一、球虫病的免疫 :活疫苗的作用（论文文献综述）
尹理君,廖申权,孙铭飞,宋忠峰,侯晓礁,李福元,吕敏娜,吴彩艳,李娟,林栩慧,蔡海明,胡俊菁,于林增,肖文婉,张健騑,戚南山,顾有方[1]（2021）在《鸡球虫毒力致弱方法及其在鸡球虫病弱毒活疫苗研发上的应用》文中研究表明鸡球虫病是由艾美耳属球虫感染引起的一种危害严重的肠道寄生原虫病,每年给全球养鸡业造成巨大经济损失。活疫苗是替代抗球虫药防控鸡球虫病的有效手段,而减毒活疫苗安全性能更高,免疫原性更好,更加稳定,有效防控鸡球虫病的暴发。通过理化致弱、鸡胚传代和早熟选育方法诱导虫株毒力减弱是常用的鸡球虫毒力致弱手段,但目前尚缺乏相关方法的系统性综述。鉴于此,为综合了解当前鸡球虫毒力致弱方法的研究进展及其在鸡球虫病弱毒活疫苗的应用研究,本文通过查阅、搜集和整理国内外文献相关研究内容,对鸡球虫强毒株致弱措施和方法及其在鸡球虫病弱毒苗应用现状进行综述,为新一代鸡球虫病弱毒活疫苗的研究提供理论依据。
程振扬[2]（2021）在《柔嫩艾美耳球虫配子体GAM22蛋白的真核表达及其免疫保护效力评价》文中提出鸡球虫病是一种呈全球性分布的寄生性原虫病,其病原有7种,其中柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）和毒害艾美耳球虫（E.necatrix）的致病性最强,分别引起鸡的急性盲肠球虫病和小肠球虫病,给养鸡业造成巨大的经济损失。目前,鸡球虫病的防治措施主要有在饲料或饮水添加药物和接种活虫苗两种方法。长期添加药物已引起耐药、污染环境和危害肉蛋品质等问题。活虫苗虽可产生较强的免疫保护效果,但存在着扩散病原、毒力返强等缺点,且生产成本较高,对免疫后鸡群的饲养管理要求较高。而基因工程疫苗可以解决这些难题。本实验室前期对柔嫩艾美耳球虫配子体蛋白Etgam22和Etgam59基因进行了克隆与原核表达,获得的重组蛋白rEtGAM22和rEtGAM59能被柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫感染鸡的康复血清识别,可提高免疫鸡的平均增重、降低卵囊产量。在此基础上,本研究利用杆状病毒表达系统对Etgam22基因进行表达,通过动物试验评价其对柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫感染的免疫保护力,并与原核表达的重组蛋白进行比较,最后通过动物试验评价rEtGAM22和rEtGAM59联合免疫的保护效果,为研制重组配子体抗原亚单位疫苗奠定基础。1.柔嫩艾美耳球虫gam22基因真核表达载体的构建及其反应原性分析将优化后的Etgam22基因插入转座载体pFastbac1构建重组质粒,命名为pFastbac1-Etgam22;然后将pFastbacl-Etgam22转化到DH1OBac感受态细胞,构建重组杆状病毒穿梭载体,命名为Bacmid-Etgam22;将Bacmid-Etgam22转染Sf9细胞获得重组杆状病毒,命名为reBac-Etgam22。重组杆状病毒在Sf9细胞诱导表达,获得真核表达蛋白rEtGAM22-e,其大小约35 kDa。用IFA检测结果显示重组蛋白能被抗原核表达蛋白rEtGAM22-p多克隆抗体识别;Western blot检测结果显示重组蛋白可被鼠抗His单抗特异性识别,也可被鼠抗重组蛋白多克隆抗体,以及柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫感染的鸡阳性血清特异性识别,显示真核表达蛋白rEtGAM22-e具有良好的反应原性和交叉反应原性。2.真核表达重组配子体蛋白rEtGAM22-e的免疫保护效力分析以黄羽鸡为试验动物,主要以成活率、平均增重、病变记分、卵囊减少率、抗球虫指数、血清抗体水平等为指标,评价杆状病毒表达蛋白rEtGAM22-e对柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫的免疫保护效果,并与原核表达蛋白rEtGAM22-p和rEtGAM59相比较。结果显示:（1）对柔嫩艾美耳球虫的免疫保护力:免疫组成活率均为100%,未免疫攻虫组为90%;真核表达的重组蛋白rEtGAM22-e组平均增重稍次于重组蛋白rEtGAM59组,但高于原核表达蛋白rEtGAM22-p组;真核表达蛋白rEtGAM22-e组病变记分高于原核表达蛋白rEtGAM22-p组和rEtGAM59组;真核表达蛋白rEtGAM22-e组卵囊减少率高于原核表达蛋白rEtGAM22-p组,但低于rEtGAM59组;原核表达蛋白rEtGAM59组ACI最高,为158.83;真核表达蛋白rEtGAM22-e组血清抗体水平显着高于原核表达蛋白rEtGAM22-p组,但低于rEtGAM59组。（2）对毒害艾美耳球虫的免疫保护力:与对柔嫩艾美耳球虫的相似,但ACI值要低。结论:rEtGAM22和rEtGAM59对柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫能产生一定的免疫保护力;真核表达的重组蛋白rEtGAM22-e免疫保护力稍高于原核表达的重组蛋白rEtGAM22-p;重组蛋白rEtGAM59免疫保护效力高于重组蛋白rEtGAM22。3.重组配子体蛋白rEtGAM22-e与rEtGAM59联合免疫的保护效力分析按上一章方法,评价rEtGAM22-e和rEtGAM59联合免疫对柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫的免疫保护效果。结果显示:（1）对柔嫩艾美耳球虫的免疫保护力:各试验组存活率均为100%;除rEtGAM22-e单免组外,其余各免疫组的平均增重均显着大于未免疫攻虫组（P<0.05）,且与未免疫未攻虫组相比差异不显着（P>0.05）;联合免疫低剂量组病变记分最低;联合免疫组卵囊减少率相近,分别为46.21%和44.70%,高于单免组;联合免疫组的抗球虫指数分别为153.43和157.65,高于单免组;联合免疫组的血清抗体水平显着高于单免组（P<0.05）。（2）对攻毒害艾美耳球虫的免疫保护力:与对柔嫩艾美耳球虫的相似,但抗球虫指数分别为158.28和160.34。结论:rEtGAM22-e和rEtGAM59联合免疫保护效力高于单一重组蛋白免疫,联合免疫剂量100 μg（50+50）的保护效力要好于200 μg（100+100）剂量。
徐向东[3]（2021）在《鉴定鸡球虫种类的多重PCR方法的建立与应用》文中研究表明鸡球虫病是由艾美耳球虫（Eimeria spp.）寄生于鸡肠道引起的一种寄生虫病,其病原有7种,常为混合感染。各种鸡球虫的流行病学、致病性、免疫原性以及对药物敏感性不尽一致。因此,对鸡球虫种类鉴定与流行病学调查有助于鸡球虫病的防控。鸡球虫种类鉴定的传统方法,主要根据卵囊形态、虫体寄生部位、眼观病变特征、潜在期等生物学特征,这不仅要饲养无球虫感染的雏鸡,而且鉴定过程费时费力。为此,本文根据鸡球虫核糖体DNA内转录间隔区1（ITS-1）序列设计7对种特异性引物,建立鉴定鸡球虫种类的单重PCR与多重PCR方法;构建球虫ITS-1重组质粒,以重组质粒DNA为球虫rDNA阳性标准品;最后用多重PCR方法对如东县20个养殖户的31个鸡群进行鸡球虫流行病学调查。本研究建立的方法为鸡球虫病的防控提供了技术手段。1.鸡球虫种类鉴定的单重PCR方法的建立根据GenBank中柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）、毒害艾美耳球虫（E.necatrix）、堆型艾美耳球虫（E.acervulina）巨型艾美耳球虫（E.maxima）、早熟艾美耳球虫（E.praecox）、和缓艾美耳球虫（E.mitis）和布氏艾美耳球虫（E.brunetti）的ITS-1序列,设计7对种特异性引物,以7种鸡球虫的全基因组DNA为模板,分别进行PCR扩增,优化反应条件,建立7种球虫的单重PCR方法,并对其特异性和敏感性进行了研究。结果显示,每对引物均能扩增出特异性条带,其大小分别为278bp（柔嫩艾美耳球虫）、383bp（毒害艾美耳球虫）、476bp（堆型艾美耳球虫）、220bp（巨型艾美耳球虫）、390 bp（早熟艾美耳球虫）、350bp（和缓艾美耳球虫）和311 bp（布氏艾美耳球虫）,其最小检测浓度为0.01 ng。