一、凝血酶神经毒性作用的在体MRI观察（论文文献综述）
周桂银[1]（2021）在《MicroRNA-200a-3p通过靶向Egr2调节脑出血后炎性损伤的作用与机制研究》文中研究指明目的:使用高通量测序技术检测小鼠脑出血后mRNAs和miRNAs的表达,用生物信息学技术分析筛选出差异表达的mRNA-Egr2及其具有潜在相互作用的mi R-200a-3p。建立脑出血的在体和离体模型,观察mi R-200a-3p和Egr2的表达水平,并进一步探讨mi R-200a-3p通过Egr2对脑出血后血肿周围组织继发性炎性损伤的生物学调控作用,探索脑出血治疗的潜在靶点。方法:1.筛选目的mRNA和miRNA:建立小鼠脑出血模型,制备组织样本,用高通量测序技术构建测序文库;利用生物信息学技术对测序结果进行分析,筛选出差异表达的mRNA-Egr2及其具有潜在相互作用的mi R-200a-3p。2.离体实验:采用LPS刺激BV2细胞,选取最佳诱导浓度和时间,建立离体炎症损伤模型,检测mi R-200a-3p、Egr2的表达水平;利用细胞免疫荧光染色法,明确Egr2在BV2细胞中的亚细胞定位;通过瞬时转染mi R-200a-3p mimics或inhibitors,将其过表达或抑制,检测各组中Egr2及下游炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平变化;使用Target Scan数据库预测mi R-200a-3p和Egr2的结合位点,并用双荧光素酶报告基因实验进行验证。3.在体实验:建立小鼠脑出血模型,于建模后第1、3、7天分别检测血肿周围脑组织mi R-200a-3p、Egr2的表达水平;通过侧脑室注射沉默mi R-200a-3p腺相关病毒,建立下调mi R-200a-3p的脑出血小鼠模型,检测Egr2及下游炎症因子的表达水平变化,并观察小鼠行为学、脑水肿等神经损伤改变情况。结果:1.高通量测序显示:在小鼠脑出血模型中有969个差异表达的mRNAs（545个下调,424个上调）,106个差异表达的miRNAs（55个下调,51个上调）,生物信息学技术分析筛选出显着下调的mRNA-Egr2和显着上调的mi R-200a-3p。2.离体实验显示:LPS浓度为1ug/ml时,BV2细胞活性最佳;当持续作用24h,培养上清液中TNF-α的表达水平达到峰值。与Control组相比,LPS组中mi R-200a-3p表达水平显着升高,而Egr2的表达水平显着降低。细胞免疫荧光结果显示Egr2主要表达于BV2细胞的胞核内。在BV2细胞中转染mi R-200a-3p mimics,Egr2的表达水平降低,IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平升高;转染mi R-200a-3p inhibitors,Egr2的表达水平升高,IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平降低。双荧光素酶报告基因实验显示,Egr2 mRNA的3′-UTR包含保守的mi R-200a-3p结合位点。3.在体实验显示:与Sham组相比,mi R-200a-3p的表达水平在脑出血后第1天显着升高,在随后的1周内逐渐降低;Egr2的表达水平在脑出血后第1天显着降低,在随后的1周内则逐渐升高。在脑出血小鼠侧脑室注射沉默mi R-200a-3p的腺相关病毒,下调其表达后可显着增加Egr2的表达水平,减少炎症因子的表达水平,并且减轻脑水肿程度,改善神经功能损伤。结论:小鼠脑出血后血肿周围组织中,高表达的mi R-200a-3p可能通过靶向抑制Egr2,促进小胶质细胞分泌炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α,加重了脑出血后的继发性神经炎性损伤。抑制mi R-200a-3p的表达可能通过减轻继发性神经炎性损伤,从而发挥神经保护作用。
吕健[2]（2021）在《芪龙胶囊治疗气虚血瘀证缺血性中风病的临床评价与疗效机制研究》文中认为芪龙胶囊（国药准字Z20000097,医保乙类）以“益气活血”立法,补气与活血并重,主要用于气虚血瘀证缺血性中风病。但芪龙胶囊在真实世界临床实践中的临床疗效尚未有过评价,且疗效机制尚不清楚。中药复方具有成分复杂、靶点通路多样等特点。为解决芪龙胶囊在真实世界中临床疗效不明确的临床问题,及其疗效机制不清楚的科学问题,本研究通过前瞻性队列研究证明了芪龙胶囊在真实临床实践中的临床疗效,并采用 RNA 测序（RNA-sequencing,RNA-Seq）技术与实时荧光定量 PCR（Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）验证技术,筛选出芪龙胶囊发挥疗效所调控的关键基因以及信号通路与生物过程。本研究为芪龙胶囊临床精准定位于气虚血瘀证缺血性中风病提供了真实世界证据,并从转录组学层面揭示了芪龙胶囊“多成分-多靶点-多通路”的疗效机制,为临床精准定位于气虚血瘀证缺血性中风病提供了生物学客观依据。目的通过前瞻性队列研究,评价芪龙胶囊在真实临床实践中治疗气虚血瘀证缺血性中风病的临床疗效,并采用RNA-Seq高通量测序与RT-qPCR验证技术,筛选芪龙胶囊调控的关键基因以及信号通路与生物过程,阐释其疗效机制。方法1.芪龙胶囊治疗气虚血瘀证缺血性中风病的前瞻性队列研究:研究对象为气虚血瘀证缺血性中风患者,以服用芪龙胶囊为暴露因素,形成暴露组与非暴露组,所有入组患者均进行基础治疗;总样本量不少于2249例;主要结局指标为Rankin评分量表（mRS评分）、美国国立卫生院神经功能缺损评分（National Institute of Health stroke scale,NIHSS）和Barthel指数量表（BI评分）,次要结局指标包括中医证候（气虚证评分、血瘀证评分）、心理指标（抑郁自评量表SDS评分、焦虑自评量表SAS评分）、血脂指标、凝血指标、同型半胱氨酸;分别于治疗结束后第12周、24周对患者进行现场随访以评估疗效。使用插补法处理缺失数据,使用倾向性评分匹配法（Propensity Score Matching,PSM）处理混杂因素,通过差值检验法、对齐秩转换方差分析（Aligned Ranks Transformation ANOVA,ART ANOVA）、广义线性混合模型（Generalized Linear Mixed Model,GLMM）评价临床疗效。研究结果遵循STROBE-cohort study规范进行报告。2.基于RNA-Seq高通量测序的芪龙胶囊干预后差异表达mRNA研究:（1）血样为临床试验中分别于基线与芪龙胶囊治疗12周后所取患者的全血,采血管为2.5ml Paxgene Blood RNA tube,依据患者12周治疗后NIHSS评分、mRS评分降低数值最大且BI评分提高数值最大筛选原则,选取了 20名患者治疗前后的全血,共计40个血样。（2）治疗前分组为20名患者治疗前血样（20个生物样本重复）,治疗后分组为此20名患者服用芪龙胶囊治疗12周后血样（20个生物样本重复）。除主分析组外,还依据患者临床特征进行了亚组的设置,包括性别（男、女）、年龄（年龄≤60岁、年龄>60岁）、初发与复发。（3）实验方法主要为样本总RNA提取、总RNA质控、文库构建与测序、测序数据的过滤与质控、差异基因检测、差异基因富集分析6个过程。（4）差异基因筛选使用DEGseq方法,为了提高筛选的准确性,我们定义log2 Fold Change≥1并且Q-value≤0.001的基因,筛选为芪龙胶囊干预后显着差异表达基因。（5）对差异基因进行GO功能与KEGG Pathway富集分析,计算得到的P-value分别通过Bonferroni与FDR校正后,以P-value或Q-value（corrected P-value）<0.05为阈值,满足此条件的GO term和Pathway定义为在候选基因中显着富集的GO term与KEGG Pathway,通过GO功能与KEGG Pathway显着性富集分析能确定差异基因行使的主要信号转导途径与生物学功能。3.基于RT-qPCR的芪龙胶囊干预后关键基因与调控机制研究:（1）选取测序结果中差异表达显着性大且基因表达量较高的基因AREG、CAV2、PEDS1-UBE2V1、MYL9、ITGA2B、CXCL8、LY96、GNG10、CXCL10进行验证,以β肌动蛋白（β-actin）为内参基因。（2）选取RNA-Seq高通量测序部分同一批患者血样RNA进行验证实验,共10名患者（女性3例、男性7例;年龄≤60岁5例、年龄>60岁5例;初发6例、复发4例）,20个血样RNA进行验证（治疗前、治疗后）。（3）实验方法包括样本总RNA质检、mRNA逆转录、实时荧光定量PCR扩增（序列与引物设计、PCR反应体系）。（4）使用2⊿⊿Ct法分析实时定量PCR实验中目标基因干预后表达相对变化,将治疗前和治疗后各10个样本的三次重复平均Ct与平均内参Ct统一计算为两组的均值,然后以治疗前为对照（2-⊿⊿Ct=1）,计算每个目标基因在治疗后与治疗前中表达量比值2-⊿⊿Ct,若比值>1,则干预后此基因表达量上调;若比值<1,则表达量下调。以此判断验证的目标基因与转录组测序上下调趋势是否一致。同时结合转录组测序富集结果,阐释关键基因调控的主要信号通路与生物过程。结果1.芪龙胶囊治疗气虚血瘀证缺血性中风病的前瞻性队列研究:（1）从2016年11月3日～2019年1月16日,共筛选了 2468例患者,基线入组时因不符合入组标准排除97例,共2371例患者进入研究队列,第12周、24周随访共剔除与失访69例,最终纳入分析合格病例2302例（暴露组1260例、非暴露组1042例）。（2）2302例全数据集治疗前后差值组间比较:①在治疗后第24周,芪龙胶囊联合基础治疗在降低mRS评分、NIHSS评分、气虚证评分、血瘀证评分、SDS评分、SAS评分和提高BI评分方面优于单用基础治疗（P<0.05）;②在治疗后第12周,芪龙胶囊联合基础治疗在降低总胆固醇含量方面优于单用基础治疗（P<0.05）。（3）PSM 600例子数据集治疗前后差值组间比较:①在治疗后第24周,芪龙胶囊联合基础治疗在降低mRS评分、NIHSS评分、气虚证评分、血瘀证评分、SAS评分和提高BI评分方面优于单用基础治疗（P<0.05）;②在治疗后第12周,芪龙胶囊联合基础治疗在降低甘油三酯含量方面优于单用基础治疗（P<0.05）。（4）600例子数据集对齐秩转换方差分析模型:三次测量的主要结局指标分析结果显示,mRS评分和BI评分在分组的P值小于0.05,说明mRS评分和BI评分各组的数据的差异有统计学意义,而分组和测量次数交互作用的P值大于0.05,说明测量次数和分组无交互作用;NIHSS评分在测量次数的P值小于0.05,则说明NIHSS评分在各个测量时间的数据的差异有统计学意义,而分组和测量交互作用的P值大于0.05,说明测量次数和分组无交互作用。（5）广义线性混合模型分析:分别在2302例全数据与600例子数据集进行mRS评分、NIHSS评分、BI评分建模,结果显示:①在mRS评分方面,600例子数据集中暴露组受试者mRS评分的odds ratio的估计随时间每次下降99.83%,非暴露组的受试者mRS评分的odds ratio的估计随时间每次下降95.8%,暴露组患者的mRS评分下降速度快于非暴露组,且差异显着（P<0.05）;2302例全数据集结果显示,暴露组受试者mRS评分的odds ratio的估计随时间每次下降99.82%,非暴露组受试者mRS评分的odds ratio的估计随时间每次下降97%,暴露组患者的mRS评分下降速度快于非暴露组,且差异有统计学意义（P<0.05）。②在NIHSS评分方面,600例子数据集结果显示,暴露组受试者NIHSS评分的odds ratio的估计随时间每次下降99.98%,非暴露组受试者NIHSS评分的odds ratio的估计随时间每次下降99.77%,暴露组受试者的NIHSS评分下降速度快于非暴露组,且差异有统计学意义（P<0.05）;2302例全数据集结果显示,暴露组受试者NIHSS评分的odds ratio的估计随时间每次下降99.99%,非暴露组受试者NIHSS评分的odds ratio的估计随时间每次下降99.97%,暴露组患者的NIHSS评分下降速度快于非暴露组,且差异有统计学意义（P<0.05）。③在BI评分方面,600例子数据集结果显示,暴露组患者的BI评分上升速度快于非暴露组,且差异有统计学意义（P<0.05）。2.基于RNA-Seq高通量测序的芪龙胶囊干预后差异表达mRNA研究:（1）40个样本总RNA平均浓度为282.08 ng/μL,平均总量为5.61μg;RIN值除了两个样本为6.6和5.1,其余均高于7,28S/18S在1.3～2.9之间,表明40个总RNA纯度和完整度较高,符合后续建库与测序的要求。（2）使用DNBSEQ平台进行测序,40个样品共产出1869.27Mb原始数据,原始数据经过过滤后,共有1619.21Mb（86.62%）的原始数据作为高质量读段（Cleanreads）被保留下来,说明测序数据结果较好,大部分读段被保留下来,且样本间Clean reads差异较小,可用于后续分析。