一、EGFR定量与乳腺癌生物学特征关系的探讨（论文文献综述）
赵倩[1]（2021）在《转录因子AP-1与三阴型乳腺癌的关系及其抑制剂T5224对三阴型乳腺癌细胞的作用研究》文中进行了进一步梳理三阴型乳腺癌（Triple Negative Breast Cancer,TNBC）是缺乏雌激素受体（Estrogen Receptor,ER）、孕激素受体（Progesterone Receptor,PR）和人表皮生长因子受体2（Human Epidermal Growth Factor Receptor 2,HER2）表达的一类乳腺癌（Breast Cancer,BC）,占全部BC患者的12–17%。与其他BC亚型相比,TNBC患者肿瘤体积更大,组织学分级更高,侵袭能力更强。然而由于其缺乏ER、PR、HER2靶向受体的表达,临床治疗以化疗为主,预后在所有BC患者中最差。本课题组的前期研究发现转录因子AP-1（Activator Protein 1）家族成员Fra-1在TNBC患者中高表达,与肿瘤的高侵袭性和患者的无远处转移生存密切相关。且沉默TNBC细胞内高表达的AP-1家族成员Fra-1或c-Jun后TNBC细胞的增殖和侵袭能力被抑制。AP-1抑制剂T5224,特异地抑制AP-1（c-Fos/cJun）与DNA的结合活性,在关节炎治疗方面进入Ⅱ期临床试验,但在BC治疗中的运用尚不明确。目的:本研究采用特异的AP-1抑制剂T5224作用于TNBC细胞,在抑制剂的角度,从生物信息层面、细胞层面和分子层面进一步明确AP-1是否是TNBC患者的治疗靶点,并明确T5224是否具有抗肿瘤作用及其可能的作用机制,为TNBC患者的治疗提供理论依据。方法:使用Kaplan-Meier plotter和UCSC数据库明确转录因子AP-1家族成员Fra-1在不同PAM50分型BC患者中的表达水平及其与BC患者生存的关系。RT-qPCR及Western-blot技术明确AP-1家族成员Fra-1和c-Jun在BC细胞系中的m RNA及蛋白水平。细胞增殖实验确定T5224对TNBC细胞的剂量反应关系以及对TNBC细胞增殖的影响。RT-qPCR及Western-blot技术明确T5224对Fra-1和c-Jun的m RNA及蛋白水平的影响。划痕实验、穿孔实验以及流式细胞术明确T5224对TNBC细胞生物学功能的影响。使用Illumina Hiseq Xten测序仪进行全基因组基因表达检测;R语言4.0.3进行差异表达基因（Differentially Expressed Genes,DEGs）分析,基因本体论（Gene Ontology,GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路分析,并绘制火山图、聚类热图及染色体分布图;GSEA 4.1.0进行基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）。结合沉默c-Jun（课题组前期研究结果）,沉默Fra-1（课题组前期研究结果）及使用T5224的全基因组数据、Kaplan-Meier plotter数据库及功能富集分析结果筛选AP-1靶基因,Ch IP-qPCR技术进行靶基因验证。细胞增殖实验、划痕实验、穿孔实验以及流式细胞术明确AP-1靶基因在TNBC细胞中的生物学功能。结果:1、Fra-1在乳腺癌中的表达水平及其与预后的关系Kaplan-Meier plotter和UCSC数据库基因表达数据显示Fra-1在Basal-like型BC患者实体瘤组织中的表达水平高于其他BC亚型,且差异具有统计学意义。Kaplan-Meier plotter数据库生存分析结果显示:在BC患者或Luminal型BC患者中,Fra-1低表达者无复发生存（Recurrence-Free Survival,RFS）时间长[BC:HR=1.24（1.03,1.50）,P=0.024;Luminal:HR=1.30（1.03,1.64）,P=0.028],无远处转移生存（Distance Metastasis Free Survival,DMFS）时间长[BC:HR=1.70（1.27,2.26）,P<0.001;Luminal:HR=1.85（1.30,2.64）,P=0.001];在HER2-阳性型BC患者中Fra-1低表达者DMFS时间长[HR:2.61（1.21,5.67）;P=0.031],总生存（Overall survival,OS）时间短[HR:0.35（0.12,1.00）;P=0.022]。UCSC数据库生存分析结果显示:在BC患者或Luminal型BC患者中Fra-1低表达者DMFS时间长[BC:HR=1.42（1.08,1.86）,P=0.008;Luminal:HR=1.61（1.10,2.35）,P=0.007]。2、T5224对三阴型乳腺癌的作用效果研究1)T5224对转录因子AP-1表达水平的影响RT-qPCR和western-blot技术证实Fra-1和c-Jun在TNBC细胞株（BT549和HS578T）中的表达水平高于非TNBC细胞株（T47D、MCF-7和LCC2）。细胞增殖实验结果显示使用15μM T5224作用BT549细胞48h后增殖抑制率为43.56%;40μM T5224作用HS578T细胞48h后增殖抑制率为48.42%。RT-qPCR和westernblot技术进一步证实在15μM T5224的作用下BT549细胞中Fra-1和c-Jun的m RNA在48h时呈下调状态、蛋白在72h时呈下调状态;40μM T5224的作用下HS578T细胞中c-Jun的m RNA在48h时呈下调状态、蛋白在72h时呈下调状态,Fra-1的m RNA和蛋白在72h时呈下调状态。2)T5224对三阴型乳腺癌细胞生物学功能的影响以15μM T5224作用BT549细胞48h、40μM T5224作用HS578T细胞48h为T5224作用剂量探究T5224对TNBC细胞生物学功能的影响。流式细胞术检测细胞凋亡结果显示BT549细胞T5224组凋亡的细胞数是对照组的1.79倍,HS578T细胞T5224组凋亡的细胞数是对照组的1.29倍,且差异具有统计学意义（P<0.01）。划痕实验结果显示TNBC细胞在划痕48h后T5224组的空白区域面积明显大于对照组,且差异具有统计学意义（P<0.01）。Transwell细胞侵袭实验结果显示TNBC细胞使用T5224后穿过小室的细胞数明显比对照组少,且差异具有统计学意义（P<0.01）。3)T5224对三阴型乳腺癌细胞全基因组基因表达的影响GO富集分析显示5136个DEGs参与的生物过程主要包括血管形态发生、细胞-基质粘附、对拓扑结构有误的蛋白质的应答、I型干扰素信号通路等;涉及的细胞成分主要包括粘着斑、蛋白质类细胞外基质、细胞间粘附连接等;涉及的分子功能主要包括细胞粘附分子结合、钙粘蛋白结合、生长因子结合等。GSEA分析显示使用T5224后BT549细胞GO富集分析中蛋白质的从头折叠过程、对拓扑结构有误的蛋白质的应答过程、蛋白质折叠的分子伴侣功能增强;先天免疫反应过程、对I型干扰素的应答过程、脉管系统发育过程、细胞外基质结合能力、生长因子结合能力等减弱。KEGG通路分析显示5136个DEGs参与的通路主要包括:PI3K-Akt信号通路、人乳头瘤病毒感染、粘着斑、钙信号通路等。GSEA分析显示使用T5224后BT549细胞内KEGG信号通路中粘着斑、钙信号通路、ERBB信号通路、JAK-STAT信号通路、RIG-1样受体信号通路等减弱。3、AP-1靶基因筛选及功能验证1)AP-1靶基因的筛选Kaplan-Meier plotter数据库显示OLFML2A的表达量与c-Jun正相关,且Basallike型BC患者中OLFML2A低表达者DMFS时间长[HR:3.04（1.40,6.61）;P=0.029]。Ch IP-qPCR进一步证实OLFML2A与转录因子AP-1显着富集。2)OLFML2A在三阴型乳腺癌细胞中的生物学功能细胞增殖实验显示沉默OLFML2A 5天后,沉默组光密度值明显小于对照组,且差异具有统计学意义（P<0.05）。流式细胞术显示在BT549细胞中沉默OLFML2A 48h后凋亡的细胞数是对照组的1.53倍,在HS578T细胞中沉默OLFML2A 48h后凋亡的细胞数是对照组的1.15倍,且差异具有统计学意义（P<0.01）。划痕实验显示划痕24h后沉默OLFML2A组的空白区域面积大于对照组,且差异具有统计学意义（P<0.01）。Transwell细胞侵袭实验显示沉默OLFML2A组穿过小室的细胞数比对照组少,且差异具有统计学意义（P<0.01）。结论:1、Fra-1在TNBC患者及TNBC细胞中的表达量高于非TNBC患者及非TNBC细胞;c-Jun在TNBC细胞中的表达量高于非TNBC细胞。2、在BC患者或Luminal型BC患者中Fra-1低表达者RFS时间长、DMFS时间长。3、T5224抑制c-Jun和Fra-1的m RNA及蛋白水平。4、T5224具有抗肿瘤作用,可以抑制TNBC细胞的增殖能力,且呈剂量依赖关系;并促进TNBC细胞的凋亡能力,抑制TNBC细胞的迁移和侵袭能力。5、在Basal-like型BC患者中OLFML2A低表达者DMFS时间长。6、沉默OLFML2A后TNBC细胞的增殖、迁移和侵袭能力被抑制,凋亡能力被促进。7、OLFML2A是转录因子AP-1调控的靶基因,T5224通过调控AP-1/OLFML2A轴,参与TNBC细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭过程。