在刚地弓形虫、火鸡组织滴虫、住白细胞虫对照样本中均未扩增出任何条带,表明建立的方法具有很强特异性和较高敏感性。2.鸡球虫种类鉴定的多重PCR方法的建立在7种鸡球虫中,柔嫰、堆型和巨型艾美耳球虫在临床上最常见;柔嫰、毒害和布氏艾美耳球虫致病性大,均在盲肠中形成卵囊,且卵囊形态相似;早熟、和缓和堆型艾美耳球虫潜在期相近,卵囊形态相似。快速鉴别这些球虫种类,有助于鸡球虫病的准确诊断与防控。为此,应用上述鸡球虫虫种特异性引物,建立了能同时鉴定3种鸡球虫的多重PCR方法,并分别对其特异性和敏感性进行了研究。结果显示,每个多重PCR反应中的3对引物均能扩增出其特异性条带,其最小检测浓度为0.01 ng,其敏感性与单重PCR一致,在刚地弓形虫、火鸡组织滴虫、住白细胞虫对照样本中均未扩增出任何条带,表明建立的多重PCR方法具有很强特异性和较高敏感性。3.鸡球虫ITS-1序列重组质粒的构建及其在PCR检测中的应用纯化7种鸡球虫的单重PCR扩增产物,分别连接到pGEM-TEasy载体中,转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,经蓝白斑筛选及限制性酶切分析,获得含ITS-1序列的重组质粒;对重组质粒中插入的片段进行测序,用MegAgin 7.1.0软件进行序列分析,并采用邻位相连法（Neighbor-joiningmethod,NJ）构建系统发育进化树;分别以含鸡球虫ITS-1序列的重组质粒DNA为模板,对应已知球虫的卵囊DNA为阳性对照,用上述特异性引物进行PCR扩增,验证构建的7种鸡球虫重组质粒作为球虫rDNA阳性标准品的可能性。结果显示,柔嫩、毒害、巨型、堆型、早熟、和缓和布氏艾美耳球虫的ITS-1 片段大小分别为 278 bp、383 bp、220 bp、476 bp、390 bp、350 bp、311 bp,经系统发育进化树分析,均与GenBank中相应虫种处于同一分枝,表明重组质粒DNA可用作球虫rDNA 阳性标准品。4.多重PCR方法在鸡球虫流行病学调查中的初步应用采用饱和盐水漂浮法和多重PCR方法对如东县20个养殖户的31个鸡群进行鸡球虫种类调查。结果显示,饱和盐水漂浮法检查,65%（13/20）养殖户和64.5%（20/31）鸡群感染球虫;多重PCR检测,75%（15/20）养殖户和70.9%（22/31）鸡群感染球虫;共检测到7种球虫,柔嫩艾美耳球虫感染率为64.5%（20/31）,毒害艾美耳球虫为38.7%（12/31）,堆型艾美耳球虫为35.5%（11/31）,早熟艾美耳球虫为45.2%（14/31）,巨型耳艾美球虫为19.4%（6/31）,和缓艾美耳球虫为19.4%（6/31）,布氏艾美耳球虫为12.9%（4/31）;优势种为柔嫩艾美耳球虫;布氏艾美耳球虫感染率最低;球虫均为混合感染（100%）,混合感染2种球虫最多,为36.3%（8/22）。地面圈养鸡群的球虫感染率（80.0%）高于笼养（33.3%）。调查结果为该地区鸡球虫病有效防治提供了依据。
华恩玉[4]（2020）在《堆型艾美耳球虫配子体蛋白EaGAM56与EaGAM82的原核表达及其免疫保护作用研究》文中研究说明鸡球虫病是一种严重危害养鸡业的寄生原虫病,据不完全统计每年球虫病给家禽养殖业造成的经济损失超过30亿美元。长期以来,鸡球虫病的防控主要依赖药物。但随着球虫耐药性的不断增强以及药物残留危害食品安全,鸡球虫病的防控措施由药物防治转向疫苗免疫预防。目前,用于临床的鸡球虫病疫苗主要是活虫苗,亚单位疫苗仅见有一种,即由分离于巨型艾美耳球虫（Eimeriamaxima）配子体的3种蛋白研制而成。堆型艾美耳球虫（E.acervulina）是养鸡场流行最广泛的鸡球虫之一,可引起鸡的亚临床球虫病,影响鸡的生长发育,降低饲料利用率。迄今,国内外对堆型艾美耳球虫配子体蛋白及其基因少有报道,其重组蛋白的免疫保护力也尚无见有报道。为此,本文对堆型艾美耳球虫配子体蛋白56基因（Eagam56）与82基因（Eagam82）进行了克隆和序列分析,分别构建了 2个基因的原核表达质粒,诱导表达后鉴定了重组蛋白的免疫原性,并经动物免疫保护试验评价了重组蛋白对堆型艾美耳球虫的免疫保护力,研究结果将为研制重组配子体抗原亚单位疫苗奠定基础。1.堆型艾美耳球虫Eagam56基因的克隆表达与免疫原性分析提取堆型艾美耳球虫（扬州株）卵囊的基因组DNA,PCR扩增Eagam56基因片段,克隆至pGEM-T-Easy载体;经测序、密码子优化后连接至pET-28a（+）质粒,构建pET-28a（+）-Eagam56表达载体,转化至大肠杆菌BL21;重组菌经酶切和测序鉴定后进行诱导表达,表达产物分别进行SDS-PAGE分析、Western-blot鉴定以及免疫原性分析。结果显示,克隆的Eagam56基因全长为1323 bp,具有一个大小为1323 bp的完整开放阅读框,编码440个氨基酸;与Genbank上的Eagam56基因序列对比,其同源性为99.9%;用在线软件对该基因编码区抗原性进行预测,发现Eagam56基因含有10个抗原决定簇,其中3个位于酪氨酸、脯氨酸富集区;重组蛋白大小约49 kDa,以可溶蛋白形式居多,可被HIS单抗特异性识别,也可被鼠抗重组蛋白多克隆抗体,以及堆型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫（E.necatrix）、巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）感染的鸡阳性血清特异性识别,显示重组蛋白EaGAM56具有良好的免疫原性和交叉抗原性。2.堆型艾美耳球虫Eagam82基因的克隆表达与免疫原性分析提取堆型艾美耳球虫（扬州株）卵囊的基因组DNA,PCR扩增Eagam82基因片段,克隆至pGEM-T-Easy载体;经测序、密码子优化后连接至pET-28a（+）质粒,构建pET-28a（+）-Eagam82表达载体,转化至大肠杆菌BL21;重组菌经酶切和测序鉴定后,对表达产物进行SDS-PAGE分析、Western-blot鉴定以及免疫原性分析。结果显示,克隆的Eagam82基因全长为1704bp,具有一个大小为1704bp的完整开放阅读框,编码568个氨基酸;与Genbank上的Eagam8基因序列对比,其同源性为99.4%;用在线软件对该基因编码区抗原性进行预测,发现Eagam82基因含有15个抗原决定簇,其中2个位于酪氨酸、脯氨酸富集区;重组蛋白大小约82 kDa,以可溶蛋白形式为多;可被HIS单抗特异性识别,也可被鼠抗重组蛋白多克隆抗体,以及堆型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫感染的鸡阳性血清特异性识别,显示重组蛋白EaGAM82具有良好免疫原性和交叉抗原性。3.重组蛋白rEaGAM56和rEaGAM82及其联合免疫对堆型艾美耳球虫的免疫保护力以黄羽肉鸡为试验动物,以鸡的增重、相对增重率、卵囊减少率、病变记分、抗球虫指数（ACI）以及血清抗体水平等为评价指标,评价重组蛋白rEaGAM56、rEaGAM82以及2种重组蛋白联合应用的免疫保护效果。结果显示,rEaGAM56与rEaGAM82高（200 μg/鸡）、中（100 μg/鸡）剂量免疫组以及联合免疫组,鸡临床症状减轻。随着免疫剂量的增加,鸡的相对增重率与卵囊减少率增加,平均肠道病变记分减少。联合免疫高剂量组（各100 μg/鸡重组蛋白）的相对增重率与卵囊减少率达73.74%和74.27%。rEaGAM56、rEaGAM82、联合免疫高剂量组的 ACI 分别为 148.24、143.92 和 148.74。rEaGAM56的免疫保护力较rEaGAM82的强,rEaGAM56和rEaGAM82免疫鸡后均能产生血清抗体。结论:两种重组蛋白免疫均能产生一定的免疫保护力。