（3）显着差异基因检测结果显示,主分析组干预后检测到的差异基因有39个;男性亚组检测到的差异基因有40个;女性亚组检测到的差异基因有151个;年龄≤60岁亚组检测到的差异基因有61个;年龄>60岁亚组检测到的差异基因有84个;初发亚组检测到的差异基因有52个;复发亚组检测到的差异基因有102个。（4）富集分析显示,芪龙胶囊主要通过调控以下5个方面信号通路与生物功能改善患者炎症与动脉粥样硬化情况,修复神经功能缺损。分别为:①免疫反应（LY96、CXCL8、CXCL10等参与免疫反应调节,LY96、HP、HLA-DRB5等参与免疫系统过程）;②炎症反应相关信号通路（LY96、CXCL8、CXCL10等参与炎症反应调控,AREG、ITGA2B、FN1等参与PI3K-AKT信号通路调控,ITGA2B、FN1、GP1BB等参与ECM-受体相互作用调控,AREG、CAV2参与MAPK级联反应的正调控,GNG10、CXCL10、CXCL8等参与趋化因子信号通路调控,PEDS1-UBE2V1、CXCL8、CXCL1等参与IL-17信号通路调控,LY96、CXCL8、CCL4L1等参与NF-κB信号通路调控,LY96、CXCL8、CAV1等参与Toll样受体信号通路调控,CXCL8、CXCL1、CCL4L1等参与到细胞因子受体的相互作用,FN1、ARG1、CAV1等参与到TGF-β信号通路,DAAM2、CAV1、BAMBI等参与Wnt信号通路调控）;③动脉粥样硬化调控（CAV2、ITGA2B、GSTT1等参与流体剪切应力与动脉粥样硬化调控）;④细胞相关功能调控（AREG、CAV2、IGFBP2等参与到细胞增殖与分化调控,CXCL8、E2F1、KIR2DL1等参与到细胞衰老,HBA1、HBB、HP等参与到细胞凋亡及清除,CAV2、ITGA2B、CAV1等参与细胞粘附调控,ITGA2B、MYL9、FN1等参与白细胞迁移调控）;⑤血压调节（AREG、KLK1、HBB等参与到血压调节）。3.基于RT-qPCR的芪龙胶囊干预后关键基因与调控机制研究:（1）20个样本浓度在200-700 ng/μl之间,纯度在2.0-2.3之间,浓度与纯度符合下一步反转录和扩增实验要求,且电泳检测所有样本RNA质量显示良好。（2）PCR扩增后,扩增曲线图显示目的基因和内参的扩增效率基本一致;熔解曲线是单峰,说明产物只有一条,特异性较好,PCR扩增结果较好。（3）RT-qPCR结果显示,基因AREG、CAV2、ITGA2B、PEDS1-UBE2V1、MYL9在治疗后的表达量比值2-⊿⊿Ct均大于1,即相对于治疗前在干预后的表达量上调;基因LY96、GNG10在治疗后的表达量比值2-⊿⊿Ct均小于1,即相对于治疗前在干预后的表达量下调。（4）基因AREG、CAV2、PEDS1-UBE2V1、MYL9、ITGA2B、LY96、GNG10的表达水平与RNA-Seq高通量测序相应基因的上下调趋势一致,一方面说明 AREG、CAV2、PEDS1-UBE2V1、MYL9、ITGA2B、LY96、GNG10可能是芪龙胶囊调控的关键基因;另一方面说明RT-qPCR验证结果与RNA-Seq高通量测序结果整体一致性较高,测序结果比较可靠。依据转录组测序富集分析结果发现,芪龙胶囊通过以上关键基因参与到免疫反应、炎症反应相关信号通路、动脉粥样硬化、细胞相关功能、血压调节等关键信号通路与生物过程调控。结论1.在常规治疗基础上,使用芪龙胶囊治疗气虚血瘀证缺血性中风患者可显着降低mRS评分、NIHSS评分、气虚证评分、血瘀证评分、SDS评分、SAS评分、总胆固醇含量、甘油三酯含量并提高BI评分,改善神经功能缺损、气虚血瘀与抑郁焦虑情况,降低患者血脂,提高患者日常生活能力,且安全性较好。真实世界临床实践中,芪龙胶囊临床精准定位于气虚血瘀证缺血性中风病疗效显着。2.芪龙胶囊治疗气虚血瘀证缺血性中风患者主要通过调控AREG、CAV2、PEDS1-UBE2V1、MYL9、ITGA2B、LY96、GNG10等关键基因的表达,参与免疫反应、炎症反应相关信号通路（炎症反应调控、PI3K-AKT信号通路、ECM-受体相互作用、MAPK级联反应的正调控、趋化因子信号通路、IL-17信号通路、NF-κB信号通路、Toll样受体信号通路）、动脉粥样硬化调控、细胞相关功能（细胞增殖与分化、细胞粘附、白细胞迁移）、血压调节等关键信号通路与生物过程,改善患者的炎症与动脉粥样硬化情况,促进神经细胞与组织再生,恢复神经功能,提高日常生活能力。其中君药黄芪与免疫反应、炎症反应相关信号通路与动脉粥样硬化调控相关,君药地龙与动脉粥样硬化调控、细胞相关功能、血压调节相关,臣药丹参、当归、赤芍、川芎、红花、桃仁与炎症反应相关信号通路、动脉粥样硬化调控、细胞相关功能、血压调节相关。芪龙胶囊在以上药物配伍作用下,以益气活血、化瘀通络立法,共同参与到以上5个关键信号通路与生物过程。本研究从转录组水平阐释了芪龙胶囊临床精准定位于气虚血瘀证缺血性中风病的疗效机制。创新点1.将倾向性评分匹配法与对齐秩变换方差分析、广义线性混合模型相结合,通过前瞻性队列研究证实了真实临床实践中芪龙胶囊治疗气虚血瘀证缺血性中风病的临床疗效,为临床精准定位于气虚血瘀证提供了真实世界证据;2.采用RNA-Seq高通量测序技术与RT-qPCR验证技术,发现芪龙胶囊主要通过调控 AREG、CAV2、PEDS1-UBE2V1、MYL9、ITGA2B、LY96、GNG10 等关键基因的表达,参与免疫反应、炎症反应相关信号通路、动脉粥样硬化、细胞相关功能、血压调节等关键通路与生物过程,初步阐释了芪龙胶囊的“多成分-多靶点-多通路”的疗效机制,为临床精准定位提供了生物学客观依据。
陈蔚翔[3]（2021）在《线粒体去极化在脑出血后继发性神经损伤中的作用及机制研究》文中研究表明背景与目的:脑出血（Intracerebral hemorrhage,ICH）是一种非常常见和严重的疾病,其患病率约为120/100000,58%的患者在一年内死亡。三分之二的幸存者将面临中度甚至重度残疾。脑出血的高发病率和高死亡率是由占位效应所致原发性损伤和血红蛋白降解产物诱导的继发性损伤共同造成的。目前缺乏基于循证医学证据的外科手术策略,促使研究人员寻找治疗ICH后继发性损伤的可能干预靶点及手段。脑出血后继发性脑损伤包括神经元死亡、ROS爆发和DNA损伤。动物模型和人体样本的证据表明,脑出血后神经元死亡的主要类型是坏死并伴随着严重的炎症、水肿和组织损伤。细胞坏死既往被认为是一种伴随炎症和组织损伤的非程序性细胞死亡。但是,随着2005年首次报道部分细胞坏死过程可以被调控,不同类型的调节性细胞坏死相继被发现,其中多种类型的细胞坏死与中枢神经系统疾病相关。调节性坏死通过促进炎症和组织损伤在中枢神经系统疾病的发展中起着极其重要的作用,甚至被认为是成熟中枢神经系统细胞死亡的主要执行者。动物模型和人类样本的证据表明脑出血后神经元死亡的主要类型是坏死。一些证据表明,铁可以直接引发导致神经元死亡,而其他研究表明铁的积累只是神经元死亡的诱发因素。总的来说,铁超载及其对神经元死亡的影响尚不完全清楚。游离铁离子可引起不同类型细胞的脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤。已有的研究发现,脑出血后患者和实验动物脑组织出现急性和严重的铁超载,铁超载与继发性脑损伤密切相关。动物研究表明,清除过量的铁可以改善脑出血的预后。目前,针对脑出血后铁超载引起损伤的治疗主要集中在铁螯合剂和抗氧化剂。然而,最近的临床研究结果显示铁螯合剂或抗氧化剂治疗没有显着改善ICH患者脑出血的预后。铁离子参与细胞的许多正常生理功能,包括细胞色素氧化酶等某些酶的活性维持、中枢系统中的突触形成等生理过程。活性氧也参了机体正常的生理功能,如NOX（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸[NADPH]）氧化酶参与的吞噬功能和一些细胞内信号传导。因此,铁螯合和ROS清除的一个挑战是在尽量少影响铁和ROS依赖性的生理功能情况下,减轻病理性铁和ROS过量积累引起的脑损伤。可见,目前迫切需要寻找特异且精准的铁超载相关神经细胞损伤靶点,以利于通过干预来减轻继发性神经损伤。在本研究中,我们围绕以下三个方面进行研究:1、我们首先用小鼠自体血ICH模型确定脑出血后血肿周围脑组织铁离子价态,再利用体外铁超载模型及RNA-sequencing寻找铁离子引起的神经细胞损伤靶点与主要损伤特征;2、确定脑出血后铁超载引起神经元损伤的具体分子机制;3、针对我们所确定的机制,探讨对实验性小鼠脑出血的治疗作用。第一部分:线粒体功能障碍是脑出血后神经元铁超载的主要损伤特征目的:发现并确认脑出血后铁超载导致的主要损伤靶点方法:为验证脑出血（ICH）后血肿周围的铁离子的价态,提取脑出血后血肿周围与皮层脑组织,采用一种新的铁离子检测方法分别测定Fe2+和Fe3+。从不同铁离子剂量处理的PC-12细胞中提取RNA,并对其进行序列测定,探讨铁离子诱导神经元损伤的机制。其次,根据测序筛选结果应用线粒体功能检测试剂研究亚铁离子对线粒体复合体Ⅰ功能的影响,用能量代谢检测仪与ATP检测分析铁超载对氧耗率（OCR）和三磷酸腺苷（ATP）的影响。结果:（1）脑出血后24小时,二价铁（而非三价铁）浓度急剧升高,脑出血后28天皮层和内囊中的铁离子浓度仍显着高于正常浓度。（2）用50或250μM FeCl2处理PC-12细胞后,RNA测序检测到差异表达基因。与未处理的PC-12细胞相比,50μM FeCl2处理的细胞有110个基因的表达发生了显着变化,而250μM FeCl2处理的细胞有129个基因的表达发生了显着变化。此外,50和250μM FeCl2处理后细胞的线粒体相关基因占差异表达基因的比例分别为42%和19%。对线粒体相关基因的进一步分析显示,50μM和250μM FeCl2处理后细胞的线粒体呼吸复合物I相关基因的表达发生了显着变化。（3）Fe2+以剂量依赖的方式降低细胞的氧耗率（OCR）和三磷酸腺苷（ATP）水平,且铁超载显着降低了线粒体NAD+/NADH比值。利用四甲基罗丹明甲酯（TMRM）及活细胞工作站实时检测PC-12细胞线粒体膜电位（ΔΨm）发现,250μM亚铁处理PC-12细胞12h后TMRM的荧光强度降低。结论:线粒体功能障碍是神经元亚铁超载的重要生物标志物,以NAD+/NADH比值下降、OCR与ATP含量降低、线粒体膜电位去极化为其主要特点。第二部分:线粒体Fe2+内流/CypD乙酰化正反馈分子环路介导的线粒体去极化促进脑出血后神经元坏死目的:确认线粒体Fe2+内流/CypD乙酰化正反馈分子环路及其在脑出血后线粒体去极化依赖的神经元死亡中的作用方法:利用活细胞二价铁离子探针RPA（罗丹明B-[（1,10-菲咯啉-5-基）氨基羰基]苄基酯）检测线粒体游离Fe2+,免疫共沉淀检测线粒体分子CypD乙酰化水平,钙黄绿素释放试验原位评价mPTP开放,CRISPR-Cas9技术构建CypD敲除的细胞（CypD-KO-PC-12细胞系）,RNAi方法敲低PC-12细胞的ABCB10。结果:（1）线粒体亚铁超载导致神经元线粒体膜电位降低。（2）线粒体亚铁超载导致CypD乙酰化增加,使神经元mPTP开放。（3）开放的mPTP增加（促进）神经元线粒体Fe2+超载。（4）CypD乙酰化抑制剂或CypD缺失可抑制铁超载引起的线粒体功能障碍和膜电位去极化引起的神经元死亡。结论:Fe2+超载可降低线粒体膜电位、增加CypD的乙酰化。CypD乙酰化的增加促使神经元细胞mPTP开放,进而促进亚铁(线粒体Fe2+内流)通过开放的mPTP进入线粒体基质,加速神经元死亡;而抑制CypD乙酰化或CypD缺失则可抑制Fe2+超载引起的线粒体功能障碍和神经元死亡。即,线粒体Fe2+内流/CypD乙酰化正反馈分子环路介导的线粒体去极化促进了脑出血后神经元坏死。第三部分:脑出血后抑制线粒体去极化的神经保护作用目的:探讨抑制线粒体去极化对脑出血后神经系统的保护作用方法:PI染色检测亚铁与兴奋性氨基酸情况下的原代神经元死亡。小鼠脑出血模型下,应用BMS、pole test和旷场实验评价小鼠脑出血后的神经功能。结果:（1）兴奋性氨基酸加重了Fe2+超载引起的神经元坏死。（2）环孢素A治疗或CypD缺失可在体内外抑制脑出血后的神经元坏死,改善神经功能。（3）线粒体活性氧清除剂MitoQ减轻脑出血导致的白质损伤,改善神经功能。结论:线粒体Fe2+内流/CypD乙酰化正反馈分子环路是ICH的治疗靶点,CsA与MitoQ处理或CypD缺失能明显抑制脑出血后急性期和慢性期的神经功能缺损。