曹琳[2]（2021）在《平分型GlcNAc糖基化修饰调控乳腺癌发展及耐药性的机制研究》文中研究指明乳腺癌是发病率最高的女性常见肿瘤,具有高度异质性,乳腺癌细胞分泌的小胞外囊泡（Small extracellular vesicle,sEV）是肿瘤微环境的重要组成成分,通过传递其携带的生物活性分子,可以促进乳腺肿瘤的远处转移和恶性进展,以及对化疗药物的耐受性。平分型GlcNAc是一种重要的N-糖基化修饰,在多种癌症的发生发展过程中异常表达,参与调控肿瘤细胞粘附及增殖等。本文针对平分型GlcNAc修饰调控乳腺癌细胞来源sEV的生物学功能,及其调控乳腺癌细胞耐药性的机制展开研究,以阐明平分型GlcNAc在乳腺癌发展以及耐药过程中的作用。首先,为了明确平分型GlcNAc及其对应糖基转移酶MGAT3在乳腺癌发展中的生物学功能,在乳腺癌细胞中过表达MGAT3或用毛喉素处理,增加细胞内平分型GlcNAc水平,发现细胞增殖、迁移及克隆形成能力降低,而细胞凋亡增加;小鼠体内实验发现,高表达平分型GlcNAc的乳腺癌细胞由尾静脉向肺部远距离迁移的能力下降。说明高平分型GlcNAc修饰对乳腺癌细胞的恶性表型尤其是迁移能力有一定抑制作用。随后,本研究发现高迁移性乳腺癌细胞MDA-MB-231来源的sEV能够促进低迁移性乳腺癌细胞MCF7的迁移能力,而供体细胞中平分型GlcNAc修饰水平的提高抑制了其分泌的sEV对受体细胞的促迁移功能。通过糖肽质谱以及免疫沉淀等技术,鉴定到乳腺癌细胞中整合蛋白β1（Integrinβ1）具有平分型GlcNAc修饰,且sEV也含有integrinβ1。受体细胞能够摄入sEV中的β1。当sEV中β1的平分型GlcNAc水平较低时,β1能够与受体细胞中的galectin 3相互作用启动下游FAK/AKT信号通路,促进细胞迁移,而高平分型GlcNAc修饰抑制了β1与galectin 3的结合,进而抑制下游信号通路的激活及sEV的促迁移功能;提取乳腺癌患者血浆中的sEV处理MCF7细胞,同样发现高平分型GlcNAc修饰,抑制了sEV对MCF7细胞的促迁移功能;小鼠体内实验证明,注射高平分型GlcNAc修饰的sEV组小鼠,MCF7细胞向肺部迁移数量及肺部肿瘤结节明显下降;以上结果说明高平分型GlcNAc修饰能够抑制sEV对MCF7细胞促迁移作用,这种调控是通过β1介导的。结合TCGA数据库分析发现β1上平分型GlcNAc修饰水平更高的病人,其生存期更长。最后,本文探究了平分型GlcNAc对乳腺癌细胞耐药的影响。化疗药物处理能够增加MGAT3的泛素化修饰并加速其通过蛋白酶体途径降解,进而降低乳腺癌细胞中MGAT3的表达和平分型GlcNAc的含量;高平分型GlcNAc修饰的乳腺癌细胞对化疗药物更加敏感。与耐药细胞MCF7/Adr相比,过表达MGAT3的耐药细胞（7/AdrM3）排出药物的速度减慢;进一步探究平分型GlcNAc修饰调控药物外排的分子机制,发现药物转运蛋白-P-糖蛋白（P-gp）带有平分型GlcNAc修饰,7/Adr-M3细胞中以及细胞膜上的P-gp含量呈下降趋势,平分型GlcNAc修饰促进P-gp从细胞膜进入胞质内,发生降解,进而导致细胞排出药物的速度减慢,耐药性降低。平分型GlcNAc通过影响P-gp的定位及表达调控细胞的药物耐受性。综上,本文得到以下结论:平分型GlcNAc可以通过修饰integrinβ1调控sEV的促迁移功能,抑制乳腺癌细胞的恶性表型,高平分型GlcNAc修饰能够降低由P-gp介导的乳腺癌细胞耐药性。本研究为临床治疗迁移性乳腺癌提供了新的治疗靶点,并为克服P-gp介导的乳腺癌细胞耐药提供除小分子拮抗剂之外的治疗策略。
梅延辉[3]（2021）在《ROCK1在膀胱癌中表达及功能的研究》文中研究指明研究背景:膀胱癌（Bladder Cancer,BC）是一种异质性恶性肿瘤。在全球范围内每年大约有40万例新发病例,对全球人类生命健康造成严重威胁。膀胱癌发病率具有三大特点:1.与年龄密切相关,随着人类年龄的增长,膀胱癌发病率逐渐升高;2.地域差异性,在不同地理区域之间,膀胱癌发病率存在巨大差异,发达国家的膀胱癌年龄标准化发病率（Age-standardized rate,ASR）明显高于发展中国家;3.性别差异性,男性膀胱癌发病率明显高于女性,男女比例为9.0:3.2。但有趣的是,如果按临床分期统计,女性膀胱癌复发率明显高于男性,提示我们膀胱癌的发生发展机制有待于进一步探讨。目前为止,手术切除、化学疗法、放射疗法与免疫治疗等多种治疗方法均被广泛用于膀胱癌治疗。但是,上述治疗方法总体疗效依旧欠佳,无法达到根治效果。因此,发掘并明确调控膀胱癌发生发展的关键调节因子及其具体分子机制,对于膀胱癌治疗具有重要的临床意义,这也是近年来膀胱肿瘤研究领域的重点、热点和难点。Rho相关蛋白激酶1（Rho-associated protein kinase 1,ROCK1）作为 ROCK 家族的成员之一,主要是通过调控下游蛋白的磷酸化过程,参与肌动蛋白骨架的组织和动态调控等正常生理过程。除此之外,ROCK1已被证实在肝细胞癌、黑色素瘤、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、骨肉瘤及胶质细胞瘤在内等多种类型肿瘤中表达水平升高,参与肿瘤细胞新血管生成、迁移、侵袭和转移等过程,并在这些过程中发挥重要调节作用。但是,有关ROCK1在膀胱癌细胞中发挥作用的具体分子作用机制以及与患者预后和存活率的相关性目前尚未完全明了,有待于进一步发掘与研究。研究目的:明确ROCK1在膀胱癌组织样本与不同膀胱癌细胞系中表达水平,探讨膀胱癌样本组织中ROCK1的表达水平与膀胱癌各项临床指标之间的相关性,明确ROCK1在膀胱癌中发挥的细胞生物学作用以及在膀胱癌发生发展中所扮演的角色。探讨ROCK1是否可以成为膀胱癌诊断的预测标志物,或者为膀胱癌靶向治疗的临床研究提供新的提示与线索。研究方法:为了明确ROCK1在膀胱癌中表达水平以及膀胱癌患者临床表现与预后的关系,本研究首先系统性回顾分析了 64例膀胱癌患者临床资料与随访结果;随后,通过 qPCR、Western blot 和免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）等方法测定膀胱癌患者的肿瘤样本组织及其相应对照组中ROCK1的mRNA与蛋白表达水平。探讨ROCK1表达水平与膀胱癌TNM分期之间的相关性,并通过Kaplan-Meier生存曲线进一步分析组织样本中ROCK1表达水平与膀胱癌患者总体生存率之间的关系。随后,通过qPCR和Western blot等方法测定SW780、T24、TCCSUP、UMUC-3和5637膀胱癌细胞系中ROCK1的mRNA与蛋白表达水平,从中筛选出高表达ROCK1的膀胱癌细胞系。然后,以高表达ROCK1的膀胱癌细胞系为载体,使用RNA干扰技术敲低细胞中ROCK1的表达水平,建立稳定敲除ROCK1的膀胱癌细胞系,进而通过CCK-8和集落形成实验验证敲低ROCK1蛋白表达水平对膀胱癌细胞增殖能力的影响。最后通过膜联蛋白V-FITC/PI染色及流式细胞仪分析检测不同ROCK1表达水平的膀胱癌细胞凋亡水平,并通过蛋白质印迹实验进一步验证ROCK1表达变化对膀胱癌细胞抗凋亡能力的影响。研究结果:通过对符合入组条件的64例患者进行系统性回顾分析和患者随访,并同时检测ROCK1在肿瘤样本组织中的表达水平,我们发现在临床膀胱癌组织样本中ROCK1的mRNA、蛋白的表达水平均显着高于周围正常膀胱组织。不仅如此,ROCK1表达水平的升高与淋巴结转移发生率,尤其是盆腔转移率密切相关;除此之外,与早期阶段（Ta-T1）和较小体积（≤3cm）膀胱肿瘤相比,在晚期（T2-T4）和大体积（>3cm）膀胱肿瘤组织样本中ROCK1的表达水平明显升高。随后,以ROCK1的表达水平为标准,当癌组织mRNA表达量高于癌旁组织时定义为高表达,当癌组织mRNA表达量低于癌旁组织时定义为低表达,将病人分为高表达组（n=37）和低表达组（n=27）。在60个月的随访中,与ROCK1低表达组（n=27）相比,ROCK1高表达组（n=37）生存时间明显缩短,并且ROCK1高表达的患者有更多的淋巴结转移,且转移多发生在盆腔。进一步的IHC结果证实,相对于癌旁组织,ROCK1蛋白在肿瘤组织中的表达明显升高。而在SW780、T24、TCCSUP、UMUC-3和5637五种膀胱癌细胞系中,ROCK1的mRNA和蛋白水平均显着增加,尤其是UMUC-3和T24细胞系。在此基础上,我们以UMUC-3和T24细胞为载体,利用RNA干扰技术敲低UMUC-3和T24细胞中ROCK1的表达并建立稳定细胞系。随后,我们通过CCK-8和集落形成实验,分别进一步检测降低膀胱癌细胞中ROCK1的表达水平对膀胱癌细胞系细胞增殖能力和集落形成能力的影响。结果显示,与Scramble组相比,降低UMUC-3和T24细胞中ROCK1的表达水平不仅能够明显抑制UMUC-3和T24细胞的细胞增殖能力,还能够显着抑制UMUC-3和T24细胞的集落形成能力。综上所述,ROCK1参与了膀胱癌细胞的细胞增殖能力和集落形成能力的调控,并且发挥重要的调节作用。进一步的流式细胞分析结果显示,敲低细胞中ROCK1可以显着诱导UMUC-3和T24细胞的凋亡,通过Western Blot实验进一步证明,敲低膀胱癌细胞UMUC-3和T24的ROCK1表达能够增加膀胱癌细胞UMUC-3和T24中促凋亡蛋白Bax和Cleaved-Caspase 3的表达同时降低抗凋亡蛋白Bcl-xl的表达。所有这些结果表明,敲低ROCK1可能促进膀胱癌的细胞凋亡,而ROCK1在膀胱癌增殖的侵袭过程中发挥着重要作用。研究结论:在膀胱癌中,在肿瘤体积较大的膀胱癌组织中ROCK1的表达水平显着高于肿瘤体积较小的膀胱癌组织,并且,ROCK1高表达的膀胱癌患者的生存期显着短于ROCK1低表达患者,当膀胱癌细胞中存在高水平的ROCK1表达,预示着患者发生转移、死亡等不良预后,提示ROCK1的表达水平与膀胱癌的发生和发展明确相关。降低膀胱癌细胞UMUC-3和T24中ROCK1的表达可以抑制膀胱癌的细胞增殖与细胞集落形成,并通过调节膀胱癌细胞UMUC-3和T24中促凋亡蛋白Bax、c-Caspase 3与抗凋亡蛋白Bcl-x1表达水平促进细胞凋亡,初步证明ROCK1在人类膀胱癌的进展过程中发挥着重要作用,可以成为膀胱癌诊断的预测标志物,并为膀胱癌靶向治疗临床研究提供新的提示与线索,有望用于弥补临床上现有检测与治疗手段的不足。
董亮亮[4]（2021）在《MicroRNA-139-5p靶向调节SOX8抑制三阴性乳腺癌的机制研究》文中认为研究背景乳腺癌（breast cancer,BC）是女性最常见的恶性肿瘤,其发病率约占全身各种恶性肿瘤的7-10%,严重危害女性健康。全世界每年有45.8万人死于乳腺癌,使之成为女性癌症相关死亡的最主要原因。乳腺癌发病率在过去几十年中迅速、持续上升,据估计每年全球新增病例约138万例,且由于人口老龄化和生存率的持续提高,这一数字预计将不断增加。值得庆幸的是,随着人们对乳腺癌致病机理的不断深入研究,很多新型靶向治疗药物应运而生,如抗Her-2药物曲妥珠单抗、帕妥珠单抗及内分泌治疗药物他莫昔芬、芳香化酶抑制剂等。这类药物旨在通过特异性靶向抑制不同的分子靶点,阻断肿瘤细胞或相关细胞的信号转导通路,从而抑制肿瘤的生长与扩散。即便如此,还有一部分乳腺癌对内分泌治疗和分子靶向治疗均缺乏疗效,这类乳腺癌亚型占所有乳腺癌病理类型的15%-23.8%,称为三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer,TNBC）。它是指雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）及人表皮生长因子受体2（HER2/neu）基因表达阴性的乳腺癌亚型,具有侵袭性强、复发率高、远处转移率高、预后不良的特点。常规化疗是临床上用于治疗晚期TNBC的标准策略,但其疗效并不理想。据报道,34%新诊断的TNBC患者在接受辅助或新辅助化疗后5年内复发。近年来基于其他分子生物学特征寻找到了新的治疗靶点如抗PD-L1抗体、PARP抑制剂等,但由于患者的异质性及易对药物产生耐药性等原因,使得现有治疗方法对TNBC的治疗效果仍然不佳。因此,寻找更加有效的用于TNBC早期筛查、预后评估和治疗的肿瘤生物标志物和新的靶点具有重要的临床意义。