余水兰[5]（2020）在《柔嫩艾美耳球虫免疫增强剂筛选与早熟株相关基因研究》文中研究表明鸡球虫病是由艾美耳属球虫感染引起的一种家禽传染性寄生虫病。由于使用药物防治球虫病会产生耐药性及药物残留的问题,因此迫切需要免疫预防替代药物成为球虫病控制的主导途径。由早熟株卵囊组成的减毒活疫苗是目前应用最广泛的球虫病疫苗,但球虫活疫苗对免疫鸡的生长具有潜在不良影响。研究发现免疫增强剂不仅可增强球虫活疫苗的免疫效果,同时也可降低接种疫苗带来的不良影响。与母株相比,球虫早熟株具有潜在期明显缩短、致病性减弱、繁殖能力降低等独特的生物学特性,但其早熟的分子机制不明。为此,本研究一方面通过笼养试验和平养试验研究盐酸左旋咪唑、黄芪多糖、壳寡糖、地衣芽孢杆菌、酵母多糖等对柔嫩艾美耳球虫的免疫增强效果和免疫鸡增重的影响,以筛选获得每种免疫增强剂的有效剂量,为筛选球虫活疫苗的免疫增强剂奠定基础;另一面通过RNA-seq技术筛选柔嫩艾美耳球虫早熟株与母株孢子化卵囊的转录组差异,并对其中两个差异表达基因——柔嫩艾美耳球虫颈部蛋白2和3（EtRON2和EtRON3）的功能和特性进行初步分析,为探讨早熟性状产生的分子机制奠定基础。1.五种免疫增强剂对柔嫩艾美耳球虫免疫增强效果的评价——笼养试验通过笼养试验评价盐酸左旋咪唑、黄芪多糖、壳寡糖、地衣芽孢杆菌、酵母多糖的不同剂量对柔嫩艾美耳球虫早熟株卵囊的免疫增强效果,以筛选每种免疫增强剂的有效剂量。3日龄雏鸡进行首次免疫并服用免疫增强剂,10日龄时仅用卵囊进行二免,17日龄时用柔嫩艾美耳球虫野毒株进行攻虫,以免疫期间体重、攻虫后的抗球虫指数（ACI）以及试验期间血清IgG和IgM抗体水平等作为评判指标。结果显示,0.05 mg～0.1 mg盐酸左旋咪唑、2.5 mg～5 mg黄芪多糖、2.5 mg～7.5 mg壳寡糖、1.25 mg酵母多糖以及10 mg地衣芽孢杆菌对柔嫩艾美耳球虫感染鸡具有免疫增强和促生长双重作用。2.五种免疫增强剂对柔嫩艾美耳球虫的免疫增强研究——平养试验通过平养试验对笼养试验中所获得的5种免疫增强剂的有效剂量进一步验证。3日龄雏鸡用柔嫩艾美耳球虫早熟株卵囊进行免疫并服用免疫增强剂,24日龄用柔嫩艾美耳球虫野毒株进行攻虫,以免疫期间体重、攻虫后的抗球虫指数（ACI）以及试验期间血清IgG和IgM抗体、CD4和CD8分子、细胞因子（TNF-α、TGF-β1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10）水平等作为评价指标。结果显示,0.1 mg盐酸左旋咪唑可明显促进鸡CD4、CD8因子的增殖和TNF-α、IL-2的分泌,明显提高柔嫩艾美耳球虫的免疫效果,且有促生长的作用。2 mg和6 mg地衣芽孢杆菌、5 mg和7.5 mg壳寡糖、2.5 mg酵母多糖均可明显促进鸡CD8分子的增殖和TNF-α的分泌,具有免疫增强和促生长的作用。5 mg黄芪多糖对柔嫩艾美耳球虫感染鸡具有促生长作用,但免疫增强效果不显着,黄芪多糖对球虫具有免疫增强作用的有效剂量仍需进一步研究。3.柔嫩艾美耳球虫早熟株和母株孢子化卵囊的转录组分析继续对本实验室前期获得的柔嫩艾美耳球虫早熟株进行早熟选育,经过11次的早熟株选育,潜在期由126 h缩短到107 h,缩短了19 h,与同源母株的潜在期141 h相比,缩短了34 h。通过RNA-seq技术比较了该早熟株与母株之间孢子化卵囊的转录组差异,筛选两个虫株之间的差异表达基因。结果共鉴定出差异表达基因6602个,早熟株上调表达基因3888个,下调表达基因2714个。这些差异基因主要与阳离子结合、未折叠蛋白结合、磷酸酯水解酶活性等功能相关,参与细胞内吞作用、泛素介导的蛋白水解、谷胱甘肽代谢、内质网蛋白加工等通路。利用qPCR对转录组数据分析获得的22个差异表达基因和5个非差异表达基因进行验证,结果显示27个基因的mRNA转录水平均与RNA-seq结果一致。研究结果为探索球虫早熟性状产生的分子机制奠定基础。4.柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2和3特性与功能初步分析根据转录组学结果,选取两个早熟株下调基因——柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2和3（EtRON2和EtRON3）进行特性和功能的初步研究。结果显示,EtRON2的mRNA转录水平在孢子化卵囊中最高,未孢子化卵囊和第二代裂殖子次之,子孢子最低;蛋白主要分布在游离的子孢子、胞内子孢子和第二代裂殖子顶端棒状体的位置,以及未成熟裂殖体的细胞质中;其抗体对子孢子入侵DF-1细胞具有显着的抑制作用。EtRON3转录水平在孢子化卵囊阶段转录水平最高,未孢子化卵囊阶段次之,第二代裂殖子和子孢子最低;蛋白主要分布在游离的子孢子和胞内子孢子顶端棒状体的位置,第二代裂殖子的胞质以及未成熟裂殖体的表面;其抗体对子孢子入侵DF-1细胞具有显着的抑制作用。EtRON2和EtRON3在早熟株孢子化卵囊中转录水平均明显低于母株,与转录组学分析的结果一致,这提示EtRON2和EtRON3与早熟性状的产生有着一定的关系。但是EtRON2和EtRON3在球虫入侵以及发育调节中的作用仍需深入研究。
汪飞燕[6]（2020）在《毒害艾美耳球虫配子体抗原的免疫保护分析》文中认为鸡是具有重要经济意义的家禽品种,其生长速度快,成熟早,产代间隔短,便于人们在短期内获得量多且质优的家禽产品。在许多发达国家和发展中国家,家禽是动物蛋白的主要来源。然而,鸡球虫病的广泛传播不仅危害了动物福利,也限制了全球养鸡业的发展,毒害艾美耳球虫（E.necat）rix是鸡球虫病的重要病原,在临床上常危害8～18周龄的鸡,引起鸡的急性小肠球虫病。近年来,在我国随着生长周期较长的黄羽鸡饲养数量的不断攀升,以及采用地面平养方式,使得由毒害艾美耳球虫引起的球虫病呈上升趋势,给养鸡业带来很大的经济损失,因此开展球虫病的防治研究至关重要。已有报道,柔嫩艾美耳球虫天然配子体抗原的单克隆抗体可以有效抑制配子体的受精过程,首次证实了艾美耳球虫配子生殖阶段抗原的免疫原性,且在近几年得到了广泛的研究。本文分析了毒害艾美耳球虫不同感染剂量下的卵囊产量情况;同时,克隆表达了毒害艾美耳球虫配子体抗原基因Engam56;通过免疫保护性试验证实,体外重组表达的全长配子体蛋白rEnGAM56（rEnGAM56-F）对毒害艾美耳球虫的感染具有一定的免疫保护效果;同时将本研究室前期已验证并高效表达的rEnGAM56截短重组蛋白（rEnGAM56-T）进行免疫保护试验,探索并比较两种重组蛋白的免疫保护效果。最后,选取3种配子体抗原联合免疫鸡群,包括rEnGAM22、rEnGAM56-T和rEnGAM59,结果显示三种蛋白同时免疫的保护效果高于两种或一种蛋白免疫,进而为球虫多价亚单位疫苗的研制和开发奠定基础。1.不同感染剂量对毒害艾美耳球虫繁殖力的影响为研究不同感染剂量对毒害艾美耳球虫繁殖力的影响,设4个感染剂量组:500、2 500、5 000和10 000个孢子化卵囊/鸡;一个无感染阴性对照组,每组5只23日龄雏鸡。经鸡嗉囊接种卵囊。感染后鸡粪便中出现卵囊起至第16天,每天用麦克马斯特氏法对各组粪便中的卵囊进行计数;在感染后第16天扑杀鸡,取盲肠进行卵囊计数。结果显示,各试验组鸡均未发生死亡,但10 000个卵囊感染组的临床症状最为严重;感染后144 h粪便中查有卵囊,500、2 500和5 000个卵囊感染组均出现2个排卵囊峰值,10 000个卵囊感染组只出现1个峰值;各感染组在第7～13天产出的卵囊量均占总产量的94.74%以上;每只鸡粪便中排出的卵囊数随感染剂量的增加而增加,但单个卵囊的产量随感染剂量的增加而减少;感染后第16天,盲肠中卵囊数不到总卵囊量的1%。试验结果显示,在疫苗生产或增殖传代时,感染剂量可选择10000个卵囊/鸡,在感染后第7～13天收集粪便中卵囊。2.毒害艾美耳球虫Engam56基因的克隆与序列分析分离纯化毒害艾美耳球虫配子体,提取基因组DNA,分3段扩增Engam56基因,插入到T载体,挑取阳性克隆测序,将3段核苷酸序列进行拼接,获取Engam56基因全长序列。试验结果表明,Engam56基因全长为1 407 bp,编码468个氨基酸,且为一个完整的开放阅读框,前20个氨基酸为信号肽,预测分子量大小约为58.0 kDa。抗原决定簇在线分析软件预测此编码蛋白共含有10个抗原决定簇,与巨型艾美耳球虫配子体蛋白EmGAM56和EmGAM82相类似,Engam56基因编码的蛋白也含有一个酪氨酸-丝氨酸和一个脯氨酸-甲硫氨酸富集区。其中,酪氨酸-丝氨酸富集区（第246～323位）位于1个完整的抗原决定簇中,且为10个抗原决定簇中最长;脯氨酸-甲硫氨酸富集区（第338～454位）内含有1个抗原决定簇。序列比对结果显示,Engam56与其他艾美耳属配子体蛋白编码基因的同源性为59.3%到99.2%。综合以上序列分析结果,扩增的Engam56基因确为配子体蛋白编码基因,且基因保守性较高。3.