刘一鸣[4]（2021）在《β分泌酶与血管病理在认知损伤相关疾病中的作用研究》文中指出β分泌酶（Beta-site APP Cleavage Enzyme 1,BACE1）是切割淀粉样蛋白前体（Amyloid Precursor Protein APP）产生淀粉样蛋白（Amyloid-β,Aβ）的关键限速蛋白酶,而Aβ的沉积被认为是阿尔兹海默病（Alzheimer’s Disease,AD）中的重要病理之一。研究发现,AD患者的脑实质、脑脊液和血浆中BACE1蛋白水平以及酶活性均有提高,并与AD病理进程密切相关,提示了升高的BACE1蛋白浓度和活性是AD的重要风险因素。BACE1在AD中升高的可能与很多压力因素有关,如氧化应激、炎症水平提高以及缺氧环境、高糖环境等等。研究发现许多疾病都可以提高认知损伤的风险,如高血压、脑血管疾病和糖尿病等。脑血管疾病可分为大血管疾病（如动脉硬化）和小血管疾病,小血管疾病一般指直径200um以下的小血管病变,其又可分为两种:1、衰老和高血压相关的脑小血管病（Cerebral Small Vascular Diseases,CSVD）,其主要影像学特征包括腔隙、微出血、脑白质高信号和血管周围间隙扩大等;2、Aβ相关的脑淀粉样血管病（Cerebral Amyloid Angiopathy,CAA）,其主要特征为Aβ在软脑膜、皮质下血管和小动脉的沉积,并与AD紧密相关。无论是CSVD还是CAA,都会导致患者的认知出现严重损伤。除此之外,二型糖尿病（Type-ⅡDiabetes Mellitus,T2DM）也是导致认知损伤的重要风险因素之一。T2DM是一种慢性代谢性疾病,典型特征包括肥胖、高血糖、胰岛素抵抗和炎症水平升高等。T2DM提高多种痴呆的发病率,如血管性痴呆和AD等,导致患者的认知损伤。我们注意到,以上几种促进认知损伤的疾病都伴随着炎症水平提高、局部缺氧或者高糖环境等压力因素,这都有可能引发BACE1的表达上调。因此我们提出,这些疾病是否通过引发BACE1的蛋白浓度或酶活性提高进而促进认知损伤的发生?针对这一问题,我们分别招募了AD患者队列、CAA患者队列、T2DM及T2DM伴随认知损伤患者队列和老年人社区队列,对其血浆中BACE1的蛋白浓度和酶活性进行检测,并结合患者的认知状况和病理特征,对BACE1的蛋白浓度和酶活性与患者病理及认知损伤的关系进行分析,得到了如下结果:1、BACE1蛋白浓度和酶活性与认知水平相关:在AD患者队列中,AD患者相对于健康组对照有更高的血浆BACE1蛋白浓度,且在所有患者中BACE1蛋白浓度与认知评分相关,但酶活性无显着关联;在T2DM患者队列中,T2DM患者和T2DM伴随认知损伤患者血浆BACE1蛋白浓度和活性均提高,并且与认知评分相关;CAA患者队列中患者血浆BACE1酶活性提高,并与认知评分相关,另外在CAA转换痴呆的患者中BACE1酶活性和浓度均提高;最后在社区队列中我们发现校正年龄性别后的血浆BACE1蛋白浓度与患者认知评分负相关,而血浆Aβ42/40比例与认知评分也有关。以上结果提示我们,血浆BACE1的蛋白浓度与患者认知水平有关,这可能是通过影响Aβ病理来达到的;而在一些其他病理如T2DM和CAA中,BACE1的酶活性与认知也有相关。2、BACE1酶活性与生理及病理指标相关:①CAA患者队列中,血浆BACE1酶活性在高血压和糖尿病患者中提高;社区队列中,校正年龄性别后血浆BACE1酶活性与血压、血糖和血脂水平均有关。②在T2DM患者队列中,血浆BACE1酶活性与炎症水平相关;CAA患者队列中,血浆BACE1酶活性与白质高信号体积正相关;在社区队列中,校正年龄性别后血浆BACE1酶活性与动脉硬化相关指标有关,并且与部分血管炎症因子正相关。这部分结果显示,环境压力如高血压和高血糖可能提高了BACE1的酶活性,而BACE1酶活性与血管损伤和炎症水平有一定相关性。结论:脑小血管病和糖尿病患者中高血压和高血糖等压力因素导致的BACE1的酶活性和蛋白浓度提高可能是促进其认知损伤的共同机制。本研究中我们完成了国际上第一个多中心的BACE1酶活性和蛋白浓度检测,并以病例对照研究作为发现组,以社区队列研究作为验证组,发现患者血浆BACE1蛋白浓度的升高与认知下降有关,而BACE1酶活性则对压力因素如高血压和高血糖较为敏感,且与血管炎症的提高有关。阿尔兹海默病（Alzheimer’s Disease,AD）是发病率最高的神经退行性疾病,在所有痴呆类型占据最主要的地位。AD的典型病理学特征包含淀粉样蛋白（Amyloid-β,Aβ）沉积形成的斑块,过度磷酸化的Tau蛋白造成的神经元纤维缠结以及胆碱能突触丢失和神经元凋亡等。除此之外,血管病变也是AD患者脑内的重要病理,80%的AD患者都伴随着小血管病变、微梗死、微出血等症状。最新的研究发现,AD患者脑内存在着血脑屏障（Blood-Brain Barrier,BBB）的结构与功能损伤。鉴于血脑屏障承担保护大脑稳态,物质运输等多个重要功能,其损伤使得营养物质不能转运至脑内,脑内的代谢废物如Aβ不能运出至血液,且血浆中其它蛋白、病原体甚至免疫细胞的渗漏还会使得脑内炎症的发生,这些都对AD病理起到了重要的推动作用。但是,AD患者中BBB结构和功能损伤的机制目前还并不十分清楚。有研究认为,异常激活的炎症以及Aβ对内皮细胞的毒性作用会引发BBB损伤。同时,有些中枢神经系统疾病中存在血管异常再生的现象,由于新生的血管紧密连接（Tight Junctions,TJs）结构的不完整性,导致其BBB功能异常,因此提高了整体上的血管通透性。而之前有研究报道,AD患者脑内血管密度增加,提示其脑内也存在着异常的血管再生。针对这一问题,我们结合AD患者捐献的脑组织样本以及招募的临床认知障碍队列的脑脊液样本,研究AD患者脑内是否有异常血管再生及其在AD病人BBB损伤中的可能作用。取得了如下结果:1、AD患者脑中存在血管过度生成的现象为了探究AD是否存在血管生成的病理现象,我们首先对AD患者脑组织样本的血管密度进行了检测,发现AD患者脑内的确有血管密度增加的现象。为了探究血管增加的原因,接下来我们又对脑实质内血管再生因子的表达进行检测,结果发现,多种血管再生因子在AD患者脑内的表达增加。由于大部分血管再生因子释放到脑间质液中,于是我们检测了临床队列脑脊液（Cerebrospinal Fluid,CSF）中血管再生因子的表达情况,发现多数血管再生因子也在AD患者CSF中显着提高。以上结果提示我们,AD患者脑内确实存在血管过度生成的现象。2、患者血管生成与AD病理的关系为了探究血管生成与AD典型病理之间的关系,我们将所有患者按照CSF pTau和Aβ的水平分成阴性和阳性两组,比较血管生成相关因子的表达。结果发现,多数血管生成相关因子在p-Tau阳性组中增加,而在Aβ组中无明显变化。线性回归的结果也显示了p-Tau变化与更多的因子升高有关。这可能提示我们,Aβ可能不是刺激异常血管再生的主要机3、AD患者脑血管通透性增加为了探究AD患者血管通透性的改变,我们首先检测了AD患者脑组织样本中紧密连接蛋白（Tight Junctions,TJs）的表达情况,结果发现AD患者脑中多种TJs表达降低,免疫荧光的结果显示,TJs在内皮细胞上的表达减少。接下来,我们又通过检测临床队列患者血管通透性指标白蛋白商（Albumin Quotient,Qalb）的比较发现,AD患者Qalb值显着提高,与此结果相一致的是,血管损伤组患者Qalb值也显着提高。以上结果显示,AD患者BBB结构不完整,血管通透性增加,血管损伤增加。4、AD患者血管通透性增加与血管生成有关为了探究血管生成与通透性的关系,我们首先检测了促血管再生转录因子Slug和Snail的表达,发现其在AD患者中表达升高。进一步的,我们将Slug和Snail的表达与TJs表达做相关性分析,发现Slug和Snail与多种TJs呈负相关,提示血管再生因子刺激下的血管再生抑制了TJs表达。接下来,我们将患者按照血管病理进行分组,结果发现,两种血管生成相关因子PAI-1和PlGF在血管损伤组显着提高。之后我们又对血管生成因子和血管通透性指标Qalb进行了分析,结果发现,所有患者中Qalb的增加与三种血管生成因子PlGF、VEGFR2和IL-8有关,而在进一步的患者分类中,AD患者Qalb与血管生成因子的回归系数相对健康对照显着提高,认知状况更差的患者也出现了类似的现象。该部分的结果说明,血管通透性的增加与血管生成有关,且在AD患者和认知障碍中更为明显。结论:异常的血管再生存在于AD病理发生过程中。在AD脑内,异常的血管再生因子表达促进了血管再生发生,同时通过上调表达Slug与Snail,抑制紧密连接蛋白的表达。这导致血管内皮之间的紧密连接结构的丢失,促进了BBB的损伤。临床队列的结果也表明,血管再生因子与血管通透性正相关。因此,异常血管再生可能是导致AD血管通透性增加的重要病理机制之一。
王子钧[5]（2021）在《JNK抑制剂D-JNKI1缓解帕金森病多巴胺能神经退行性变和减少阿尔兹海默病的老年斑沉积》文中提出目的:神经退行性疾病是脑和脊髓中的神经元逐渐丢失所导致痴呆等症状的一类退行性疾病,好发于中老年人,包括阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease,AD）、帕金森病（Parkinson’s disease,PD）等,其病因尚不完全清楚。c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）通路在AD和PD的病理机制中发挥着关键作用,并日益被认为是其发病机制中的重要组成部分。因此,JNK抑制剂可能为神经退行性变提供有前景的防治策略。D-JNKI1是一种新型JNK抑制剂,具有许多优点,是目前为止最具特异的JNK抑制剂。本实验采用C57BL/6小鼠和SHSY-5Y细胞构建的PD模型以及APPswe/PS1E9双转基因小鼠AD模型为研究对象,采用形态学实验、行为学实验以及分子生物学实验等研究方法,探究D-JNKI1对PD和AD模型中神经元的作用及其所涉及的分子机制,为D-JNKI1成为防治PD和AD中的潜在药物提供实验依据。研究方法:采用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP）诱导的亚急性C57BL/6小鼠PD模型和1-甲基-4-苯基吡啶离子（1-methyl-4-phenylpyridiniumion,MPP+）诱导的SH-SY5Y细胞PD模型为研究对象,探讨D-JNKI1对PD神经退行性变的影响;同时采用APPswe/PS1E9双转基因小鼠探讨D-JNKI1对AD大脑皮层和海马β淀粉样蛋白（Amyloid beta,Aβ）沉积的影响。1.使用旷场实验和牵引试验检测PD小鼠行为学的变化。2.使用免疫组化和Western blotting检测D-JNKI1对MPTP/MPP+诱导的PD模型多巴胺能神经元的保护作用及其机制。3.使用试剂盒检测SH-SY5Y细胞中活性氧（Reactive oxygen species,ROS）水平和线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,MMP）。4.使用CCK-8试验和TUNEL检测SH-SY5Y细胞活力和凋亡情况。5.使用免疫组化检测APPswe/PS1E9双转基因小鼠大脑皮层和海马中Aβ沉积。6.使用Western blotting分别检测D-JNKI1对大脑皮层和海马淀粉样前体蛋白（amyloid precusor protein,APP）裂解、神经元凋亡和Tau蛋白磷酸化的影响及机制。结果:一、D-JNKI1在PD细胞和动物模型中的作用:1.D-JNKI1缓解MPTP诱导的PD行为学症状。2.D-JNKI1缓解MPTP诱导的黑质（substantia nigra,SN）和纹状体（corpus striatum,CPU）中多巴胺能神经元和神经纤维数量的减少,并使MPTP诱导的酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）和多巴胺转运体（dopamine transporter,DAT）表达水平的下降得到缓解;D-JNKI1缓解MPP+诱导的SH-SY5Y细胞TH表达水平的下降。3.D-JNKI1抑制MPTP诱导的小鼠脑内JNK磷酸化;并使MPP+诱发的SH-SY5Y细胞中JNK和c-Jun磷酸化水平受到显着抑制;D-JNKI1抑制MPTP诱发的ERK磷酸化但不影响p38磷酸化水平。D-JNKI1抑制MPP+诱发的p38磷酸化水平的增高,但不影响ERK磷酸化水平。4.D-JNKI1抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞中ROS的产生,并使MPP+诱导的SH-SY5Y细胞MMP降低得到缓解。5.D-JNKI1抑制MPTP/MPP+诱导的Bcl-2/Bax比值的降低和caspase-3及cleaved-caspase-3水平的升高;TUNEL显示D-JNKI1缓解MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。二、D-JNKI1在AD动物模型中的作用:1.D-JNKI1减少AD小鼠大脑皮层和海马中Aβ阳性产物覆盖的区域;降低大脑皮层和海马中APP的磷酸化水平和s APPβ/s APPα比值。2.D-JNKI1对脑中APP水解酶α-分泌酶解整合素金属蛋白酶（α-disintegrin and metalloproteinase-10,ADAM10）、β-分泌酶（β-site amyloid cleavage enzyme-1,BACE1）和早老素1（presenilin 1,PS1）的表达水平无显着影响。3.D-JNKI1抑制脑中JNK和c-Jun的磷酸化;抑制脑中ERK和p38的磷酸化。4.D-JNKI1升高大脑皮层中Bcl-2/Bax比值,但降低海马中Bcl-2/Bax比值,对大脑皮层和海马中caspase-3的表达水平无显着影响。5.D-JNKI1对脑中Tau蛋白磷酸化无显着影响。结论:1.D-JNKI1通过抑制JNK通路来缓解MPTP/MPP+诱导的PD模型中多巴胺能神经退行性变。2.D-JNKI1通过JNK通路减少AD小鼠大脑皮层和海马中β淀粉样蛋白的沉积。以上研究为D-JNKI1有望成为PD和AD的潜在防治手段提供了实验依据。