SRY 相关高迁移率族蛋白框（SRY associated high mobility group（HMG）box,SOX）家族被报道参与多种组织的病理和生理过程,例如重编程和再生等。到目前为止,已鉴定到20种不同的SOX蛋白,它们并共享一个HMG结构域,具有80%以上的序列同源性。SOX8与SOX9、SOX10同属于SOXE家族。研究表明SOX8在非小细胞肺癌的表达受microRNA-124调控,其高表达能促进肿瘤细胞的增殖;肝癌中SOX8的高表达也促进肿瘤细胞的增殖并且与β-catenin的高表达呈正相关;此外SOX8还可作为分子标志物提示脑胶质瘤的恶性预后。通过检索TCGA数据库发现SOX8基因在乳腺癌中表达高于正常对照组人群,进一步检索TCGA和METABRIC数据库,发现SOX8是一个功能性癌基因,参与维持TNBC细胞的干细胞样功能,ZEB1是SOX8的转录激活子,通过与启动子结合增强SOX8的表达。因此SOX8有望被用作TNBC预后的标志物。但是通过检索GEO（GSE76275）数据库发现,TNBC较非TNBC中HORMAD1和SOX8明显增高,而SOX8与预后无相关性,与之前的结论相矛盾,因此有必要进一步阐明SOX8在TNBC发展中的确切作用机制。MicroRNA（miRNA）是一类由大约20-22个核苷酸组成的非蛋白编码RNA分子,通过与特定靶位结合来调节基因表达。miRNA表达失调与多种疾病有关,被认为是许多细胞过程的潜在生物标志物或关键性调控因子,miRNA与肿瘤的发生发展密切相关。其中miR-139-5p作为具有抑癌作用的miRNA分子,在多种肿瘤中表达降低,过表达miR-139-5p可通过其靶基因抑制肿瘤细胞的增殖及迁移、侵袭,并诱导凋亡。因此调控miR-139-5p的表达在肿瘤的诊断、治疗、预后判断等方面有潜在的应用前景。研究表明miR-139-5p可能是结直肠癌复发和转移可靠的血清生物标志物;通过组蛋白甲基化沉默miR-139-5p可以促进非小细胞肺癌细胞侵袭;miR-139-5p可以靶向ZEB-1促进乳腺癌、胰腺癌、宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭。目前,关于miR-139-5p与TNBC发生机制的相关性研究较少。通过检索GSE数据库（GSE40049和GSE19783）发现,miR-139-5p是一个预测TNBC复发的因子,与TNBC预后高度相关。关于miRNA与SOX家族的调控关系已有相关报道,比如SOX5是miR-499的靶点,SOX2是miR-145的靶点。但是,目前关于SOX8与miR-139-5p之间在TNBC中具体作用关系的研究较少。鉴于SOX8及miR-139-5p在肿瘤调控中发挥的作用,有必要在TNBC中进一步探讨SOX8和miR-139-5p的关系,并寻找两者的调节机制。研究目的本研究旨在探讨miR-139-5p对TNBC病理发生和发展的调节作用,并探讨miR-139-5p通过调控SOX8表达,抑制TNBC发展的分子机制,为TNBC的诊断和治疗中新的生物标志物及靶点的探索提供理论基础。研究方法1.研究SOX8在三阴性乳腺癌细胞中的表达模式实验选取两种常用的人类TNBC细胞系（HCC1806和BT549）,分别采用实时荧光定量PCR和免疫印迹方法（Western blot）检测其中SOX8在mRNA和蛋白水平上的相对表达量。2.研究SOX8基因对三阴性乳腺癌细胞生物学行为的影响通过在HCC1806和BT549细胞系中转染SOX8过表达质粒或microRNA-SOX8特异性短发夹RNA来增强或敲减基因表达,再用定量PCR和Western blot检测转染后细胞中SOX8 mRNA和蛋白的相对表达量,判断过表达和干扰的效率高低。随后分别进行CCK-8实验、克隆形成和Transwell实验,用于测定HCC1806和BT549细胞的活力、克隆形成能力和迁移情况,评估SOX8基因表达量改变对TNBC细胞增殖和迁移的影响。3.SOX8对三阴性乳腺癌细胞凋亡及细胞干性形成的影响利用流式细胞分析SOX8过表达或干扰后,HCC1806和BT549细胞凋亡的变化情况,同时用Western blot检测凋亡标志物Caspase3、Caspase9的表达水平。用体外成球实验鉴定两种肿瘤细胞自我更新能力即细胞的干性。4.过表达SOX8对Wnt/β-catenin通路活性影响利用Targetscan、Starbase等网络软件,利用生物信息学方法预测出SOX8可能与Wnt通路受体FZD7的互补结合的位点,通过RT-PCR验证过表达SOX8对FZD7转录的影响。5.miR-139-5p对三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移的影响利用定量PCR检测miR-139-5p在HCC1806和BT549细胞与正常乳腺上皮细胞MCF-10A中的表达量。分别在两种细胞中过表达miR-139-5p,观察miR-139-5p表达量,以及SOX8 mRNA和蛋白的表达量与未转染组相比发生的变化,从而揭示二者的关系。通过CCK-8、克隆形成、Transwell实验研究miR-139-5p过表达对细胞增殖和迁移的影响。6.miR-139-5p对三阴性乳腺癌细胞凋亡及肿瘤球形成的影响分别在HCC1806和BT549细胞中过表达miR-139-5p,流式细胞仪分析检测细胞凋亡率,Western blot检测活性Caspase3、Caspase9表达量,用体外肿瘤细胞成球实验检测细胞干性。7.miR-139-5p和SOX8的相互作用关系研究利用Targetscan、Starbase等网站工具,通过生物信息学方法预测出SOX8 3’-UTR与miR-139-5p可能的互补结合位点。随后进行了双荧光素酶报告实验证实二者直接相互作用关系,将正常的SOX8 3’-UTR序列（WT）及其突变序列（Mut）融合在报告基因载体上,与miR-139-5p mimics共同转染细胞,并通过荧光信号检测SOX8的表达变化。8.功能回复实验在HCC1806和BT549细胞中同时转染miR-139-5p mimics和SOX8,分别检测细胞活力、克隆形成能力、迁移、干性和凋亡水平的变化,观察是否可以逆转miR-139-5p过表达导致的细胞表型变化。9.小鼠移植瘤模型肿瘤生长实验将 miR-139-5p mimics、pcDNA3.1-SOX8、microRNA-SOX8 特异性短发夹RNA单独或同时转染HCC1806和BT549细胞,培养获得稳转细胞系。将稳定转染的细胞接种在小鼠右前肢皮下,不同时间段内对荷瘤小鼠皮下异种移植瘤的体积进行记录。接种28天后,取出异种移植肿瘤并称取重量,评估miR-139-5p和SOX8对TNBC肿瘤生长的影响。提取小鼠移植瘤组织中RNA,RT-PCR和Western blot方法测定不同质粒转染的移植瘤组织中miR-139-5p和SOX8 mRNA、蛋白表达量。10.三阴性乳腺癌组织miR-139-5p和SOX8差异表达采集TNBC患者病灶及癌旁组织,并利用试剂盒提取组织中总mRNA;利用荧光定量PCR法检测组织中的miR-139-5p及SOX8的mRNA含量,并对其差异表达进行分析。研究结果1.三阴性乳腺癌细胞系中SOX8表达上调与正常乳腺上皮细胞MCF-10A相比,SOX8 mRNA、蛋白在HCC1806和BT549乳腺癌细胞系中的表达量均明显上调（P<0.05）。2.SOX8可以促进三阴性乳腺癌细胞增殖和迁移与对照组相比,在转染microRNA-SOX8特异性短发夹RNA的HCC1806和BT549细胞中SOX8 mRNA和蛋白表达量均显着下调（P<0.05）;而过表达组细胞中SOX8 mRNA和蛋白的表达水平均明显增加（P<0.05）。结果表明SOX8基因过表达和干扰的效率较高,转染细胞系构建成功。过表达SOX8的HCC1806和BT549细胞的存活率与对照组细胞相比大幅提高（P<0.05）;同时,SOX8过表达后,两种细胞的相对克隆数增加（P<0.05）,表明TNBC细胞克隆能力增强。Transwell实验结果显示在SOX8过表达后,细胞迁移能力显着增加（P<0.05）;另一方面,转染microRNA-SOX8特异性短发夹RNA的细胞显示出相反的结果。由此可知SOX8基因可以促进TNBC细胞增殖和迁移。3.SOX8抑制三阴性乳腺癌细胞凋亡并参与维持细胞干性SOX8过表达的HCC1806和BT549细胞凋亡率明显低于对照组（P<0.05）,而转染SOX8特异性短发夹RNA的细胞凋亡率显着增加（P<0.05）;同时发现活性Caspase3和Caspase9的表达量在SOX8过表达后明显下降,而SOX8干扰后两种凋亡标志蛋白的表达水平上升。与对照组相比,SOX8过表达组肿瘤细胞成球数量明显增加（P<0.05）,而干扰SOX8的表达可以使细胞成球能力减弱（P<0.05）,表明SOX8可以抑制TNBC细胞凋亡并参与肿瘤细胞干性的维持。4.过表达SOX8增强Wnt/β-catenin通路活性TNBC细胞中SOX8的过表达,增强了 Wnt/β-catenin通路的活性,进而增强TNBC细胞的干性,加剧了其增殖、迁移等行为。5.miR-139-5p抑制三阴性乳腺癌细胞增殖miR-139-5p在HCC1806和BT549细胞中的表达显着低于MCF-10A细胞（P<0.05）,说明miR-139-5p在TNBC细胞中表达下调。在两种细胞中过表达miR-139-5p,可观察到miR-139-5p表达量明显增加。有趣的是,过表达miR-139-5p后SOX8 mRNA和蛋白的表达量也随之降低,说明后者表达量可能受前者调控。进一步研究miR-139-5p对细胞功能的影响,发现该基因过表达后细胞增殖和迁移率大幅度降低,差异有统计学意义（P<0.05）。6.miR-139-5p诱导TNBC细胞凋亡并抑制肿瘤球形成miR-139-5p过表达组细胞的凋亡率明显高于对照组（P<0.05）,同时该组细胞形成肿瘤球的能力降低（P<0.05）,与敲减SOX8对细胞的影响结果一致。因此推断miR-139-5p可能通过降低SOX8在细胞中的表达水平来发挥生物学作用,起到控制细胞生长的作用。7.SOX8是miR-139-5p的直接靶点双荧光素酶报告分析结果表明,miR-139-5p mimics共转染显着降低了含有野生型SOX8 3’-UTR的细胞荧光素酶活性（P<0.05）,但对突变序列的荧光素酶活性无影响,说明miR-139-5p可以靶向结合SOX8并抑制其翻译。8.miR-139-5p通过靶向调控SOX8影响细胞干性在HCC1806和BT549细胞中单独过表达miR-139-5p或敲减SOX8可以显着降低两种TNBC细胞的活力、形成克隆数量、迁移能力,与空白对照组细胞相比差异有统计学意义（P<0.05）;而同时过表达miR-139-5p和SOX8的细胞增殖和迁移率明显高于上述组别（P<0.05）,接近转染前的细胞。