毒害艾美耳球虫Engam56基因的原核表达与鉴定经软件预测全长Engam56基因编码的氨基酸序列,去除信号肽,根据大肠杆菌的最适氨基酸密码子,优化合成,选取BamH I和Xho I酶切位点,插入原核表达载体pET28a（+）,命名为pET28a（+）-Engam56。常规转化表达菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达。试验结果显示,重组表达的蛋白大小约为58.0 kDa左右,且主要在包涵体中表达。Western blot检测结果显示,重组表达的蛋白能够被6×HIS标签单抗特异性识别,同时能被鼠抗重组蛋白多抗和毒害艾美耳球虫病鸡康复血清识别,证实此体外重组表达的蛋白为特异性表达的蛋白,且具有较好的免疫原性。4.毒害艾美耳球虫重组配子体抗原rEnGAM56的免疫保护分析黄羽肉鸡为试验动物,以病变记分、平均增重、卵囊产量,体液抗体水平和细胞因子变化等作为评价指标,将全长Engam56基因的重组蛋白rEnGAM56-F与研究室前期已成功诱导表达的截短Engam56基因的重组蛋白rEnGAM56-T同时进行免疫保护试验,并进行比较分析。结果显示,综合病变记分、平均增重、卵囊产量,rEnGAM56-T低剂量组（50μg）的免疫效果最佳;综合体液抗体水平和细胞因子水平,rEnGAM56-T中剂量组的效果最佳,其次为rEnGAM56-T低剂量组。结论:rEnGAM56-F和rEnGAM56-T重组蛋白对鸡群均具有一定的免疫保护效果,综合检测指标,重组蛋白rEnGAM56-T免疫效果优于rEnGAM56-F,以rEnGAM56-T中剂量组和低剂量组的免疫保护效果最佳。5.毒害艾美耳球虫三种重组配子体抗原的联合免疫保护分析黄羽肉鸡为试验动物,以攻虫前后的平均增重、相对增重率;攻虫后的病变记分与卵囊减少率等作为评价指标,初步研究了重组蛋白rEnGAM22、rEnGAM56-T、rEnGAM59的免疫保护效果,并检测了重组蛋白诱导产生的特异性抗体水平。结果显示,综合病变记分、平均增重,卵囊产量,rEnGAM（22+59+56-T）组的效果最佳,其次为rEnGAM22组和rEnGAM（22+56-T）组。而在体液抗体水平和细胞因子变化检测中,rEnGAM（22+59+56-T）组最佳,其次为rEnGAM（22+56-T）组和rEnGAM22组。结论:验证了蛋白联合免疫的效果优于蛋白单独免疫,其中3种蛋白联合免疫的效果优于2种蛋白,本试验研究为球虫多价亚单位疫苗的研制奠定了理论基础。
郝飞飞[7]（2019）在《鸡球虫病活疫苗基因佐剂IL-2、IL-4实验室效力和安全性研究》文中研究指明为探讨基因佐剂IL-2、IL-4对鸡球虫病活疫苗的免疫增强效果和安全性,本试验使用SPF雏鸡,以基因佐剂pCI-chIL-4-EGFP、pCI-chIL-2-EGFP和pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP配合鸡球虫病三价四株活疫苗对雏鸡进行免疫攻毒,对基因佐剂的免疫增效作用进行检验;同时对基因佐剂的实验室安全性和体内分布表达情况进行研究。结果表明:（1）各佐剂接种组均能达到疫苗效力检验标准;随给药剂量的增加,免疫攻毒后鸡只的相对增重率（RWG）、抗球虫指数（ACI）升高;但剂量超过250μg/只时,其ACI、RWG反而下降;100μg/只pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP单独给药,50μg/只pCI-chIL-2-EGFP和200μg/只pCI-chIL-4-EGFP联合给药时,ACI值均达到高效。表明pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP单独给药、pCI-chIL-2-EGFP和pCI-chIL-4-EGFP联合给药剂量分别为100μg/只、50μg/只和200μg/只。（2）球虫疫苗免疫同时肌注100μg/只pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP,免疫间隔时间佐剂添加组≥6 d、免疫攻毒组≥7 d时,均可达到良好免疫效果,符合效力检验标准。表明pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP可使鸡球虫病活疫苗免疫间隔缩短1 d。（3）口服组（100300μg/只）ACI随接种剂量增加而升高。其中当口服给药为300μg/只时,其ACI（188.41）与肌注100μg/只ACI（190.49）接近,达到高效。表明鸡口服pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP可以起到免疫增效作用,但给药剂量为肌注的3倍。（4）佐剂添加组在二免后≥5 d和免疫攻毒组≥6 d攻毒时,符合效力检验标准。表明球虫疫苗配合接种100μg/只pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP时,免疫产生期缩短1 d。（5）pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP一次单剂量（100μg/只）、重复单剂量、一次超剂量（10倍）肌注组均无鸡死亡;鸡体温均在39.640.7℃之间,符合健康鸡正常体温;实验组平均增重与空白组差异不显着（p>0.05）;各组鸡未见眼观和镜检病变,基因佐剂未在体内的微生物中进行转移整合。表明该佐剂的安全性符合兽用生物制品的要求。（6）以100μg/只pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP肌注和口服给药鸡,接种部位最先检测到质粒;其次是血液和心脏;肝、脾、肾和肺在最后。其中肌注部位肌肉最长可达21 d;并可从注射后8 h持续表达到14 d。表明基因佐剂通过肌注途径接种可以在体内存在21d,佐剂肌注在体内分布和表达的时间长于口服。
胡伟高[8]（2019）在《堆型艾美耳球虫涓滴免疫与脉冲免疫保护效果对比研究》文中指出鸡球虫病是严重危害鸡群健康的重大疾病之一,世界公认的鸡球虫种类有7个种,其中堆型艾美耳球虫（Eimeria acervulina）在7种鸡球虫中最为流行,也是我国常见的鸡球虫种类之一。本论文对堆型艾美耳球虫早熟疫苗株的不同免疫方式和免疫剂量进行免疫效果比较,为了解鸡抗球虫免疫力建立过程提供依据。第一部分研究为观察堆型艾美耳球虫河源株早熟系（PAHY）涓滴免疫与脉冲免疫接种鸡后的卵囊排泄规律。低剂量涓滴免疫组鸡于1日龄开始每天接种20个卵囊/羽,连续免疫接种21天;高剂量涓滴免疫组鸡于1～7日龄时每天接种20个卵囊/羽,之后于8～21日龄时每天接种1710个卵囊/羽。低剂量脉冲免疫组于3日龄、10日龄、17日龄时分别每只鸡免疫140个卵囊/羽,共免疫接种3次;高剂量脉冲免疫组鸡于3日龄时每只鸡免疫140个卵囊/羽,之后于10日龄和17日龄时每羽鸡再分别接种1710个卵囊/羽,共免疫接种3次。两个涓滴免疫组于4日龄开始连续采集粪便监测、记录卵囊排泄数据,两个脉冲免疫组于6～8日龄、13～15日龄、20～22日龄时采集粪便监测、记录卵囊排泄数据。结果表明,涓滴免疫组第一周龄期间出现排卵囊高峰期,4日龄到6日龄间排卵囊量逐步增加,在6日龄到达到高峰期,之后逐渐减少。相比脉冲免疫组排卵囊高峰期,涓滴免疫组排卵囊高峰期有所延迟,比脉冲免疫组排卵囊高峰期延后1天。低剂量涓滴免疫组第2周龄期间没有出现明显的排卵囊高峰期,高剂量涓滴免疫组第2周龄期间仍会出现排卵高峰期,但没有脉冲免疫组的高峰期明显。低剂量脉冲免疫组与高剂量脉冲免疫组均出现明显的卵囊排出高峰期,而且都在免疫接种后4天出现。经过两周的涓滴免疫和两次脉冲免疫接种后,由于鸡群产生一定的抗球虫免疫力,各免疫组在第3周龄或第三次脉冲免疫之后卵囊排出量均出现大幅下降。第二部分研究为攻虫免疫保护试验。分别于脉冲免疫的每一次免疫接种后的第7天进行攻虫试验,观察和比较堆型艾美耳球虫河源株早熟系（PAHY）涓滴免疫与脉冲免疫的免疫效果。随机抽取每个免疫组的10羽鸡进行攻虫,分析攻虫后鸡的肠道病变记分、相对增重率、卵囊减少率等指标。涓滴免疫组与脉冲免疫组经过第一次免疫周期后,进行攻虫,鸡肠道病变记分分别为:涓滴免疫攻虫组肠道病变记分3,脉冲免疫攻虫组肠道病变记分2.75,阳性对照组肠道病变记分2.75,阴性对照组肠道病变记分0。各组相对增重率分别为:涓滴免疫攻虫组94.7%,脉冲免疫攻虫组93.9%,阳性对照组89.7%,阴性对照组100%。