张钟圆[6]（2020）在《PGC-1α通过调控线粒体TOM70/MICU1通路在脑出血中的神经保护作用研究》文中研究说明研究背景脑出血（Intracranial hemorrhage,ICH）是一种临床上常见的卒中类型,具有高致残率和高死亡率,约占所有卒中类型的10-15%。文献中报道,脑出血发生后1个月的死亡率约为40%,过去20年内并无明显的改变。对于脑出血疾病,目前仍无确切有效的治疗方案能够显着改善患者生存率,仍仅限于初期的支持治疗,如控制血压,减缓脑水肿以及维持血流动力学的稳定。随着社会老龄化加剧,脑出血的发生率将会不断上升。因此,对于研究人员来说,进一步了解脑出血之后的相关病理生理学机制,并且发现新的治疗方案,无疑是脑出血相关研究进展中最重要的部分。目前在相关研究中,炎症在脑出血介导的脑损伤中占无比重要的地位。当出血发生后,血液成分包括红细胞、白细胞、巨噬细胞、血浆蛋白（比如凝血酶）迅速进入脑实质,随即炎症应答立即开始发生,表现为炎症细胞的活化与聚集。越来越多证据表明,炎症引起的损伤在脑出血介导的继发性损伤中占有重要地位。固有免疫的活化和炎症应答导致脑出血后炎症损伤的发生。固有免疫的活化同时导致小胶质细胞的激活、血肿周围炎症反应、血源性炎症细胞的浸润、炎症因子（如TNF-α、IL-1β）的释放以及脑水肿。炎症反应进一步加重脑出血引起的脑损伤,最终导致组织损伤、血脑屏障破坏以及大量神经细胞死亡。应用药物对脑出血引起的继发性损伤,特别是神经炎症的发生过程进行干预,是目前研究的热点所在,对于缓解脑出血后的脑损伤,改善患者神经功能,具有十分重要的意义。过氧化物酶体增殖物激活受体共激活因子1α（PGC-1α）是一种调节细胞能量代谢的转录共激活因子,高表达于棕色脂肪组织、心脏、骨骼肌、肾脏和脑。PGC-1α是氧化应激中抗氧化反应的关键调节因子,并且是线粒体发生强有力的激动剂。相关研究表明,PGC-1α因其具有抗氧化作用,在多种神经系统疾病中扮演者重要角色。在脑出血中,先前研究指出,抑制PGC-1α的表达进一步加重了脑出血引起的脑损伤,恶化神经功能。最近有学者发现,PGC-1α存在特异性活化剂ZLN005,并且在缺血诱导脑损伤模型中,通过改善线粒体功能,表现出明显的神经保护作用。PGC-1α可通过调节炎症细胞中线粒体钙离子通道相关蛋白TOM70/MICU1的表达,抑制活性氧的产生,上调抗炎相关蛋白表达,从而抑制炎症反正。因此,我们将使用注射自体血法制作出ICH的大鼠模型,探索PGC-1α在ICH引起的继发性脑损伤中的神经保护作用,以及其通过TOM70/MICU1通路对神经炎症的作用情况,为脑出血提供新的治疗方向。方法第一部分SD成年大鼠随机分为以下4组:假手术组（sham组）、脑出血组（ICH组）、脑出血+溶剂组（ICH+Vehicle组）、脑出血+治疗组（ICH+ZLN005组）。记录各组大鼠的神经功能评分（前肢放置试验和30°角落转弯试验）,7T磁共振检测脑肿胀及血肿情况,透射电子显微镜观察各组脑组织中线粒体损伤情况,Western blot检测PGC-1α以及相关炎症因子（TNF-α,IL-1β,IL-6和IL-10）的表达水平,免疫荧光检测CD16+Iba-1+以及CD206+Iba-1+细胞比例。第二部分实验1:SD成年大鼠随机分为以下7组:假手术组（sham组）、脑出血造模后3小时组（ICH 3h组）、脑出血造模后6小时组（ICH 6h组）、脑出血造模后12小时组（ICH 12组）、脑出血造模后24小时组（ICH 24组）、脑出血造模后48小时组（ICH 48组）、脑出血造模后72小时组（ICH 72组）。Western blot检测各时间点的TOM70以及MICU1水平,免疫荧光染色观察TOM70和MICU1分别与Iba-1共定位情况。实验2:SD成年大鼠随机分为以下4组:假手术组（sham组）、脑出血组（ICH组）、脑出血+溶剂组（ICH+Vehicle组）、脑出血+治疗组（ICH+ZLN005组）。透射电子显微镜观察各组脑组织中线粒体损伤情况,Western blot检测TOM70、MICU1表达水平,ATP检测试剂盒检测ATP含量水平。实验3:SD成年大鼠随机分为以下5组:脑出血+溶剂组（ICH+Vehicle组）,脑出血+治疗组（ICH+ZLN005组）,脑出血+治疗+空白si RNA组（ICH+ZLN005+scramble si RNA组）、脑出血+治疗+PGC-1αsi RNA组（ICH+ZLN005+PGC-1αsi RNA组）以及脑出血+治疗+TOM 70 si RNA组（ICH+ZLN005+TOM70 si RNA组）。Western blot检测PGC-1α、TOM70、MICU1以及相关炎症因子（TNF-α,IL-1β,IL-6和IL-10）的表达水平,ROS及ATP检测试剂盒分别检测ROS及ATP水平,免疫荧光检测CD16+Iba-1+以及CD206+Iba-1+细胞比例。结果第一部分ICH发生后72小时,PGC-1α表达显着升高,大鼠的各项神经功能评分显着降低,脑肿胀明显,活性氧积聚,促炎性炎症因子的表达上升,血肿周围M1型小胶质/巨噬细胞比例明显增加。每天以2.5mg/kg剂量静脉给与ZLN005后,PGC-1α表达进一步升高,大鼠神经功能评分明显改善,活性氧含量下降,脑水肿减轻,减缓颅内血肿的溶解,降低炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达,上调IL-10的表达。同时,血肿周围M2型小胶质/巨噬细胞比例升高,相应的,M1型小胶质/巨噬细胞比例降低。第二部分ICH发生后,TOM70以及MICU1表达显着下调,并在72小时达到最低。TOM70、MICU1在小胶质细胞中高表达,免疫荧光双重染色提示TOM70和MICU1均定位于胞质中。ICH 72小时后,TEM线粒体形态呈空泡化,ATP含量下降,给予ZLN005能够恢复TOM70、MICU1的表达以及线粒体定位,并使ATP含量上升,恢复线粒体形态结构。提前给予PGC-1α或TOM70特异性小分子干扰RNA,能够逆转ZLN005的保护作用,结论第一部分通过ZLN005特异性激动PGC-1α能够改善脑出血引起的脑水肿,减缓血肿溶解,促进小胶质/巨噬细胞朝M2型转化,减轻脑出血后的炎症反应,从而改善大鼠神经功能,在脑出血后起到神经保护作用。第二部分PGC-1α通过调控TOM70/MICU1线粒体通路,改善线粒体功能,从而减轻ICH后的炎症反应,促进小胶质细胞的极化。
陈林玲[7]（2020）在《基于代谢组学研究针刺对基底节区急性脑梗死患者干预效应》文中研究说明目的:本研究以基底节区ACI患者为研究对象,结合UPLC-Q-TOF/MS技术,对血清生物样本进行无靶向代谢组学研究,寻找基底节区ACI的差异性生物标志物并研究针刺干预效应。方法:1.根据纳入和排除标准筛选符合要求的基底节区ACI患者35例（脱落5例）作为疾病组,收集患者治疗前血液样本,在2小时内进行处理,分离出血清,然后将装有血清样本的冻存管置于-80℃冰箱中封存。同时收集25例健康人血清样本作为健康组。待样本收齐后,每个样本中取100μL血清,分别加入300μL乙腈（1:3体积比）,涡旋混匀1min,冰水浴超声10min,4℃下以13000rmp/min的转速离心15min,移取上清液200μL置进样小瓶中,待UPLC-Q-TOF/MS液质分析。首先采用Masslynx软件对采集的原始数据进行降维和质谱矩阵信息获取,以找出潜在的判别变量,然后将数据进行80%修约后导入SIMCA-P12.0统计软件,构建非监督主成分分析（PCA）和有监督模式的偏最小二乘判别分析（PLS-DA）模型,初步筛选出具有潜在可能性的标志物。同时以R2X值、R2Y值和Q2值对所建模型进行评价,以上的参数数值越接近1,说明模型建立的越稳定越可靠。在PLS-DA模型中筛选出差异性变量（VIP>1）。利用显着性差异的代谢物的m/z值在HMDB数据库、Chemspider数据库中查找可能的物质,进一步利用所查到的差异性代谢小分子,通过MS/MS分析、代谢物数据库碎片信息以及文献碎片等信息来确认筛选出的候选标志物作为基底节区ACI的潜在生物标志物。2.基底节区ACI患者分为观察组20例与对照组10例,对照组予常规治疗,观察组在对照组基础上加针刺治疗,治疗2周后收集患者血液样本,按上述方式处理之后与患者治疗前血清进行对比分析,观察上述生物标志物治疗前后的含量变化情况。结果:1.基于代谢组学筛选基底节区ACI患者血清差异性生物标志物:通过与健康组进行对比分析,成功构建PCA及PLS-DA模型,最后共筛选出7个生物标志物—脯氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、焦谷氨酸、Lyso PC、肌醇、苯丙氨酸。与健康组相比,疾病组Lyso PC含量低于健康组,有统计学意义（P<0.01）,其余标志物含量均高于健康组,有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。2.基于代谢组学研究针刺对基底节区ACI患者干预效应:（1）2周治疗结束后,与治疗前相比,对照组治疗后有三个生物标志物含量发生回调,分别是甲硫氨酸、焦谷氨酸、苯丙氨酸,观察组治疗后有五个生物标志物含量发生回调,分别是甲硫氨酸、色氨酸、焦谷氨酸、肌醇、苯丙氨酸,含量均较治疗前有所下降,均有统计学意义（P<0.05,P<0.01）;（2）2周治疗结束后,与治疗前相比,对照组治疗后脯氨酸、色氨酸、肌醇含量较治疗前降低,Lyso PC含量较治疗前升高,但无统计学意义;观察组治疗后脯氨酸含量较治疗前上升,但无统计学意义,Lyso PC含量较治疗前降低,且有统计学意义（P<0.01）;结论:1.血清代谢组学提示基底节区ACI发生后氨基酸代谢和磷脂代谢出现严重异常。2.针刺介入后,调节的代谢物数目更多,涉及的代谢途径更广。调节氨基酸及磷脂代谢障碍,使机体紊乱的代谢趋于正常,可能是针刺治疗基底节区急性脑梗死的重要作用途径。
郝晓迪[8]（2020）在《大鼠脑积水模型脉络丛相关炎症反应的作用及干预策略研究》文中指出研究背景脑积水是神经科常见疾病,是出血性卒中的常见并发症,也是患者预后不良的独立危险因素。除出血性卒中外还有脑膜炎、脑外伤等多种神经系统相关疾病会导致脑积水的发生,从婴幼儿到老年人影响人群广泛。但目前脑积水的内科治疗手段较为有限,外科手术治疗会伴随有癫痫、感染等并发症。所以深入探讨理解脑积水的发生机制十分重要,这将为临床治疗脑积水提供可行性方案。脉络丛是产生脑脊液的主要器官,在脑积水的发生中扮演了十分重要的角色。脉络丛在参与脑脊液分泌的同时,其相关炎症反应及脉络丛巨噬细胞的免疫调节功能也日益受到关注,脉络丛炎症反应与多种神经系统疾病相关。脉络丛巨噬细胞是一种独特来源的大脑非实质区巨噬细胞,具备胚胎前体细胞及成年造血系统前体细胞的双重来源,是中枢神经系统重要的免疫门户,是参与脉络丛炎症反应的重要组成部分。但脉络丛相关炎症反应,特别是脉络丛巨噬细胞在脑积水中的具体作用并不清楚。本研究将利用侧脑室注射凝血酶和自发高血压大鼠两种动物模型模拟脑积水的发生。重点观察不同模型下脑积水的发生发展过程及脉络丛变化,探讨不同模型中脑积水的发生机制及干预策略。第一部分凝血酶诱导大鼠脑积水形成模型中脉络丛相关炎症反研究目的凝血酶在脑出血继发脑损伤中发挥了重要作用,但其在脑积水中的作用还不明确。该研究将进一步探讨脉络丛相关炎症反应在凝血酶诱导大鼠脑积水中的作用及其干预策略。研究方法1.采用侧脑室注射凝血酶的方法模拟脑室出血后脑积水发生。成年SD大鼠被随机分为两组,分别给予相同体积的生理盐水或凝血酶侧脑室注射。24小时后采用核磁共振成像（Magneticresonanceimage,MRI）方法测量侧脑室体积。使用HE染色及免疫荧光染色观察脉络丛炎症细胞浸润及脉络丛巨噬细胞变化。用Evans blue染料含量测定和白蛋白免疫组织化学染色的方法检测大鼠脑屏障渗透性。并采用蛋白免疫印迹和免疫荧光染色的方法观察脉络丛中连接蛋白的变化情况。2.给予凝血酶受体（Protease-activated receptor1,PAR1）拮抗剂SCH79797观察其在凝血酶诱导脑积水中的作用及其对脉络丛的影响。将成年SD大鼠侧脑室注射凝血酶后随机分组,分别给予PAR1拮抗剂（SCH79797）,以及PAR1下游效应因子Src抑制剂（PP2）、PAK1抑制剂（IPA3）。