另一方面与空白对照组相比,转染miR-139-5p或敲减SOX8可以增加细胞凋亡比率（P<0.05）,但肿瘤细胞的成球能力却明显降低（P<0.05）;而同时高表达miR-139-5p和SOX8的细胞凋亡率低于上述单独转染组,肿瘤球的数目则显着增加。由此可见在细胞中同时上调SOX8的表达量可以在一定程度上消除miR-139-5p过表达对细胞表型的影响,进一步证实miR-139-5p可以通过下调SOX8的表达来限制乳腺癌细胞的生长和迁移。9.miR-139-5p通过下调SOX8促进小鼠体内肿瘤生长接种单独过表达miR-139-5p或敲减SOX8的HCC1806、BT549细胞的小鼠体内移植瘤生长速度显着减缓,在接种后不同时间段肿瘤体积均较空白对照组低（P<0.05）,而同时过表达miR-139-5p和SOX8的细胞衍生的移植瘤的体积则比上述两组增加（P<0.05）。此外,在接种28天后,异种移植肿瘤重量也呈现出类似趋势。与单纯BC组相比,接种了单独过表达miR-139-5p或敲减SOX8细胞的小鼠瘤体内SOX8的mRNA和蛋白含量降低,miR-139-5p含量提高（P<0.05）。10.三阴性乳腺癌肿瘤组织SOX8、miR-139-5p异常表达相较于癌旁组织,TNBC病灶组织中SOX8的mRNA含量升高,miR-139-5p含量明显下降,两组间差异具有统计学意义（p<0.05）;病灶组织内miR-139-5p荧光探针所携带荧光强度明显降低,与癌旁组织有显着差异。结论miR-139-5p可以抑制TNBC细胞生长、迁移并诱导细胞凋亡,在乳腺癌的发病机制中作为一个重要调节因子,这种作用是通过直接靶向下调SOX8的表达量来实现的。miR-139-5p与SOX8的3’-UTR位点直接作用,阻止SOX8的转录。当miR-139-5p含量降低,SOX8 3’-UTR位点得以释放,增强了对SOX8的转录与翻译,同时激活了Wnt/β-catenin信号通路,大幅提升TNBC细胞增殖、迁移和侵袭能力。因此可知,通过干扰SOX8基因或上调miR-139-5p的表达来抑制TNBC细胞增殖和迁移,可以在一定程度上减缓疾病的进展。这一研究可以为TNBC的诊断和分子靶向治疗提供新的思路。
方玉婷[5]（2021）在《抗菌肽LL-37激活Wnt信号通路诱导乳腺癌细胞增殖迁移的机制研究》文中认为目的:研究抗菌肽LL-37/CRAMP增强乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移能力是否通过Wnt/β-catenin信号通路介导;LL-37/CRAMP能否诱导髓系巨噬细胞分化为M2型,并发挥促肿瘤作用。背景:目前乳腺癌是全世界最常见的女性恶性肿瘤,对女性健康的威胁不容置疑。抗菌肽LL-37普遍存在于人体各细胞和组织中,具有多种生物活性。LL-37除了具有抗菌活性外,还在机体内发挥抗感染、抗肿瘤、参与免疫调节、血管生成及损伤修复等多种效应。最新的研究发现LL-37对不同肿瘤的发生、发展具有不同的作用。癌症和肿瘤基因图谱（Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库分析显示原发性乳腺癌中LL-37的表达显着高于正常乳腺组织,这提示LL-37可能为乳腺癌的发生、发展提供了一定的生长优势。已有研究报道LL-37可活化PI3K/Akt信号途径诱导乳腺癌细胞系发生迁移,活化的Akt使包括GSK3β在内的多种底物磷酸化,从而抑制细胞凋亡并促进生存。而GSK3β作为丝氨酸/苏氨酸家族激酶成员之一,是Wnt信号系统中的关键组成成分,在β-catenin分子的调节中起着负性作用。但在乳腺癌中抗菌肽LL-37促进乳腺癌发生发展和Wnt/β-catenin信号通路之间是否存在关联尚未阐明。肿瘤微环境内存在着肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、树突状细胞（DCs）、髓源性抑制细胞（MDSCs）、淋巴细胞等免疫细胞。肿瘤细胞能对肿瘤微环境进行改造,后者反过来又会影响肿瘤细胞的行为和状态。基于前期抗菌肽LL-37与Akt信号之间的联系,我们推测LL-37可能通过Wnt经典信号介导,促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移等生物学功能,并且影响肿瘤相关巨噬细胞趋向于M2型极化从而进一步发挥其促癌作用。方法:1、首先在人类癌症和肿瘤基因图谱（TCGA）数据库中进行搜索验证原发性乳腺癌和正常乳腺组织中LL-37的表达水平。体外实验中以MCF-10A（人正常乳腺上皮细胞系）作为对照,real-time PCR方法检测多种人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、BT549中抗菌肽CAMP基因的转录水平。通过外源性Cramp si RNA干扰小鼠乳腺癌细胞PY8119中抗菌肽的固有表达,real-time PCR检测对比分析干扰前后PY8119细胞中与增殖、迁移能力相关指标的转录水平变化,以初步探究抗菌肽LL-37/CRAMP对乳腺癌细胞生物学特征的作用。2、体外实验中以重组多肽LL-37/CRAMP处理人乳腺癌细胞系MCF-7和小鼠乳腺癌细胞系PY8119、4T1一定时间后,通过集落形成实验、CCK8、划痕愈合实验、Transwell检测乳腺癌细胞在增殖、侵袭、迁移能力的改变;收集乳腺癌细胞总RNA和总蛋白质,real-time PCR和Western Blot方法用于检测与细胞增殖、侵袭和迁移等细胞功能相关的指示标志物,信号通路（PI3K/Akt及Wnt/β-catenin）中的重要信号分子如β-catenin、GSK3β、AXIN2、LEF1、MMP-9的表达变化,以及乳腺癌细胞内部分相关受体如LRP5/6、FZD1、EGFR、FPR2、TLR4的激活程度;细胞免疫荧光共聚焦技术探究LL-37/CRAMP在处理乳腺癌后,β-catenin在细胞中的定位改变和p-β-catenin的表达强度变化,以明确Wnt/β-catenin信号通路受到抗菌肽作用后的激活情况;3、给予β-catenin特异性抑制剂XAV939处理乳腺癌细胞MCF-7和PY8119,以real-time PCR和Western Blot检测外源性重组多肽并抑制剂组中Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白包括p-β-catenin/β-catenin、p-GSK3β/GSK3β的表达水平变化;4、外源性重组多肽CRAMP预处理小鼠乳腺癌细胞系PY8119、4T1后,检测乳腺癌细胞-巨噬细胞共培养体系中巨噬细胞炎性因子CXCL1及M1、M2型巨噬细胞极化标志物（NOS2、ARG1）的表达,以验证LL-37/CRAMP是否有助于塑造促进乳腺癌发生发展的巨噬细胞免疫表型。结果:1、TCGA人类癌症数据库显示,原发性乳腺癌中抗菌肽LL-37的表达较正常组织显着上调。体外细胞实验中,与MCF-10A相比,MCF-7细胞CAMP基因的mRNA水平明显增加。当PY8119细胞的内源性Cramp表达沉默,增殖迁移能力相关指标c-myc、PCNA、MMP-9、fibronectin转录水平均下降,表明乳腺癌细胞增殖和迁移能力有所减弱。2、体外细胞实验结果发现,LL-37/CRAMP可显着提高MCF-7、PY8119细胞的增殖、横向和纵向迁移以及侵袭能力。定量分析显示LL-37/CRAMP明显促进细胞增殖和迁移标志物Cyclin D1、MMP-9的表达水平上升。3、给予外源性CRAMP后,PY8119细胞中Akt的mRNA水平明显高于未处理组,且Wnt通路响应基因,包括AXIN2、β-catenin、LEF1、fibronectin在PY8119细胞中呈时间依赖性方式显着上调。4T1、MCF-7乳腺癌细胞系中AXIN2、β-catenin、LEF1转录水平也均明显增加。经LL-37/CRAMP处理,发现PY8119、4T1、MCF-7三种细胞p-β-catenin/β-catenin信号蛋白表达降低,p-GSK3β/GSK3β上调。细胞免疫荧光染色实验亦观察到p-β-catenin绿色荧光明显减弱,β-catenin红色荧光与胞核蓝色荧光重叠后为粉红色,表明其部分易位至胞核中。此外,LL-37/CRAMP刺激下,PY8119细胞中Wnt信号通路受体LRP5/6、FZD1的mRNA水平升高,表明该信号通路受到明显激活。4、在MCF-7、PY8119细胞中,外源性重组多肽LL-37/CRAMP和Wnt/β-catenin特异性抑制剂XAV939处理组,p-β-catenin/β-catenin、p-GSK3β/GSK3β的蛋白表达水平与单纯LL-37/CRAMP处理组相比呈现出相反的变化趋势,即p-β-catenin/β-catenin信号蛋白表达升高,p-GSK3β/GSK3β下调。5、在乳腺癌细胞-巨噬细胞共培养体系中,经重组多肽CRAMP预处理后,PY8119、4T1细胞NOS2（M1型标志物）下调,ARG1（M2型标志物）表达上调,提示共培养环境中的巨噬细胞有向M2型极化的趋势。结论:本研究发现抗菌肽LL-37/CRAMP在乳腺癌中表达上调,经体外细胞实验证实LL-37/CRAMP通过激活Wnt经典信号传导显着增强乳腺癌细胞在增殖、侵袭和迁移方面的能力,并且促进巨噬细胞趋向于M2型极化,从而进一步发挥肿瘤促进作用。因此我们认为LL-37/CRAMP是促进乳腺癌发生发展的一种重要调节蛋白分子。这为抗菌肽类分子在乳腺癌进展过程中的作用机制提供新的发现,也提示了LL-37-Wnt/β-catenin可以作为乳腺癌临床诊断和治疗的候选靶点,为控制乳腺癌的发展转归提供了新的实验研究依据。