试验结果表明,涓滴免疫组与脉冲免疫组经过第一个免疫周期均不能建立坚强的免疫保护力。鸡群经过第二次免疫周期后,进行攻虫,鸡肠道病变记分为:阳性对照组肠道病变记分（2.9）>低剂量涓滴免疫攻虫组肠道病变记分（2.15）>高剂量脉冲免疫攻虫组肠道病变记分（1.47）>低剂量脉冲免疫攻虫组肠道病变记分（0.72）>高剂量涓滴免疫攻虫组肠道病变记分（0.17）;各组相对增重率为:低剂量涓滴免疫攻虫组的相对增重率（83.3%）>高剂量脉冲免疫攻虫组（79.5%）>低剂量脉冲免疫攻虫组（74%）>高剂量涓滴免疫攻虫组（72.2%）>阳性对照攻虫组（66.2%）,各免疫组相对增重率明显高于阳性组;各组卵囊减少率为:低剂量脉冲免疫攻虫组卵囊减少率（68.3%）>高剂量脉冲免疫攻虫组卵囊减少率（13.3%）>高剂量涓滴免疫攻虫组卵囊减少率（-54.3%）>低剂量涓滴免疫攻虫组卵囊减少率（-63.4%）。经过两次免疫周期后,从试验鸡群的肠道病变记分、相对增重率、卵囊减少率等数据可以得出,各免疫组均建立了有效的免疫保护力,其中高剂量免疫组保护力较好。鸡群经过第三次免疫周期后,进行攻虫,鸡肠道病变记分为:阳性对照组肠道病变记分（2.9）>高剂量涓滴免疫攻虫组肠道病变记分（1.63）>高剂量脉冲免疫攻虫组肠道病变记分（1.4）>低剂量脉冲免疫攻虫组肠道病变记分（1.35）>低剂量涓滴免疫攻虫组肠道病变记分（1.24）;各组相对增重率为:高剂量涓滴免疫攻虫组相对增重率（77.4%）>低剂量涓滴免疫攻虫组相对增重率（76.3%）>低剂量脉冲免疫攻虫组相对增重率（76.3%）>高剂量脉冲免疫攻虫组相对增重率（74.3%）>阳性对照组相对增重率（63%）;各组卵囊减少率为:低剂量涓滴免疫攻虫组卵囊减少率（90.8%）>高剂量脉冲免疫攻虫组卵囊减少率（70.5%）>高剂量涓滴免疫攻虫组卵囊减少率（65.8%）>低剂量脉冲免疫攻虫组卵囊减少率（29.3%）。经过三次免疫周期后,各免疫组均建立了坚强的免疫保护力。从试验数据可以得出鸡群进行二次免疫周期就可以获得坚强免疫力,为养鸡生产过程中疫苗使用、垫料管理等提供理论基础。本论文分析堆型艾美耳球虫河源株早熟系（PAHY）涓滴免疫和脉冲免疫后卵囊排泄规律,并比较了涓滴免疫与脉冲免疫的免疫效果,为改进堆型艾美耳球虫免疫方法提供依据。
贡鑫[9]（2018）在《鸡IL-2与IL-4融合基因表达载体的构建、表达及体外生物学活性研究》文中认为为了提高鸡球虫病活疫苗免疫效果,增强免疫保护力,降低活疫苗副作用,缩短免疫产生期,通过以鸡白介素4（chIL-4）和鸡白介素2（chIL-2）为研究对象,构建新型细胞因子免疫佐剂chIL-4和chIL-2融合基因表达载体,研究该融合基因的佐剂作用。试验结果表明:（1）采用基因合成与双酶切连接技术,经测序鉴定成功构建携带鸡白介素4、鸡白介素2以及二者融合基因的重组真核表达载体pCI-chIL-4-EGFP、pCI-chIL-2-EGFP和pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP。（2）采用HilyMax脂质体介导方法转染小鼠成肌细胞C2C12,对转染条件进行优化,在荧光显微镜下观察,通过IPP软件分析其累计光密度值。结果表明,重组载体pCI-chIL-2-EGFP能在小鼠成肌细胞内正确表达,DNA与Hilymax脂质体比例为1:3时细胞转染率最高（29.65%±2.58%）,转染72h后蛋白表达量达到最高。（3）将构建的 pCI-chIL-4-EGFP、pCI-chIL-2-EGFP 和 pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP 三种重组质粒转染鸡胚盲肠上皮细胞、鸡胚成纤维细胞,24h-96hmRNA表达量均先升高后降低,48h极显着（P<0.01）高于其他时间段,达到峰值;累积光密度值先升高后降低,72h显着（P<0.05）或极显着（P<0.01）高于24h和48h,达到峰值,到96h已检测不到;细胞上清液荧光强度先升高后降低,72h极显着（P<0.01）高于其余三个时间段,达到峰值。转染小鼠成肌细胞24h-96h,mRNA和蛋白表达量均先升高后降低,mRNA 48h和蛋白72h极显着高于其他时间段,达到峰值;细胞上清液荧光强度先升高后降低,72h极显着（P<0.01）高于其余三个时间段,达到峰值,表明三种重组质粒均能在三种细胞中进行表达,并能持续72h以上,三种重组蛋白均能分泌到细胞外,并在72h达峰值。（4）pCI-chIL-4-EGFP、pCI-chIL-2-EGFP 和 pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP 三种重组质粒转染鸡胚盲肠上皮细胞、鸡胚成纤维细胞和小鼠成肌细胞三种细胞24h-96h的上清液均能极显着（P<0.01）促进鸡脾淋巴细胞的增殖,刺激指数均先升高后降低,72h达峰值,表明三种重组蛋白都具有生物学活性;而pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP重组质粒转染细胞的上清液对鸡脾淋巴细胞的增殖极显着（P<0.01）高于另外两种重组质粒,表明chIL-4-chIL-2融合蛋白的生物学活性显着高于chIL-4重组蛋白或chIL-2重组蛋白。
易永萍[10]（2018）在《柔嫩艾美耳球虫临床分离株生物学特性研究》文中认为艾美耳球虫引起的鸡球虫病是一种严重危害养禽业的寄生虫病,柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）属于致病力最强的一种,在集约化养鸡场中流行率较高,对鸡的生长发育和饲料转化率有明显的影响。本试验对广东博罗地区鸡柔嫩艾美耳球虫分离株进行了分离鉴定,并对分离株的卵囊大小、形状指数、潜隐期、繁殖力、致病性、耐药性以及免疫原性进行研究,为广东博罗地区柔嫩艾美耳球虫病的有效防控奠定理论基础。本研究第一部分对柔嫩艾美耳球虫临床分离株生物学特性进行研究,结果表明:卵囊平均大小为22.46μm×18.82μm,卵囊形状指数1.19,潜隐期为116 h。按1,000个孢子化卵囊感染7日龄鸡,其排卵高峰期时间为168192 h,经鸡体繁殖产生3.04×108个卵囊,每个卵囊的繁殖指数为3,000。将48只7日龄鸡平均分成6组,分别感染柔嫩艾美耳球广东博罗株孢子化卵囊0、5,000、10,000、30,000、50,000、100,000个/羽。结果表明,感染剂量越高病变越严重,剂量以感染1×105个/羽的组最严重,感染剂量达到5×104个/羽时开始引起雏鸡致死,解剖发现肠腔内无正常内容物,多见盲肠外观肿胀,盲肠肠腔内有大量带血的肠芯,盲肠壁增厚及出血点。应用特异性PCR方法进一步分子鉴定,结果确定分离株球虫卵囊为柔嫩艾美耳球虫纯种,未被其他种球虫感染。第二部分评价柔嫩艾美耳球虫的药物敏感性。将56只14日龄鸡平均分成7组,设立5个用药组、1个感染不用药对照组和1个不感染不用药对照组,以肠病变记分减少率（RLS）、血便记分比、抗球虫指数（ACI）为指标综合评定此株柔嫩艾美耳球虫对托曲珠利、癸氧喹酯、盐霉素、马杜米星铵、磺胺氯吡嗪钠等5种常用抗球虫药的耐药性。结果表明:抗球虫药中癸氧喹酯、磺胺氯吡嗪钠敏感,托曲珠利、盐霉素、马杜米星铵部分耐药。第三部分评价柔嫩艾美耳球虫的免疫原性。将分离株作为免疫虫株,以平均增重、血便记分、存活率及病变记分、粪便OPG、抗球虫指数（ACI）等评价指标对柔嫩艾美耳球虫进行免疫原性分析,结果表明:所有免疫组均产生了一定免疫保护力,其中一次免疫卵囊300个/羽抗球虫指数为192.27,其免疫效果最佳。
二、球虫病的免疫 :活疫苗的作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、球虫病的免疫 :活疫苗的作用（论文提纲范文）
（1）鸡球虫毒力致弱方法及其在鸡球虫病弱毒活疫苗研发上的应用（论文提纲范文）
| 1 鸡胚传代致弱法 |
| 1.1 鸡胚传代的背景 |
| 1.2 鸡胚传代的原理 |
| 1.3 鸡胚传代的优势与局限 |
| 2 理化致弱法 |
| 2.1 理化致弱的背景 |
| 2.2 理化致弱的原理 |
| 2.3 理化致弱的优势与局限 |
| 3 早熟卵囊选育法 |
| 3.1 早熟选育的背景 |
| 3.2 早熟选育的原理 |
| 3.3 早熟选育的优势 |
