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.1.1 小鼠与疟原虫 |
| 2.1.2 TLRs激动剂或抑制剂的处理及夏氏疟原虫感染 |
| 2.1.3 感染率检测 |
| 2.1.4 血清IgG1和IgG2a检测 |
| 2.1.5 流式细胞检测 |
| 2.1.6 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 TLR7和TLR9 激活可缓解BALB/c小鼠初次感染和再次感染P.chabaudi的疟原虫血症 |
| 3.2 TLR7和TLR9 激活可有效增加感染小鼠血清中IgG1和IgG2a的含量 |
| 3.3 TLR7和TLR9 激活可有效促进发生IgG1或IgG2a类别转换的记忆性B细胞增殖 |
| 3.4 TLR7和TLR9 激活可有效促进分泌IgG1或IgG2a的浆细胞增殖 |
| 3.5 TLR7和TLR9 激活可有效促进感染小鼠脾脏中Tcm细胞和Tem细胞增殖 |
| 3.6 TLR7和TLR9 激活可有效促进感染小鼠脾脏中Tfh细胞增殖 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（8）丙型肝炎（HCV）广谱中和抗体表位分析和作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 HCV流行病学 |
| 1.2 HCV基因组分子生物学特征 |
| 1.3 HCV研究模型 |
| 1.3.1 细胞培养模型 |
| 1.3.2 动物模型 |
| 1.4 HCV生命周期 |
| 1.5 HCV预防和治疗手段 |
| 1.5.1 HCV的 DAA治疗 |
| 1.5.2 HCV的抗体治疗和预防 |
| 1.6 HCV广谱中和抗体诱导对疫苗设计的启示 |
| 1.6.1 E1/E2 包膜糖蛋白诱导产生广谱中和抗体 |
| 1.6.2 HCV胚系抗体对疫苗设计的启示 |
| 1.7 8D6 筛选过程及表位分析、功能鉴定 |
| 1.8 课题设计思路 |
| 1.9 总结与展望 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 HCVcc病毒 |
| 2.1.3 抗体及蛋白 |
| 2.1.4 病人血清样本 |
| 2.1.5 试剂 |
| 2.1.6 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 HCVpp中和实验 |
| 2.2.2 HCV E2 分选探针制备 |
| 2.2.3 抗体表达 |
| 2.2.4 Protein-G亲和层析纯化抗体 |
| 2.2.5 胚系抗体设计及改造 |
| 2.2.6 OCTET RED96 仪器检测抗原抗体亲和力 |
| 2.2.7 8D6 Fab制备 |
| 2.2.8 小角度X射线散射(SAXS) |
| 2.2.9 Docking |
| 2.2.10 HCVcc制备 |
| 2.2.11 HCV RNA电转 |
| 2.2.12 HCV耐药株构建 |
| 2.2.13 微中和实验 |
| 2.2.14 免疫荧光 |
| 2.2.15 HCV E2 截短突变体及丙氨酸扫描突变体构建 |
| 2.2.16 Lipo3000 脂质体DNA转染 |
| 2.2.17 酶联免疫吸附实验 |
| 2.2.18 8D6 表位保守性序列分析 |
| 2.2.19 数据分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 HCV广谱中和抗体8D6 的分离和初步评价 |
| 3.2 8D6 与纯化的重组Con1(1b亚型)E2 蛋白具有高亲和力 |
| 3.3 8D6 对不同基因型HCV病毒E2 蛋白具有广谱结合活性 |
| 3.4 8D6 对不同基因型HCVcc病毒具有广谱结合活性 |
| 3.5 8D6 对不同基因型HCV病毒E2 蛋白具有广谱中和活性 |
| 3.6 8D6 可以中和DAA药物耐药毒株 |
| 3.7 8D6 通过阻断E2与CD81 的结合来阻断病毒入侵 |
| 3.8 8D6 是构象表位抗体并且识别保守的E2 表位 |
| 3.9 8D6 识别E2 的具体表位探究 |
| 3.10 E2 N448 去糖基化对8D6 识别的影响 |
| 3.11 8D6 Fab-E2 小角散射(SAXS)模型 |
| 3.12 重组E2(1b/Con1)与8D6 Fab复合物模型 |
| 3.13 8D6 通过体细胞超频突变获得广谱中和活性 |
| 3.14 8D6在CDRH3 上存在一个对抗体广谱活性获得重要的CX_4C基序 |
| 3.15 通过8D6 胚系抗体筛选疫苗合适的HCV免疫原 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 缩略词表(中英文对照) |
| 附录二 抗体序列 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
（9）HCV和HBV的特异性T细胞免疫反应和分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 ABSTRACT 第一部分 研究内容 |