曹入双[6]（2021）在《成纤维细胞对乳腺上皮细胞生长分化的影响》文中认为目的通过人成纤维细胞与人乳腺癌细胞及人乳腺正常上皮细胞进行共培养,模拟“种子”与“土壤”的肿瘤微环境,观察间质中主要成分成纤维细胞对肿瘤及上皮细胞生长与分化的影响,分析成纤维细胞生理生化的改变与乳腺癌发生发展和预后的关系,探讨成纤维细胞相关生理生化改变作为肿瘤筛查、诊断及预后的生物标志物达到将肿瘤预防哨点监测的“关口”前移的可行性。方法（1）将人成纤维细胞（CCC-ESF-1）与乳腺癌细胞株（MDA-MB-231,MDA-MB-468）及人乳腺正常上皮细胞（MCF10A）采用条件培养基法进行共培养:a.当细胞生长汇合至大约80%时,弃去原有培养基,更换无血清培养基培养24h,离心后收集上清液分装制成含5%胎牛血清（Fetal bovine serum,FBS）的条件培养基（Conditioned Medium,CM）;b.按照此方法分别制成了CCC-ESF-1-CM、MDA-MB-231-CM、MDA-MB-468-CM、MCF10A-CM,即以成纤维细胞和乳腺正常细胞、癌细胞互相作为彼此的目的细胞与条件细胞;c.观察比较细胞条件培养基共培养前后的生长状况,采用实时荧光定量PCR检测成纤维细胞和乳腺正常细胞、癌细胞中EGFR m RNA的变化;Western Blot检测EGFR、Vimentin、E-cadherin蛋白的表达变化,免疫细胞化学法检测乳腺正常细胞、癌细胞中EGFR表达变化;（2）人乳腺癌组织芯片EGFR免疫组织化学染色,比较不同成纤维细胞间质含量的组织中乳腺正常细胞、癌细胞EGFR表达情况,分析成纤维细胞对乳腺上皮细胞生长分化的影响。结果1.与MDA-MB-231、MDA-MB-468及MCF10A条件培养基共培养的CCC-ESF-1细胞中,EGFR m RNA与EGFR蛋白水平变化相比于单独培养表达均上调,分别增加30.75%（P<0.05）、7.20倍（P<0.05）和35.24倍（P<0.05）;Vimentin表达均下调,分别降低8.88%（P<0.05）、17.94%（P<0.05）和11.19%（P<0.05）;E-cadherin表达上调分别增加2.61倍（P<0.05）、14.72倍（P<0.05）和1.56倍（P<0.05）。2.与CCC-ESF1条件培养基共培养后,MDA-MB-231,MCF10A细胞EGFR m RNA和蛋白表达水平均下调,相比于单独培养,分别降低98.83%（P<0.05）和59.98%（P<0.05）;MDA-MB-468细胞EGFR m RNA和蛋白水平表达均上调,蛋白表达增加4.79倍（P<0.05）;MDA-MB-231,MCF10A细胞Vimentin表达上调,分别增加32.54%（P<0.05）和30.51%（P<0.05）;MDA-MB-468细胞Vimentin表达下调62.43%（P<0.05）。MDA-MB-231细胞几乎不表达E-cadherin,且与单独培养相比差异不具有显着性（下降13.42%,P>0.05）;MDA-MB-468、MCF10A细胞E-cadherin表达均上调,分别增加2.40倍（P<0.05）和15.33%（P<0.05）。3.人乳腺癌组织芯片分析检测,远癌（正常）组织中间质含量越高,乳腺上皮细胞EGFR表达越强;在癌组织中,间质含量过高或过低,乳腺肿瘤细胞EGFR均不表达。结论1.乳腺上皮细胞可以上调成纤维细胞EGFR和E-cadherin的表达水平,并且降低Vimentin表达水平,说明在肿瘤微环境中正常成纤维细胞可能逐渐发生间充质-上皮转化。2.成纤维细胞可使MDA-MB-231和MCF10A中EGFR表达降低,MDA-MB-468中EGFR表达增加,而Vimentin的表达趋势则与之相反。成纤维细胞对不同的乳腺癌细胞及正常上皮细胞调控机制可能存在差异性。MDA-MB-468和MCF10A细胞中E-cadherin表达均上调,说明成纤维细胞可能促进乳腺细胞间的黏附,降低分化程度。3.人乳腺癌组织芯片表明间质中成纤维细胞可下调乳腺癌细胞EGFR表达,与细胞实验结果一致,成纤维细胞能够调控乳腺上皮细胞的生长分化。4.成纤维细胞作为重要的细胞间质成分,和乳腺上皮细胞存在“土壤”与“种子”的关系,对乳腺上皮细胞的生长与分化起着重要调控作用,与乳腺癌发生发展和预后密切相关。成纤维细胞相关生理生化改变一般早于上皮细胞,可作为肿瘤筛查、诊断及预后的生物标志物,将肿瘤预防哨点监测“关口”前移具有可行性。
马晓丽[7]（2021）在《ILK对食管鳞癌恶性表型的影响及其功能研究》文中提出目的:本研究目的是探讨整合素连接激酶（ILK）基因对食管癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响,研究其在食管癌中功能,为食管癌的精准诊疗奠定理论基础和临床参考。方法:1)采用meta分析评价ILK在消化系统肿瘤组织中的表达,及与消化系统肿瘤临床表型及预后间的相关性;2)筛选ILK高表达的人食管鳞癌细胞系,建立ILK慢病毒干扰序列。将ILK慢病毒干扰序列转染食管鳞癌细胞系TE-1和KYSE-150,用q RT-PCR检测干扰载体转染后ILK的表达。在细胞水平上,利用MTT增殖、克隆检测、流式细胞仪凋亡检测、Transwell小室侵袭及划痕愈合等技术,研究ILK基因消减对食管鳞癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响;3)建立ILK慢病毒干扰载体,转染KYSE-150细胞。在裸鼠皮下分别接种sh ILK及对照细胞株,建立KYSE-150细胞裸鼠皮下移植瘤模型,通过观察肿瘤生长,测量肿瘤大小和体积。在动物水平上,研究ILK基因消减对食管鳞癌细胞生长的影响。基于RNA-seq技术筛选食管癌的差异表达基因,通过GO功能富集和KEGG通路分析预测其可能的发病机制,筛选可能参与食管癌发生发展的关键调控基因及相关信号通路。结果:第一部分:meta分析结果显示ILK在消化系统肿瘤组中高表达,ILK表达与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移、肿瘤浸润程度及生存预后呈相关性,与年龄及性别无明显相关性。第二部分:在体外ESCC细胞水平,沉默ILK基因后,可显着抑制TE-1、KYSE-150细胞增殖和集落形成,促进TE-1、KYSE-150细胞凋亡。ILK基因消减后,TE-1、KYSE-150细胞侵袭及迁移能力明显减弱。第三部分:裸鼠移植瘤动物模型结果发现,ILK干扰组裸鼠肿瘤生长缓慢,相比较于对照组,肿瘤的重量及体积均偏小,ILK基因消减后影响了裸鼠成瘤的能力。基于RNA-seq技术,ILK基因干扰后挖掘到5540个食管癌差异表达基因,其中上调基因为2839个,下调基因为2601个。上调的基因有SOD2、IRF6、PER1、PHLDB2、TNFAIP3等,下调的基因有RPL21、HYOU1、WARS、SUPT16H、DHCR24等。可能参与TNF信号通路、AMPK信号通路、Fox O信号通路、P53信号通路、NF-k B信号通路等。结论:ILK在消化系统肿瘤中高表达,与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移、肿瘤浸润程度及生存预后呈相关性,与年龄及性别无明显相关性。ILK基因消减抑制ESCC细胞增殖、克隆形成、侵袭及转移,促进细胞凋亡。体内致瘤研究证实,ILK基因消减会阻碍KYSE-150移植瘤的生长。基于RNA-seq技术筛选出食管癌的差异表达基因,通过GO功能富集和KEGG通路分析预测差异表达基因,可能相关的信号传导通路。
薛晶[8]（2021）在《基于TMT蛋白质组学的差异蛋白PP1γ在胶质瘤中的作用及机制研究》文中提出目的:通过探索胶质瘤差异表达蛋白,了解差异表达蛋白的生物学功能及相互作用网络,筛选调控重要信号通路的关键因子,研究关键差异蛋白在胶质瘤中的作用及其分子机制,为改善胶质瘤预后提供新的治疗靶点奠定理论基础。方法:1)选择5对胶质母细胞瘤（Glioblastoma,GBM）及手术路径非肿瘤脑组织,应用串联质谱标签（Tandem mass tags,TMT）蛋白质组学技术筛选差异表达的蛋白质,通过GO分析、IPA（Ingenuity Pathway Analysis）生物分析平台、KEGG、PPI及GEPIA分析等生物信息学方法,探索差异表达蛋白的主要功能、蛋白互作网络、上游调控因子、参与的信号通路及预后意义,筛选出调控重要信号通路的关键因子;2)选择低级别胶质瘤（Low grade glioma,LGG）和GBM石蜡包埋组织样本制作组织芯片,利用免疫组织化学技术在组织芯片中检测差异蛋白PP1γ的表达及其与临床病理特征及预后之间的关系;在LGG中通过Sanger测序技术检测异柠檬酸脱氢酶1（Isocitrate dehydrogenase 1,IDH1）突变,并通过荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization,FISH）检测1p19q共缺失,分析不同分子分型中PP1γ表达水平的差异;3)构建PP1γ稳定低表达细胞株,研究PP1γ沉默对GBM细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期及侵袭和迁移能力的影响;观察PP1γ沉默对Yes相关蛋白1（Yes-associated protein1,YAP1）磷酸化水平、YAP1在胞核/胞浆中的定位和表达量及对干细胞多潜能标记物Sox2,Oct4和Nanog表达水平的影响;分析PP1γ沉默对干细胞标志物CD133阳性率、细胞悬浮球形成能力及替莫唑胺（Temozolomide,TMZ）药物敏感性的影响。结果:1)根据TMT蛋白质组学共鉴定出2458个差异表达蛋白质,包括1398个上调的差异表达蛋白和1060个下调的差异表达蛋白,结合生物信息学分析及文献报道,Hippo/YAP1信号通路是差异表达蛋白显着富集的重要信号通路,PP1γ是上调的差异表达蛋白并处于Hippo/YAP1信号通路的关键位点;2)PP1γ在胶质瘤组织中高表达,PP1γ表达与WHO分级、Ki-67、YAP1和Sox2的表达呈正相关,在LGG中PP1γ在IDH1突变型中低表达,PP1γ高表达是胶质瘤预后差的独立影响因素;3)PP1γ沉默抑制了胶质瘤细胞增殖、促进了细胞凋亡、使细胞阻滞于G0/G1期并抑制了细胞侵袭和迁移的能力;PP1γ沉默使YAP1磷酸化水平升高,增加了YAP1在胞浆中的表达,降低了YAP1在胞核中的表达,并抑制了干细胞多潜能标记物Sox2,Oct4和Nanog的表达;PP1γ沉默降低了干细胞标记物CD133阳性细胞比例,抑制了细胞悬浮球形成能力,增强了胶质瘤细胞对TMZ药物处理的敏感性。结论:PP1γ是GBM中上调的关键差异表达蛋白,PP1γ高表达与胶质瘤恶性程度高及预后不良相关,PP1γ主要通过YAP1/Sox2途径调控胶质瘤细胞增殖、侵袭、GSCs干性特征维持及TMZ药物敏感性。PP1γ可能成为新的胶质瘤靶向治疗的重要因子。
崔乐[9]（2021）在《PA-MSHA联合紫杉醇对三阴性乳腺癌细胞的抑制作用研究》文中认为背景:三阴性乳腺癌（TNBC）是一种高度侵袭性的乳腺癌,其治疗以手术和化疗为主。而化疗药物与其他药物联合使用是一种趋势,多药联合选择不同作用机制的药物,从而在降低药物的最低有效剂量同时达到更好的临床效果,并且降低药物的毒副作用和耐药性。目的:探究铜绿假单胞菌注射液（PA-MSHA）联合紫杉醇对TNBC细胞的抑制作用及机制。方法:（1）采用CCK8法评价单药PA-MSHA、紫杉醇及两药联合对TNBC细胞增殖抑制作用。（2）采用细胞划痕实验评价PA-MSHA对TNBC细胞迁移的影响。（3）采用流式细胞分析检测PA-MSHA对TNBC细胞周期和凋亡的影响,同时比较PAMSHA、紫杉醇及两药联合对细胞凋亡的改变。（4）采用q RT-PCR及Western Blot法检测单药PA-MSHA、紫杉醇及两药联合作用TNBC细胞后对BAX、BCL-2、c-Myc、NF-κB、CIP2A表达的影响。结果:（1）CCK8结果表明,与对照组相比,PA-MSHA、紫杉醇及两药联合均可抑制TNBC细胞的增殖,且联合用药效果更强（P<0.05）。（2）划痕实验结果表明与对照组相比,实验组PA-MSHA作用于TNBC细胞24h的划痕愈合率较低（P<0.05）,明显抑制细胞迁移。（3）流式细胞仪检测结果表明在TNBC中,两药联合组细胞凋亡率较单药PA-MSHA和紫杉醇组高（P<0.05）。除此之外,PA-MSHA组TNBC细胞周期阻滞于G0/G1期。（4）q RT-PCR及Western Blot结果显示,与对照组相比,PA-MSHA、紫杉醇及联合用药BAX表达均增高,BCL-2、c-Myc、CIP2A、NF-κB表达降低（P<0.05）,且联合用药组对目标基因的下调作用更显着。结论:研究证实PA-MSHA、紫杉醇及两药联合能够有效抑制TNBC细胞的增殖、迁移,并诱导TNBC细胞的凋亡和周期阻滞,凋亡机制可能与BAX、BCL-2有关,且联合用药有更显着的效果。PA-MSHA联合紫杉醇能够增强化疗药物对肿瘤的抑制作用,其分子机制可能与PA-MSHA下调了癌基因NF-κB、c-Myc、CIP2A的表达有关。