| 4 致弱方法在鸡球虫病疫苗研发上的应用 |
| 5 结语 |
（2）柔嫩艾美耳球虫配子体GAM22蛋白的真核表达及其免疫保护效力评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 1 鸡球虫免疫机理 |
| 2 鸡球虫病疫苗类型 |
| 3 本研究的目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第一章 柔嫩艾美耳球虫配子体蛋白gam22基因真核表达载体的构建及其反应原性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 真核表达重组配子体蛋白rEtGAM22-e的免疫保护效力分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 重组配子体蛋白rEtGAM22-e与rEtGAM59联合免疫的保护效力分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 附录 |
（3）鉴定鸡球虫种类的多重PCR方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述: 鸡球虫病研究概述与进展 |
| 1 鸡球虫病的病原生物学 |
| 2 鸡球虫病的临床症状与眼观病变 |
| 3 鸡球虫病的防控 |
| 4 鸡球虫种类的鉴定方法 |
| 5 本研究目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第一章 鸡球虫种类鉴定的单重PCR方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 鸡球虫种类鉴定的多重PCR方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 鸡球虫ITS-1序列重组质粒的构建及其在PCR检测中应用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 多重PCR方法在鸡球虫流行病学调查中的初步应用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（4）堆型艾美耳球虫配子体蛋白EaGAM56与EaGAM82的原核表达及其免疫保护作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 文献综述 鸡球虫病防治研究进展 |
| 1 鸡球虫的生物学特征 |
| 2 鸡球虫病的诊断与防治 |
| 3 鸡球虫病的免疫预防 |
| 4 本研究的目的与意义 |
| 第一章 堆型艾美耳球虫配子体蛋白gam56基因的克隆与表达及其免疫原性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 堆型艾美耳球虫配子体蛋白gam82基因的克隆与表达及其免疫原性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 重组蛋白rEaGAM56和rEaGAM82及其联合免疫对堆型艾美耳球虫的免疫保护力 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（5）柔嫩艾美耳球虫免疫增强剂筛选与早熟株相关基因研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 鸡球虫病 |
| 1.1.1 鸡球虫病原 |
| 1.1.2 鸡球虫病的防治 |
| 1.2 鸡球虫疫苗研究进展 |
| 1.2.1 活疫苗 |
| 1.2.2 DNA疫苗 |
| 1.2.3 亚单位疫苗 |
| 1.2.4 活载体疫苗 |
| 1.3 禽用免疫增强剂研究进展 |
| 1.3.1 微生态制剂类免疫增强剂 |
| 1.3.2 生物制剂类免疫增强剂 |
| 1.3.3 中草药及多糖类免疫增强剂 |
| 1.3.4 化学合成小分子类免疫增强剂 |
| 1.4 展望 |
| 第二章 五种免疫增强剂对柔嫩艾美耳球虫免疫增强效果的评价——笼养试验 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验虫株 |
| 2.2.3 实验试剂和仪器 |
| 2.2.4 柔嫩艾美耳球虫免疫用和攻毒用卵囊制备 |
| 2.2.5 免疫增强剂的配制 |
| 2.2.6 实验动物分组 |
| 2.2.7 免疫攻虫程序 |
| 2.2.8 主要观察指标 |
| 2.2.9 数据统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 免疫期间动物体重变化 |
| 2.3.2 免疫增强剂对攻虫后免疫效果的影响 |
| 2.3.3 血清抗体水平检测结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 五种免疫增强剂对柔嫩艾美耳球虫的免疫增强研究——平养试验 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验虫株 |
| 3.2.3 实验试剂和仪器 |
| 3.2.4 柔嫩艾美耳球虫免疫用和攻毒用卵囊制备 |
| 3.2.5 免疫增强剂的制备 |
| 3.2.6 实验动物分组 |
| 3.2.7 免疫攻虫程序 |
| 3.2.8 主要观测指标 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 免疫增强剂对免疫期间动物体重变化 |
| 3.3.2 免疫增强剂对攻虫后免疫效果的影响 |
| 3.3.3 免疫增强剂对鸡群抗体和细胞因子水平的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 柔嫩艾美耳球虫早熟株和母株孢子化卵囊的转录组分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 实验虫株 |
| 4.2.3 实验试剂和仪器 |
| 4.2.4 继续对柔嫩艾美耳球虫早熟株进行早熟选育 |
| 4.2.5 柔嫩艾美耳球虫母株卵囊的收集和纯化 |
| 4.2.6 柔嫩艾美耳球虫早熟株卵囊的繁殖和纯化 |
| 4.2.7 柔嫩艾美耳球虫早熟株和母株孢子化卵囊的转录组测序 |
| 4.2.8 荧光定量PCR验证转录组差异表达基因 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 继续对柔嫩艾美耳球虫早熟株的早熟选育结果 |
| 4.3.2 早熟株与母株转录组测序结果 |
| 4.3.3 差异基因的筛选 |
| 4.3.4 差异基因功能分类 |
| 4.3.5 转录组差异表达基因的荧光定量验证结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2和3特性与功能初步分析 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 实验虫株和细胞 |
| 5.2.2 实验试剂和仪器 |
| 5.2.3 柔嫩艾美耳球虫四个阶段虫体的纯化以及cDNA制备 |
| 5.2.4 EtRON2和EtRON3 转录水平分析 |
| 5.2.5 DF-1细胞的传代培养 |
| 5.2.6 EtRON2和EtRON3 在不同发育阶段虫体中的分布 |
| 5.2.7 EtRON2和EtRON3 多抗对子孢子入侵DF-1 细胞的影响 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 EtRON2和EtRON3 在早熟株和母株孢子化卵囊的转录水平差异 |
| 5.3.2 EtRON2和EtRON3 在不同发育阶段中转录水平的差异 |
| 5.3.3 EtRON2和EtRON3 在虫体不同发育阶段的分布情况 |
| 5.3.4 EtRON2和EtRON3 多抗对子孢子入侵DF-1 细胞的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）毒害艾美耳球虫配子体抗原的免疫保护分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1 鸡球虫活疫苗的应用与现状 |