通过核磁共振、免疫荧光染色、蛋白免疫印迹等方法观察大鼠脑室大小,脉络丛巨噬细胞变化及细胞连接相关蛋白的变化情况。研究结果1.与注射相同体积生理盐水相比,大鼠侧脑室注射凝血酶24小时后,MRI发现大鼠脑室体积明显扩大;脉络丛炎症细胞浸润增多,脉络丛巨噬细胞活化（CD68阳性细胞）明显增加;脑组织中Evans blue含量增加,免疫组织化学结果提示脉络丛周围白蛋白沉积增多,蛋白免疫印迹结果发现脉络丛组织中血管内皮钙连蛋白（vascular endothelial cadherin,VE-cadherin）显着减少。2.大鼠侧脑室注射凝血酶的同时,分别随机给予PAR1拮抗剂（SCH79797）、Src抑制剂（PP2）、PAK1抑制剂（IPA3）治疗。24小时后观察发现,SCH79797治疗组缓解了大鼠脑积水的发生,减少了脉络丛巨噬细胞CD68阳性细胞数量,一定程度上逆转了脉络丛中VE-cadherin的减少;PP2和IPA3也不同程度的缓解了凝血酶注射后脑室体积扩大,逆转脉络丛中VE-cadherin的减少。结论1.侧脑室注射凝血酶可以导致脉络丛炎症浸润、脉络丛巨噬细胞激活,血脑屏障及血脑脊液屏障破坏,脉络丛连接蛋白VE-cadherin减少,诱导大鼠脑积水的产生。2.PAR1拮抗剂（SCH79797）可以减少脉络丛巨噬细胞激活及脉络丛中连接蛋白VE-cadherin的破坏,缓解大鼠脑积水的发生;Src抑制剂（PP2）和PAK1抑制剂（IPA3）也不同程度的缓解了大鼠脑积水的发生;SCH79797可以通过抑制PAR1-Src-PAK1通路逆转脉络丛中VE-cadherin的减少。研究目的明确自发高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats,SHRs）脑积水发生发展规律,着重研究脉络丛相关炎症反应中脉络丛巨噬细胞变化对SHRs脑积水影响,并探讨SHRs脑积水治疗策略。研究方法1.取同周龄同性别WKY（Wistar-Kyoto）大鼠与自发高血压大鼠进行对照。MRI分别于不同时间点观察大鼠侧脑室大小。采用免疫组织化学染色的方法观察脉络丛巨噬细胞（Iba1）及其激活（CD68）情况的变化。为了进一步观察脑积水继发脑损伤的情况,实验采用新事物识别的行为学方法评价了SHRs脑积水发生后的认知功能。并采用HE组织染色的方法观察不同大鼠的胼胝体厚度,采用免疫荧光的方法观察海马CA1区神经元数量。2.在脑积水发生初期将雄性SHRs随机分组,治疗组给予去铁敏或米诺环素腹腔注射;对照组给予相同体积的生理盐水。用核磁共振的方法观察大鼠侧脑室变化情况,并采用免疫组织化学的方法观察脉络丛巨噬细胞变化及激活情况。通过行为学评分检测认知功能障碍,并用免疫组织化学的方法观察SHRs治疗组和对照组的神经元丢失及胼胝体区的变化。研究结果1.与同周龄同性别WKY大鼠相比,七周龄SHRs已经发生明显的脑积水。九周龄SHRs脑积水进一步加重,且雄性SHRs比雌性SHRs脑积水程度更为严重。免疫组织化学染色的结果发现,与WKY大鼠相比,九周龄SHRs脉络丛巨噬细胞CD68阳性细胞明显增多。同时发现与WKY大鼠相比,九周龄SHRs胼胝体厚度变薄,海马CA1区神经元Neu N数量减少,且伴随有认知功能受损。而脑积水发生前（四周龄时）的免疫组织化学结果提示,SHRs在脑积水出现前已经发生脉络丛巨噬细胞胞体变大及激活的CD68阳性细胞数量的显着增加。2.米诺环素治疗组相比较于对照组缓解了SHRs脑积水的发生;减少了激活的脉络丛巨噬细胞CD68细胞数量;改善了认知功能障碍,减轻了胼胝体萎缩及海马CA1区神经元丢失情况。同时监测大鼠的一般生理状况发现,米诺环素在一定程度上缓解了SHRs高血压,但并未出现体重下降等不良反应。而去铁敏治疗不能改善SHRs脑积水的发生。结论1.脉络丛相关炎症反应是SHRs脑积水发生的重要因素,且脉络丛巨噬细胞激活与脑积水严重程度呈显着正相关。九周龄SHRs相比较于WKY大鼠发生明显的脑积水,同时伴随有认知功能障碍及白质损伤和神经元丢失。2.在SHRs脑积水发生后给予米诺环素可以通过抑制脉络丛巨噬细胞激活延缓脑积水进展,改善认知功能,减轻白质损伤和神经元丢失。而去铁敏治疗不能改善SHRs脑积水的发生,也提示米诺环素治疗SHRs脑积水并不是通过螯合铁离子发挥作用的。
杨阳[9]（2020）在《Acetylated α-tubulin在脑出血后运动神经传导通路损伤中的保护作用与机制研究》文中研究表明脑出血（Intracerebral hemorrhage,ICH）指血管破裂导致血液在脑实质内的聚集,是最严重的脑卒中亚型。人群中ICH的发病率为12-15/10万人每年,占所有脑卒中类型的1015%,急性期病死率为30%40%,90%以上患者遗留不同程度的神经功能障碍。随着医疗水平的逐渐提高,ICH患者的病死率呈下降趋势,但致残率仍居高不下,而且目前临床仍缺乏治疗ICH后神经功能障碍的有效策略,高致残率仍然是ICH治疗的瓶颈。因此,如何改善ICH患者的神经功能（如运动、感觉、认知等）障碍、降低ICH患者的残疾率成为ICH研究领域的重点。高血压性ICH好发于基底节区域,此区域含有大量的下行白质纤维传导束,损伤后往往导致严重的运动功能障碍。很多临床研究用弥散张量成像（diffusion tensor imaging,DTI）和弥散加权成像（diffusion-weighted imaging,DWI）来观察ICH后白质纤维束-皮质脊髓束（corticospinal trac,CST）的损伤,发现ICH后CST损伤的程度和运动功能障碍的程度密切相关。结果提示,在ICH早期减轻CST损伤有利于运动功能恢复。加之中枢神经系统神经再生困难,因此,在ICH早期保护更多神经纤维比促进后期神经再生更加关键,残存的神经纤维也是神经功能康复的结构基础。然而,我们回顾了既往ICH的主要研究方向,发现绝大多数研究聚焦在ICH后血脑屏障保护、灰质区神经元保护、炎症抑制、铁螯合、血肿吸收等机制和转化研究。值得注意的是,既往有1000多种在实验性脑卒中动物模型上证实有保护效果的药物,而且近200种药物进行了临床试验,但所有药物在临床试验中均没有显着性治疗效果。造成这种现象的原因有很多:第一,啮齿类动物与人类有巨大差异;第二,绝大多数研究忽略了非常重要的早期运动神经传导通路的保护;第三,随着研究的不断深入,我们会发现神经损伤的机制有很多,单一的干预措施只能取得适度的效果,只有把几种干预措施联合应用,才可能取得显着的效果。综上,ICH位置特殊性和多种损伤机制提示我们应该探索新的研究方向、干预靶点和模式动物来改善脑出血后神经功能障碍。因此,我们认为ICH的基础研究要注重以下几个方面:1)注重ICH早期运动神经传导通路-白质纤维束的保护,为功能恢复保留结构基础;2)利用与人类神经系统解剖结构相似的大动物进行实验,如非人灵长类动物、猪等;3)针对多种干预靶点、采用多种措施进行联合治疗。然而,关于ICH早期运动神经传导通路损伤的作用和机制研究仍为空白,在论文的第二章和第三章我们探索了两种关键的运动神经传导通路在ICH后的病理改变:控制精细运动的锥体系-CST和协调精细运动的锥体外系-黑质纹状体通路（Nigrostriatal pathway,NSP）近年来研究发现微管解聚和线粒体功能障碍参与了脊髓损伤、阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）、帕金森病（Parkinson’s disease,PD）等疾病的发生发展。维持微管的稳定性可以促进啮齿类动物脊髓损伤后轴突再生、改善AD和PD症状;新近研究也发现,脊髓损伤后保护线粒体功能可以促进小鼠神经再生、改善运动功能障碍。Acetylatedα-tubulin是稳定型微管的标志物,促进acetylatedα-tubulin表达可以维持微管的稳定;抑制线粒体通透性转换孔（Mitochondrial Permeability Transition Pore,m PTP）开放可以缓解线粒体肿胀、改善线粒体的功能。我们推测促进acetylatedα-tubulin表达以维持微管的稳定和线粒体保护将有利于改善ICH后运动神经传导通路的损伤,并在论文的第二章和第三章探索了维持微管稳定性和线粒体保护对CST和NSP通路的保护作用。此外,稳定的、可重复的大动物脑出血模型非常必要,也可以用来探索临床前药物干预的剂量、周期、时机等。此外,在建立大动物脑出血模型后,应该建立相应的检测额评估脑出血严重程度的手段,特别是MRI对模型脑水肿、铁含量和白质纤维成像的分析。在本论文的第四章,我们重点探索了巴马香猪脑出血模型的建立,并利用MRI-T2、定量磁化率成像（quantitative susceptibility mapping,QSM）、弥散张量成像（diffusion tensor imaging,DTI）对脑组织结构、脑铁含量、白质纤维束进行无创、准确、定量的分析,为更多临床转化研究提供更符合临床的脑出血模型,而后探索了具有脑出血治疗前景的药物米诺环素（minocycline,Mino）在巴马香猪脑出血模型中的保护作用。具体研究内容如下:一、微管稳定和线粒体保护在小鼠脑出血后皮质脊髓束损伤中的作用与机制研究目的 脑出血（intracerebral hemorrhage,ICH）好发于白质纤维束密集的丘脑基底节区域,皮质脊髓束（Corticospinal tract,CST）是白质纤维束的轴突部分,作为控制精细功能的最重要结构,ICH后CST损伤的病理改变仍不清楚,本部分主要研究小鼠ICH后CST轴突的病理变化。探索微管和线粒体在ICH后CST轴突损伤的作用和机制,以及利用转基因小鼠、药物等技术增加稳定型微管acetylatedα-tubulin表达、保护线粒体功能能否改善小鼠ICH后CST轴突损伤和运动功能障碍,以及为脑出血后CST运动神经传导束的保护提供理论依据和可能的治疗策略。方法 利用Thy1-YFP小鼠,采用自体血25μL立体定位注入小鼠右侧纹状体区域构建ICH模型,首先利用免疫荧光、电镜等方式观察ICH后24h时血肿周围CST损伤的特点。然后利用MEC17-/-小鼠减少acetylatedα-tubulin表达使微管处于不稳定状态,HDAC6的特异性抑制剂Tubastatin A（Tub A）来增加acetylatedα-tubulin表达以增加微管稳定性,Cyp D的抑制剂环孢菌素A（cyclosporin A,Cs A）阻断m PTP形成、缓解线粒体肿胀等方式单独或者联合应用到ICH小鼠上,并采用免疫荧光染色、电镜、神经环路示踪等方法评估CST运动神经传导束的形态学变化,利用Beam-walking,irregular ladder walk等行为学方法检测精细运动功能改变,评估稳定微管及线粒体保护的作用。此外,提取原代皮层神经元,观察神经元突起内线粒体的运动以及acetylatedα-tubulin和线粒体的位置关系。结果1.小鼠ICH导致CST轴突的退缩样小球的病理改变,电镜结果发现退缩小球内含有无规则排列的微管和肿胀的线粒体,形成无营养神经锥。顺行神经环路示踪提示CST的损害,行为学发现CST相关精细运动功能障碍。2.小鼠ICH后24小时内白质纤维的损伤仅发生在轴突内,髓鞘没有显着损伤,ICH后第7天髓鞘崩解最为严重,ICH后第14天有新形成髓鞘的出现。3.小鼠原代皮层神经元突起上41%线粒体与acetylatedα-tubulin表达的“增强点”共标,敲除MEC17导致acetylatedα-tubulin表达缺失引起运动的线粒体数目显着减少。4.MEC17敲除小鼠的ICH模型表现出更加严重的CST轴突损伤和运动功能障碍。5.利用Tub A增加acetylatedα-tubulin表达、Cs A缓解线粒体肿胀均能够减轻ICH导致的CST损伤,如减少退缩小球的形成、改善运动功能障碍,两者联合干预ICH小鼠能够取得更加显着的保护效果。结论该部分研究探索了小鼠ICH导致的锥体系-CST运动神经传导束的病理损伤以及机制,我们发现了ICH后早期微管解聚和线粒体损伤是CST运动神经传导束损伤重要原因,acetylatedα-tubulin和线粒体相辅相成,同时促进acetylatedα-tubulin表达和保护线粒体功能显着改善ICH后CST损伤,并认为联合多种治疗措施在ICH早期进行运动神经传导通路保护是治疗运动障碍的关键,为ICH后运动功能障碍治疗提供了新的研究策略和干预靶点。二、微管稳定在脑出血后小鼠黑质纹状体通路损伤中的保护作用与机制研究目的黑质纹状体通路（Nigrostriatal pathway,NSP）是锥体外系主要神经结构之一,由起源于黑质、投射到纹状体的多巴胺能神经元胞体及纤维构成,主要作用是调节肌肉张力、协调各种精细复杂的运动。纹状体内含有尾状核、豆状核以及大量从中间穿行的白质纤维束,是脑出血（intracerebral hemorrhage,ICH）好发部分。目前仍没有对纹状体出血后NSP通路损伤的系统性研究及干预。因此,本部分关注于小鼠ICH对NSP通路的损伤,以及探索Acetylatedα-tubulin介导微管稳定在ICH后NSP损伤中的保护作用与机制,为ICH后精细运功功能障碍的恢复开拓新的研究思路。