蒙勇梅[10]（2021）在《血浆游离DNA在乳腺癌预后评估中的价值》文中研究表明目的:通过检测女性乳腺癌患者血浆游离DNA（Cell Free DNA,cf DNA）的丰度、完整性、点突变（Single Nucleotide Variant,SNV）及拷贝数变异（Copy Number Variation,CNV）,探讨血浆cf DNA参数（丰度、完整性、SNV、CNV）在乳腺癌患者预后判断中的价值。方法:收集2018年8月至2019年8月在泰州市人民医院就诊的92例乳腺癌患者的EDTA-K2抗凝全血样本,离心分离获取血浆样本;提取血浆样本中cf DNA,采用PCR方法检测cf DNA中LINE1基因-223bp片段（LINE1-223）及LINE1基因-97bp片段（LINE1-97）的表达水平;以LINE1-97表达水平表示cf DNA丰度,LINE1-223和LINE1-97表达水平的比值（LINE1-223/LINE-97）表示cf DNA完整性。将合格的cf DNA样本进行文库构建,依据cf DNA文库快速制备试剂盒（MGI平台）说明书通过末端修复、接头连接、连接产物纯化、PCR扩增及PCR产物纯化等步骤构建cf DNA文库;采用MGISEQ-2000RS配套的试剂进行高通量测序,检测cf DNA中的拷贝数变异情况;对cf DNA样本进行50基因多重PCR建库操作,利用MGISEQ-2000RS高通量测序试剂套装进行测序,检测乳腺癌患者cf DNA样本中点突变SNV情况。结果:患者一般资料显示,92例患者的中位年龄50岁。HER2阳性、HER2阴性患者分别为65例（70.6%）、17例（18.5%）;三阴性乳腺癌患者10例（10.9%）。根据肿瘤大小的不同,<2cm、2-5cm和≥5cm的乳腺癌患者分别为37例（40.2%）、49例（53.3%）和6例（6.5%）。I/II期、III/IV期患者分别为42例（45.6%）、50例（54.4%）。研究起始时,38例（41.3%）无转移,54例（58.7%）患者有转移。最常见的转移部位是淋巴结（48/92,52.2%）、骨（18/92,19.6%）、肝（7/92,7.6%）、肺（10/92,10.9%）、胸壁（3/92,3.3%）、脑（5/92,5.4%）、心脏（2/92,2.2%）;24例乳腺癌患者（26.1%）血清CA15-3水平高于正常参考值范围。依据临床参数分组,比较各组血浆cf DNA丰度、完整性、CNV和CA15-3水平的差异情况。结果显示,CA15-3水平与肿瘤大小有关,肿瘤直径越大,CA15-3水平越高,差异具有统计学意义（P<0.05）;cf DNA丰度、完整性、CNV和CA15-3水平均与肿瘤分期有关,与I/II期患者相比,III/IV期患者的cf DNA丰度[12.77ng/ml（8.66 ng/ml,18.54 ng/ml）vs 32.72 ng/ml（21.20 ng/ml,46.30 ng/ml）]、CNV[1.03（0.89,1.18）vs 1.20（0.95,1.94）]和CA15-3水平[9.25 U/ml（6.92 U/ml,14.18 U/ml）vs 24.35 U/ml（11.82 U/ml,53.80 U/ml）]均显着升高。与I/II期患者相比,III/IV期患者cf DNA完整性显着降低[（0.37±0.05）vs（0.23±0.03）],差异有统计学意义（P<0.05）。另外,结果显示,cf DNA丰度、完整性、CNV与转移状态有关,与研究开始时未发生转移的乳腺癌患者相比,存在转移的乳腺癌患者cf DNA丰度、CNV、CA15-3水平均显着升高[14.78 ng/ml（9.71 ng/ml,21.53 ng/ml）vs 26.16 ng/ml（15.25 ng/ml,42.83 ng/ml）]、[1.01（0.87,1.14）vs 1.22（0.97,1.75）]、[10.85U/ml（7.35 U/ml,18.18 U/ml）vs 15.10 U/ml（9.55 U/ml,50.90 U/ml）],而cf DNA完整性显着降低[0.26（0.14,0.55）vs 0.19（0.07,0.33）],差异有统计学意义（P<0.05）。此外,与研究开始时未发生远处转移的乳腺癌患者相比,发生远处转移的乳腺癌患者cf DNA丰度[15.10 ng/ml（9.71 ng/ml,24.36 ng/ml）vs 33.95ng/ml（21.41 ng/ml,49.47 ng/ml）]、CNV[1.02（0.90,1.18）vs 1.44（1.03,1.98）]和CA15-3水平[10.65 U/ml（7.35 U/ml,14.50 U/ml）vs 38.40 U/ml（14.10 U/ml,76.40 U/ml）]均显着升高;cf DNA完整性显着降低[0.35±0.04 vs 0.20±0.03],差异有统计学意义（P<0.05）。高通量二代测序结果显示,50基因检测中乳腺癌患者有19个基因（TP53、PIK3CA、KRAS、EGFR、NRAS、CDKN2A、CTNNB1、KIT、SMAD4、GNAS、FGFR3、MET、STK11、VHL、MLH1、HRA、FBXW7、SMO和RB1）存在点突变（SNV）。突变频率前三的基因为TP53（27/92,29.3%）、PIK3CA（14/92,15.2%）及KRAS（9/92,9.8%）。SNV与肿瘤的分期相关,TP53突变与乳腺癌分期及远处转移密切相关（P<0.05）。乳腺癌患者无进展生存（Progression-Free Survival,PFS）分析中发现,cf DNA高丰度组的PFS显着低于cf DNA低丰度组（P<0.05）。TP53基因突变组PFS较野生型组亦显着降低（P<0.05）。结论:cf DNA丰度、完整性、CNV及TP53突变状态是乳腺癌患者潜在的预后标志物,对乳腺癌患者的疾病状态监控具有重要的预测价值。
二、EGFR定量与乳腺癌生物学特征关系的探讨（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、EGFR定量与乳腺癌生物学特征关系的探讨（论文提纲范文）
（1）转录因子AP-1与三阴型乳腺癌的关系及其抑制剂T5224对三阴型乳腺癌细胞的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 乳腺癌 |
| 1.1.1 流行病学特征 |
| 1.1.2 乳腺癌分型 |
| 1.1.3 乳腺癌治疗 |
| 1.1.4 乳腺癌预后 |
| 1.1.5 三阴型乳腺癌 |
| 1.2 AP-1蛋白 |
| 1.2.1 AP-1与炎症性疾病 |
| 1.2.2 AP-1与肿瘤 |
| 1.3 AP-1抑制剂 |
| 1.3.1 SP100030 |
| 1.3.2 Curcumin |
| 1.3.3 Momordin I |
| 1.3.4 T5224 |
| 1.4 立题依据 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 资料来源 |
| 2.2 细胞株 |
| 2.3 主要试剂 |
| 2.4 主要仪器 |
| 2.5 细胞培养 |
| 2.6 T5224配制 |
| 2.7 RNA提取 |
| 2.8 全基因组基因表达检测(RNA-Seq) |
| 2.9 实时荧光定量PCR |
| 2.10 Western-blot |
| 2.11 基因沉默 |
| 2.12 增殖实验 |
| 2.13 凋亡实验 |
| 2.14 划痕实验 |
| 2.15 侵袭实验 |
| 2.16 ChIP-qPCR |
| 2.17 统计分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 Fra-1在乳腺癌中的表达水平及其与预后的关系 |
| 3.1.1 Fra-1在乳腺癌患者组织内的表达水平 |
| 3.1.2 Fra-1表达水平与乳腺癌患者预后的关系 |
| 3.2 T5224 对三阴型乳腺癌的作用效果研究 |
| 3.2.1 AP-1在乳腺癌细胞中的表达水平 |
| 3.2.2 三阴型乳腺癌细胞中T5224对AP-1表达水平的抑制作用 |
| 3.2.3 T5224 对三阴型乳腺癌细胞生物学功能的影响 |
| 3.2.4 T5224 对三阴型乳腺癌细胞全基因组基因表达的影响 |
| 3.3 AP-1靶基因筛选及功能验证 |
| 3.3.1 AP-1靶基因筛选 |
| 3.3.2 OLFML2A在三阴型乳腺癌中的生物学功能 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 转录因子AP-1在三阴型乳腺癌中的表达水平 |
| 4.2 T5224 的生物学作用 |
| 4.3 T5224 对三阴型乳腺癌细胞全基因组基因表达的影响 |
| 4.3.1 血管形态发生对乳腺癌的影响 |
| 4.3.2 粘着斑及细胞外基质对乳腺癌的影响 |
| 4.3.3 免疫系统及干扰素对乳腺癌的影响 |
| 4.3.4 PI3K-Akt信号通路对乳腺癌的影响 |
| 4.3.5 人乳头瘤病毒对乳腺癌的影响 |
| 4.3.6 Hippo信号通路对乳腺癌的影响 |
| 4.3.7 钙信号通路对乳腺癌的影响 |
| 4.4 嗅素结构域蛋白家族与肿瘤 |
| 4.5 AP-1相关信号传导途径与乳腺癌 |
| 4.6 下一步研究计划 |
| 第5章 结论 |
| 本研究的创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在攻读学位期间的科研成果 |
| 项目支撑和资金支持 |
| 致谢 |
（2）平分型GlcNAc糖基化修饰调控乳腺癌发展及耐药性的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 乳腺癌概述 |
| 1.2 平分型GlcNAc糖基化修饰概述 |
| 1.3 整合蛋白β1 |