| 2 鸡球虫核酸疫苗的应用与现状 |
| 3 鸡球虫亚单位疫苗的应用与现状 |
| 4 鸡球虫配子体疫苗的应用与现状 |
| 5 结语 |
| 参考文献 |
| 第一章 不同感染剂量对毒害艾美耳球虫繁殖力的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 毒害艾美耳球虫Engam56基因的克隆与序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 毒害艾美耳球虫Engam56基因的原核表达与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 毒害艾美耳球虫重组配子体抗原rEnGAM56的免疫保护分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 毒害艾美耳球虫重组配子体抗原rEnGAM22,rEnGAM56-T和rEnGAM59的联合免疫保护分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录1 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（7）鸡球虫病活疫苗基因佐剂IL-2、IL-4实验室效力和安全性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 鸡球虫病研究进展 |
| 1.1 鸡球虫病 |
| 1.2 鸡球虫病免疫机制研究 |
| 1.3 鸡球虫病疫苗研究进展 |
| 2 鸡球虫病基因佐剂研究进展 |
| 2.1 鸡球虫病基因佐剂研究进展 |
| 2.2 鸡球虫病基因佐剂的分类与作用机制 |
| 2.3 细胞因子基因佐剂在鸡球虫病防控中的应用 |
| 2.3.1 鸡白介素2 |
| 2.3.2 鸡白介素4 |
| 3 鸡球虫病基因佐剂免疫效果的主要影响因素 |
| 3.1 免疫途径 |
| 3.2 免疫剂量 |
| 3.3 免疫次数 |
| 4 基因佐剂体内分布研究 |
| 5 安全性评价 |
| 6 本课题的目的和意义 |
| 材料与方法 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验菌株及球虫 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 试剂配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 质粒制备 |
| 2.1.1 冻存菌活化 |
| 2.1.2 菌液裂解 |
| 2.1.3 质粒纯化 |
| 2.1.4 纯化质粒检测 |
| 2.2 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂对球虫疫苗的实验室效力试验 |
| 2.2.1 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂接种剂量筛选 |
| 2.2.2 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂对疫苗免疫间隔的影响 |
| 2.2.3 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂口服和肌注免疫增效比较 |
| 2.2.4 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂对疫苗的免疫产生期影响 |
| 2.3 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂实验室安全性试验 |
| 2.4 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂的体内分布及表达鉴定试验 |
| 2.4.1 动物分组及处理 |
| 2.4.2 PCR敏感度测定 |
| 2.4.3 pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP体内分布检测 |
| 2.4.4 pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP体内表达检测 |
| 2.5 检测指标和判定标准 |
| 2.6 数据处理 |
| 试验结果 |
| 1 质粒制备结果 |
| 2 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂对球虫疫苗的实验室效力试验 |
| 2.1 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂接种剂量筛选结果 |
| 2.2 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂对疫苗免疫间隔的影响 |
| 2.3 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂口服效果和肌注效果比较 |
| 2.4 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂对疫苗的免疫产生期影响 |
| 3 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂实验室安全性 |
| 4 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂的体内分布及表达试验 |
| 4.1 引物特异性及敏感性测定结果 |
| 4.2 基因佐剂体内分布及代谢鉴定结果 |
| 4.2.1 基因佐剂在体内微生物中的转移情况 |
| 4.2.2 基因佐剂的组织分布结果 |
| 4.3 基因佐剂体内转录鉴定结果 |
| 4.3.1 荧光显微镜观察蛋白表达 |
| 4.3.2 组织中基因佐剂转录结果 |
| 讨论分析 |
| 1 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂对球虫疫苗免疫增效作用研究 |
| 1.1 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂给药剂量筛选 |
| 1.2 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂给药间隔筛选 |
| 1.3 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂口服和肌注效果比较 |
| 1.4 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂对疫苗的免疫产生期影响 |
| 2 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂实验室安全性 |
| 3 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂的体内分布及表达 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 附图 |
| 致谢 |
（8）堆型艾美耳球虫涓滴免疫与脉冲免疫保护效果对比研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩写对照表 |
| 1 前言 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 生活史 |
| 1.4 致病性 |
| 1.5 防治 |
| 1.6 疫苗研究进展 |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 堆型艾美耳球虫 |
| 2.1.3 主要试剂和仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 实验分组及处理 |
| 2.2.2 一次脉冲免疫与涓滴免疫的免疫攻虫保护效果测定 |
| 2.2.2.1 攻虫分组 |
| 2.2.2.2 评价指标及标准 |
| 2.2.3 二次脉冲免疫与涓滴免疫的攻虫保护效果测定 |