方法本实验采用自体血25μL立体定位注入小鼠右侧纹状体区域构建小鼠ICH模型。在建模成功后的1、3、7天分别用免疫荧光染色、电镜、Western-blot、神经环路示踪等技术检测出血周围纹状体及同侧黑质区多巴胺能神经元纤维和胞体的病理改变,并检测转运多巴胺的囊泡单胺转运体2（vesicular monoamine transporter-2,VMAT2）、囊泡运输蛋白（Kinesin和Dynein）表达水平以及多巴胺神经递质含量来检测多巴胺能神经元功能。此外,我们利用评估大体运动功能的行为学（旷场、神经功能评分、Rotarod）和精细的行为学（Beam walking和irregular ladder walk task）检测ICH后小鼠的运动功能障碍,以及检测稳定型微管acetylatedα-tubulin的蛋白表达水平与上述多巴胺能神经元形态和功能异常的相关性。同时,我们给予微管稳定剂Epo B来干预小鼠ICH模型、体外氧合血红蛋白模拟的ICH模型,观察其对NSP中多巴胺能神经元及纤维损伤的保护作用及对精细运动行为学的修复作用。此外,利用上述实验方法,我们将微管解聚剂Nocodazole注射到纹状体内观察单独微管解聚因素对NSP的损伤效应和Epo B的反转效应。最后,我们利用慢病毒、腺病毒载体将αTAT1/MEC17（α-tubulin的乙酰基转移酶）sh RNA在体及离体干预黑质区的多巴胺能神经元来降低acetylatedα-tubulin表达,观察单纯的稳定型微管acetylatedα-tubulin降低对黑质神经元胞体、纤维以及相关行为学的影响。结果1.小鼠纹状体出血导致血肿周围多巴胺能神经元纤维密度、同侧黑质区多巴胺能够神经元数目均显着降低。多巴胺能神经元呈现“空泡状”病理改变,伴随多巴胺神经递质囊泡转运相关蛋白VMAT2、Kinesin、Dynein表达降低、多巴胺神经递质含量降低、稳定型微管标记物acetylatedα-tubulin表达显着降低。2.顺行、逆行神经环路示踪均显示小鼠纹状体出血导致黑NSP通路的显着损害,旷场、神经功能评分方法只能发现3天内ICH小鼠的运动功能障碍,但需要技巧性的精细运动（Beam waking和irregular ladder walk task）在ICH后14天仍有功能障碍。3.微管稳定剂Epo B干预可以增加稳定型微管acetylatedα-tubulin表达,改善上述脑出血导致的NSP结构和功能的损害,并显着提高ICH后精细运动功能。4.微管解聚剂Nocodazole注射到纹状体内可以引起上述ICH后NSP的损伤及运动功能障碍,提示单独微管解聚因素对NSP既有损伤效应,维持微管稳定性是保护ICH后NSP损伤是重要靶点。5.αTAT1 sh RNA干预均可以降低多巴胺能神经元稳定型微管acetylatedα-tubulin表达下调,加重ICH及氧合血红蛋白对NSP结构和功能损伤,Epo B对αTAT1 sh RNA及氧合血红蛋白干预引起的多巴胺能神经元损伤也有显着的保护作用。结论小鼠纹状体出血会导致NSP通路的损害,ICH后acetylatedα-tubulin表达降低导致微管稳定性下降可能是NSP运动通路损伤的重要原因。微管稳定剂Epo B的干预可以增加acetylatedα-tubulin表达、显着减轻ICH导致的NSP通路损害,改善了ICH小鼠运动功能障碍。该部分研究首次探索了ICH导致的锥体外系-黑质纹状体通路的损害以及可能的机制,为改善ICH后运动功能障碍提供了新的思路。三、巴马香猪脑出血模型的建立及大动物MRI检测方法的探索目的实验性脑出血（intracerebral hemorrhage,ICH）模型主要建立在啮齿类动物中,但啮齿类动物白质纤维组织不够丰富,也无明显的内囊解剖结构。因此,本实验我们拟建立稳定性好、可重复、便于操作的巴马香猪ICH模型,同时对出血后脑水肿、脑室体积改变、铁沉积等进行多时间点的观察分析,并采用MRI-T2、QSM、DTI等序列进行脑组织结构分析、铁含量定量分析和白质纤维束定量分析,并观察米诺环素干预猪ICH模型的治疗效应,以此来评估模型的稳定性和可靠性,为更多临床转化研究提供更符合临床的ICH模型。方法我们选取10-12Kg的雄性巴马香猪,异氟烷麻醉后将猪固定到大动物立体定位仪上,在内囊上方（坐标为:前囟前11mm;旁开11mm）的颅骨表面钻一个直径约1mm大小的孔,利用微量注射泵、5m L注射器和33G针头将2m L自体动脉血缓慢注射到猪的右侧内囊区域,深度18mm。在脑出血后1天、7天、28天对巴马香猪进行MRI-T2、QSM、DTI扫描、脑含水量测定、血肿周围铁含量测定以及免疫组织化学染色。此外,我们在巴马香猪ICH模型中检测米诺环素的保护效应。结果1.自体血注入巴马香猪内囊处,造成了脑内血肿、脑室扩张、脑水肿、白质纤维损伤及神经功能障碍,较好的模拟了ICH的临床特点,表明巴马香猪ICH模型是一个具有相似性、重复性、可靠性的模型;2.血肿周围铁含量测定和QSM定量磁化率数值相关性好,QSM可以对脑出血后血肿周围铁含量进行无创的、准确的定量分析。DTI可以对白质纤维束进行定量分析;3.米诺环素可以行使铁螯合功能,降低血肿周围铁含量的同时,改善了巴马香猪脑水肿、侧脑室扩张、白质纤维束损伤及神经功能障碍。结论巴马香猪ICH模型具有相似性、重复性、可靠性;QSM是一种可以无创的、准确的评估ICH后急性、慢性期血肿铁含量的方法;米诺环素可以减轻巴马香猪ICH模型引起的脑水肿、脑室扩张、铁超载、白质纤维损伤、胶质细胞激活、神经功能障碍等。
郑智通[10]（2019）在《VEGI对颅脑创伤急性期血脑屏障通透性的影响及机制研究》文中研究说明研究目的:创伤性颅脑损伤（Traumatic brain injury,TBI）以其高致死致残率成为世界范围内重要公共卫生问题。创伤后原发性血脑屏障破坏导致脑血流灌注不足、血脑屏障通透性升高,代谢失衡、出凝血障碍等病理过程,引起继发性脑损伤,加重血脑屏障开放,形成恶性循环。及时修复血脑屏障成为TBI治疗的关注重点之一。血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）又被称作血管通透性因子,在血脑屏障开放、血管新生中起到重要作用。血管内皮生长抑制因子（Vascular endothelial growth inhibitor,VEGI）是机体内天然抑制VEGF的因子,且在抑制VEGF的同时并不影响血管内皮细胞的正常功能。因此,本实验在建立TBI动物模型的基础上,检测TBI后不同时间点VEGF和VEGI的表达变化,探讨二者与血脑屏障通透性的相关联系。通过侧脑室注射VEGI纯化蛋白对TBI急性期小鼠进行干预治疗,观察TBI后VEGF表达变化,血脑屏障通透性的改变,创伤侧细胞凋亡水平和小鼠神经运动功能。同时,探究VEGI对VEGF的下游作用机制,及其在TBI急性期抑制血管新生的作用机制。研究方法:1)在C57BL/6雄性小鼠上建立TBI模型,应用Western Blot技术检测TBI后不同时间点创伤侧纤维蛋白原的含量。2)应用Western Blot技术分别检测TBI后不同时间点VEGF和VEGI的各自表达量。3)应用立体定位侧脑室微量注射技术,对TBI后小鼠进行VEGI干预。4)通过改良的神经功能缺损评分（modified Neurological Severity Score,mNSS）和错步实验对实验各组进行神经功能评分。筛选出差异最大时间点,进行后续探究。5)应用Western Blot和免疫荧光技术检测比较TBI第3天对照组和干预组血脑屏障通透性的变化。6)应用Western Blot技术检测VEGFR2和下游eNOS的磷酸化表达。7)应用流式细胞技术和AnnexinV/PI试剂盒检测比较创伤对照组和VEGI干预组小鼠创伤侧细胞凋亡情况。8)应用Western Blot、免疫荧光技术观察血管新生相关细胞的变化。9)体外实验中比较VEGI对内皮细胞和周细胞成管能力的影响。10)应用Western Blot技术检测血管新生相关因子的相对表达变化。结果:1.TBI后小鼠血脑屏障开放在第3天最为显着。VEGF在TBI后逐渐升高,第3天达峰值。VEGI在TBI后第3天下降明显。综合比较VEGF与VEGI比值发现,VEGF/VEGI值在TBI后逐渐升高,在第3天最为明显。2.VEGI干预后对TBI小鼠神经运动功能改善从第3天开始出现明显差异。VEGI干预明显减少创伤侧的细胞凋亡数量,减轻了血脑屏障开放程度。VEGI干预可以显着抑制TBI急性期创伤侧VEGFR2和其下游eNOS的磷酸化。3.VEGI干预显着抑制了TBI后的血管新生,体现在对血管新生相关细胞的抑制和对血管新生相关因子之间平衡的调节。结论:1.TBI急性期后VEGF的单一变化不能完全解释血脑屏障通透性升高的时间峰值,综合VEGF与VEGI相对变化可能会更有效的研究TBI后血脑屏障损伤的原因。TBI急性期第3天VEGF相对于VEGI的高表达可能为血脑屏障通透性峰值的原因之一,为后续TBI急性期的治疗奠定基础。2.VEGI局部干预在TBI急性期对神经功能的改善作用集中于TBI后第3天,我们选用创伤后第3天为后续实验的重要观察点。3.VEGI通过减少紧密连接蛋白的损伤,降低基质金属蛋白酶的表达,抑制VEGF-VEGFR-2下游的磷酸化,有效地降低了血脑屏障通透性。VEGI局部干预在TBI后第3天有效抑制创伤侧的细胞凋亡。4.VEGI干预一定程度上恢复了TBI后促血管新生相关因子和抑制血管新生因子表达的失衡,减少了未成熟的新生血管的形成,以阻止血脑屏障通透性进一步的升高,从而缓解TBI后的继发性损伤。
二、凝血酶神经毒性作用的在体MRI观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、凝血酶神经毒性作用的在体MRI观察（论文提纲范文）
（1）MicroRNA-200a-3p通过靶向Egr2调节脑出血后炎性损伤的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 MicroRNAs调控脑出血后小胶质细胞激活、炎症和极化的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）芪龙胶囊治疗气虚血瘀证缺血性中风病的临床评价与疗效机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 芪龙胶囊的研究进展 |
| 1.1 芪龙胶囊组成与功效 |
| 1.2 芪龙胶囊药理与毒理 |
| 1.3 芪龙胶囊的临床研究 |
| 2 缺血性中风病的研究进展 |
| 2.1 缺血性中风的临床流行病学特征 |
| 2.2 动脉粥样硬化及其相关信号通路与生物过程 |
| 2.3 西医对缺血性中风的治疗现状 |
| 2.4 中医对缺血性中风的认识与治疗 |
| 3 队列研究与混杂因素的处理方法 |
| 3.1 前瞻性队列研究与混杂控制 |
| 3.2 差值检验法与倾向性评分匹配法 |
| 4 重复测量数据的分析方法 |
| 4.1 重复测量数据定义与常见分析模型 |
| 4.2 对齐秩转换方差分析与广义线性混合模型 |
| 5 转录组测序与RT-qPCR技术 |
| 5.1 转录组学与常见研究方法 |
| 5.2 RNA-Seq与RT-qPCR技术 |
| 5.3 基于RNA-Seq与RT-qPCR技术的中药复方疗效机制研究探索 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 第二部分 芪龙胶囊治疗气虚血瘀证缺血性中风病的前瞻性队列研究 |
| 1 研究目的 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 研究设计 |
| 2.2 研究人群 |
| 2.3 受试者来源 |
| 2.4 暴露因素 |
| 2.5 随访内容与随访时点 |
| 2.6 结局指标 |
| 2.7 样本量计算 |
| 2.8 生物样本采集 |
| 2.9 知情同意、伦理与国际注册 |
| 2.10 质量控制与数据管理 |
| 2.11 数据预处理与统计方法 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 队列建立流程图 |
| 3.2 招募与纳入分析情况 |
| 3.3 全数据集基线特征 |
| 3.4 基础治疗情况 |
| 3.5 全数据集差值检验分析结果 |
| 3.6 PSM子数据集基线特征 |
| 3.7 子数据集差值检验分析结果 |
| 3.8 子数据集对齐秩转换方差分析结果 |
| 3.9 广义线性混合模型分析结果 |
| 3.10 安全性分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 研究的主要发现 |
| 4.2 研究的优势与不足 |
| 4.3 临床应用与未来研究的指导意义 |
| 参考文献 |
| 第三部分 基于RNA-Seq高通量测序的芪龙胶囊干预后差异表达mRNA研究 |