| 第一章 聚集性献血导致的HCV感染的T细胞免疫研究 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.2.1 主要实验仪器 |
| 1.2.2 主要实验试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 研究对象 |
| 1.3.2 血样的采集与处理 |
| 1.3.3 抗HCV抗体的定性检测 |
| 1.3.4 临床信息的获得 |
| 1.3.5 HCV基因分型 |
| 1.3.6 HCV RNA足量 |
| 1.3.7 HCV多肽库的设计与合成 |
| 1.3.8 HCV特异性T细胞的刺激及流式分析 |
| 1.3.9 统计分析 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 研究对象的人口学特征 |
| 1.4.2 研究对象的临床特征 |
| 1.4.3 HCV慢性感染者的病毒特征 |
| 1.4.4 HCV病毒清除组与HCV慢性感染组有持续的CD8~+T细胞及CD4~+T细胞应答 |
| 1.4.5 多因子分泌 |
| 1.4.6 HCV特异性T细胞的表型特征 |
| 1.4.7 免疫抑制分子的表达特点 |
| 1.4.8 T细胞免疫与肝功能 |
| 1.5 小结与讨论 |
| 第二章 聚集性献血感染HCV的分子生物学研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 主要的试剂及耗材 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 HCV RNA提取 |
| 2.3.2 RNA反转录 |
| 2.3.3 全序列引物设计及测序 |
| 2.3.4 序列组装及分析 |
| 2.3.5 二代测序 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 HCV病毒基因组的各片段反转录PCR结果 |
| 2.4.2 HCV病毒5'/3' RACE扩增结果 |
| 2.4.3 全基因序列拼接 |
| 2.4.4 序列同源性分析及进化分析 |
| 2.4.5 二代测序 |
| 2.5 小结与讨论 |
| 第三章 盐桥在HBV特异性多肽呈递和T细胞识别中的作用机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验主要仪器 |
| 3.2.2 主要实验耗材及商品试剂 |
| 3.2.3 实验试剂及其配方 |
| 3.2.4 实验动物、菌株、载体 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 实验所用的多肽合成和载体构建 |
| 3.3.2 H-2K~d-HBV多肽免疫小鼠及脾细胞的获得 |
| 3.3.3 ELISPOT实验 |
| 3.3.4 H-2K~d和HLA-B~*4001分子的表达与纯化 |
| 3.3.5 HLA-B*4001-peptide(GETALALLLL)的结晶条件的筛选 |
| 3.3.6 HLA-B*4001 Χ-射线衍射及结构解析 |
| 3.3.7 圆二色谱实验检测H-2K~d-HBVpeptide的热稳定性 |
| 3.3.8 H-2K~d-HBV peptide四聚体的制备及流式染色 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 H-2K~d分子和HLA-B~*4001-分子的蛋白纯化 |
| 3.4.2 探究H-2K~d/HLA-B~*4001野生型/突变体与多肽的结合能力 |
| 3.4.3 探究H-2-K~d野生型及突变体结合多肽识别TCR |
| 3.4.4 H-2K~d和HLA-B~*4001形成的两种不同的盐桥 |
| 3.4.5 盐桥对MHCI和结合肽的结构构象的影响 |
| 3.4.6 潜在盐桥广泛存在不同脊椎动物中 |
| 3.5 讨论 第二部分 文献综述 |
| 第四章 HCV病毒及细胞免疫概述 |
| 4.1 HCV病毒的流行病学及临床 |
| 4.1.1 HCV的流行 |
| 4.1.2 HCV的临床表现 |
| 4.1.3 HCV病毒的检测和实验室诊断 |
| 4.1.4 HCV的防控及治疗 |
| 4.2 HCV病毒的基本特征 |
| 4.2.1 HCV病毒的形态特征 |
| 4.2.2 HCV病毒的基因组成及全基因组测序 |
| 4.2.3 HCV病毒的生活周期 |
| 4.2.4 HCV病毒的传播及变异 |
| 4.3 HCV病毒感染的免疫反应特征 |
| 4.3.1 血清学反应 |
| 4.3.2 T细胞免疫 |
| 第五章 MHC分子结构免疫学概述 |
| 5.1 MHC的概念 |
| 5.2 MHC的抗原呈递及T细胞识别 |
| 5.2.1 MHCⅠ类途径 |
| 5.2.2 MHCⅡ类途径 |
| 5.2.3 外源抗原的MHCⅠ类途径交叉呈递 |
| 5.3 MHC及相关分子的结构特征 |
| 5.3.1 MHCⅠ类分子的结构特征 |
| 5.3.2 MHCⅡ类分子的结构 |