| 2.2.3.1 二次免疫实验分组及处理 |
| 2.2.3.2 二次免疫攻虫实验设计 |
| 2.2.3.3 二次免疫保护效果评价指标及标准 |
| 2.2.4 三次脉冲免疫与涓滴免疫的攻虫保护效果测定 |
| 2.2.4.1 三次脉冲免疫实验分组与处理 |
| 2.2.4.2 第三次免疫攻虫实验设计 |
| 2.2.4.3 三免保护效果评价指标及标准 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 涓滴免疫组与脉冲免疫组免疫后卵囊排放规律分析 |
| 3.1.1 涓滴免疫组与脉冲免疫组第一次免疫卵囊排放量规律 |
| 3.1.2 涓滴免疫组与脉冲免疫组第二次免疫卵囊排放量规律 |
| 3.1.3 涓滴免疫组与脉冲免疫组第三次免疫卵囊排放量规律 |
| 3.1.4 涓滴免疫组与脉冲免疫组整个免疫期间卵囊排放量规律 |
| 3.2 攻虫免疫保护效果测定结果 |
| 3.2.1 涓滴免疫组与脉冲免疫组第一次攻虫结果 |
| 3.2.1.1 涓滴免疫组与脉冲免疫组第一次攻虫后体重变化情况 |
| 3.2.1.2 涓滴免疫组与脉冲免疫组第一次攻虫后病变记分结果 |
| 3.2.2 涓滴免疫组与脉冲免疫组第二次攻虫结果 |
| 3.2.2.1 第二次攻虫后各组体重变化情况 |
| 3.2.2.2 第二次攻虫后排卵囊量结果 |
| 3.2.2.3 第二次攻虫后病变记分结果 |
| 3.2.3 各组第三次攻虫的体重变化 |
| 3.2.3.1 各组第三次攻虫后排卵囊量结果 |
| 3.2.3.2 各组第三次攻虫后病变记分结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 涓滴免疫组与脉冲免疫组卵囊排放规律 |
| 4.2 涓滴免疫组与脉冲免疫组免疫效果比较 |
| 5 总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（9）鸡IL-2与IL-4融合基因表达载体的构建、表达及体外生物学活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 鸡球虫病的研究概况 |
| 1.1 分类 |
| 1.2 生活史 |
| 1.3 流行特点 |
| 1.4 致病性 |
| 2 鸡球虫病免疫预防研究进展 |
| 2.1 免疫原性 |
| 2.2 免疫应答 |
| 3 鸡球虫疫苗的研究进展 |
| 3.1 强毒活疫苗 |
| 3.2 弱毒活疫苗 |
| 3.3 DNA疫苗 |
| 4 细胞因子免疫佐剂的研究进展 |
| 4.1 宿主免疫应答 |
| 4.2 细胞因子佐剂的作用 |
| 5 细胞因子融合蛋白研究进展 |
| 6 本课题的目的和意义 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验菌株与质粒 |
| 1.2 试验细胞、鸡胚和鸡 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 试剂配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.2 阳离子脂质体HilyMax浓度对重组融合蛋白表达质粒转染细胞的影响 |
| 2.3 chIL-4和chIL-2重组真核表达质粒细胞转染和表达效果的测定 |
| 2.4 chIL-4和chIL-2重组真核表达质粒表达分泌蛋白量的测定 |
| 2.5 chIL-4和chIL-2重组真核表达质粒mRNA相对表达量的测定 |
| 2.6 重组融合蛋白分泌活性测定 |
| 2.7 数据处理 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP真核表达载体的构建与鉴定 |
| 3.2 阳离子脂质体HilyMax浓度对重组融合蛋白表达质粒转染细胞的影响 |
| 3.3 chIL-4和chIL-2重组真核表达质粒细胞转染和表达效果 |
| 3.4 重组融合蛋白分泌活性 |
| 4 分析与讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 攻读硕士期间科研情况 |
| 致谢 |
（10）柔嫩艾美耳球虫临床分离株生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 1 前言 |
| 1.1 鸡球虫卵囊生物学特性 |
| 1.2 鸡球虫生活史 |
| 1.3 鸡球虫病的流行病学 |
| 1.4 鸡球虫病的药物防治状况 |
| 1.5 鸡球虫疫苗 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 供试虫株 |
| 2.2 供试动物 |
| 2.3 饲料 |
| 2.4 主要实验试剂 |
| 2.5 供试药物 |
| 2.6 主要实验仪器 |
| 2.7 试验方法 |
| 2.7.1 鸡球虫卵囊的分离与收集 |
| 2.7.2 鸡球虫卵囊的繁殖和复壮 |
| 2.7.3 潜隐期测定 |
| 2.7.4 卵囊大小测定 |
| 2.7.5 卵囊繁殖力测定 |
| 2.7.6 卵囊致病性测定 |
| 2.7.7 柔嫩艾美耳球虫分子鉴定 |
| 2.7.8 耐药性试验分组与处理 |
| 2.7.9 免疫原性试验分组与处理 |
| 2.7.10 评价指标及标准 |
| 2.7.11 统计项目 |
| 2.8 实验数据处理与统计 |
| 3 结果 |
| 3.1 柔嫩艾美耳球虫分离、繁殖及复壮结果 |
| 3.2 潜隐期测定结果 |
| 3.3 卵囊大小及形状指数 |
| 3.4 柔嫩艾美耳球虫虫株的繁殖能力结果 |
| 3.5 柔嫩艾美耳球虫致病力 |
| 3.5.1 临床症状、致病力 |
| 3.5.2 增重、盲肠病变及血便记分 |
| 3.6 柔嫩艾美耳球虫分子鉴定 |
| 3.6.1 特异性PCR鉴定结果 |
| 3.6.2 外源虫株鉴定结果 |
| 3.7 柔嫩艾美耳球虫虫株耐药性试验 |
| 3.7.1 病变记分减少率 |
| 3.7.2 血便记分比 |
| 3.7.3 抗球虫指数 |
| 3.7.4 药物耐药性试验综合评价 |
| 3.8 柔嫩艾美耳球虫免疫原性试验 |
| 3.8.1 增重情况 |
| 3.8.2 血便记分 |
| 3.8.3 存活率及病变记分 |
| 3.8.4 OPG变化 |
| 3.8.5 血清中IgG、IgA浓度变化 |
| 3.8.6 抗球虫指数 |
| 4 讨论 |
| 4.1 柔嫩艾美耳球虫生物学特性 |
| 4.2 鸡球虫卵囊特异性PCR鉴定 |
| 4.3 药物耐药性 |
| 4.4 临床分离株免疫原性 |
| 5 总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
四、球虫病的免疫 :活疫苗的作用（论文参考文献）
- [1]鸡球虫毒力致弱方法及其在鸡球虫病弱毒活疫苗研发上的应用[J]. 尹理君,廖申权,孙铭飞,宋忠峰,侯晓礁,李福元,吕敏娜,吴彩艳,李娟,林栩慧,蔡海明,胡俊菁,于林增,肖文婉,张健騑,戚南山,顾有方. 畜牧与兽医, 2021(11)
- [2]柔嫩艾美耳球虫配子体GAM22蛋白的真核表达及其免疫保护效力评价[D]. 程振扬. 扬州大学, 2021
- [3]鉴定鸡球虫种类的多重PCR方法的建立与应用[D]. 徐向东. 扬州大学, 2021
- [4]堆型艾美耳球虫配子体蛋白EaGAM56与EaGAM82的原核表达及其免疫保护作用研究[D]. 华恩玉. 扬州大学, 2020
- [5]柔嫩艾美耳球虫免疫增强剂筛选与早熟株相关基因研究[D]. 余水兰. 中国农业科学院, 2020
- [6]毒害艾美耳球虫配子体抗原的免疫保护分析[D]. 汪飞燕. 扬州大学, 2020
- [7]鸡球虫病活疫苗基因佐剂IL-2、IL-4实验室效力和安全性研究[D]. 郝飞飞. 山西农业大学, 2019(07)
- [8]堆型艾美耳球虫涓滴免疫与脉冲免疫保护效果对比研究[D]. 胡伟高. 华南农业大学, 2019(02)
- [9]鸡IL-2与IL-4融合基因表达载体的构建、表达及体外生物学活性研究[D]. 贡鑫. 山西农业大学, 2018
- [10]柔嫩艾美耳球虫临床分离株生物学特性研究[D]. 易永萍. 华南农业大学, 2018(08)