| 1.4 细胞外囊泡 |
| 1.5 小细胞外囊泡 |
| 1.5.1 sEV的形成 |
| 1.5.2 sEV与肿瘤微环境 |
| 1.5.3 sEV与肿瘤的多药耐药性 |
| 1.6 癌症与多药耐药性 |
| 1.6.1 多药耐药性概述 |
| 1.6.2 药物转运蛋白 |
| 1.6.3 细胞迁移与细胞耐药 |
| 1.6.4 DNA修复机制与细胞耐药 |
| 1.6.5 肿瘤微环境与细胞耐药 |
| 1.6.6 糖基化修饰与细胞耐药 |
| 1.7 研究内容及意义 |
| 第二章 平分型 GlcNAc水平影响乳腺癌细胞表型 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 细胞株 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.2.4 试剂配制方法 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞复苏 |
| 2.3.2 细胞传代 |
| 2.3.3 细胞冻存 |
| 2.3.4 RNA提取 |
| 2.3.5 逆转录-聚合酶链式反应 |
| 2.3.6 MGAT3 过表达质粒构建 |
| 2.3.7 慢病毒转染 |
| 2.3.8 细胞裂解及蛋白提取 |
| 2.3.9 免疫印迹/凝集素印记 |
| 2.3.10 免疫荧光染色 |
| 2.3.11 Transwell检测细胞迁移 |
| 2.3.12 划痕检测细胞迁移 |
| 2.3.13 细胞凋亡检测 |
| 2.3.14 克隆形成能力检测 |
| 2.3.15 小鼠体内乳腺癌细胞肺迁移实验 |
| 2.3.16 人乳腺癌组织芯片免疫染色 |
| 2.3.17 小鼠肿瘤组织切片苏木精/伊红染色 |
| 2.3.18 数据分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 乳腺癌细胞过表达MGAT3 的验证 |
| 2.4.2 过表达MGAT3 对细胞表型的影响 |
| 2.4.3 过表达MGAT3 对细胞迁移能力的影响 |
| 2.4.4 过表达MGAT3 对乳腺癌细胞肺迁移能力研究 |
| 2.4.5 MGAT3 及平分型GlcNAc水平影响乳腺癌病人生存期 |
| 2.5 本章小结与讨论 |
| 第三章 sEV影响受体细胞迁移能力 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 细胞株 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.2.4 试剂配制方法 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 无sEV血清的制备 |
| 3.3.3 供体细胞条件培养基的提取 |
| 3.3.4 Transwell细胞迁移能力检测 |
| 3.3.5 划痕检测细胞迁移 |
| 3.3.6 细胞凋亡检测 |
| 3.3.7 细胞裂解及蛋白提取 |
| 3.3.8 免疫印迹/凝集素印记 |
| 3.3.9 细胞共培养模型 |
| 3.3.10 Edu方法检测细胞增殖 |
| 3.3.11 sEV提取 |
| 3.3.12 密度梯度离心 |
| 3.3.13 透射电镜样品制备 |
| 3.3.14 免疫电镜样品制备 |
| 3.3.15 纳米颗粒粒径分析 |
| 3.3.16 琥珀酰亚胺酯染色s EV |
| 3.3.17 免疫荧光染色检测受体细胞摄入s EV |
| 3.3.18 流式检测受体细胞摄入s EV |
| 3.3.19 克隆形成能力检测 |
| 3.3.20 数据分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 供体细胞的条件培养基影响受体细胞表型 |
| 3.4.2 共培养模型供体细胞分泌物对受体细胞的表型影响 |
| 3.4.3 sEV影响受体细胞迁移能力 |
| 3.4.4 sEV的表征 |
| 3.4.5 受体细胞对sEV的摄入 |
| 3.4.6 sEV中平分型GlcNAC水平的检测 |
| 3.4.7 不同来源sEV对受体细胞表型的影响 |
| 3.5 本章小结与讨论 |
| 第四章 sEV中整合蛋白β1 的平分型GlcNAc修饰影响受体细胞迁移的机制研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 主要试剂 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 试剂配制方法 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 细胞裂解及蛋白提取 |
| 4.3.3 免疫印迹/凝集素印记 |
| 4.3.4 病人血浆sEV提取 |
| 4.3.5 带有平分型GlcNAc修饰的蛋白质谱鉴定 |
| 4.3.6 免疫沉淀和免疫共沉淀 |
| 4.3.7 密度梯度离心 |
| 4.3.8 免疫电镜样品制备 |
| 4.3.9 NHS-biotin标记s EV |
| 4.3.10 流式检测受体细胞膜表面的integrinβ1 |
| 4.3.11 磷酸激酶阵列分析 |
| 4.3.12 蔗糖和乳糖处理 |
| 4.3.13 细胞迁移能力检测 |
| 4.3.14 小鼠乳腺癌细胞肺迁移能力检测 |
| 4.3.15 数据分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 平分型GlcNAc修饰的糖肽质谱鉴定 |
| 4.4.2 质谱鉴定到的糖蛋白功能分析 |
| 4.4.3 平分型GlcNAc修饰的integrinβ1 的鉴定 |
| 4.4.4 sEV中 integrinβ1 的检测 |
| 4.4.5 sEV中 integrinβ1 的平分型GlcNAc修饰水平检测 |
| 4.4.6 Integrinβ1 通过s EV进入受体细胞 |
| 4.4.7 Integrinβ1 启动受体细胞中FAK信号通路 |
| 4.4.8 Integrinβ1 的平分型GlcNAc修饰水平影响受体细胞的迁移能力 |
| 4.4.9 乳腺癌病人血浆sEV对 MCF7 细胞迁移能力的影响 |
| 4.4.10 sEV影响乳腺癌细胞肺转移能力 |
| 4.4.11 数据库分析MGAT3和integrinβ1 水平与乳腺癌病人生存期的关系 |
| 4.5 本章小结与讨论 |
| 第五章 平分型GlcNAc修饰影响乳腺癌细胞化疗耐药性的机制研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 细胞株 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.2.3 主要仪器 |
| 5.2.4 主要试剂配制 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 细胞培养及耐药细胞株诱导 |
| 5.3.2 质粒构建 |
| 5.3.3 细胞裂解及蛋白提取 |
| 5.3.4 免疫印迹/凝集素印记 |
| 5.3.5 免疫荧光检测平分型GlcNAc水平 |
| 5.3.6 流式检测细胞表面平分型GlcNAc水平 |
| 5.3.7 酶联免疫吸附法检测乳腺癌病人血浆中平分型GlcNAc水平 |
| 5.3.8 细胞活力检测 |
| 5.3.9 流式检测细胞凋亡 |
| 5.3.10 RNA提取和反转录RCR |
| 5.3.11 RT-PCR检测细胞内MGAT3和P-gp的 mRNA表达 |
| 5.3.12 免疫沉淀-质谱检测 |
| 5.3.13 免疫沉淀和免疫共沉淀 |
| 5.3.14 NHS-biotin标记膜蛋白 |
| 5.3.15 数据分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 化疗药物处理降低细胞内MGAT3 和平分型GlcNAc的水平 |
| 5.4.2 耐药细胞和耐药病人血清中的平分型GlcNAc水平下调 |
| 5.4.3 提高平分型GlcNAc修饰降低细胞的药物耐受性 |
| 5.4.4 过表达MGAT3 细胞药物耐受性下降 |
| 5.4.5 化疗药物处理不改变MGAT3-mRNA水平 |
| 5.4.6 化疗药物处理导致MGAT3 通过蛋白酶体途径降解 |
| 5.4.7 平分型GlcNAc修饰水平影响P-gp在细胞内的含量 |
| 5.4.8 P-gp带有平分型GlcNAc修饰 |
| 5.4.9 平分型GlcNAc修饰水平导致细胞膜表面P-gp的含量差异 |
| 5.4.10 高平分型GlcNAc修饰的P-gp通过多种途径发生降解 |
| 5.4.11 平分型GlcNAc通过P-gp影响细胞耐药性 |
| 5.5 本章小结与讨论 |
| 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）ROCK1在膀胱癌中表达及功能的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 R0CK1在膀胱癌病人样本中表达与预后的相关性 |
| 前言 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 R0CK1在膀胱癌细胞系中表达与敲低细胞系构建 |
| 前言 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分 ROCK1敲低对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响 |
| 前言 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 附图 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 膀胱癌的分子生物学特征及发病机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 附英文文章 |
（4）MicroRNA-139-5p靶向调节SOX8抑制三阴性乳腺癌的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 引言 |
| 乳腺癌流行病学概述 |
| 乳腺癌的治疗及靶向药物 |
| 三阴性乳腺癌的靶向治疗策略 |
| SOX8在三阴性乳腺癌中可能的作用 |
| miRNA-139-5p简介 |
| 拟解决的科学问题及研究意义 |
| 附图表 |
| 第一部分 SOX8对三阴性乳腺癌细胞生物学行为的影响 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 小结 |
| 附图表 |