| 5.3.3 非经典的MHCⅠ类分子结构 |
| 5.4 MHC分子结构在T细胞免疫研究中的应用 |
| 5.4.1 MHC结构研究对于MHC分子分类的影响-HLA超级型及其意义 |
| 5.4.2 MHC分子对TCR识别的限制性 |
| 5.4.3 MHC交叉呈递和TCR交叉识别的结构基础 全文总结 参考文献 附录1 缩略表 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文 致谢 |
（10）创伤弧菌溶血素A在创伤弧菌感染小鼠中的免疫保护作用机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 创伤弧菌溶血素A(VvhA)蛋白疫苗的制备 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 VvhA蛋白的诱导表达 |
| 2.2 重组VvhA蛋白的大量表达和纯化 |
| 2.3 纯化重组VvhA蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 2.4 纯化重组VvhA蛋白的免疫印迹分析 |
| 2.5 重组VvhA蛋白疫苗的制备 |
| 结果 |
| 1 重组VvhA蛋白的表达及鉴定 |
| 2 重组VvhA蛋白的纯化 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 创伤弧菌溶血素A蛋白疫苗诱导免疫保护效果的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器设备 |
| 1.2 主要溶液配制 |
| 1.3 菌株和实验动物 |
| 2 方法 |
| 2.1 建立重组VvhA蛋白疫苗免疫小鼠模型 |
| 2.2 创伤弧菌毒力株感染小鼠 |
| 2.3 小鼠生存率检测 |
| 2.4 肝功能血清学检测 |
| 2.5 肝脏和肺组织病理学检测 |
| 2.6 肝脏组织质谱成像 |
| 结果 |
| 1 创伤弧菌感染小鼠生存率变化 |
| 2 小鼠肝脏和肺的组织病理学变化 |
| 3 血清肝功能指标变化 |
| 4 肝脏组织质谱成像分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第三部分 创伤弧菌溶血素A蛋白疫苗免疫保护作用机制的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器设备 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 VvhA蛋白疫苗免疫小鼠后淋巴结和脾脏Th/Tfh/GCB细胞的应答变化 |
| 2.2 IL-21 调控小鼠模型的建立 |
| 2.3 创伤弧菌毒力株感染小鼠 |
| 2.4 小鼠生存率检测 |
| 2.5 肝脏和肺组织病理学检测 |
| 2.6 IL-21 调控小鼠淋巴结Tfh/GC B细胞的应答变化 |
| 2.7 IL-21 调控小鼠转录组测序 |
| 结果 |
| 1 VvhA蛋白疫苗免疫小鼠后脾脏和淋巴结Th/Tfh/GCB细胞的应答变化 |
| 2 IL-21 调控小鼠在创伤弧菌感染后生存率改变 |
| 3 IL-21 调控小鼠的肝脏和肺组织病理学变化 |
| 4 小鼠淋巴结 Tfh/GC B 细胞的含量变化 |
| 5 IL-21 调控基因的表达情况及参与的功能信号通路 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表文章 |
四、HCV感染后机体保护性免疫缺陷原因探讨（论文参考文献）
- [1]利用人源化小鼠模型研究人肺脏对于甲型流感病毒感染后的免疫应答[D]. 王亦心. 吉林大学, 2021(01)
- [2]弓形虫感染小鼠T细胞表面TIGIT分子的表达和功能研究[D]. 李浩然. 新乡医学院, 2021(01)
- [3]γδT细胞在金黄色葡萄球菌乳腺感染中的作用及机制研究[D]. 修磊. 内蒙古大学, 2020(01)
- [4]组织驻留记忆T细胞在结核病人组织中的表达特征和功能研究[D]. 杨倩婷. 南方医科大学, 2020
- [5]弓形虫、疟原虫感染小鼠免疫细胞表面TIM-3分子的差异表达及生物学效应研究[D]. 张义伟. 沈阳农业大学, 2020(03)
- [6]PD-1/PD-L1通路在伯氏疟原虫感染BALB/c小鼠中的作用研究[D]. 潘艳艳. 中国医科大学, 2020(01)
- [7]TLR2、TLR4、TLR7、TLR9在夏氏疟原虫感染BALB/c小鼠过程中对细胞免疫，体液免疫及免疫记忆形成的生物学作用[D]. 高文燕. 中国医科大学, 2020(01)
- [8]丙型肝炎（HCV）广谱中和抗体表位分析和作用机制研究[D]. 夏静. 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所), 2019(07)
- [9]HCV和HBV的特异性T细胞免疫反应和分子机制研究[D]. 纪伟. 中国疾病预防控制中心, 2019(12)
- [10]创伤弧菌溶血素A在创伤弧菌感染小鼠中的免疫保护作用机制的研究[D]. 黄菲. 泰山医学院, 2018(06)