| 1 实验目的 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验血样 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 实验分组 |
| 3.2 总RNA提取 |
| 3.3 总RNA质控 |
| 3.4 文库构建与测序 |
| 3.5 测序数据的过滤和质控 |
| 3.6 数据分析与统计 |
| 4 结果 |
| 4.1 总RNA纯度和完整性测定结果 |
| 4.2 测序数据结果 |
| 4.3 基因表达量分析结果 |
| 4.4 差异基因分析结果 |
| 4.5 差异基因功能富集结果 |
| 5 讨论 |
| 5.1 转录组测序技术在中药复方作用机制研究中的适用性 |
| 5.2 实验血样总RNA质量与测序数据质量 |
| 5.3 实验各组显着差异基因与功能富集 |
| 5.4 芪龙胶囊调控的主要差异基因及信号通路与生物过程 |
| 参考文献 |
| 第四部分 基于RT-qPCR的芪龙胶囊干预后关键基因与调控机制研究 |
| 1 实验目的 |
| 2 实验分组 |
| 3 实验材料 |
| 3.1 实验试剂 |
| 3.2 实验仪器 |
| 4 实验方法 |
| 4.1 样本总RNA提取 |
| 4.2 样本总RNA质检 |
| 4.3 mRNA逆转录 |
| 4.4 实时荧光定量PCR扩增 |
| 4.5 统计分析 |
| 5 实验结果 |
| 5.1 总RNA质量检测结果 |
| 5.2 扩增曲线及溶解曲线 |
| 5.3 两组间目标基因相对表达量比较 |
| 6 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 查新报告 |
| 附件 |
（3）线粒体去极化在脑出血后继发性神经损伤中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 线粒体功能障碍是脑出血后神经元铁超载的主要损伤特征 |
| 2.1 Fe~(2+)诱导PC-12神经元样细胞线粒体功能障碍 |
| 2.2 线粒体Fe~(2+)超载导致线粒体氧化呼吸异常与线粒体去极化 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 线粒体Fe~(2+)内流/CypD乙酰化正反馈分子环路介导线粒体去极化 |
| 3.1 线粒体Fe~(2+)超载导致神经元线粒体膜电位去极化 |
| 3.2 CypD乙酰化介导线粒体亚铁超载导致的线粒体膜电位去极化 |
| 3.3 CypD乙酰化介导的mPTP开放促进线粒体Fe~(2+)内流 |
| 3.4 CypD乙酰化介导亚铁超载引起的线粒体功能障碍 |
| 3.5 CypD乙酰化介导亚铁超载引起的神经元死亡 |
| 3.6 讨论 |
| 3.7 小结 |
| 第四章 抑制线粒体去极化的脑出血后的神经保护作用 |
| 4.1 抑制CypD乙酰化可减少FeCl_2导致的神经元氧化应激而不影响细胞铁代谢 |
| 4.2 环孢素A治疗或CypD缺失可抑制脑出血后线粒体损伤和神经元调节性坏死 |
| 4.3 环孢素A治疗或CypD缺失可改善脑出血后神经功能 |
| 4.4 MitoQ减少脑出血后铁超载导致的OPC膜电位去极化及白质损伤 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 脑出血后线粒体损伤与氧化应激的研究进展 |
| 参考文献 |
| 研究生学习期间所发表论文 |
| 致谢 |
（4）β分泌酶与血管病理在认知损伤相关疾病中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 β分泌酶提高多种血管相关疾病患者认知损伤风险研究 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 BACE1 |
| 1.1.1 BACE1与AD |
| 1.1.2 BACE1的表达调控 |
| 1.2 二型糖尿病 |
| 1.2.1 二型糖尿病的流行病学特征 |
| 1.2.2 二型糖尿病与认知损伤 |
| 1.3 脑血管疾病 |
| 1.3.1 脑小血管病 |
| 1.3.2 脑淀粉样血管病 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 患者血浆样本来源 |
| 2.1.2 荧光共振能量转移实验相关材料 |
| 2.1.3 ELISA检测相关材料 |
| 2.1.4 Luminex检测相关器材及试剂 |
| 2.1.5 其他材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 荧光共振能量转移实验 |
| 2.2.2 ELISA |
| 2.2.3 Luminex |
| 2.2.4 统计学分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 血浆BACE1提高认知损伤的风险 |
| 3.1.1 AD队列患者血浆BACE1蛋白浓度显着上升,且与认知评分相关 |
| 3.1.2 T2DM队列患者BACE1酶活性和浓度升高,与认知评分相关 |
| 3.1.3 CAA患者血浆BACE1蛋白浓度和活性与认知相关 |
| 3.1.4 社区队列患者血浆BACE1与认知评分呈负相关 |
| 3.2 血浆BACE1酶活性与血管病理相关 |
| 3.2.1 T2DM队列患者BACE1酶活性与炎症水平相关 |
| 3.2.2 CAA队列患者BACE1酶活性与病理相关 |
| 3.2.3 社区队列患者BACE1酶活性与血管病理相关 |
| 第4章 总结与讨论 |
| 第二部分 阿尔兹海默病脑内异常血管再生在血脑屏障损伤中的作用研究 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 阿尔兹海默病 |
| 1.1.1 阿尔兹海默病的流行病学特征 |
| 1.1.2 阿尔兹海默病的病理学特征 |
| 1.1.3 阿尔兹海默病的标志物 |
| 1.1.4 阿尔兹海默病的发病机制 |
| 1.2 血脑屏障与血管通透性 |
| 1.2.1 血脑屏障的结构和功能 |
| 1.2.2 阿尔兹海默病中的血脑屏障损伤和血管通透性改变 |
| 1.3 血管生成 |
| 1.3.1 血管生成 |
| 1.3.2 阿尔兹海默病中的血管生成 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验样本 |
| 2.1.1 人脑组织样本 |
| 2.1.2 患者CSF样本 |
| 2.1.2.1 患者招募及出入组标准 |
| 2.1.2.2 患者脑脊液样本提取及保存 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 蛋白免疫印迹实验器材及试剂 |
| 2.2.2 免疫焚光及免疫组化实验相关材料 |
| 2.2.3 ELISA检测相关器材及试剂 |
| 2.2.4 Luminex检测相关器材及试剂 |
| 2.2.5 其他实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 免疫印迹实验 |
| 2.3.2 免疫荧光实验 |
| 2.3.3 免疫组织化学实验 |
| 2.3.4 ELISA |
| 2.3.5 Luminex |
| 2.3.6 统计学分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 AD人脑组织样本中存在血管过度生成现象 |
| 3.1.1 AD人脑组织样本中血管密度及新生血管密度增加 |
| 3.1.2 血管生成相关因子在AD人脑组织样本中表达增加 |
| 3.1.3 AD患者血管呈现活化的表型 |
| 3.1.4 AD患者CSF中血管生成相关因子相较于健康对照表达升高 |
| 3.2 患者CSF血管生成相关因子与AD病理标志物的关系 |
| 3.2.1 患者CSF血管生成相关因子在p-Tau阳性患者中增加 |
| 3.2.2 患者CSF多数血管生成相关因子在Aβ分类患者中无差别 |
| 3.2.3 患者CSF血管生成相关因子与Tau病理关系更密切 |
| 3.3 AD患者血管通透性增加 |
| 3.3.1 AD人脑组织样本中内皮细胞表面紧密连接蛋白表达降低 |
| 3.3.2 AD患者Qalb相较于健康对照提高、血管损伤加剧 |
| 3.3.3 血管损伤组患者Qalb显着高于健康对照 |
| 3.4 AD患者血管生成可能导致血管通透性增加 |
| 3.4.1 促血管生成转录因子与紧密连接蛋白表达呈负相关 |
| 3.4.2 脑出血患者血管生成相关因子表达增加 |
| 3.4.3 所有患者中CSF血管生成相关因子与Qalb呈显着正相关 |
| 3.4.4 AD患者CSF血管生成相关因子与Qalb回归系数相较于健康对照更高 |
| 3.5 患者CSF血管生成相关因子与生理指标的关系 |
| 3.5.1 CSF血管生成相关因子与生理指标的关系 |
| 3.5.2 其他生理指标间的关系 |
| 第4章 总结及讨论 |
| 4.1 总结 |
| 4.2 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录：Mini-review article |
| References |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间的主要研究成果 |
（5）JNK抑制剂D-JNKI1缓解帕金森病多巴胺能神经退行性变和减少阿尔兹海默病的老年斑沉积（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:JNK抑制剂D-JNKI1 缓解MPTP/MPP+诱导的帕金森病模型多巴胺能神经退行性变 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 动物实验 |
| 2.2.2 细胞实验 |
| 2.2.3 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 D-JNKI1 抑制MPTP诱导的小鼠行为学异常 |
| 3.2 D-JNKI1 抑制MPTP诱导的多巴胺能神经元死亡 |
| 3.3 D-JNKI1 抑制MPTP诱导的多巴胺能神经元JNK的激活 |
| 3.4 D-JNKI1 对多巴胺能神经元ERK和 p38 磷酸化的影响 |
| 3.5 D-JNKI1 缓解MPTP诱导的caspase-3及cleaved-caspase-3 水平和Bcl-2/Bax比值的改变 |
| 3.6 MPP~+和D-JNKI1 随浓度变化对SH-SY5Y细胞活力的影响 |
| 3.7 D-JNKI1 缓解SH-SY5Y细胞中MPP~+对TH表达的抑制 |
| 3.8 D-JNKI1 缓解SH-SY5Y细胞中MPP~+诱导的JNK和 c-Jun活化 |
| 3.9 D-JNKI1对SH-SY5Y细胞中MPP~+诱导的p38和ERK活性的影响 |
| 3.10 D-JNKI1 抑制MPP~+诱导的ROS产生 |
| 3.11 D-JNKI1 缓解MPP~+诱导的MMP下降 |
| 3.12 D-JNKI1对SH-SY5Y细胞中Bcl-2/Bax比值和caspase-3及cleaved-caspase-3 表达水平的影响 |
| 3.13 D-JNKI1 随浓度变化对MPP~+诱导的细胞毒性和凋亡的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:JNK抑制剂D-JNKI1 减少APPswe/PS1E9 双转基因小鼠的β淀粉样蛋白沉积 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 APPswe/PS1E9 双转基因小鼠分组与D-JNKI1 注射 |
| 2.2.2 Aβ免疫组化 |
| 2.2.3 Western blotting |
| 2.2.4 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 D-JNKI1 对大脑皮层和海马中Aβ沉积的影响 |
| 3.2 D-JNKI1 对大脑皮层和海马中APP裂解的影响 |
| 3.3 D-JNKI1 对大脑皮层和海马中JNK及 c-Jun磷酸化水平的影响 |
| 3.4 D-JNKI1 对大脑皮层和海马中ERK和 p38 磷酸化水平的影响 |
| 3.5 D-JNKI1 对大脑皮层和海马中Bcl-2/Bax比值及caspase-3 表达水平的影响 |
| 3.6 D-JNKI1 对小鼠大脑皮层和海马中Tau蛋白磷酸化水平的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 JNK信号通路在帕金森病发病机制中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）PGC-1α通过调控线粒体TOM70/MICU1通路在脑出血中的神经保护作用研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 PGC-1α在脑出血引起的继发性脑损伤中的神经保护及抗炎作用研究 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 实验动物 |