| 第二部分 microRNA-139-5p调控肿瘤细胞中SOX8表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 小结 |
| 附图表 |
| 第三部分 miRNA-139-5p调控SOX8对三阴性乳腺癌的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 小结 |
| 附图表 |
| 讨论与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 三阴性乳腺癌的生物标记物 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文Ⅰ |
| 外文论文Ⅱ |
（5）抗菌肽LL-37激活Wnt信号通路诱导乳腺癌细胞增殖迁移的机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 研究LL-37/CRAMP在乳腺癌组织和细胞中的表达水平 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 证实LL-37增强乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移能力 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 证实LL-37 对乳腺癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路活化的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四部分 证实LL-37 是否可以促进巨噬细胞趋向于M2 型促肿瘤表型分化 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 人抗菌肽LL-37与肿瘤的研究和进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
（6）成纤维细胞对乳腺上皮细胞生长分化的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 肿瘤微环境与生长因子受体相关研究进展 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间研究情况 |
| 致谢 |
（7）ILK对食管鳞癌恶性表型的影响及其功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 ILK表达与消化系统恶性肿瘤临床表型及预后相关性的Meta分析 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 检索数据库 |
| 1.2 文献纳入和排除标准 |
| 1.3 文献筛选和资料提取 |
| 1.4 研究方法学质量评价 |
| 1.5 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 ILK对食管鳞癌细胞恶性表型的功能影响 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 细胞系及来源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 ILK对食管鳞癌体内成瘤性的影响及生物信息学分析 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验动物来源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 整合素连接激酶在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 新疆医科大学博士研究生学位论文 导师评阅表 |
（8）基于TMT蛋白质组学的差异蛋白PP1γ在胶质瘤中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 胶质瘤差异表达蛋白的筛选和初步验证 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 仪器与试剂 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 差异蛋白PP1γ与胶质瘤临床病理特征及预后的关系 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 仪器与试剂 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 PP1γ对胶质瘤细胞生物学行为的影响及机制研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 仪器与试剂 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 数据统计 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 蛋白磷酸酶 1 与恶性肿瘤关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术成果 |
| 个人简介 |
| 新疆医科大学博士研究生学位论文 导师评阅表 |
（9）PA-MSHA联合紫杉醇对三阴性乳腺癌细胞的抑制作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 乳腺癌的流行病学 |
| 1.2 乳腺癌的分子分型 |
| 1.3 TNBC的治疗 |
| 1.3.1 TNBC的化学化疗 |
| 1.3.2 TNBC的免疫治疗 |
| 1.4 PA-MSHA在肿瘤中的研究 |
| 1.4.1 PA-MSHA在肝癌中的研究 |
| 1.4.2 PA-MSHA在宫颈癌中的研究 |
| 1.4.3 PA-MSHA在膀胱癌中的研究 |
| 1.4.4 PA-MSHA在肺癌中的研究 |
| 1.4.5 PA-MSHA在乳腺癌中的研究 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系及培养条件 |
| 2.1.2 实验试剂及耗材 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 实验试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 CCK8 法检测细胞增殖 |
| 2.2.3 划痕实验检测PA-MSHA对细胞迁移影响 |
| 2.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.2.5 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 2.2.6 qRT-PCR检测mRNA表达 |
| 2.2.7 Western Blot检测蛋白表达 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 细胞增殖改变 |
| 3.1.1 不同浓度的PA-MSHA和紫杉醇作用于TNBC不同时间后对细胞增殖的影响 |
| 3.1.2 PA-MSHA和紫杉醇联合用药对TNBC细胞增殖的影响 |
| 3.2 PA-MSHA对 TNBC细胞迁移能力的影响 |
| 3.3 PA-MSHA、紫杉醇及联合用药对TNBC细胞凋亡的影响 |
| 3.4 PA-MSHA对TNBC细胞周期的影响 |
| 3.5 PA-MSHA、紫杉醇及联合用药对TNBC细胞相关mRNA表达的影响 |
| 3.6 PA-MSHA、紫杉醇及联合用药对TNBC细胞相关蛋白表达的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 研究结论 |
| 5.2 研究展望 |
| 5.3 创新点及局限性 |
| 参考文献 |
| 综述 铜绿假单胞菌注射液抗肿瘤作用机制的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（10）血浆游离DNA在乳腺癌预后评估中的价值（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| (一)前言 |
| (二)材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 分离血浆 |
| 2.2 提取血浆中cf DNA |
| 2.3 检测cf DNA丰度和完整性 |
| 2.4 游离DNA文库构建 |
| 2.5 检测游离DNA拷贝数变异CNV |
| 2.6 检测游离DNA点突变(SNV) |
| 2.7 统计学分析 |
| (三)结果 |
| 1.乳腺癌患者的一般临床特征 |
| 2.cfDNA丰度、完整性、CNV及 CA15-3 水平比较 |
| 3.cfDNA基因突变与临床参数相关性分析 |
| 4.cfDNA丰度及TP53 突变与乳腺癌患者不良预后相关 |
| (四)讨论 |
| (五)结论 |
| (六)参考文献 |
| 三、综述 |
| (一)综述 循环游离 DNA 在癌症中的作用 |
| (二)参考文献 |
| 四、攻读学位期间发表文章情况 |
| 五、致谢 |
四、EGFR定量与乳腺癌生物学特征关系的探讨（论文参考文献）
- [1]转录因子AP-1与三阴型乳腺癌的关系及其抑制剂T5224对三阴型乳腺癌细胞的作用研究[D]. 赵倩. 吉林大学, 2021(01)
- [2]平分型GlcNAc糖基化修饰调控乳腺癌发展及耐药性的机制研究[D]. 曹琳. 西北大学, 2021(12)
- [3]ROCK1在膀胱癌中表达及功能的研究[D]. 梅延辉. 山东大学, 2021(12)
- [4]MicroRNA-139-5p靶向调节SOX8抑制三阴性乳腺癌的机制研究[D]. 董亮亮. 山东大学, 2021(10)
- [5]抗菌肽LL-37激活Wnt信号通路诱导乳腺癌细胞增殖迁移的机制研究[D]. 方玉婷. 重庆医科大学, 2021(01)
- [6]成纤维细胞对乳腺上皮细胞生长分化的影响[D]. 曹入双. 西南医科大学, 2021(01)
- [7]ILK对食管鳞癌恶性表型的影响及其功能研究[D]. 马晓丽. 新疆医科大学, 2021
- [8]基于TMT蛋白质组学的差异蛋白PP1γ在胶质瘤中的作用及机制研究[D]. 薛晶. 新疆医科大学, 2021(08)
- [9]PA-MSHA联合紫杉醇对三阴性乳腺癌细胞的抑制作用研究[D]. 崔乐. 兰州大学, 2021(12)
- [10]血浆游离DNA在乳腺癌预后评估中的价值[D]. 蒙勇梅. 大连医科大学, 2021(01)