| 1.2.2 主要试剂 |
| 1.2.3 主要仪器 |
| 1.2.4 主要试剂配制 |
| 1.2.5 实验设计及分组 |
| 1.2.6 实验方法 |
| 1.2.7 统计分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 一般生理情况 |
| 1.3.2 神经功能评分 |
| 1.3.3 脑水肿及血肿溶解 |
| 1.3.4 ZLN005对PGC-1α的作用 |
| 1.3.5 ZLN005对ROS的作用 |
| 1.3.6 炎症因子表达情况 |
| 1.3.7 小胶质细胞的活化与极化 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 PGC-1α抑制大鼠脑出血后神经炎症反应的机制研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要器材 |
| 2.2.4 主要试剂配制 |
| 2.2.5 实验设计及分组 |
| 2.2.6 实验方法 |
| 2.2.7 统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 一般生理情况 |
| 2.3.2 TOM70和MICU1 的表达变化 |
| 2.3.3 TOM70和MICU1 在小胶质细胞中的表达 |
| 2.3.4 ZLN005对TOM70和MICU1 的作用 |
| 2.3.5 脑组织标本中细胞超微结构的变化 |
| 2.3.6 ZLN005 对线粒体ATP的影响 |
| 2.3.7 小分子干扰RNA的作用结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 脑出血介导的神经炎症及潜在治疗靶点 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
（7）基于代谢组学研究针刺对基底节区急性脑梗死患者干预效应（论文提纲范文）
| 中文摘要 ABSTRACT 英文缩略词表 前言 实验一 基于代谢组学筛选基底节区急性脑梗死患者血清差异性生物标志物的研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验软件 |
| 2 病例选择 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 西医诊断标准 |
| 2.3 纳入标准 |
| 2.4 排除标准 |
| 2.5 剔除、脱落标准 |
| 2.6 健康对照组选择和纳入标准 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 实验分组 |
| 3.2 观察内容 |
| 3.3 临床样本的收集与处理 |
| 3.4 代谢组学分析 |
| 3.5 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 方法学考察结果 |
| 4.2 健康组与基底节区ACI组基线资料比较 |
| 4.3 基底节区ACI患者生物标志物的筛选 |
| 5 小结 实验二 基于代谢组学研究针刺对基底节区急性脑梗死的干预效应 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验软件 |
| 2 病例选择 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 实验分组 |
| 3.2 治疗方案 |
| 3.3 观察内容 |
| 3.4 临床样本的收集与处理 |
| 3.5 代谢组学分析 |
| 3.6 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 方法学考察 |
| 4.2 观察组与对照组基线资料比较 |
| 4.3 观察组与对照组治疗后生物标志物的变化 |
| 5 小结 讨论 |
| 1 基底节区ACI患者血清的代谢组学分析 |
| 1.1 氨基酸代谢 |
| 1.2 磷脂代谢 |
| 2 观察组治疗前后代谢组学分析 |
| 2.1 氨基酸代谢 |
| 2.2 磷脂代谢 |
| 3 对照组治疗前后代谢组学分析 |
| 4 不足与展望 结论 创新点 参考文献 综述 急性脑梗死治疗研究进展 |
| 参考文献 致谢 个人简历 |
（8）大鼠脑积水模型脉络丛相关炎症反应的作用及干预策略研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一部分 凝血酶诱导大鼠脑积水形成模型中脉络丛相关炎症反应的作用及干预策略 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 动物与实验分组 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 主要试剂 |
| 2.4 主要试剂配制 |
| 2.5 主要实验方法 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 侧脑室凝血酶注射诱导了大鼠脑积水的发生 |
| 3.2 侧脑室凝血酶注射导致大鼠脉络丛炎症浸润及脉络丛巨噬细胞激活 |
| 3.3 侧脑室凝血酶注射导致大鼠脑屏障功能的破坏 |
| 3.4 侧脑室注射凝血酶后引起脉络丛连接蛋白的改变 |
| 3.5 PAR1 拮抗剂SCH79797缓解凝血酶诱导的脉络丛炎症浸润 |
| 3.6 抑制PAR1/Src/PAK1通路缓解凝血酶诱导脑积水的产生 |
| 3.7 SCH79797通过抑制PAR1-Src-PAK1通路缓解连接蛋白减少 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 自发高血压大鼠脑积水形成中脉络丛巨噬细胞激活的作用及干预策略 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 动物与实验分组 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 主要试剂 |
| 2.4 主要试剂配制 |
| 2.5 主要实验方法 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 SHRs血压体重变化规律 |
| 3.2 SHRs脑积水发生发展规律 |
| 3.3 SHRs脑积水大鼠脉络丛染色 |
| 3.4 脑积水发生前脉络丛巨噬细胞染色 |
| 3.5 SHRs认知行为学检测 |
| 3.6 去铁敏治疗不能改善SHRs脑积水进展 |
| 3.7 米诺环素治疗后SHRs一般生理情况 |
| 3.8 米诺环素缓解了SHRs脑积水进展 |
| 3.9 米诺环素减少了SHRs脉络丛相关炎症反应 |
| 3.10 米诺环素治疗改善了SHRs认知功能障碍 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文总结 |
| 创新性 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 脉络丛结构特点及其在脑损伤中的病理生理机制及干预策略 |
| 参考文献 |
| 作者简历及其在学期间所取得的科研成果 |
（9）Acetylated α-tubulin在脑出血后运动神经传导通路损伤中的保护作用与机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 微管稳定和线粒体保护在小鼠脑出血后皮质脊髓束损伤中的作用与机制研究 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 微管稳定在小鼠脑出血后黑质纹状体通路损伤中的保护作用与机制研究 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 巴马香猪脑出血模型的建立及大动物MRI检测方法的探索 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 自发性脑出血后脑白质损伤与修复的相关研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（10）VEGI对颅脑创伤急性期血脑屏障通透性的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、颅脑创伤后血脑屏障通透性的变化和VEGF与 VEGI相对改变的观察 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验动物和主要仪器 |
| 1.1.2 实验试剂及材料 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.1.4 实验统计方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 脑创伤急性期中不同时间点血脑屏障通透性的观察 |
| 1.2.2 TBI急性期中不同时间点VEGF与 VEGI的相对表达检测 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、VEGI对脑创伤后急性期神经功能的影响及血脑屏障通透性和创伤侧细胞凋亡的作用 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验动物和主要仪器 |
| 2.1.2 实验试剂及材料 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.1.4 实验统计方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 VEGI干预对脑创伤急性期神经功能的影响 |
| 2.2.2 VEGI干预对脑创伤急性期对血脑屏障通透性的影响 |
| 2.2.3 VEGI干预对脑创伤急性期脑组织细胞的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、VEGI干预对脑创伤后血管新生的影响 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验动物和主要仪器 |
| 3.1.2 实验试剂及材料 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.1.4 实验统计方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 VEGI干预对血管新生相关细胞的作用 |
| 3.2.2 VEGI干预对血管新生相关因子的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、凝血酶神经毒性作用的在体MRI观察（论文参考文献）
- [1]MicroRNA-200a-3p通过靶向Egr2调节脑出血后炎性损伤的作用与机制研究[D]. 周桂银. 遵义医科大学, 2021
- [2]芪龙胶囊治疗气虚血瘀证缺血性中风病的临床评价与疗效机制研究[D]. 吕健. 中国中医科学院, 2021(02)
- [3]线粒体去极化在脑出血后继发性神经损伤中的作用及机制研究[D]. 陈蔚翔. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021
- [4]β分泌酶与血管病理在认知损伤相关疾病中的作用研究[D]. 刘一鸣. 中国科学技术大学, 2021(09)
- [5]JNK抑制剂D-JNKI1缓解帕金森病多巴胺能神经退行性变和减少阿尔兹海默病的老年斑沉积[D]. 王子钧. 中国医科大学, 2021(02)
- [6]PGC-1α通过调控线粒体TOM70/MICU1通路在脑出血中的神经保护作用研究[D]. 张钟圆. 浙江大学, 2020(01)
- [7]基于代谢组学研究针刺对基底节区急性脑梗死患者干预效应[D]. 陈林玲. 天津中医药大学, 2020(04)
- [8]大鼠脑积水模型脉络丛相关炎症反应的作用及干预策略研究[D]. 郝晓迪. 浙江大学, 2020(01)
- [9]Acetylated α-tubulin在脑出血后运动神经传导通路损伤中的保护作用与机制研究[D]. 杨阳. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(01)
- [10]VEGI对颅脑创伤急性期血脑屏障通透性的影响及机制研究[D]. 郑智通. 天津医科大学, 2019(02)